Định lượng đồng thời paracetamol, ibuprofen, cafein trong thuốc Cadiltamol F, Bidiipalvic bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao và quang phổ hấp thụ phân tử (LV thạc sĩ)

Định lượng đồng thời paracetamol, ibuprofen, cafein trong thuốc Cadiltamol F, Bidiipalvic bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao và quang phổ hấp thụ phân tử (LV thạc sĩ)Định lượng đồng thời paracetamol, ibuprofen, cafein trong thuốc Cadiltamol F, Bidiipalvic bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao và quang phổ hấp thụ phân tử (LV thạc sĩ)Định lượng đồng thời paracetamol, ibuprofen, cafein trong thuốc Cadiltamol F, Bidiipalvic bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao và quang phổ hấp thụ phân tử (LV thạc sĩ)Định lượng đồng thời paracetamol, ibuprofen, cafein trong thuốc Cadiltamol F, Bidiipalvic bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao và quang phổ hấp thụ phân tử (LV thạc sĩ)Định lượng đồng thời paracetamol, ibuprofen, cafein trong thuốc Cadiltamol F, Bidiipalvic bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao và quang phổ hấp thụ phân tử (LV thạc sĩ)Định lượng đồng thời paracetamol, ibuprofen, cafein trong thuốc Cadiltamol F, Bidiipalvic bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao và quang phổ hấp thụ phân tử (LV thạc sĩ)Định lượng đồng thời paracetamol, ibuprofen, cafein trong thuốc Cadiltamol F, Bidiipalvic bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao và quang phổ hấp thụ phân tử (LV thạc sĩ)Định lượng đồng thời paracetamol, ibuprofen, cafein trong thuốc Cadiltamol F, Bidiipalvic bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao và quang phổ hấp thụ phân tử (LV thạc sĩ)Định lượng đồng thời paracetamol, ibuprofen, cafein trong thuốc Cadiltamol F, Bidiipalvic bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao và quang phổ hấp thụ phân tử (LV thạc sĩ)Định lượng đồng thời paracetamol, ibuprofen, cafein trong thuốc Cadiltamol F, Bidiipalvic bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao và quang phổ hấp thụ phân tử (LV thạc sĩ)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGUYỄN THỊ MAI DUNG

ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI PARACETAMOL, IBUPROFEN, CAFEIN

TRONG THUỐC CADILTAMOL F, BIDI-IPALVIC BẰNG

PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

VÀ QUANG PHỔ HẤP THỤ PHÂN TỬ

LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC

Ngành: Hóa phân tích

Mã số: 8 44 01 18

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Mai Xuân Trường

Thái Nguyên, năm 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này

là trung thực và chưa hề được sử dụng trong bất cứ một công trình nào

Tôi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận vănnày đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã đượcchỉ rõ nguồn gốc

Thái Nguyên, tháng 4 năm 2018

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Mai Dung

Xác nhận của Trưởng khoa chuyên môn

Xác nhận của giáo viên hướng dẫn

PGS.TS Nguyễn Thị Hiền Lan PGS.TS Mai Xuân Trường

ii

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập và thực hiện luận văn, tác giả đã nhận đượcnhiều sự quan tâm, động viên và giúp đỡ của các thầy giáo, cô giáo, bạn

bè và gia đình

Tác giả bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:

Khoa Hóa học, Phòng Đào tạo - Trường Đại học Sư phạm - Đại học TháiNguyên, các thầy cô giáo tham gia giảng dạy đã cung cấp những kiến thức giúptôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Đặc biệt tác giả xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo PGS.TS MaiXuân Trường người đã tận tình hướng dẫn chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quátrình nghiên cứu, thực hiện và hoàn thành luận văn này

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè nhữngngười đã luôn bên tôi, động viên và khuyến khích tôi trong quá trình thực hiện

đề tài nghiên cứu của mình

Với thời gian nghiên cứu có hạn, khối lượng công việc lớn, khả năngnghiên cứu còn hạn chế, chắc chắn luận văn không thể tránh khỏi những thiếusót Tác giả rất mong nhận được các ý kiến đóng góp từ các thầy giáo, cô giáo

và bạn đọc

Xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, tháng 04 năm 2018

Tác giả

Nguyễn Thị Mai Dung

Trang bìa phụ

Lời

cam đoan .i

Lời

cảm ơn .ii

Mục lục .iii

Danh mục các từ

viết tắt .iv

Danh mục bảngbiểu .v

Danh mục các hình .vi

paracetamol, ibuprofen, cafein 2

1.1.1 Parac etam ol

2

1.1.2 Ibupr ofen 4

iv

1.1.3 Caf

ein 6

1.1.4 Các

loại dượ

c phẩ

m chứ

a par ace tam

ol, ibu pro fen

và

caf ein 9

p qua

ng phổ hấp thụ phâ

n tử 91.2.2.Cá

c địn

h

luậ

t cơsởcủasựhấ

pthụánhsáng[10,14,17]91.2.3.Nhữn

g

nguyên

nhân

làm

cho

sự

hâ

v

ươ

ng phá

p lọcKalman111.3 Tổn

g phá

p quan

g ph

ổ hấ

p th

ụ phâ

1.4 Giới thiệu về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) .22

1.4.1 Nguy

ên tắc của phươ ng

pháp HPL C

22

1.4.2 Các đại lượn

g đặc trưng của quá trình sắc ký

24

1.4.3 Hệ thống máy HPL C.

26

vi

1.5 Tổng quan về phương pháp xác định đồng thời ba 3 thành phần theo phương

pháp HPLC 28

1.6 Các đại lượng đặc trưng để xử lý kết quả phân tích 34

1.6.1 Đánh giá độ tin cậy của quy trình phân tích 34

1.6.2 Các phương pháp để xử lý kết quả phân tích 36

Chương 2 THỰC NGHIỆM 38

2.1 Phương pháp nghiên cứu 38

2.1.1 Phương pháp nghiên cứu lý thuyết 38

2.1.2 Phương pháp thực nghiệm 38

2.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 38

2.2.1 Thiết bị 38

2.2.2 Dụng cụ 39

2.2.3 Hóa chất 39

2.3 Chuẩn bị các dung môi để hòa tan mẫu 40

2.3.1 Phương pháp HPLC 40

2.3.2 Phương pháp UV-Vis 40

2.4 Cách tiến hành 40

2.4.1. Xác định đồng thời ba chất theo phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử 40

2.4.2. Xác định đồng thời ba chất theo phương pháp HPLC 45

2.4.3. Đánh giá phương pháp định lượng 46

2.4.4. Xác định PRC, IBU và CFI trong thuốc Bidi-ipalvic và thuốc CaditamolF 48 2.4.5. Khảo sát độ đúng của phép xác định PRC, IBU và CFI theo phương pháp thêm chuẩn 49

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 51

3.1 Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử 51

3.1.1 Khảo sát phổ hấp thụ phân tử của PRC, IBU và CFI 51

iv

3.1.2 Khảo sát khoảng tuyến tính tuân theo định luật Bughe – Lambe– Bia của PRC, IBU và CFI Xác định chỉ số LOD và LOQ 523.1.3. Khảo sát và đánh giá độ tin cậy của phương pháp nghiên cứu

trên các mẫu tự pha 583.1.4 Xác định hàm lượng PRC, IBU và CFI trong thuốc BIDI-IPALVIC

và CADITAMOL-F 63 3.1.5 Khảo sát độ đúng của phép xác định PRC, IBU và CFI theo phương

pháp thêm chuẩn 653.2 Phương pháp HPLC 693.2.1 Xây dựng điều kiện tối ưu để xác định đồng thời paracetamol, ibuprofen

và cafein 693.2.2 Đánh giá phương pháp định lượng 723.2.3 Xác định PRC, IBU và CFI trong thuốc Bidi-ipalvic và thuốc CaditamolF

763.2.4 Khảo sát độ đúng của phép xác định PRC, IBU và CFI theo phương pháp

thêm chuẩn 78

KẾT LUẬN 81 TÀI LIỆU THAM KHẢO 83

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Mã giải phẫu – điều trị - hóa

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Trang

Bảng 2.1 Danh mục chất chuẩn của viện kiểm nghiệm thuốc 39

Bảng 2.2 Danh mục dung môi tinh khiết dùng cho HPLC 39

Bảng 3.1 Độ hấp thụ quang của PRC ở các giá trị nồng độ 53

Bảng 3.2 Kết quả xác định LOD và LOQ của PRC 54

Bảng 3.3 Độ hấp thụ quang của CFI ở các giá trị nồng độ 55

Bảng 3.4 Kết quả tính LOD và LOQ của CFI 56

Bảng 3.5 Độ hấp thụ quang của IBU ở các giá trị nồng độ 57

Bảng 3.6 Kết quả tính LOD và LOQ của IBU 58

Bảng 3.7 Pha chế các dung dịch hỗn hợp PRC và CFI 58

Bảng 3.8 Kết quả tính nồng độ, sai số của PRC, CFI 59

Bảng 3.9 Pha chế các dung dịch hỗn hợp PRC và IBU 60

Bảng 3.10 Kết quả tính nồng độ, sai số của PRC và IBU trong hỗn hợp 61

Bảng 3.11 Pha chế các dung dịch hỗn hợp CFI và IBU 61

Bảng 3.12 Kết quả tính nồng độ, sai số của CFI và IBU trong hỗn hợp 62

Bảng 3.13 Pha các dung dịch chuẩn PRC, IBU, CFI và hỗn hợp 62

Bảng 3.14 Kết quả tính nồng độ, sai số của PRC, IBU và CFI 63

Bảng 3.15 Kết quả tính nồng độ, sai số các PRC,CFI,IBU trong mẫu thuốc BIDI_IPALVIC 63

Bảng 3.16 Kết quả tính nồng độ, sai số các PRC,CFI,IBU trong mẫu thuốc CADITAMOL – F 64

Bảng 3.17 Thành phần các dung dịch chuẩn PRC, IBU và CFI thêm vào dung dịch mẫu thuốc Bidi-ipalvic 65

Bảng 3.18 Kết quả xác định độ thu hồi của PRC, IBU và CFI trong mẫu thuốc Bidi-ipalvic 66

Bảng 3.19 Thành phần các dung dịch chuẩn PRC, IBU và CFI thêm vào dung dịch mẫu thuốc Caditamol-F 67

Bảng 3.20 Kết quả xác định độ thu hồi của PRC, IBU và CFI trong mẫu thuốc Caditamol-F 68

Bảng 3.21 Giá trị các đại lượng đặc trưng 72

Bảng 3.22 Kết quả khảo sát thời gian lưu 72

Bảng 3.23 Kết quả khảo sát diện tích pic 72

Bảng 3.24 Mối tương quan giữa nồng độ và diện tích pic của PRC, IBU và CFI 73

Bảng 3.25 Kết quả khảo sát độ lặp lại 75

Bảng 3.26 Kết quả phân tích thuốc Bidi-ipalvic 76

Bảng 3.27 Kết quả phân tích thuốc Caditamol F 77

Bảng 3.28 Kết quả khảo sát độ đúng 78

Bảng 3.29 Kết quả khảo sát độ đúng 80

vi

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của paracetamol 2

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của ibupfofen 5

Hình 1.5: Mô hình hoạt động bộ lọc Kalman 12

Hình 3.1 Phổ hấp thụ của các dung dịch chuẩn của PRC(8µg/ml), IBU(10µg/ml) và CFI(8µg/ml) trong dung dịch HCl 0,1 M 51

Hình 3.2 Phổ hấp thụ quang của PRC ở các nồng độ 0,2÷ 40µg/mL 52

Hình 3.3 Đường hồi quy tuyến tính biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ quang A vào nồng độ của PRC 53

Hình 3.4 Phổ hấp thụ quang của CFI ở các nồng độ 0,2÷ 40,0µg/mL 54

Hình 3.5 Đường hồi quy tuyến tính biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ quang A vào nồng độ của CFI 55

Hình 3.6 Phổ hấp thụ quang của IBU ở các nồng độ 1,0 ÷ 40,0µg/mL 56

Hình 3.7 Đường hồi quy tuyến tính biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ quang A vào nồng độ của IBU 57

Hình 3.8 Sắc ký đồ của PRC 300 µg/mL tại bước sóng λ = 224 nm 70

Hình 3.9 Sắc ký đồ của CFI 200 µg/mL tại bước sóng λ = 224 nm 70

Hình 3.10 Sắc ký đồ của IBU 100 µg/mL tại bước sóng λ = 224 nm 70

Hình 3.11 Sắc ký đồ của PRC 300 µg/mL (1), CFI 200 µg/mL (2) và IBU 100 µg/mL (3) 71

Hình 3.12 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của PRC 74

Hình 3.13 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của IBU 74

Hình 3.14 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của CFI 74

vi

MỞ ĐẦU

Với sự phát triển của khoa học và công nghệ thì ngành dược học là mộtngành đang phát triển hiện nay Có rất nhiều loại thuốc của các công ty dượcphẩm được đưa ra thị trường Mà chất lượng thuốc có ảnh hưởng trực tiếp đếnsức khỏe của con người Vì vậy vấn đề xác định đúng chất lượng của thuốcxem có đúng theo tiêu chuẩn của nhà sản xuất hay không là rất quan trọng vàngày càng được xã hội quan tâm

Có rất nhiều phương pháp đã được áp dụng trên thế giới cũng như tạiViệt Nam để xác định hàm lượng của thuốc Trong đó có hai phương pháp hayđược sử dụng đó là:

Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) và phương pháp quang

phổ hấp thụ phân tử (UV-Vis) kết hợp với kĩ thuật tính toán là hai phương

pháp cho kết quả chính xác, độ tin cậy cao, nhanh

Xuất phát từ những lí do trên chúng tôi chọn đề tài: “Định lượng đồng

thời paracetamol, ibuprofen, cafein trong thuốc Cadiltamol F, Bidi-ipalvic bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao và quang phổ hấp thụ phân tử”.

13

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về ba chất paracetamol, ibuprofen, cafein

1.1.1 Paracetamol

1.1.1.1 Giới thiệu chung[1,2,4,8]

- Tên biệt dược: Acetaminophen (tên khác: Paracetamol) Ký hiệu PRC.

- Công thức phân tử: C8H9O2N

- Khối lượng mol phân tử: 151,17 g/mol

- Công thức cấu tạo:

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của paracetamol

- Danh pháp IUPAC: N-(4-hydroxyphenyl)acetamit hoặc p-hydroxy acetanilit hoặc 4-hydroxy acetanilit

Tên gọi paracetamol được lấy từ tên hóa học của hợp chất para-

- Khối lượng riêng: 1,263 g/cm 3

- Nhiệt độ nóng chảy: 169 0 C

- Chế phẩm tan ít trong nước, tan nhiều hơn trong nước sôi, khó tan trongclorofom,ete và các dung dịch kiềm…Dung dịch bão hòa trong nước có pHkhoảng 5,6-5,6.

- Nhóm -OH làm cho chế phẩm có tính axit và khi tác dụng với dung dịch muối sắt (III) cho màu tím

- Đun nóng với dung dịch HCl thì bị thủy phân Thêm thuốc thử kali dicromat thìcó kết tủa màu tím

1.1.1.3 Một số loại chế phẩm chứa PRC tại Việt Nam[1,2,3,4,8]

- Chế phẩm viên nén: Paracetamol,Tiffy, Panadol Extra, Decogen

Forte…

- Chế phẩm viên sủi: Efferalgan, Coldko, Happcol codein, Panadol 500mg…

- Chế phẩm gói bột: Efferalgan 80 mg, Hapacol Kids

- Chế phẩm dạng dung dịch uống

- Chế phẩm dạng bột tiêm: Pro-Dafalgan 2g propracetamol

- Các chế phẩm kết hợp với các thuốc khác

1.1.1.4 Định lượng paracetamol theo dược điển Việt Nam IV[1]

* Định lượng viên nén paracetamol

Cân 20 viên, tính khối lượng trung bình viên và nghiền thành bột mịn.Cân chính xác một lượng bột viên tương ứng khoảng 0,15 g paracetamol vàobình định mức 200 ml, thêm 50 ml dung dịch natri hydroxyd 0,1 M (TT) và

100 ml nước, lắc 15 phút, thêm nước đến định mức Lắc đều, lọc qua giấy lọckhô, bỏ 20 ml dịch lọc đầu

Lấy chính xác 10 ml dịch lọc cho vào bình định mức 100 ml Thêm nướcvừa đủ đến vạch, lắc đều Lấy chính xác 10 ml dung dịch trên cho vào bình địnhmức 100 ml, thêm 10 ml dung dịch natri hydroxyd 0,1 M (TT), thêm nước đếnđịnh mức, lắc đều Đo độ hấp thụ (Phụ lục 4.1) của dung dịch thu được ở bướcsóng 257 nm, dùng cốc dày 1 cm Mẫu trắng là dung dịch natri hydroxyd 0,01 M(TT)

Tính hàm lượng paracetamol, C8H9NO2 theo A (1 %, 1 cm) Lấy 715 làgiá trị A (1 %, 1 cm) ở bước sóng 257 nm

* Định lượng paracetamol bằng phương pháp HPLC sử dụng:

- Pha động: Hỗn hợp gồm 375 thể tích dung dịch dinatri hydrophotphat 1,79%, 375thể tích dung dịch natri dihydrophotphat 0.78% và 250 thể tích metanol có chứa0,46% của dung dịch tetra-butylamoni hydroxid 40%

- Cột pha tĩnh: Cột thép không gỉ, 250 mm x 4,6 mm, 5 µm

- Dectector UV, bước sóng hấp thụ 245 nm

- Tốc độ dòng 1,5 mL/phút

- Nhiệt độ cột: 350C

- Thể tích tiêm mẫu 20µL

1.1.2 Ibuprofen

1.1.2.1 Giới thiệu chung[1,13,29]

- Tên quốc tế: Ibuprofen

- Một số tên khác: Advil, Genpril,Ibu-200, Midol, Motrin, Nuprin

- Công thức phân tử: C13H18O2

- Công thức cấu tạo:

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của ibupfofen

C13H18O2

- Khối lượng mol phân tử: M=206,28g/mol

-Tên IUPAC: axit-2-[4-(2-metyl propyl) phenyl] propanoic (hay acid

(RS)-2-(4-isobutylphenyl) propionic )

1.1.2.2 Tính chất[1,3,13,29]

* Tính chất vật lí:

- Ibuprofen là chất bột kết tinh màu trắng hoặc tinh thể không màu

- Nhiệt độ nóng chảy:760C

- Thực tế không tan trong nước, dễ tan trong axeton, diclorometan, metanol và ether Tan trong các dung dịch hydroxyd kiềm loãng và cacbonat kiềm,tan trong các dung dịch kiềm và cacbonat kiềm(do nhóm chức axit), tan trong axit

1.1.2.3 Một số loại chế phẩm chứa ibuprofen[1,3]

Dung dịch thử: Cân 20 viên (đã được loại bỏ lớp bao, nếu cần) tính khốilượng trung bình viên, nghiền thành bột mịn Cân chính xác một lượng bột viêntương ứng với khoảng 0,2 g ibuprofen, thêm 60 ml pha động, lắc trong 20 phút,thêm pha động vừa đủ 100,0 ml và trộn đều Lọc hoặc li tâm

Tiến hành sắc ký lần lượt với dung dịch chuẩn và dung dịch thử.

Tính hàm lượng ibuprofen, C13H18O2, dựa vào diện tích pic trên sắc ký đồcủa dung dịch chuẩn, dung dịch thử và hàm lượng C13H18O2 trong ibuprofenchuẩn

1.1.3 Cafein

1.1.3.1 Giới thiệu chung[1,3,4,19]

- Tên quốc tế: Cafein Ký hiệu CFI

- Tên IUPAC: l,3,7 – trimethylxanthin

- Công thức phân tử: C8H10N4O2

- Khối lượng mol phân tử: 194,19 g/mol

- Công thức cấu tạo:

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của cafein

1.1.3.2 Tính chất[1,3,4,19]

* Tính chất vật lý

- Cafein là chất rắn kết tinh dạng tinh thể màu trắng, không màu, không mùi, có

vị đắng nhẹ

- Cafein tan ít trong nước, dễ tan trong nước sôi và clorofom, các dung dịch axit,dung dịch đậm đặc của benzoat hay salixylat kiềm Tan một phần trong etanol, íttan trong nước lạnh (1lít nước lạnh hòa tan được 20 gam cafein).

- Nhiệt độ nóng chảy: khoảng 234 0 C-239oC

- Chế phẩm viên sủi: Biragan Extra

- Chế phẩm bôi ngoài da: Coje xi-ro và percutafeine-Gel

- Chế phẩm dạng bột tiêm: Cafein dung dịch tiêm

- Các chế phẩm kết hợp với các thuốc khác

1.1.3.4 Định lượng cafein [1,4,19]

* Định lượng cafein

Cân chính xác khoảng 150 mg chế phẩm đã làm khô Hòa tan trong 15

ml anhydrid acetic (TT) và 20 ml benzen (TT) Cho thêm vài giọt dung dịchtím tinh thể (TT) Chuẩn độ bằng dung dịch acid percloric 0,1 N (CĐ) cho đếnkhi dung dịch chuyển sang màu vàng Có thể xác định điểm kết thúc bằngphương pháp chuẩn độ đo điện thế 1 ml dung dịch acid percloric 0,1 N (CĐ)tương đương với 19,42 mg C8H10N4O2

* Định lượng paracetamol và cafein trong thuốc viên nén pracetamol và cafein bằng phương pháp HPLC.

Hỗn hợp dung môi: Methanol - acid acetic băng (95 : 5)

Dung dịch chuẩn gốc: Hòa tan chính xác một lượng paracetamol chuẩn

và cafein chuẩn trong hỗn hợp dung môi để thu được dung dịch có nồng độ0,25 mg/ml của paracetamol và 0,25J mg/ml của cafein, J là tỷ lệ lượng ghi trênnhãn của cafein và lượng ghi trên nhãn của paracetamol trong viên

Dung dịch chuẩn: Hút chính xác 20,0 ml dung dịch chuẩn gốc và 3,0 mldung dịch chuẩn nội vào bình định mức 50 ml, pha loãng bằng hỗn hợp dungmôi đến định mức, trộn đều Dung dịch thu được có nồng độ paracetamolkhoảng 0,1 mg/ml và nồng độ cafein khoảng 0,1J mg/ml

Dung dịch thử: Cân 20 viên, tính khối lượng trung bình viên, nghiền thànhbột mịn Cân chính xác một lượng bột viên tương ứng khoảng 250 mgparacetamol vào bình định mức 100 ml, thêm khoảng 75 ml hỗn hợp dung môi,lắc trên máy lắc 30 phút Pha loãng bằng hỗn hợp dung môi đến định mức, trộnđều Hút chính xác 2,0 ml dung dịch này và 3,0 ml dung dịch chuẩn nội vào bìnhđịnh mức 50 ml, pha loãng bằng hỗn hợp dung môi đến định mức, trộn đều

Điều kiện sắc ký:

Cột thép không gỉ (10 cm × 4,6 mm) được nhồi pha tĩnh C (5 µm)

Nhiệt độ cột: 45 °C ± 1 °C

Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 275 nm

Tốc độ dòng: 2 ml/min

Thể tích tiêm: 10 µl

1.1.4 Các loại dược phẩm chứa paracetamol, ibuprofen và cafein

- Danh mục thuốc có chứa paracetamol: Alaxan, Decolgen Forte,

Hapacol Kids, Tiffy,…

- Danh mục thuốc có chứa paracetamol và cafein: Hapacol Extra, Panadol Extra, thuốc thần kinh D3,…

- Danh mục thuốc có chứa paracetamol và ibuprofen: Alaxan, protamol,

Andolxan, Tatanol Extra…

- Thuốc có chứa paracetamol,ibuprofen, và cafein: thuốc Bidi-Ipalvic, Caditamol

F, Dimitalgin, ibuacetalvic, ibuparavic…

1.2 Giới thiệu về phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử

1.2.1 Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử

Nguyên tắc: Dựa trên phép đo lượng ánh sáng do phân tử chất phân tích hấp thụ.[10,14]

1.2.2 Các định luật cơ sở của sự hấp thụ ánh sáng[10,14,17]

Định luật hợp nhất Bughe – Lambe – Bia

- Nội dung định luật:

Khi chiếu một chùm tia sáng có năng lượng nhất định vào một dungdịch chứa cấu tử hấp thụ ánh sáng thì cấu tử đó sẽ hấp thụ chọn lọc một số tiasáng

Độ hấp thụ quang của cấu tử tỷ lệ thuận với nồng độ của chất trong dungdịch và bề dày lớp dung dịch mà ánh sáng truyền qua

- Phương trình toán học biểu diễn định luật Bughe – Lambe – Bia:

A: Độ hấp thụ quang của chất phân tích

ε : là hệ số hấp thụ mol phân tử, đơn vị L.mol-1.cm-1 b: là bề dày của dung dịch, đơn vị cm

C: nồng độ của dung dịch màu, đơn vị mol/L

Định luật cộng tính

- Nội dung định luật cộng tính: Ở một bước sóng đã cho độ hấp thụ quang củamột hỗn hợp các cấu tử không tương tác hóa học với nhau bằng tổng độ hấp thụquang của các cấu tử riêng biệt ở cùng bước sóng này

- Phương trình toán học biểu diễn định luật cộng tính

Aλ =A1,λ +A2,λ + +Ai,λ + +An,λ =

A i, λ: độ hấp thụ ánh sáng của cấu tử thứ i ở bước sóng λ; n là số cấu

tử hấp thụ ánh sáng có trong hỗn hợp; với i = 1 ÷ n

Từ (1.1) có thể viết lại phương trình (1.2) như sau:

Aλ = ε1,λ .b.C1 +ε2,λ .b.C2 + +εn,λ .b.Cn = ∑ εi,λ.b.Ci

1.2.3 Những nguyên nhân làm cho sự hấp thụ ánh sáng của dung dịch không

tuân theo định luật Bughe-Lămbe-Bia[10,14]

Từ biểu thức của định luật Bughe-Lămbe-Bia A = f(b,c) nghĩa là độ hấpthụ quang A là hàm số của ba biến Do đó mọi sự sai lệch của các tham số này

đều có thể đưa đến làm sai lệch quy luật hấp thụ quang, gây sai số cho phép

đo độ hấp thụ quang của chất, bao gồm:

- Chùm sáng chiếu qua dung dịch không hoàn toàn đơn sắc

- Các điều kiện đo quang như: bề dày cuvet, độ trong suốt của bề mặt cuvetkhông thật đồng nhất, bề mặt cuvet gây các hiện tượng quang học phụ như tán

xạ hấp thụ …

- Sự có mặt của các chất điện giải lạ trong dung dịch màu làm biến dạng cácphần tử hoặc các ion phúc màu làm ảnh hưởng đến sự hấp thụ ánh sáng của cactiểu phân hấp thụ ánh sáng

- Hiệu ứng solvat hóa ( hay hidrat hóa) làm giảm nồng độ các phần tử dung môi

tự do, do đó làm thay đổi nồng độ của dung dịch màu và làm ảnh hưởng đến sựhấp thụ ánh sáng của dung dịch màu

- Hiệu ứng liên hợp: Trong một số trường hợp có sự tương tác của chính các tiểuphân hấp thụ ánh sáng để tạo ra các tiểu phân polime làm thay đổi nồng độ hợpchất màu

- Ảnh hưởng pH của dung dịch: Sự thay đổi nồng độ của ion H+( tức sự thay đổipH) của dung dịch sẽ ảnh hưởng đến sự tuân theo định luật Bughe- Lămbe-Biatheo các trường hợp sau:

+ Thuốc thử có đặc tính axit: Nồng độ ion H+ thay đổi làm chuyển dịchcân bằng tạo thành chất màu

+ Thay đổi pH đẫn đến thay đổi thành phần hợp chất màu

+ pH tăng làm phức màu có thể bị phân hủy do sự tạo thành phứchiđroxo

+ Ion H+ làm trạng thái tồn tại và màu của dunng dịch cũng thay đổi

- Ảnh hưởng của sự pha loãng dung dịch phức màu

- Nhiệt độ môi trường và dung dịch đo phổ trong Cuvet là không hằng định trongsuốt thời gian đo

1.2.4 Phương pháp lọc Kalman

1.2.4.1 Phương pháp lọc Kalman [5,6]

- Trong phân tích trắc quang, khi tiến hành đo phổ hấp thụ quang phân tử, vì các nguyên nhân khác nhau mà một số kết quả đo thực tế luôn khác so với

giá trị lí thuyết, người ta luôn mong muốn có một phổ càng gần với phổ lí thuyết càng tốt (sai số nhỏ nhất).

- Thuật toán lọc Kalman hoạt động trên cơ sở các file dữ liệu phổ đã ghi đượccủa từng cấu tử riêng rẽ và của hỗn hợp các cấu tử, xác định sự đóng góp vềphổ của từng cấu tử trong hỗn hợp tại các bước sóng Khi chương trình chạynhững kết quả tính toán liên tiếp sẽ càng tiến gần đến giá trị thực.Trong thực tế,người ta sử dụng phương pháp bình phương tối thiểu để giảm sai số giữa phổcủa hỗn hợp với phổ nhân tạo được tiên đoán bởi các xấp xỉ Kalman

- Kết quả tính toán là lý tưởng khi phổ của hỗn hợp trừ đi phổ nhân tạo được tínhbởi lọc Kalman sẽ tạo ra một đường thẳng có độ lệch không đáng kể

- Độ đúng của phép xác định phụ thuộc vào độ nhiễu của nền, vào việc tách cácđỉnh phổ hấp thụ của các cấu tử và sự tương tác giữa các cấu tử Hỗn hợp cócàng ít cấu tử, các đỉnh hấp thụ càng cách xa nhau thì sai số của phép tính toán

sẽ càng nhỏ

- Việc tính toán sẽ được thực hiện trên toàn bộ khoảng bước sóng được chọn Nếukết thúc quá trình tính toán, độ lệch chuẩn tương đối của giá trị nồng độ các cấu tửtrong hỗn hợp vẫn lớn hơn giá trị sai số cho phép thì nồng độ của cấu tử đó sẽphải xác định lại Trong trường hợp đó, cần phải tăng giá trị sai số mặc định hoặcgiảm số giá trị nồng độ mặc định để tính giá trị nồng độ trung bình

- Một số tác giả đã sử dụng thuật toán lọc Kalman để xác định các cấu tử tronghỗn hợp bằng phương pháp trắc quang Kết quả cho thấy sai số của phép xácđịnh với hỗn hợp 2 cấu tử nhỏ hơn 1%, với hỗn hợp 3 cấu tử có sai số nhỏhơn 2%

Hình 1.5: Mô hình hoạt động bộ lọc Kalman

1.2.4.2 Cơ sở lí thuyết của thuật toán [5,6]

* Đơn giản nhất xét lọc Kalman 1 chiều (dung dịch chỉ có 1 cấu tử)

Giả sử có cấu tử i, giá trị độ hấp thụ quang của cấu tử i ở bước sóng λ tuântheo phương trình (1.1) Vì chưa biết giá trị nồng độ thực Ci nên ta cần ướcđoán giá trị của Ci từ giá trị Ci đã biết trước đó

Xét ở bước sóng khởi điểm λ0

Giá trị trung bình của nồng độ C được xác định bằng biểu thức:

Trong đó:

Ci là giá trị nồng độ tính được của cấu tử i

µ là giá trị nồng độ thực của cấu tử i

E là toán tử kỳ vọng (giá trị trung bình)

n là số lần xác định giá trị nồng độ

Cũng như các phương pháp giải lặp khác, vì ban đầu ta không thể biếtchính xác µ và chưa có giá trị nồng độ Ci là ước đoán (được cho là) tốt nhất củachúng ta về giá trị nồng độ (C) (giả sử Ce = 1,0000)

Phương sai của phép xác định được tính theo công thức:

k i=1 k i=1

Trong đó: k là số bậc tự do của phép xác định nồng độ.

Giả sử P = 0,0400

Xét ở bước sóng λ1:

Phương trình (1.4) khi viết ở bước sóng λ1 có dạng:

Ai( λ 1) = F Ci( λ 0) + u( λ 0) (1.7)Theo đó ước đoán của ta tốt nhất về Ci( λ 1) là:

Phương sai trong ước đoán này xác định từ (1.6) là:

P = 1 (C -C ) = E [ Ci(λ1) – Ce-New) 2] (1.9)

New k i=1 i(l1 ) e-New

Với E là toán tử kỳ vọng Thay thế biểu thức của C i( λ 1) ở (1.7) và Ce -New ở (1.8) và (1.9) ta sẽ được:

P New = E [ F.Ci( λ 0) + u – F.Ce) 2 ] =

= E [ F 2 (Ci( λ 0) – Ce ) 2 ] + E [ u 2 ] + E.[ 2F(Ci( λ 0) - C e) u ] (1.10)Vì u giả định là không có tương quan gì với C i( λ 0) và Ce (u = 0) nên số hạng E.[2F(Ci( λ 0) - Ce) u] = 0 Thay thế P từ (1.6) và (1.8) vào (1.10) ta được:

Trong đó:

Q = [ u2 ] là phương sai của u

Với ví dụ của chúng ta thì PNew = 0,0400.0,81 + 0,0001 = 0,0325

Bây giờ chúng ta hãy giả thiết việc xác định nồng độ C ở bước sóng λ1 có

“nhiễu đo” Gọi giá trị nồng độ ở bước sóng λ1 là x(λ1) Giả sử x(λ1) liên hệ tuyếntính với C (trường hợp đơn giản nhất)

x( λ 1) = M.C( λ 1) + w(1) (1.12)Trong đó:

w là nhiễu trắng của phương sai “R”

M là hằng số đã biết Ví dụ: M = 1, R = 0,0100 và x(λ1) = 1,2000

Nếu muốn đoán x(λ1) trước khi có giá trị đo thì phải dùng: xe = M.Ce-New với

ví dụ đang xét giá trị ước đoán x(λ1) = 0.900

Theo Kalman giá trị ước đoán tốt nhất của Ci(λ1) là:

Ce-New-New = Ce-New + K.( x(λ1) - M.Ce-New) (1.13)Trong đó: K là một số được gọi là lợi Kalman x(λ1) - xe là sai số trong việcước đoán x(λ1) Với ví dụ trên là 1,2000 – 0,9000 = +0,3000, một phần là donhiễu đo w và một phần do sai số trong việc ước đoán x(λ1) từ (1.12) Nếu tất cảsai số là do việc ước đoán x(λ1) thì rõ ràng là ta đã ước đoán Ce-New thấp hơn0,3000 Đặt K = 1 ta có thể hiệu chỉnh đủ sai số này Nhưng vì một phần sai số

do nhiễu đo w, nên để hiệu chỉnh cho Ce-New-New phải nhỏ hơn 0,3000 thì K sẽ cógiá trị nhỏ hơn 1

Vấn đề đặt ra là giá trị nào của K sẽ được sử dụng? Trước khi quyết định,chúng ta hãy tính phương sai mới kế tiếp:

E[C i( λ 1)-Ce-New-New) 2] = E [{(Ci( λ 1)- Ce-New- K.(x( λ 1) - M.Ce-New)}2 ]

= E [{(Ci( λ 1)- Ce-New- K.( M.C + w - M.Ce-New)} 2 ]

= E [{(1- KM)( C i( λ 1) – Ce-New)- Kw}2 ]

= E [(Ci( λ 1)- Ce-New)2 (1- KM)2 +Kw2 – 2Kw(Ci( λ 1)- Ce-New)(1-KM)]

= P New.(1- KM)2 + RK2 (1.14)Trong đó: R = E[w2] và số hạng thứ ba (Kw2) biến mất vì w được giả định

là không tương quan với nồng độ C và Ce-New Giá trị mới của phương sai bây giờđược xác định bởi:

P New-New = PNew.(1- KM)2 + RK2 (1.15)Nếu muốn cực tiểu hóa sai số ước đoán thì phải cực tiểu hóa PNew-New tức

là đạo hàm PNew-New theo K và cho bằng 0 để tìm K Lúc đó:

2 newVới ví dụ trên K = 0,7647; Pe-New-New = 0,001129 và PNew-New = 0,007647 Cóthể thấy ngay rằng phương sai của ước đoán đang giảm đi (P1 = 0,0400; P2=0,0325; P3 = 0,007647; P4 = 0,001129)

Như vậy ta có 5 phương trình của phép lọc Kalman như sau:

PNew-New = PNew.(1 – KM)2 + RK2 (1.21)

Ở bước sóng λ2, chúng ta lại bắt đầu sử dụng Ce-New làm giá trị ước đoáncủa Ce để đưa vào (1.17), sử dụng PNew-New như là giá trị của P trong (1.18) sauđó tính K từ (1.20) và dùng giá trị K mới tính được cùng giá trị x(λ2) trong(1.19) để nhận được một ước đoán mới về C, sau đó lại dùng (1.21) để tínhđược P tương ứng Quá trình được lặp đi lặp lại như thế cho đến bước sóngcuối cùng

* Xét lọc Kalman n chiều (hỗn hợp có n cấu tử).

Xét hỗn hợp có n cấu tử có nồng độ trong hỗn hợp lần lượt là

C = (C1, C2,C3, …, Cn) Giá trị nồng độ tính được bước sóng λ lần lượt là (C1(λ),

C2(λ),C3(λ), …, Cn(λ)) Gọi giá trị kỳ vọng (trung bình thống kê) của Ci(λ) là Ei(λ) thì

ECλ là véc tơ có các phần tử e1(λ), e2(λ),e3(λ), …, en(λ) Thường ta quan tâm đến cácvéc tơ có giá trị trung bình bằng 0 (ECλ = 0)

Gọi chuyển vị của C là CT Giả sử có giá trị trung bình thống kê bằng 0.Tích của C và CT là một ma trận bậc nxn

+ R

M P

+ R

M P

Đặt P = ECCT được gọi là ma trận hiệp biến (ma trận hiệp phương sai) của

C Phần tử thứ i, j của P là Pij(λ) = ECi(λ).Cj(λ)

Ở đây các phần tử nằm trên đường chéo chính của P là phương sai của Ci.Các phần tử nằm ngoài đường chéo chính là các hiệp biến Hiệp biến Pij có liênquan đến hệ số tương quan giữa Ci và Cj

Nếu hỗn hợp có n cấu tử thì về cơ bản các phương trình lọc Kalman vẫngiữ như trường hợp lọc 1 chiều, điều khác biệt ở đây là:

+ Thay cho các đại lượng vô hướng là các véc tơ, thay cho các véc tơ là các ma trận

+ Thay cho bình phương của một đại lượng vô hướng ta có tích ma trận chuyển vị T của nó

Ký hiệu (λ/λ-1) tương đương với New (λ/λ) tương đương với New-New

và (λ-1/λ-1) tương đương với giá trị ban đầu của đại lượng tương ứng

Các giá trị nồng độ C ở bước sóng đo (λ):

C(λ) = F(λ,λ-1).C(λ-1) + W(λ) (1.22)Trong đó:

Trong đó: A(λ) là độ hấp thụ quang tại bước sóng λ của mẫu phân tích

HT(λ) là hàm mô tả mối liên hệ giữa các tham số nồng độ với kết quả đo quang.V(λ) là nhiễu đo Đây chính là mô hình tuyến tính biểu diễn bởi định luậtBughe - Lămbe – Bia

Lọc Kalman giải bài toán ước đoán các tham số trạng thái bằng một dãy các phương trình đệ quy:

Ngoại suy ước đoán nồng độ của các cấu tử:

C(λ/λ-1) = F(λ,λ-1).C(λ-1/λ-1) (1.24)Ngoại suy ước đoán hiệp biến sai số:

P(λ/λ-1) = F(λ,λ-1).P(λ-1/λ-1).FT(λ,λ-1) + Q(λ-1) (1.25)Lợi Kalman:

P(λ/λ) = [I – K(λ).HT(λ)].P(λ/λ-1) (1.28)Trong đó:

K(λ) trọng số lợi Kalman

Q(λ) hiệp biến sai số hệ thống R(λ) biến nhiễu đo

T chuyển vị ma trận V(λ) nhiễu đoW(λ) nhiễu hệ thống

P(λ/j) dự đoán hiệp biến sai số của nồng độ các cấu tử ở bước sóng λ,

dựa vào các giá trị độ hấp thụ quang đo được ở j bước sóng: A(1) A(j)

Tiến hành lập trình theo các công thức (1.24) đến (1.28) ta thu được

chương trình xác định đồng thời các cấu tử theo phương pháp lọc Kalman

1.3 Tổng quan về phương pháp xác định đồng thời 3 thành phần theo phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử

Phương pháp UV - Vis được ứng dụng nhiều trong phân tích các chếphẩm về dược cũng như hỗn hợp các chất vô cơ, hữu cơ Các kết quả đều chothấy phương pháp nhanh và dễ thực hiện

Kết quả xác định một số chất theo phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử:

Năm 2008, tác giả Mai Xuân Trường đã nghiên cứu phương pháp hấp thụquang phân tử xác định đồng thời các chất có phổ hấp thụ xen phủ nhau dựatrên thuật toán lọc Kalman:

+ Điều kiện tối ưu để xác định đồng thời paraxetamol và ibuprofen tronghỗn hợp: Khoảng bước sóng thích hợp để quét phổ từ 200 ÷ 300nm, bước sóngứng với độ hấp thụ quang cực đại của dung dịch paraxetamol λmax=244nm,ibuprofen λmax=222nm, trong môi trường đệm photphat pH = 7 độ hấp thụquang của paraxetamol và ibuprofen ổn định và đạt cực đại Kết quả thu được:khoảng nồng độ tuyến tính của paraxetamol 2÷14μg/mL; ibuprofen4÷18μg/mL Độ thu hồi của paraxetamol từ 98,30% đến 102,53% và ibuprofen

từ 96,98% đến 102,49% [18]

+ Điều kiện tối ưu để xác định đồng thời các vitamin B1, B2, B3, B5,B6 và B12 trong hỗn hợp: Khoảng bước sóng thích hợp để quét phổ từ 200 ÷400nm trên máy quang phổ UV – Vis DU 650I – SpectrophotometerBECKMAN (Mỹ), cứ 1nm đọc số liệu 1 lần, tốc độ quét 120nm/s, trong môitrường axit HCl 0,1M độ hấp thụ quang của các vitamin B1, B2, B3, B5, B6 vàB12 ổn định Kết quả thu được có độ lặp lại và độ dúng cao [18]

Năm 2011, tác giả Lê Ngọc Anh xác định thành công acetaminophen,loratadin và dextromethophan HBr trong thuốc viên nén hapacol-CF bằng phươngpháp trắc quang Điều kiện tối ưu để xác định đồng thời acetaminophen, loratadin

và dextromethophan HBr trong hỗn hợp: Khoảng bước sóng thích hợp để quétphổ từ 210-285 nm, bước sóng ứng với độ hấp thụ quang cực đại của dung dịchacetaminophen λmax=244 nm, loratadin λmax=273 nm và dextromethophan HBr

λmax=278nm; trong môi trường axit HCl 0,1M độ hấp thụ quang củaacetaminophen, loratadin và dextromethophan HBr ổn định và đạt cực đại;khoảng thời gian tối ưu để tiến hành thí nghiệm đo quang là 30 đến 60 phút sau

khi pha và tại nhiệt độ 250C Kết quả thu được: xác định được LOD, LOQ vàkhoảng tuyến tính của acetaminophen: 1,3÷25 μg/mL, loratadin: 1,3÷80μg/mL, dextromethophan HBr: 0,6÷100 μg/mL Độ thu hồi của acetaminophen

từ 101,08% đến 102,08%; loratadin từ 92,9% đến 99,45%; dextromethophanHBr từ 99,78% đến 102,24% [1]

Năm 2012, tác giả Siladitya Behera và các cộng sự xác định thành côngacetaminophen thuốc viên nén sử dụng phương pháp UV-Vis Điều kiện tối ưu

để xác định acetaminophen: Khoảng bước sóng thích hợp để quét phổ từ

200-400 nm, bước sóng ứng với độ hấp thụ quang cực đại của dung dịchacetaminophen λmax = 243 nm Khoảng thời gian tối ưu để tiến hành thí nghiệm

đo quang là trong khoảng 8 giờ, ở nhiệt độ phòng Kết quả thu được: khoảngtuyến tính độ hấp thụ quang của acetaminophen là 0,00 đến 150,0 μg/mL, độthu hồi của acetaminophen từ 98,54% đến 99,13% [30]

Năm 2014, tác giả K.B Shalini và các cộng sự đã xác định thành côngloratadin dạng bào chế trong thuốc viên Điều kiện tối ưu để xác định loratadintrong thuốc: Khoảng bước sóng thích hợp để quét phổ từ 200-400 nm, bướcsóng ứng với độ hấp thụ quang cực đại của dung dịch loratadin λmax = 250 nm

sử dụng axetonitril làm dung môi Kết quả thu được: khoảng tuyến tính độ hấpthụ quang của loratadin 4-24 μg/mL với hệ số tương quan là 0,999; độ thu hồicủa loratadin từ 80% đến 120%, giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn địnhlượng (LOQ) tương ứng là 0,57 và 1,9 μg/mL [25]

- Năm 2014 tác giả Vũ Duy Long [8] đã nghiên cứu "định lượng đồng thờiparacetamol, clopheninamin maleat và phenylephin hydroclorit trong thuốcTIFFY bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và phương phápquang phổ hấp thụ phân tử (UV-Vis)"

+ Sử dụng phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử đã khảo sát, xácđịnh điều kiện tối ưu cho phép đo quang đối với các dung dịch hỗn hợpparacetamol, clopheninamin maleat và phenylephin hydroclorit, gồm có:

khoảng bước sóng thích hợp để quét phổ từ 210-290 nm, paracetamol λmax =

244 nm, clopheninamin maleat λmax = 264 nm và phenylephin hydroclorit λmax

= 273 nm trong môi trường axit HCl 0,1M Khoảng thời gian tối ưu để tiếnhành thí nghiệm đo quang là từ 20 đến 90 phút sau khi pha và có thể tiếnhành thí nghiệm ở nhiệt độ phòng Khảo sát, xác định khoảng tuyến tính độhấp thụ quang của paracetamol là 0,2 đến 30,0 μg/mL; clopheninaminmaleat là từ 0,2 đến 40,0 μg/mL và phenylephin hydroclorit là từ 1,0 đến40,0 μg/mL

- Năm 2015, tác giả Trần Quốc Chính [2] đã nghiên cứu " Định lượng đồng thờiacetaminophen, codeine phosphate trong thuốc Actadol codeine bằng phươngpháp sắc kí lỏng hiệu năng cao và phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử”

+ Sử dụng phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử đã khảo sát, xác địnhđiều kiện tối ưu cho phép đo quang:acetaminophenλmax = 243 nm, CDI λmax =

210 nm trong môi trường axit HCl 0,1M Khoảng thời gian tối ưu để tiến hànhthí nghiệm đo quang là từ 30 đến 40 phút sau khi pha và có thể tiến hành thínghiệm ở nhiệt độ phòng Đã khảo sát, xác định khoảng tuyến tính độ hấpthụ quang của acetaminophen là 0,2 đến 30,0 μg/mL, CDI là từ 0,2 đến 30,0μg/mL Sử dụng phương pháp thêm chuẩn xác định acetaminophen và CDItrong mẫu thuốc Actadol codein với độ thu hồi của acetaminophen từ 99,3%đến 101% và của CDI là từ 98,5% đến 100,3%

- Năm 2015, tác giả Bùi Đức Ngọc [4] đã nghiên cứu "Định lượng đồng thờiparacetamol và cafein trong thuốc Panadol Extra và Hapacol Extra bằngphương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và phương pháp quang phổhấp thụ phân tử (UV-Vis)"

+ Sử dụng phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử đã khảo sát, xác địnhđiều kiện tối ưu cho phép đo quang: khoảng bước sóng thích hợp để quét phổ

từ 210-290 nm, PRC λmax = 243 nm, CFI λmax = 272 nm trong môi trường axit

HCl 0,1M Khoảng thời gian tối ưu để tiến hành thí nghiệm đo quang là từ 30đến 40 phút sau khi pha và có thể tiến hành thí nghiệm ở nhiệt độ phòng Đãkhảo sát, xác định khoảng tuyến tính độ hấp thụ quang của PRC là 0,2 đến30,0 μg/mL, CFI là từ 0,2 đến 30,0 μg/mL.

1.4 Giới thiệu về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

- Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance LiquidChromatography-HPLC) ra đời năm 1967-1968, trên cơ sở phát triển và cải tiến

từ phương pháp sắc ký cột cổ điển Phương pháp này ngày càng phát triển vàhiện đại hóa cao do khoa học kĩ thuật phat triển

- Phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều lý do:có độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bayhơi hoặc dễ phân hủy nhiệt

- Phạm vi ứng dụng của phương pháp HPLC rất rộng, áp dụng nhiều trong cácngành kiểm nghiệm đặc biệt là ứng dụng cho ngành kiểm nghiệm thuốc: nhưphân tích thuốc kháng sinh, các hợp chất thuốc trừ sâu, các chất phụ gia thựcphẩm trong lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm, môi trường,…

1.4.1 Nguyên tắc của phương pháp HPLC

HPLC là một phương pháp chia tách hỗn hợp chất phân tích, trong đópha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn, đã được phân chiadưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao cho phép tách riêng rẽ mộthỗn hợp các chất có tính chất gần giống nhau là do ái lực hấp thu và giải hấpcủa các hợp phần có trong hỗn hợp phân tích với pha tĩnh và pha động làkhác nhau

Pha tĩnh

* Pha tĩnh là pha không di chuyển, thường nạp đầy trong cột sắc ký, có tác dụnglưu giữ chất phân tích Pha tĩnh là loại hạt rắn, xốp, kích thước hạt rất nhỏ cỡhạt từ 3-10 µm

* Là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc kí và loại sắc kí:

+ Nếu pha tĩnh là chất trao đổi ion thì ta có sắc kí trao đổi ion

+ Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì ta có sắc kí phân bố hay sắc kí chiết.+ Nếu pha tĩnh là gel thì ta có sắc kí gel hay rây phân tử

+ Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có sắc kí hấp phụ pha thuận hoặc pha đảo

Trong sắc ký pha đảo, pha tĩnh là những hợp chất hữu cơ được gắn lên chất mang rắn silica hoặc cấu thành từ silica theo hai kiểu:

Sắc ký lỏng-lỏng: Pha tĩnh được giữ lại trên chất mang rắn bằng cơ chế hấp phụ vật lý

Sắc ký pha liên kết: Pha tĩnh liên kết hóa học với chất nền

Trong quá trình sử dụng sắc ký pha liên kết có nhiều ưu điểm hơn sắc ký pha lỏng-lỏng vì một số nguyên nhân sau:

+ Pha tĩnh trong hệ sắc ký lỏng-lỏng dễ bị hòa tan bởi pha động nên dễ bịhao hụt trong thời gian sử dụng và sẽ làm sai lệch kết quả chất phân tích

+ Do pha tĩnh của sắc ký lỏng-lỏng dễ tan trong pha động nên không thể ứng dụng phương pháp rửa giải gradient dung môi

Pha động

- Pha động có nhiệm vụ chuyển chất phân tích dọc theo cột sắc ký với tốc độthích hợp Chất phân tích bị lưu giữ trên pha tĩnh phụ thuộc vào ái lực củachúng đối với pha động

- Pha động trong sắc ký lỏng nói chung phải đạt những yêu cầu sau:

+ Hòa tan mẫu phân tích

+ Phù hợp với đầu dò

+ Không hòa tan hay làm mòn pha tĩnh

+ Có độ nhớt thấp để tránh áp suất dội lại cao

+ Tinh khiết dùng cho sắc ký

- Trong sắc ký pha đảo, dung môi pha động có độ phân cực cao Trên lý thuyết có thể sử dụng khá nhiều dung môi nhưng kinh nghiệm thực tế cho thấy

metanol (MeOH), axetonitril (ACN) là đạt yêu cầu nhất

1.4.2 Các đại lượng đặc trưng của quá trình sắc ký

Có ba thông số gây ảnh hưởng lớn đến tách các pic sắc ký: số đĩa lýthuyết N, hệ số dung lượng K’, độ chọn lọc α Khi sự thay đổi thành phần phađộng không đem lại kết quả tách pic theo yêu cầu thì chúng ta phải thay đổi bảnchất pha động (sử dụng dung môi khác), tức thay đổi α

- Hệ số K tùy thuộc vào bản chất pha tĩnh, pha động và chất phân tích

Thời gian lưu

Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ khi bơm mẫu vào cột chođến khi chất đó ra khỏi cột đạt giá trị cực đại Thời gian lưu được tính theocông thức sau:

Trong đó: W là chiều rộng pic ở đáy pic.

W1/2 là chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao của pic

- Ý nghĩa của số đĩa lý thuyết N

• N càng lớn khả năng tách càng tốt, các pic sắc ký càng hẹp và nhọn (tốt)

• N nhỏ khả năng tách kém, sẽ cho các pic tù và xấu (không tốt)

- Các yếu tố ảnh hưởng đến số đĩa lý thuyết

Kích thước hạt hấp phụ ( ): hạt càng nhỏ số đĩa lý thuyết càng lớn tuy nhiên hạt nhỏ quá sẽ dẫn đến áp suất khi phân tích tăng lên

Độ nhớt của pha động càng lớn N càng nhỏ

Nhiệt độ cột càng cao N càng lớn, tuy nhiên phải nằm trong giới hạn cho phép của cột

Tốc độ pha động càng tăng N càng giảm và ngược lại, tuy nhiên với hạtnhồi có kích thước dưới 2µm sẽ không đáng kể (xem đường cong VanDeemter) và quá trình phân tích được đẩy nhanh.