Định lượng đồng thời paracetamol, ibuprofen, cafein trong thuốc Cadiltamol F, Bidiipalvic bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao và quang phổ hấp thụ phân tử (LV thạc sĩ)Định lượng đồng thời paracetamol, ibuprofen, cafein trong thuốc Cadiltamol F, Bidiipalvic bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao và quang phổ hấp thụ phân tử (LV thạc sĩ)Định lượng đồng thời paracetamol, ibuprofen, cafein trong thuốc Cadiltamol F, Bidiipalvic bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao và quang phổ hấp thụ phân tử (LV thạc sĩ)Định lượng đồng thời paracetamol, ibuprofen, cafein trong thuốc Cadiltamol F, Bidiipalvic bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao và quang phổ hấp thụ phân tử (LV thạc sĩ)Định lượng đồng thời paracetamol, ibuprofen, cafein trong thuốc Cadiltamol F, Bidiipalvic bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao và quang phổ hấp thụ phân tử (LV thạc sĩ)Định lượng đồng thời paracetamol, ibuprofen, cafein trong thuốc Cadiltamol F, Bidiipalvic bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao và quang phổ hấp thụ phân tử (LV thạc sĩ)Định lượng đồng thời paracetamol, ibuprofen, cafein trong thuốc Cadiltamol F, Bidiipalvic bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao và quang phổ hấp thụ phân tử (LV thạc sĩ)Định lượng đồng thời paracetamol, ibuprofen, cafein trong thuốc Cadiltamol F, Bidiipalvic bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao và quang phổ hấp thụ phân tử (LV thạc sĩ)Định lượng đồng thời paracetamol, ibuprofen, cafein trong thuốc Cadiltamol F, Bidiipalvic bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao và quang phổ hấp thụ phân tử (LV thạc sĩ)Định lượng đồng thời paracetamol, ibuprofen, cafein trong thuốc Cadiltamol F, Bidiipalvic bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao và quang phổ hấp thụ phân tử (LV thạc sĩ)
Trang 1ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
NGUYỄN THỊ MAI DUNG
ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI PARACETAMOL, IBUPROFEN, CAFEIN
TRONG THUỐC CADILTAMOL F, BIDI-IPALVIC BẰNG
PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
VÀ QUANG PHỔ HẤP THỤ PHÂN TỬ
LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC
Ngành: Hóa phân tích
Mã số: 8 44 01 18
Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Mai Xuân Trường
Thái Nguyên, năm 2018
Trang 2LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này
là trung thực và chưa hề được sử dụng trong bất cứ một công trình nào
Tôi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận vănnày đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã đượcchỉ rõ nguồn gốc
Thái Nguyên, tháng 4 năm 2018
Tác giả luận văn
Nguyễn Thị Mai Dung
Xác nhận của Trưởng khoa chuyên môn
Xác nhận của giáo viên hướng dẫn
PGS.TS Nguyễn Thị Hiền Lan PGS.TS Mai Xuân Trường
ii
Trang 3LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình học tập và thực hiện luận văn, tác giả đã nhận đượcnhiều sự quan tâm, động viên và giúp đỡ của các thầy giáo, cô giáo, bạn
bè và gia đình
Tác giả bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:
Khoa Hóa học, Phòng Đào tạo - Trường Đại học Sư phạm - Đại học TháiNguyên, các thầy cô giáo tham gia giảng dạy đã cung cấp những kiến thức giúptôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu
Đặc biệt tác giả xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo PGS.TS MaiXuân Trường người đã tận tình hướng dẫn chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quátrình nghiên cứu, thực hiện và hoàn thành luận văn này
Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè nhữngngười đã luôn bên tôi, động viên và khuyến khích tôi trong quá trình thực hiện
đề tài nghiên cứu của mình
Với thời gian nghiên cứu có hạn, khối lượng công việc lớn, khả năngnghiên cứu còn hạn chế, chắc chắn luận văn không thể tránh khỏi những thiếusót Tác giả rất mong nhận được các ý kiến đóng góp từ các thầy giáo, cô giáo
và bạn đọc
Xin chân thành cảm ơn!
Thái Nguyên, tháng 04 năm 2018
Tác giả
Nguyễn Thị Mai Dung
Trang 4Trang bìa phụ
Lời
cam đoan .i
Lời
cảm ơn .ii
Mục lục .iii
Danh mục các từ
viết tắt .iv
Danh mục bảngbiểu .v
Danh mục các hình .vi
paracetamol, ibuprofen, cafein 2
1.1.1 Parac etam ol
2
1.1.2 Ibupr ofen 4
iv
Trang 51.1.3 Caf
ein 6
1.1.4 Các
loại dượ
c phẩ
m chứ
a par ace tam
ol, ibu pro fen
và
caf ein 9
p qua
ng phổ hấp thụ phâ
n tử 91.2.2.Cá
c địn
h
luậ
t cơsởcủasựhấ
pthụánhsáng[10,14,17]91.2.3.Nhữn
g
nguyên
nhân
làm
cho
sự
hâ
v
Trang 6ươ
ng phá
p lọcKalman111.3 Tổn
g phá
p quan
g ph
ổ hấ
p th
ụ phâ
1.4 Giới thiệu về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) .22
1.4.1 Nguy
ên tắc của phươ ng
pháp HPL C
22
1.4.2 Các đại lượn
g đặc trưng của quá trình sắc ký
24
1.4.3 Hệ thống máy HPL C.
26
vi
Trang 71.5 Tổng quan về phương pháp xác định đồng thời ba 3 thành phần theo phương
pháp HPLC 28
1.6 Các đại lượng đặc trưng để xử lý kết quả phân tích 34
1.6.1 Đánh giá độ tin cậy của quy trình phân tích 34
1.6.2 Các phương pháp để xử lý kết quả phân tích 36
Chương 2 THỰC NGHIỆM 38
2.1 Phương pháp nghiên cứu 38
2.1.1 Phương pháp nghiên cứu lý thuyết 38
2.1.2 Phương pháp thực nghiệm 38
2.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 38
2.2.1 Thiết bị 38
2.2.2 Dụng cụ 39
2.2.3 Hóa chất 39
2.3 Chuẩn bị các dung môi để hòa tan mẫu 40
2.3.1 Phương pháp HPLC 40
2.3.2 Phương pháp UV-Vis 40
2.4 Cách tiến hành 40
2.4.1. Xác định đồng thời ba chất theo phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử 40
2.4.2. Xác định đồng thời ba chất theo phương pháp HPLC 45
2.4.3. Đánh giá phương pháp định lượng 46
2.4.4. Xác định PRC, IBU và CFI trong thuốc Bidi-ipalvic và thuốc CaditamolF 48 2.4.5. Khảo sát độ đúng của phép xác định PRC, IBU và CFI theo phương pháp thêm chuẩn 49
Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 51
3.1 Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử 51
3.1.1 Khảo sát phổ hấp thụ phân tử của PRC, IBU và CFI 51
iv
Trang 83.1.2 Khảo sát khoảng tuyến tính tuân theo định luật Bughe – Lambe– Bia của PRC, IBU và CFI Xác định chỉ số LOD và LOQ 523.1.3. Khảo sát và đánh giá độ tin cậy của phương pháp nghiên cứu
trên các mẫu tự pha 583.1.4 Xác định hàm lượng PRC, IBU và CFI trong thuốc BIDI-IPALVIC
và CADITAMOL-F 63 3.1.5 Khảo sát độ đúng của phép xác định PRC, IBU và CFI theo phương
pháp thêm chuẩn 653.2 Phương pháp HPLC 693.2.1 Xây dựng điều kiện tối ưu để xác định đồng thời paracetamol, ibuprofen
và cafein 693.2.2 Đánh giá phương pháp định lượng 723.2.3 Xác định PRC, IBU và CFI trong thuốc Bidi-ipalvic và thuốc CaditamolF
763.2.4 Khảo sát độ đúng của phép xác định PRC, IBU và CFI theo phương pháp
thêm chuẩn 78
KẾT LUẬN 81 TÀI LIỆU THAM KHẢO 83
Trang 9DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
Mã giải phẫu – điều trị - hóa
Trang 10DANH MỤC BẢNG BIỂU
Trang
Bảng 2.1 Danh mục chất chuẩn của viện kiểm nghiệm thuốc 39
Bảng 2.2 Danh mục dung môi tinh khiết dùng cho HPLC 39
Bảng 3.1 Độ hấp thụ quang của PRC ở các giá trị nồng độ 53
Bảng 3.2 Kết quả xác định LOD và LOQ của PRC 54
Bảng 3.3 Độ hấp thụ quang của CFI ở các giá trị nồng độ 55
Bảng 3.4 Kết quả tính LOD và LOQ của CFI 56
Bảng 3.5 Độ hấp thụ quang của IBU ở các giá trị nồng độ 57
Bảng 3.6 Kết quả tính LOD và LOQ của IBU 58
Bảng 3.7 Pha chế các dung dịch hỗn hợp PRC và CFI 58
Bảng 3.8 Kết quả tính nồng độ, sai số của PRC, CFI 59
Bảng 3.9 Pha chế các dung dịch hỗn hợp PRC và IBU 60
Bảng 3.10 Kết quả tính nồng độ, sai số của PRC và IBU trong hỗn hợp 61
Bảng 3.11 Pha chế các dung dịch hỗn hợp CFI và IBU 61
Bảng 3.12 Kết quả tính nồng độ, sai số của CFI và IBU trong hỗn hợp 62
Bảng 3.13 Pha các dung dịch chuẩn PRC, IBU, CFI và hỗn hợp 62
Bảng 3.14 Kết quả tính nồng độ, sai số của PRC, IBU và CFI 63
Bảng 3.15 Kết quả tính nồng độ, sai số các PRC,CFI,IBU trong mẫu thuốc BIDI_IPALVIC 63
Bảng 3.16 Kết quả tính nồng độ, sai số các PRC,CFI,IBU trong mẫu thuốc CADITAMOL – F 64
Bảng 3.17 Thành phần các dung dịch chuẩn PRC, IBU và CFI thêm vào dung dịch mẫu thuốc Bidi-ipalvic 65
Bảng 3.18 Kết quả xác định độ thu hồi của PRC, IBU và CFI trong mẫu thuốc Bidi-ipalvic 66
Bảng 3.19 Thành phần các dung dịch chuẩn PRC, IBU và CFI thêm vào dung dịch mẫu thuốc Caditamol-F 67
Bảng 3.20 Kết quả xác định độ thu hồi của PRC, IBU và CFI trong mẫu thuốc Caditamol-F 68
Trang 11Bảng 3.21 Giá trị các đại lượng đặc trưng 72
Bảng 3.22 Kết quả khảo sát thời gian lưu 72
Bảng 3.23 Kết quả khảo sát diện tích pic 72
Bảng 3.24 Mối tương quan giữa nồng độ và diện tích pic của PRC, IBU và CFI 73
Bảng 3.25 Kết quả khảo sát độ lặp lại 75
Bảng 3.26 Kết quả phân tích thuốc Bidi-ipalvic 76
Bảng 3.27 Kết quả phân tích thuốc Caditamol F 77
Bảng 3.28 Kết quả khảo sát độ đúng 78
Bảng 3.29 Kết quả khảo sát độ đúng 80
vi
Trang 12DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1 Công thức cấu tạo của paracetamol 2
Hình 1.2 Công thức cấu tạo của ibupfofen 5
Hình 1.5: Mô hình hoạt động bộ lọc Kalman 12
Hình 3.1 Phổ hấp thụ của các dung dịch chuẩn của PRC(8µg/ml), IBU(10µg/ml) và CFI(8µg/ml) trong dung dịch HCl 0,1 M 51
Hình 3.2 Phổ hấp thụ quang của PRC ở các nồng độ 0,2÷ 40µg/mL 52
Hình 3.3 Đường hồi quy tuyến tính biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ quang A vào nồng độ của PRC 53
Hình 3.4 Phổ hấp thụ quang của CFI ở các nồng độ 0,2÷ 40,0µg/mL 54
Hình 3.5 Đường hồi quy tuyến tính biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ quang A vào nồng độ của CFI 55
Hình 3.6 Phổ hấp thụ quang của IBU ở các nồng độ 1,0 ÷ 40,0µg/mL 56
Hình 3.7 Đường hồi quy tuyến tính biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ quang A vào nồng độ của IBU 57
Hình 3.8 Sắc ký đồ của PRC 300 µg/mL tại bước sóng λ = 224 nm 70
Hình 3.9 Sắc ký đồ của CFI 200 µg/mL tại bước sóng λ = 224 nm 70
Hình 3.10 Sắc ký đồ của IBU 100 µg/mL tại bước sóng λ = 224 nm 70
Hình 3.11 Sắc ký đồ của PRC 300 µg/mL (1), CFI 200 µg/mL (2) và IBU 100 µg/mL (3) 71
Hình 3.12 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của PRC 74
Hình 3.13 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của IBU 74
Hình 3.14 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của CFI 74
vi
Trang 13MỞ ĐẦU
Với sự phát triển của khoa học và công nghệ thì ngành dược học là mộtngành đang phát triển hiện nay Có rất nhiều loại thuốc của các công ty dượcphẩm được đưa ra thị trường Mà chất lượng thuốc có ảnh hưởng trực tiếp đếnsức khỏe của con người Vì vậy vấn đề xác định đúng chất lượng của thuốcxem có đúng theo tiêu chuẩn của nhà sản xuất hay không là rất quan trọng vàngày càng được xã hội quan tâm
Có rất nhiều phương pháp đã được áp dụng trên thế giới cũng như tạiViệt Nam để xác định hàm lượng của thuốc Trong đó có hai phương pháp hayđược sử dụng đó là:
Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) và phương pháp quang
phổ hấp thụ phân tử (UV-Vis) kết hợp với kĩ thuật tính toán là hai phương
pháp cho kết quả chính xác, độ tin cậy cao, nhanh
Xuất phát từ những lí do trên chúng tôi chọn đề tài: “Định lượng đồng
thời paracetamol, ibuprofen, cafein trong thuốc Cadiltamol F, Bidi-ipalvic bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao và quang phổ hấp thụ phân tử”.
13
Trang 14Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Giới thiệu về ba chất paracetamol, ibuprofen, cafein
1.1.1 Paracetamol
1.1.1.1 Giới thiệu chung[1,2,4,8]
- Tên biệt dược: Acetaminophen (tên khác: Paracetamol) Ký hiệu PRC.
- Công thức phân tử: C8H9O2N
- Khối lượng mol phân tử: 151,17 g/mol
- Công thức cấu tạo:
Hình 1.1 Công thức cấu tạo của paracetamol
- Danh pháp IUPAC: N-(4-hydroxyphenyl)acetamit hoặc p-hydroxy acetanilit hoặc 4-hydroxy acetanilit
Tên gọi paracetamol được lấy từ tên hóa học của hợp chất para-
- Khối lượng riêng: 1,263 g/cm 3
- Nhiệt độ nóng chảy: 169 0 C
Trang 15- Chế phẩm tan ít trong nước, tan nhiều hơn trong nước sôi, khó tan trongclorofom,ete và các dung dịch kiềm…Dung dịch bão hòa trong nước có pHkhoảng 5,6-5,6.
- Nhóm -OH làm cho chế phẩm có tính axit và khi tác dụng với dung dịch muối sắt (III) cho màu tím
- Đun nóng với dung dịch HCl thì bị thủy phân Thêm thuốc thử kali dicromat thìcó kết tủa màu tím
1.1.1.3 Một số loại chế phẩm chứa PRC tại Việt Nam[1,2,3,4,8]
- Chế phẩm viên nén: Paracetamol,Tiffy, Panadol Extra, Decogen
Forte…
- Chế phẩm viên sủi: Efferalgan, Coldko, Happcol codein, Panadol 500mg…
- Chế phẩm gói bột: Efferalgan 80 mg, Hapacol Kids
- Chế phẩm dạng dung dịch uống
- Chế phẩm dạng bột tiêm: Pro-Dafalgan 2g propracetamol
- Các chế phẩm kết hợp với các thuốc khác
1.1.1.4 Định lượng paracetamol theo dược điển Việt Nam IV[1]
* Định lượng viên nén paracetamol
Trang 16Cân 20 viên, tính khối lượng trung bình viên và nghiền thành bột mịn.Cân chính xác một lượng bột viên tương ứng khoảng 0,15 g paracetamol vàobình định mức 200 ml, thêm 50 ml dung dịch natri hydroxyd 0,1 M (TT) và
100 ml nước, lắc 15 phút, thêm nước đến định mức Lắc đều, lọc qua giấy lọckhô, bỏ 20 ml dịch lọc đầu
Lấy chính xác 10 ml dịch lọc cho vào bình định mức 100 ml Thêm nướcvừa đủ đến vạch, lắc đều Lấy chính xác 10 ml dung dịch trên cho vào bình địnhmức 100 ml, thêm 10 ml dung dịch natri hydroxyd 0,1 M (TT), thêm nước đếnđịnh mức, lắc đều Đo độ hấp thụ (Phụ lục 4.1) của dung dịch thu được ở bướcsóng 257 nm, dùng cốc dày 1 cm Mẫu trắng là dung dịch natri hydroxyd 0,01 M(TT)
Tính hàm lượng paracetamol, C8H9NO2 theo A (1 %, 1 cm) Lấy 715 làgiá trị A (1 %, 1 cm) ở bước sóng 257 nm
* Định lượng paracetamol bằng phương pháp HPLC sử dụng:
- Pha động: Hỗn hợp gồm 375 thể tích dung dịch dinatri hydrophotphat 1,79%, 375thể tích dung dịch natri dihydrophotphat 0.78% và 250 thể tích metanol có chứa0,46% của dung dịch tetra-butylamoni hydroxid 40%
- Cột pha tĩnh: Cột thép không gỉ, 250 mm x 4,6 mm, 5 µm
- Dectector UV, bước sóng hấp thụ 245 nm
- Tốc độ dòng 1,5 mL/phút
- Nhiệt độ cột: 350C
- Thể tích tiêm mẫu 20µL
1.1.2 Ibuprofen
1.1.2.1 Giới thiệu chung[1,13,29]
- Tên quốc tế: Ibuprofen
- Một số tên khác: Advil, Genpril,Ibu-200, Midol, Motrin, Nuprin
- Công thức phân tử: C13H18O2
- Công thức cấu tạo:
Trang 17Hình 1.2 Công thức cấu tạo của ibupfofen
C13H18O2
- Khối lượng mol phân tử: M=206,28g/mol
-Tên IUPAC: axit-2-[4-(2-metyl propyl) phenyl] propanoic (hay acid
(RS)-2-(4-isobutylphenyl) propionic )
1.1.2.2 Tính chất[1,3,13,29]
* Tính chất vật lí:
- Ibuprofen là chất bột kết tinh màu trắng hoặc tinh thể không màu
- Nhiệt độ nóng chảy:760C
- Thực tế không tan trong nước, dễ tan trong axeton, diclorometan, metanol và ether Tan trong các dung dịch hydroxyd kiềm loãng và cacbonat kiềm,tan trong các dung dịch kiềm và cacbonat kiềm(do nhóm chức axit), tan trong axit
1.1.2.3 Một số loại chế phẩm chứa ibuprofen[1,3]
Dung dịch thử: Cân 20 viên (đã được loại bỏ lớp bao, nếu cần) tính khốilượng trung bình viên, nghiền thành bột mịn Cân chính xác một lượng bột viêntương ứng với khoảng 0,2 g ibuprofen, thêm 60 ml pha động, lắc trong 20 phút,thêm pha động vừa đủ 100,0 ml và trộn đều Lọc hoặc li tâm
Trang 18Tiến hành sắc ký lần lượt với dung dịch chuẩn và dung dịch thử.
Tính hàm lượng ibuprofen, C13H18O2, dựa vào diện tích pic trên sắc ký đồcủa dung dịch chuẩn, dung dịch thử và hàm lượng C13H18O2 trong ibuprofenchuẩn
1.1.3 Cafein
1.1.3.1 Giới thiệu chung[1,3,4,19]
- Tên quốc tế: Cafein Ký hiệu CFI
- Tên IUPAC: l,3,7 – trimethylxanthin
- Công thức phân tử: C8H10N4O2
- Khối lượng mol phân tử: 194,19 g/mol
- Công thức cấu tạo:
Hình 1.3 Công thức cấu tạo của cafein
1.1.3.2 Tính chất[1,3,4,19]
* Tính chất vật lý
- Cafein là chất rắn kết tinh dạng tinh thể màu trắng, không màu, không mùi, có
vị đắng nhẹ
Trang 19- Cafein tan ít trong nước, dễ tan trong nước sôi và clorofom, các dung dịch axit,dung dịch đậm đặc của benzoat hay salixylat kiềm Tan một phần trong etanol, íttan trong nước lạnh (1lít nước lạnh hòa tan được 20 gam cafein).
- Nhiệt độ nóng chảy: khoảng 234 0 C-239oC
- Chế phẩm viên sủi: Biragan Extra
- Chế phẩm bôi ngoài da: Coje xi-ro và percutafeine-Gel
- Chế phẩm dạng bột tiêm: Cafein dung dịch tiêm
- Các chế phẩm kết hợp với các thuốc khác
1.1.3.4 Định lượng cafein [1,4,19]
* Định lượng cafein
Cân chính xác khoảng 150 mg chế phẩm đã làm khô Hòa tan trong 15
ml anhydrid acetic (TT) và 20 ml benzen (TT) Cho thêm vài giọt dung dịchtím tinh thể (TT) Chuẩn độ bằng dung dịch acid percloric 0,1 N (CĐ) cho đếnkhi dung dịch chuyển sang màu vàng Có thể xác định điểm kết thúc bằngphương pháp chuẩn độ đo điện thế 1 ml dung dịch acid percloric 0,1 N (CĐ)tương đương với 19,42 mg C8H10N4O2
Trang 20* Định lượng paracetamol và cafein trong thuốc viên nén pracetamol và cafein bằng phương pháp HPLC.
Hỗn hợp dung môi: Methanol - acid acetic băng (95 : 5)
Dung dịch chuẩn gốc: Hòa tan chính xác một lượng paracetamol chuẩn
và cafein chuẩn trong hỗn hợp dung môi để thu được dung dịch có nồng độ0,25 mg/ml của paracetamol và 0,25J mg/ml của cafein, J là tỷ lệ lượng ghi trênnhãn của cafein và lượng ghi trên nhãn của paracetamol trong viên
Dung dịch chuẩn: Hút chính xác 20,0 ml dung dịch chuẩn gốc và 3,0 mldung dịch chuẩn nội vào bình định mức 50 ml, pha loãng bằng hỗn hợp dungmôi đến định mức, trộn đều Dung dịch thu được có nồng độ paracetamolkhoảng 0,1 mg/ml và nồng độ cafein khoảng 0,1J mg/ml
Dung dịch thử: Cân 20 viên, tính khối lượng trung bình viên, nghiền thànhbột mịn Cân chính xác một lượng bột viên tương ứng khoảng 250 mgparacetamol vào bình định mức 100 ml, thêm khoảng 75 ml hỗn hợp dung môi,lắc trên máy lắc 30 phút Pha loãng bằng hỗn hợp dung môi đến định mức, trộnđều Hút chính xác 2,0 ml dung dịch này và 3,0 ml dung dịch chuẩn nội vào bìnhđịnh mức 50 ml, pha loãng bằng hỗn hợp dung môi đến định mức, trộn đều
Điều kiện sắc ký:
Cột thép không gỉ (10 cm × 4,6 mm) được nhồi pha tĩnh C (5 µm)
Nhiệt độ cột: 45 °C ± 1 °C
Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 275 nm
Tốc độ dòng: 2 ml/min
Thể tích tiêm: 10 µl
Trang 211.1.4 Các loại dược phẩm chứa paracetamol, ibuprofen và cafein
- Danh mục thuốc có chứa paracetamol: Alaxan, Decolgen Forte,
Hapacol Kids, Tiffy,…
- Danh mục thuốc có chứa paracetamol và cafein: Hapacol Extra, Panadol Extra, thuốc thần kinh D3,…
- Danh mục thuốc có chứa paracetamol và ibuprofen: Alaxan, protamol,
Andolxan, Tatanol Extra…
- Thuốc có chứa paracetamol,ibuprofen, và cafein: thuốc Bidi-Ipalvic, Caditamol
F, Dimitalgin, ibuacetalvic, ibuparavic…
1.2 Giới thiệu về phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử
1.2.1 Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử
Nguyên tắc: Dựa trên phép đo lượng ánh sáng do phân tử chất phân tích hấp thụ.[10,14]
1.2.2 Các định luật cơ sở của sự hấp thụ ánh sáng[10,14,17]
Định luật hợp nhất Bughe – Lambe – Bia
- Nội dung định luật:
Khi chiếu một chùm tia sáng có năng lượng nhất định vào một dungdịch chứa cấu tử hấp thụ ánh sáng thì cấu tử đó sẽ hấp thụ chọn lọc một số tiasáng
Độ hấp thụ quang của cấu tử tỷ lệ thuận với nồng độ của chất trong dungdịch và bề dày lớp dung dịch mà ánh sáng truyền qua
- Phương trình toán học biểu diễn định luật Bughe – Lambe – Bia:
A: Độ hấp thụ quang của chất phân tích
ε : là hệ số hấp thụ mol phân tử, đơn vị L.mol-1.cm-1 b: là bề dày của dung dịch, đơn vị cm
C: nồng độ của dung dịch màu, đơn vị mol/L
Trang 22Định luật cộng tính
- Nội dung định luật cộng tính: Ở một bước sóng đã cho độ hấp thụ quang củamột hỗn hợp các cấu tử không tương tác hóa học với nhau bằng tổng độ hấp thụquang của các cấu tử riêng biệt ở cùng bước sóng này
- Phương trình toán học biểu diễn định luật cộng tính
Aλ =A1,λ +A2,λ + +Ai,λ + +An,λ =
A i, λ: độ hấp thụ ánh sáng của cấu tử thứ i ở bước sóng λ; n là số cấu
tử hấp thụ ánh sáng có trong hỗn hợp; với i = 1 ÷ n
Từ (1.1) có thể viết lại phương trình (1.2) như sau:
Aλ = ε1,λ .b.C1 +ε2,λ .b.C2 + +εn,λ .b.Cn = ∑ εi,λ.b.Ci
1.2.3 Những nguyên nhân làm cho sự hấp thụ ánh sáng của dung dịch không
tuân theo định luật Bughe-Lămbe-Bia[10,14]
Từ biểu thức của định luật Bughe-Lămbe-Bia A = f(b,c) nghĩa là độ hấpthụ quang A là hàm số của ba biến Do đó mọi sự sai lệch của các tham số này
Trang 23đều có thể đưa đến làm sai lệch quy luật hấp thụ quang, gây sai số cho phép
đo độ hấp thụ quang của chất, bao gồm:
- Chùm sáng chiếu qua dung dịch không hoàn toàn đơn sắc
Trang 24- Các điều kiện đo quang như: bề dày cuvet, độ trong suốt của bề mặt cuvetkhông thật đồng nhất, bề mặt cuvet gây các hiện tượng quang học phụ như tán
xạ hấp thụ …
- Sự có mặt của các chất điện giải lạ trong dung dịch màu làm biến dạng cácphần tử hoặc các ion phúc màu làm ảnh hưởng đến sự hấp thụ ánh sáng của cactiểu phân hấp thụ ánh sáng
- Hiệu ứng solvat hóa ( hay hidrat hóa) làm giảm nồng độ các phần tử dung môi
tự do, do đó làm thay đổi nồng độ của dung dịch màu và làm ảnh hưởng đến sựhấp thụ ánh sáng của dung dịch màu
- Hiệu ứng liên hợp: Trong một số trường hợp có sự tương tác của chính các tiểuphân hấp thụ ánh sáng để tạo ra các tiểu phân polime làm thay đổi nồng độ hợpchất màu
- Ảnh hưởng pH của dung dịch: Sự thay đổi nồng độ của ion H+( tức sự thay đổipH) của dung dịch sẽ ảnh hưởng đến sự tuân theo định luật Bughe- Lămbe-Biatheo các trường hợp sau:
+ Thuốc thử có đặc tính axit: Nồng độ ion H+ thay đổi làm chuyển dịchcân bằng tạo thành chất màu
+ Thay đổi pH đẫn đến thay đổi thành phần hợp chất màu
+ pH tăng làm phức màu có thể bị phân hủy do sự tạo thành phứchiđroxo
+ Ion H+ làm trạng thái tồn tại và màu của dunng dịch cũng thay đổi
- Ảnh hưởng của sự pha loãng dung dịch phức màu
- Nhiệt độ môi trường và dung dịch đo phổ trong Cuvet là không hằng định trongsuốt thời gian đo
1.2.4 Phương pháp lọc Kalman
1.2.4.1 Phương pháp lọc Kalman [5,6]
- Trong phân tích trắc quang, khi tiến hành đo phổ hấp thụ quang phân tử, vì các nguyên nhân khác nhau mà một số kết quả đo thực tế luôn khác so với
Trang 25giá trị lí thuyết, người ta luôn mong muốn có một phổ càng gần với phổ lí thuyết càng tốt (sai số nhỏ nhất).
- Thuật toán lọc Kalman hoạt động trên cơ sở các file dữ liệu phổ đã ghi đượccủa từng cấu tử riêng rẽ và của hỗn hợp các cấu tử, xác định sự đóng góp vềphổ của từng cấu tử trong hỗn hợp tại các bước sóng Khi chương trình chạynhững kết quả tính toán liên tiếp sẽ càng tiến gần đến giá trị thực.Trong thực tế,người ta sử dụng phương pháp bình phương tối thiểu để giảm sai số giữa phổcủa hỗn hợp với phổ nhân tạo được tiên đoán bởi các xấp xỉ Kalman
- Kết quả tính toán là lý tưởng khi phổ của hỗn hợp trừ đi phổ nhân tạo được tínhbởi lọc Kalman sẽ tạo ra một đường thẳng có độ lệch không đáng kể
- Độ đúng của phép xác định phụ thuộc vào độ nhiễu của nền, vào việc tách cácđỉnh phổ hấp thụ của các cấu tử và sự tương tác giữa các cấu tử Hỗn hợp cócàng ít cấu tử, các đỉnh hấp thụ càng cách xa nhau thì sai số của phép tính toán
sẽ càng nhỏ
- Việc tính toán sẽ được thực hiện trên toàn bộ khoảng bước sóng được chọn Nếukết thúc quá trình tính toán, độ lệch chuẩn tương đối của giá trị nồng độ các cấu tửtrong hỗn hợp vẫn lớn hơn giá trị sai số cho phép thì nồng độ của cấu tử đó sẽphải xác định lại Trong trường hợp đó, cần phải tăng giá trị sai số mặc định hoặcgiảm số giá trị nồng độ mặc định để tính giá trị nồng độ trung bình
- Một số tác giả đã sử dụng thuật toán lọc Kalman để xác định các cấu tử tronghỗn hợp bằng phương pháp trắc quang Kết quả cho thấy sai số của phép xácđịnh với hỗn hợp 2 cấu tử nhỏ hơn 1%, với hỗn hợp 3 cấu tử có sai số nhỏhơn 2%
Hình 1.5: Mô hình hoạt động bộ lọc Kalman
Trang 261.2.4.2 Cơ sở lí thuyết của thuật toán [5,6]
* Đơn giản nhất xét lọc Kalman 1 chiều (dung dịch chỉ có 1 cấu tử)
Giả sử có cấu tử i, giá trị độ hấp thụ quang của cấu tử i ở bước sóng λ tuântheo phương trình (1.1) Vì chưa biết giá trị nồng độ thực Ci nên ta cần ướcđoán giá trị của Ci từ giá trị Ci đã biết trước đó
Xét ở bước sóng khởi điểm λ0
Giá trị trung bình của nồng độ C được xác định bằng biểu thức:
Trong đó:
Ci là giá trị nồng độ tính được của cấu tử i
µ là giá trị nồng độ thực của cấu tử i
E là toán tử kỳ vọng (giá trị trung bình)
n là số lần xác định giá trị nồng độ
Cũng như các phương pháp giải lặp khác, vì ban đầu ta không thể biếtchính xác µ và chưa có giá trị nồng độ Ci là ước đoán (được cho là) tốt nhất củachúng ta về giá trị nồng độ (C) (giả sử Ce = 1,0000)
Phương sai của phép xác định được tính theo công thức:
Trang 27k i=1 k i=1
Trang 28Trong đó: k là số bậc tự do của phép xác định nồng độ.
Giả sử P = 0,0400
Xét ở bước sóng λ1:
Phương trình (1.4) khi viết ở bước sóng λ1 có dạng:
Ai( λ 1) = F Ci( λ 0) + u( λ 0) (1.7)Theo đó ước đoán của ta tốt nhất về Ci( λ 1) là:
Phương sai trong ước đoán này xác định từ (1.6) là:
P = 1 (C -C ) = E [ Ci(λ1) – Ce-New) 2] (1.9)
New k i=1 i(l1 ) e-New
Với E là toán tử kỳ vọng Thay thế biểu thức của C i( λ 1) ở (1.7) và Ce -New ở (1.8) và (1.9) ta sẽ được:
P New = E [ F.Ci( λ 0) + u – F.Ce) 2 ] =
= E [ F 2 (Ci( λ 0) – Ce ) 2 ] + E [ u 2 ] + E.[ 2F(Ci( λ 0) - C e) u ] (1.10)Vì u giả định là không có tương quan gì với C i( λ 0) và Ce (u = 0) nên số hạng E.[2F(Ci( λ 0) - Ce) u] = 0 Thay thế P từ (1.6) và (1.8) vào (1.10) ta được:
Trong đó:
Q = [ u2 ] là phương sai của u
Với ví dụ của chúng ta thì PNew = 0,0400.0,81 + 0,0001 = 0,0325
Trang 29Bây giờ chúng ta hãy giả thiết việc xác định nồng độ C ở bước sóng λ1 có
“nhiễu đo” Gọi giá trị nồng độ ở bước sóng λ1 là x(λ1) Giả sử x(λ1) liên hệ tuyếntính với C (trường hợp đơn giản nhất)
x( λ 1) = M.C( λ 1) + w(1) (1.12)Trong đó:
w là nhiễu trắng của phương sai “R”
M là hằng số đã biết Ví dụ: M = 1, R = 0,0100 và x(λ1) = 1,2000
Nếu muốn đoán x(λ1) trước khi có giá trị đo thì phải dùng: xe = M.Ce-New với
ví dụ đang xét giá trị ước đoán x(λ1) = 0.900
Theo Kalman giá trị ước đoán tốt nhất của Ci(λ1) là:
Ce-New-New = Ce-New + K.( x(λ1) - M.Ce-New) (1.13)Trong đó: K là một số được gọi là lợi Kalman x(λ1) - xe là sai số trong việcước đoán x(λ1) Với ví dụ trên là 1,2000 – 0,9000 = +0,3000, một phần là donhiễu đo w và một phần do sai số trong việc ước đoán x(λ1) từ (1.12) Nếu tất cảsai số là do việc ước đoán x(λ1) thì rõ ràng là ta đã ước đoán Ce-New thấp hơn0,3000 Đặt K = 1 ta có thể hiệu chỉnh đủ sai số này Nhưng vì một phần sai số
do nhiễu đo w, nên để hiệu chỉnh cho Ce-New-New phải nhỏ hơn 0,3000 thì K sẽ cógiá trị nhỏ hơn 1
Vấn đề đặt ra là giá trị nào của K sẽ được sử dụng? Trước khi quyết định,chúng ta hãy tính phương sai mới kế tiếp:
E[C i( λ 1)-Ce-New-New) 2] = E [{(Ci( λ 1)- Ce-New- K.(x( λ 1) - M.Ce-New)}2 ]
= E [{(Ci( λ 1)- Ce-New- K.( M.C + w - M.Ce-New)} 2 ]
= E [{(1- KM)( C i( λ 1) – Ce-New)- Kw}2 ]
= E [(Ci( λ 1)- Ce-New)2 (1- KM)2 +Kw2 – 2Kw(Ci( λ 1)- Ce-New)(1-KM)]
= P New.(1- KM)2 + RK2 (1.14)Trong đó: R = E[w2] và số hạng thứ ba (Kw2) biến mất vì w được giả định
là không tương quan với nồng độ C và Ce-New Giá trị mới của phương sai bây giờđược xác định bởi:
Trang 30P New-New = PNew.(1- KM)2 + RK2 (1.15)Nếu muốn cực tiểu hóa sai số ước đoán thì phải cực tiểu hóa PNew-New tức
là đạo hàm PNew-New theo K và cho bằng 0 để tìm K Lúc đó:
2 newVới ví dụ trên K = 0,7647; Pe-New-New = 0,001129 và PNew-New = 0,007647 Cóthể thấy ngay rằng phương sai của ước đoán đang giảm đi (P1 = 0,0400; P2=0,0325; P3 = 0,007647; P4 = 0,001129)
Như vậy ta có 5 phương trình của phép lọc Kalman như sau:
PNew-New = PNew.(1 – KM)2 + RK2 (1.21)
Ở bước sóng λ2, chúng ta lại bắt đầu sử dụng Ce-New làm giá trị ước đoáncủa Ce để đưa vào (1.17), sử dụng PNew-New như là giá trị của P trong (1.18) sauđó tính K từ (1.20) và dùng giá trị K mới tính được cùng giá trị x(λ2) trong(1.19) để nhận được một ước đoán mới về C, sau đó lại dùng (1.21) để tínhđược P tương ứng Quá trình được lặp đi lặp lại như thế cho đến bước sóngcuối cùng
* Xét lọc Kalman n chiều (hỗn hợp có n cấu tử).
Xét hỗn hợp có n cấu tử có nồng độ trong hỗn hợp lần lượt là
C = (C1, C2,C3, …, Cn) Giá trị nồng độ tính được bước sóng λ lần lượt là (C1(λ),
C2(λ),C3(λ), …, Cn(λ)) Gọi giá trị kỳ vọng (trung bình thống kê) của Ci(λ) là Ei(λ) thì
ECλ là véc tơ có các phần tử e1(λ), e2(λ),e3(λ), …, en(λ) Thường ta quan tâm đến cácvéc tơ có giá trị trung bình bằng 0 (ECλ = 0)
Gọi chuyển vị của C là CT Giả sử có giá trị trung bình thống kê bằng 0.Tích của C và CT là một ma trận bậc nxn
+ R
M P
+ R
M P
Trang 31Đặt P = ECCT được gọi là ma trận hiệp biến (ma trận hiệp phương sai) của
C Phần tử thứ i, j của P là Pij(λ) = ECi(λ).Cj(λ)
Ở đây các phần tử nằm trên đường chéo chính của P là phương sai của Ci.Các phần tử nằm ngoài đường chéo chính là các hiệp biến Hiệp biến Pij có liênquan đến hệ số tương quan giữa Ci và Cj
Nếu hỗn hợp có n cấu tử thì về cơ bản các phương trình lọc Kalman vẫngiữ như trường hợp lọc 1 chiều, điều khác biệt ở đây là:
+ Thay cho các đại lượng vô hướng là các véc tơ, thay cho các véc tơ là các ma trận
+ Thay cho bình phương của một đại lượng vô hướng ta có tích ma trận chuyển vị T của nó
Ký hiệu (λ/λ-1) tương đương với New (λ/λ) tương đương với New-New
và (λ-1/λ-1) tương đương với giá trị ban đầu của đại lượng tương ứng
Các giá trị nồng độ C ở bước sóng đo (λ):
C(λ) = F(λ,λ-1).C(λ-1) + W(λ) (1.22)Trong đó:
Trong đó: A(λ) là độ hấp thụ quang tại bước sóng λ của mẫu phân tích
HT(λ) là hàm mô tả mối liên hệ giữa các tham số nồng độ với kết quả đo quang.V(λ) là nhiễu đo Đây chính là mô hình tuyến tính biểu diễn bởi định luậtBughe - Lămbe – Bia
Lọc Kalman giải bài toán ước đoán các tham số trạng thái bằng một dãy các phương trình đệ quy:
Trang 32Ngoại suy ước đoán nồng độ của các cấu tử:
C(λ/λ-1) = F(λ,λ-1).C(λ-1/λ-1) (1.24)Ngoại suy ước đoán hiệp biến sai số:
P(λ/λ-1) = F(λ,λ-1).P(λ-1/λ-1).FT(λ,λ-1) + Q(λ-1) (1.25)Lợi Kalman:
P(λ/λ) = [I – K(λ).HT(λ)].P(λ/λ-1) (1.28)Trong đó:
K(λ) trọng số lợi Kalman
Q(λ) hiệp biến sai số hệ thống R(λ) biến nhiễu đo
T chuyển vị ma trận V(λ) nhiễu đoW(λ) nhiễu hệ thống
P(λ/j) dự đoán hiệp biến sai số của nồng độ các cấu tử ở bước sóng λ,
dựa vào các giá trị độ hấp thụ quang đo được ở j bước sóng: A(1) A(j)
Tiến hành lập trình theo các công thức (1.24) đến (1.28) ta thu được
chương trình xác định đồng thời các cấu tử theo phương pháp lọc Kalman
1.3 Tổng quan về phương pháp xác định đồng thời 3 thành phần theo phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử
Phương pháp UV - Vis được ứng dụng nhiều trong phân tích các chếphẩm về dược cũng như hỗn hợp các chất vô cơ, hữu cơ Các kết quả đều chothấy phương pháp nhanh và dễ thực hiện
Trang 33Kết quả xác định một số chất theo phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử:
Năm 2008, tác giả Mai Xuân Trường đã nghiên cứu phương pháp hấp thụquang phân tử xác định đồng thời các chất có phổ hấp thụ xen phủ nhau dựatrên thuật toán lọc Kalman:
+ Điều kiện tối ưu để xác định đồng thời paraxetamol và ibuprofen tronghỗn hợp: Khoảng bước sóng thích hợp để quét phổ từ 200 ÷ 300nm, bước sóngứng với độ hấp thụ quang cực đại của dung dịch paraxetamol λmax=244nm,ibuprofen λmax=222nm, trong môi trường đệm photphat pH = 7 độ hấp thụquang của paraxetamol và ibuprofen ổn định và đạt cực đại Kết quả thu được:khoảng nồng độ tuyến tính của paraxetamol 2÷14μg/mL; ibuprofen4÷18μg/mL Độ thu hồi của paraxetamol từ 98,30% đến 102,53% và ibuprofen
từ 96,98% đến 102,49% [18]
+ Điều kiện tối ưu để xác định đồng thời các vitamin B1, B2, B3, B5,B6 và B12 trong hỗn hợp: Khoảng bước sóng thích hợp để quét phổ từ 200 ÷400nm trên máy quang phổ UV – Vis DU 650I – SpectrophotometerBECKMAN (Mỹ), cứ 1nm đọc số liệu 1 lần, tốc độ quét 120nm/s, trong môitrường axit HCl 0,1M độ hấp thụ quang của các vitamin B1, B2, B3, B5, B6 vàB12 ổn định Kết quả thu được có độ lặp lại và độ dúng cao [18]
Năm 2011, tác giả Lê Ngọc Anh xác định thành công acetaminophen,loratadin và dextromethophan HBr trong thuốc viên nén hapacol-CF bằng phươngpháp trắc quang Điều kiện tối ưu để xác định đồng thời acetaminophen, loratadin
và dextromethophan HBr trong hỗn hợp: Khoảng bước sóng thích hợp để quétphổ từ 210-285 nm, bước sóng ứng với độ hấp thụ quang cực đại của dung dịchacetaminophen λmax=244 nm, loratadin λmax=273 nm và dextromethophan HBr
λmax=278nm; trong môi trường axit HCl 0,1M độ hấp thụ quang củaacetaminophen, loratadin và dextromethophan HBr ổn định và đạt cực đại;khoảng thời gian tối ưu để tiến hành thí nghiệm đo quang là 30 đến 60 phút sau
Trang 34khi pha và tại nhiệt độ 250C Kết quả thu được: xác định được LOD, LOQ vàkhoảng tuyến tính của acetaminophen: 1,3÷25 μg/mL, loratadin: 1,3÷80μg/mL, dextromethophan HBr: 0,6÷100 μg/mL Độ thu hồi của acetaminophen
từ 101,08% đến 102,08%; loratadin từ 92,9% đến 99,45%; dextromethophanHBr từ 99,78% đến 102,24% [1]
Năm 2012, tác giả Siladitya Behera và các cộng sự xác định thành côngacetaminophen thuốc viên nén sử dụng phương pháp UV-Vis Điều kiện tối ưu
để xác định acetaminophen: Khoảng bước sóng thích hợp để quét phổ từ
200-400 nm, bước sóng ứng với độ hấp thụ quang cực đại của dung dịchacetaminophen λmax = 243 nm Khoảng thời gian tối ưu để tiến hành thí nghiệm
đo quang là trong khoảng 8 giờ, ở nhiệt độ phòng Kết quả thu được: khoảngtuyến tính độ hấp thụ quang của acetaminophen là 0,00 đến 150,0 μg/mL, độthu hồi của acetaminophen từ 98,54% đến 99,13% [30]
Năm 2014, tác giả K.B Shalini và các cộng sự đã xác định thành côngloratadin dạng bào chế trong thuốc viên Điều kiện tối ưu để xác định loratadintrong thuốc: Khoảng bước sóng thích hợp để quét phổ từ 200-400 nm, bướcsóng ứng với độ hấp thụ quang cực đại của dung dịch loratadin λmax = 250 nm
sử dụng axetonitril làm dung môi Kết quả thu được: khoảng tuyến tính độ hấpthụ quang của loratadin 4-24 μg/mL với hệ số tương quan là 0,999; độ thu hồicủa loratadin từ 80% đến 120%, giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn địnhlượng (LOQ) tương ứng là 0,57 và 1,9 μg/mL [25]
- Năm 2014 tác giả Vũ Duy Long [8] đã nghiên cứu "định lượng đồng thờiparacetamol, clopheninamin maleat và phenylephin hydroclorit trong thuốcTIFFY bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và phương phápquang phổ hấp thụ phân tử (UV-Vis)"
+ Sử dụng phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử đã khảo sát, xácđịnh điều kiện tối ưu cho phép đo quang đối với các dung dịch hỗn hợpparacetamol, clopheninamin maleat và phenylephin hydroclorit, gồm có:
Trang 35khoảng bước sóng thích hợp để quét phổ từ 210-290 nm, paracetamol λmax =
244 nm, clopheninamin maleat λmax = 264 nm và phenylephin hydroclorit λmax
= 273 nm trong môi trường axit HCl 0,1M Khoảng thời gian tối ưu để tiếnhành thí nghiệm đo quang là từ 20 đến 90 phút sau khi pha và có thể tiếnhành thí nghiệm ở nhiệt độ phòng Khảo sát, xác định khoảng tuyến tính độhấp thụ quang của paracetamol là 0,2 đến 30,0 μg/mL; clopheninaminmaleat là từ 0,2 đến 40,0 μg/mL và phenylephin hydroclorit là từ 1,0 đến40,0 μg/mL
- Năm 2015, tác giả Trần Quốc Chính [2] đã nghiên cứu " Định lượng đồng thờiacetaminophen, codeine phosphate trong thuốc Actadol codeine bằng phươngpháp sắc kí lỏng hiệu năng cao và phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử”
+ Sử dụng phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử đã khảo sát, xác địnhđiều kiện tối ưu cho phép đo quang:acetaminophenλmax = 243 nm, CDI λmax =
210 nm trong môi trường axit HCl 0,1M Khoảng thời gian tối ưu để tiến hànhthí nghiệm đo quang là từ 30 đến 40 phút sau khi pha và có thể tiến hành thínghiệm ở nhiệt độ phòng Đã khảo sát, xác định khoảng tuyến tính độ hấpthụ quang của acetaminophen là 0,2 đến 30,0 μg/mL, CDI là từ 0,2 đến 30,0μg/mL Sử dụng phương pháp thêm chuẩn xác định acetaminophen và CDItrong mẫu thuốc Actadol codein với độ thu hồi của acetaminophen từ 99,3%đến 101% và của CDI là từ 98,5% đến 100,3%
- Năm 2015, tác giả Bùi Đức Ngọc [4] đã nghiên cứu "Định lượng đồng thờiparacetamol và cafein trong thuốc Panadol Extra và Hapacol Extra bằngphương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và phương pháp quang phổhấp thụ phân tử (UV-Vis)"
+ Sử dụng phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử đã khảo sát, xác địnhđiều kiện tối ưu cho phép đo quang: khoảng bước sóng thích hợp để quét phổ
từ 210-290 nm, PRC λmax = 243 nm, CFI λmax = 272 nm trong môi trường axit
Trang 36HCl 0,1M Khoảng thời gian tối ưu để tiến hành thí nghiệm đo quang là từ 30đến 40 phút sau khi pha và có thể tiến hành thí nghiệm ở nhiệt độ phòng Đãkhảo sát, xác định khoảng tuyến tính độ hấp thụ quang của PRC là 0,2 đến30,0 μg/mL, CFI là từ 0,2 đến 30,0 μg/mL.
1.4 Giới thiệu về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
- Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance LiquidChromatography-HPLC) ra đời năm 1967-1968, trên cơ sở phát triển và cải tiến
từ phương pháp sắc ký cột cổ điển Phương pháp này ngày càng phát triển vàhiện đại hóa cao do khoa học kĩ thuật phat triển
- Phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều lý do:có độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bayhơi hoặc dễ phân hủy nhiệt
- Phạm vi ứng dụng của phương pháp HPLC rất rộng, áp dụng nhiều trong cácngành kiểm nghiệm đặc biệt là ứng dụng cho ngành kiểm nghiệm thuốc: nhưphân tích thuốc kháng sinh, các hợp chất thuốc trừ sâu, các chất phụ gia thựcphẩm trong lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm, môi trường,…
1.4.1 Nguyên tắc của phương pháp HPLC
HPLC là một phương pháp chia tách hỗn hợp chất phân tích, trong đópha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn, đã được phân chiadưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao cho phép tách riêng rẽ mộthỗn hợp các chất có tính chất gần giống nhau là do ái lực hấp thu và giải hấpcủa các hợp phần có trong hỗn hợp phân tích với pha tĩnh và pha động làkhác nhau
Pha tĩnh
* Pha tĩnh là pha không di chuyển, thường nạp đầy trong cột sắc ký, có tác dụnglưu giữ chất phân tích Pha tĩnh là loại hạt rắn, xốp, kích thước hạt rất nhỏ cỡhạt từ 3-10 µm
Trang 37* Là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc kí và loại sắc kí:
+ Nếu pha tĩnh là chất trao đổi ion thì ta có sắc kí trao đổi ion
+ Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì ta có sắc kí phân bố hay sắc kí chiết.+ Nếu pha tĩnh là gel thì ta có sắc kí gel hay rây phân tử
+ Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có sắc kí hấp phụ pha thuận hoặc pha đảo
Trong sắc ký pha đảo, pha tĩnh là những hợp chất hữu cơ được gắn lên chất mang rắn silica hoặc cấu thành từ silica theo hai kiểu:
Sắc ký lỏng-lỏng: Pha tĩnh được giữ lại trên chất mang rắn bằng cơ chế hấp phụ vật lý
Sắc ký pha liên kết: Pha tĩnh liên kết hóa học với chất nền
Trong quá trình sử dụng sắc ký pha liên kết có nhiều ưu điểm hơn sắc ký pha lỏng-lỏng vì một số nguyên nhân sau:
+ Pha tĩnh trong hệ sắc ký lỏng-lỏng dễ bị hòa tan bởi pha động nên dễ bịhao hụt trong thời gian sử dụng và sẽ làm sai lệch kết quả chất phân tích
+ Do pha tĩnh của sắc ký lỏng-lỏng dễ tan trong pha động nên không thể ứng dụng phương pháp rửa giải gradient dung môi
Pha động
- Pha động có nhiệm vụ chuyển chất phân tích dọc theo cột sắc ký với tốc độthích hợp Chất phân tích bị lưu giữ trên pha tĩnh phụ thuộc vào ái lực củachúng đối với pha động
- Pha động trong sắc ký lỏng nói chung phải đạt những yêu cầu sau:
+ Hòa tan mẫu phân tích
+ Phù hợp với đầu dò
+ Không hòa tan hay làm mòn pha tĩnh
+ Có độ nhớt thấp để tránh áp suất dội lại cao
+ Tinh khiết dùng cho sắc ký
Trang 38- Trong sắc ký pha đảo, dung môi pha động có độ phân cực cao Trên lý thuyết có thể sử dụng khá nhiều dung môi nhưng kinh nghiệm thực tế cho thấy
metanol (MeOH), axetonitril (ACN) là đạt yêu cầu nhất
1.4.2 Các đại lượng đặc trưng của quá trình sắc ký
Có ba thông số gây ảnh hưởng lớn đến tách các pic sắc ký: số đĩa lýthuyết N, hệ số dung lượng K’, độ chọn lọc α Khi sự thay đổi thành phần phađộng không đem lại kết quả tách pic theo yêu cầu thì chúng ta phải thay đổi bảnchất pha động (sử dụng dung môi khác), tức thay đổi α
- Hệ số K tùy thuộc vào bản chất pha tĩnh, pha động và chất phân tích
Thời gian lưu
Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ khi bơm mẫu vào cột chođến khi chất đó ra khỏi cột đạt giá trị cực đại Thời gian lưu được tính theocông thức sau:
Trang 39Trong đó: W là chiều rộng pic ở đáy pic.
W1/2 là chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao của pic
- Ý nghĩa của số đĩa lý thuyết N
• N càng lớn khả năng tách càng tốt, các pic sắc ký càng hẹp và nhọn (tốt)
• N nhỏ khả năng tách kém, sẽ cho các pic tù và xấu (không tốt)
- Các yếu tố ảnh hưởng đến số đĩa lý thuyết
Kích thước hạt hấp phụ ( ): hạt càng nhỏ số đĩa lý thuyết càng lớn tuy nhiên hạt nhỏ quá sẽ dẫn đến áp suất khi phân tích tăng lên
Độ nhớt của pha động càng lớn N càng nhỏ
Nhiệt độ cột càng cao N càng lớn, tuy nhiên phải nằm trong giới hạn cho phép của cột
Trang 40Tốc độ pha động càng tăng N càng giảm và ngược lại, tuy nhiên với hạtnhồi có kích thước dưới 2µm sẽ không đáng kể (xem đường cong VanDeemter) và quá trình phân tích được đẩy nhanh.