de tai nghien cuu che tao chitosan

Nghiên cứu các phương pháp tổng hợp nano chitosan. Phân tích các đặc điểm hóa lý.Nghiên cứu tác dụng và hiệu suất hấp phụ protein của nano chitosan. Kết luận về hướng ra và ý nghĩa thực tiễn của đề tài

Trang 1

ỨNG DỤNG TRONG DẪN TRUYỀN THUỐC

Trang 2

MỤC LỤC

Trang

TRANG PHỤ BÌA ………0

MỤC LỤC i

DANH MỤC HÌNH ẢNH ii

DANH MỤC PHỤ LỤC v

1.5.1.1 Cấu trúc của protein 27

1.5.1.2 Chức năng của protein 29

DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 Tóm tắt phương pháp điều chế hạt nano chitosan làm chất dẫn các loại thuốc, protein hoặc gen khác nhau 12

Bảng 1.2 Chỉ số MIC (μg/ml ) và MBC (μg/ml) của chitosan, nano chitosan (CNP), nano chitosan nhốt Cu (CNP-Cu) và doxycycline 25

Bảng 1.3 Giá trị MIC và MBC ức chế E coli, S choleraesuis và S aureus (µg/ml) 26

Bảng 1.4 Tên các acid amin-đơn phân tạo nên protein 27

Bảng 1.5 Các loại protein chức năng 29

Bảng 3.1 Đặc điểm hạt nano chitosan điều chế từ các phương pháp khác nhau 51

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ CS/TPP đến tính chất hạt nano chitosan 59

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của pH đến tính chất hạt nano chitosan 66

Bảng 3.4 Những mũi IR chính (cm-1) của CS và nano CS-TPP 70

Bảng 3.5 Cường độ hấp thu của các dung dịch protein có nồng độ khác nhau 74

Bảng 3.6 Số liệu khảo sát hiệu suất hấp phụ và khả năng hấp phụ protein 76

Trang 3

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Công thức cấu tạo chitin và chitosan 8

Hình 1.2 Sơ đồ tạo hạt bằng phương pháp khâu mạch nhũ tương 12

Hình 1.3 Sơ đồ tạo hạt bằng phương pháp giọt tụ 13

Hình 1.4 Sơ đồ tạo hạt bằng phương pháp hợp nhất giọt nhũ tương 14

Hình 1.5 Sơ đồ tạo hạt bằng phương pháp tạo gel ion 15

Hình 1.6 Sơ đồ tạo hạt bằng phương pháp mixen đảo 16

Hình 1.7 Hình minh họa những cơ chế hấp thu dưỡng chất 24

Hình 1.8 Ảnh hiển vi lực nguyên tử (AFM) của tế bào S choleraesuis sau khi xử lý với nano chitosan theo thời gian Chưa xử lý (A), xử lý 30 phút (B), xử lý 1 giờ (C), xử lý 1,5 giờ (D), xử lý 2 giờ (E), xử lý 3 giờ (F) 25

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu 34

Hình 2.2 Máy đo pH IQ Scientific Instruments (A), máy khuấy từ IKA RET control-visc (B) 35

Hình 2.3 Máy ly tâm UNIVERSAL 32R HETTICH ZENTRIFUGEN 35

Hình 2.4 Máy đông cô TELSTAR LYOQUEST 36

Hình 2.5 Máy sắc ký thẩm thấu gel GPC AGILENT 1100 Series 37

Hình 2.6 Hệ thống hiển vi điện tử quét phát xạ trường FE-SEM JSM 7401F 38

Trang 4

Hình 2.7 Hệ thống hiển vi điện tử truyền qua JEM-1400 39

Hình 2.8 Máy nhiễu xạ tia X Bruker XRD-D8 ADVANCE 39

Hình 2.9 Máy đo phổ FT- IR BRUKER EQUINOX 55 40

Hình 2.10 Máy đo phổ Raman HORIBA JOBIN YVON 40

Hình 2.11 Máy quang phổ UV-Vis-NIR-V670, JACCO 41

Hình 3.1 Ảnh FE-SEM của chitosan khi chưa tạo nối 44

Hình 3.2 Ảnh FE-SEM chụp phần dung dịch còn lại sau khi ly tâm tách hạt nano chitosan 45

Hình 3.3 Phản ứng tạo nối ngang cộng hóa trị giữa chitosan và glutaraldehid 47

Hình 3.4 Cấu trúc hóa học của natri TPP 47

Hình 3.5 Cơ chế tương tác giữa CS và TPP 48

Hình 3.6 Mối quan hệ giữa tinh thể và nối ngang ion: (a) chitosan tinh thể ban đầu; (b) chitosan tạo nối ngang ion thấp; (c) chitosan tạo nối ngang ion cao 48

Hình 3.7 Ảnh hưởng của lực cắt đến sự hình thành hạt nano 49

Hình 3.8 Ảnh chụp bột nano chitosan điều chế từ các phương pháp khác nhau (từ trái qua phải): phương pháp tạo gel ion với TPP và phương pháp tạo nối ngang cộng hóa trị với glutaraldehid 50

Hình 3.9 Ảnh FE-SEM của hạt nano chitosan điều chế từ các phương pháp khác nhau (từ trái qua phải): phương pháp tạo nối ngang cộng hóa trị với glutaraldehid, phương pháp gel ion với tripolyphosphat (TPP) 51

Hình 3.10 Ảnh chụp dung dịch nano chitosan điều chế từ các tỷ lệ CS/TPP khác nhau (từ trái qua phải): 3:1,4:1, 5:1, 6:1, 7:1 52

Hình 3.11 Ảnh FE-SEM hạt nano chitosan khi tổng hợp với tỷ lệ CS/TPP là 3:1 54

Hình 3.12 Phân bố kích thước hạt của dung dịch nano chitosan với tỷ lệ CS/TPP là 3:1 54

Trang 5

Hình 3.14 Phân bố kích thước hạt của dung dịch nano chitosan với tỷ lệ CS/TPP là

4:1 55

Hình 3.21 Ảnh hưởng của tỷ lệ CS/TPP đến kích thước hạt 59

Hình 3.22 Ảnh chụp dung dịch nano chitosan điều chế ở những điều kiện pH khác nhau (từ trái qua phải): 4,0; 4,5; 5,0; 5,5 61

Hình 3.23.Ảnh FE-SEM hạt nano chitosan khi tổng hợp ở pH=4,0 62

Hình 3.24 Phân bố kích thước hạt của dung dịch nano chitosan ở pH=4,0 62

Hình 3.25 Ảnh FE-SEM hạt nano chitosan khi tổng hợp ở pH=4,5 63

Hình 3.31 Ảnh hưởng của pH đến kích thước hạt nano chitosan 66

Hình 3.32 Ảnh TEM của hạt nano điều chế ở pH=4,0; tỉ lệ chitosan/TPP là 6:1 69

Hình 3.33 Phổ IR của chitosan (a) và hạt nano chitosan (b) 70

Hình 3.34 Phổ Raman của chitosan 71

Trang 6

Hình 3.35 Phổ Raman của hạt nano chitosan 71

Hình 3.36 Giản đồ XRD của CS và nano CS-TPP 73

Hình 3.37 Cường độ hấp thu của các dung dịch protein có nồng độ khác nhau 75

Hình 3.39 Hiệu suất hấp phụ protein ở những liều lượng hạt nano chitosan khác nhau 77

DANH MỤC PHỤ LỤC Phụ lục 1 Kết quả đo GPC của chitosan nguyên liệu 85

Phụ lục 2 Kết quả đo GPC của chitosan nguyên liệu 86

Phụ lục 3 Phổ FT-IR của protein BSA nguyên liệu 87

Phụ lục 4 Phổ FT-IR của chitosan nguyên liệu 88

Phụ lục 5 Phổ FT-IR của nano CS-TPP 89

Phụ lục 6 Phổ Raman của chitosan nguyên liệu 90

Phụ lục 7 Phổ Raman của nano CS-TPP 92

Phụ lục 8 Giản đồ nhiễu xạ tia X của chitosan nguyên liệu 92

Phụ lục 9 Giản đồ nhiễu xạ tia X của nano CS-TPP 93

Phụ lục 11.Phổ UV-Vis protein BSA nồng độ 20 µg/ml 96

Phụ lục 12 Phổ UV-Vis protein BSA nồng độ 30 µg/ml 97

Phụ lục 15 Phổ UV-Vis dịch nổi protein BSA sau khi pha loãng, sử dụng hạt nano CS-TPP ở liều lượng 0,25 mg 99

Phụ lục 16 Phổ UV-Vis dịch nổi protein BSA sau khi pha lõang, sử dụng hạt nano CS-TPP ở liều lượng 0,50 mg 100

Trang 7

Phụ lục 17 Phổ UV-Vis dịch nổi protein BSA sau khi pha loãng, sử dụng hạt nanoCS-TPP ở liều lượng 1,0 mg 101Phụ lục 18 Phổ UV-Vis dịch nổi protein BSA sau khi pha loãng, sử dụng hạt nanoCS-TPP ở liều lượng 1,5 mg 102Phụ lục 19 Phổ UV-Vis dịch nổi protein BSA sau khi pha loãng, sử dụng hạt nanoCS-TPP ở liều lượng 2,0 mg 103

Trang 8

MỞ ĐẦU

Ngày nay, với sự phát triển trong lĩnh vực y tế và chăm sóc sức khoẻ conngười, nhiều công nghệ mới đã được sử dụng rộng rãi mà tiêu biểu là ứng dụng củacông nghệ nano vào quá trình tổng hợp những chất dẫn thuốc mới

Nhiều loại peptid và protein được ứng dụng làm thuốc vì khả năng chọn lọccao và điều trị hiệu quả Dẫn truyền thành công những thuốc protein này là chủ đềnghiên cứu trong nhiều năm nay của ngành dược

Chitosan được sử dụng làm nguyên liệu điều chế hạt nano chitosan trongnhững năm gần đây vì những tính chất ưu việt của nó ở kích thước nano Chitosan

là dạng deacetyl hóa từ chitin, có cấu trúc polysaccharide, được tìm thấy ở loài độngvật giáp xác, côn trùng và một vài loại nấm Với nhiều tính năng như tính tươngthích sinh học, phân hủy sinh học, bám dính màng và không độc hại, nó trở thànhnguyên liệu cho nhiều ứng dụng dược sinh học Ngoài ra, chitosan còn có khả năngbám lên bề mặt niêm mạc và xâm nhập vào niêm mạc Do đó, hạt nano chitosan trởthành hệ thống phân phối thuốc có tiềm năng lớn [31]

Cùng với xu thế trên, chúng tôi thực hiện nghiên cứu chế tạo vật liệu nanochitosan Đồng thời khảo sát khả năng hấp phụ protein của hạt nano chitosan nhằmứng dụng trong dẫn truyền thuốc Các kết quả sẽ được đánh giá bằng nhiều phươngpháp phân tích hóa lý khác nhau như FT-IR, Raman, XRD, FE-SEM và TEM.Thành công của đề tài sẽ tạo điều kiện sản xuất ra sản phẩm nano chitosan với giáthành thấp để có thể thực hiện những nghiên cứu tiếp theo, nhất là sớm ứng dụngnano chitosan làm chất dẫn thuốc góp phần nâng cao sức khỏe cộng đồng

Trang 9

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về chitosan

1.1.1 Cấu trúc của chitosan

Chitosan là một loại polime carbohydrate tự nhiên có thể tạo ra bằng cáchdeacetyl hoá chitin Chitosan có thể tìm thấy trong tự nhiên từ động vật giáp xácnhư tôm, cua Chitosan còn có thể được tìm thấy từ những loài vi sinh vật như nấm,men

Hình 1.1 Công thức cấu tạo chitin và chitosan

Chitosan là dẫn xuất deacetyl hoá của chitin, trong đó nhóm (–NH2) thay thếnhóm (-NHCOCH3) ở vị trí C2 Chitosan được cấu tạo từ các mắc xích D-glucosamin liên kết với nhau bởi liên kết α-(1-4)-glycoside [15], [25]

Trang 10

1.1.2 Tính chất chitosan

• Không độc, tính tương ứng sinh học cao và có khả năng phân huỷ sinh họcnên không gây dị ứng và không gây phản ứng phụ, không gây tác hại đếnmôi trường

• Có khả năng hấp phụ cao đối với các kim loại nặng

• Ở pH < 6,3, chitosan có tính điện dương cao

• Trong phân tử chitosan có chứa nhóm –OH, -NHCOCH3 trong các mắt xíchN-acetyl-D-glucosamin có nghĩa chúng vừa là alcol vừa là amin, vừa làamid Phản ứng hoá học có thể xảy ra ở vị trí nhóm chức tạo ra dẫn xuất thếO-, dẫn xuất thế N-

• Mặt khác chitosan là những polime mà các monome được nối với nhau bởicác liên kết α-(1-4)-glycoside; các liên kết này rất dễ bị cắt đứt bởi các chấtnhư: acid, bazơ, tác nhân oxy hoá và các enzyme thuỷ phân [15], [25]

1.1.3 Ứng dụng của chitosan

Trong y tế, chitosan có tác dụng làm màng chữa bỏng, tá dược độn trong làmcốm, tá dược ổn định viên nén, thuốc trị viêm loét dạ dày tá tràng Chitosan-colagenhỗn hợp làm giảm cholesterol trong máu làm giảm sự hấp thụ lipid Chitin đượcdùng làm da nhân tạo, thuốc diệt khuẩn, chỉ khâu trong phẫu thuật

Trong công nghiệp thực phẩm, chitosan làm phụ gia thực phẩm duy trìhương vị tự nhiên, ổn định màu, nhũ tương, làm dày cấu trúc, màng bảo quản rauquả tươi, làm trong nước quả ép, giữ màu sắc và hương vị tự nhiên của sản phẩm

Trang 11

Trong công nghiệp in, chitosan làm chất keo cảm quang, trong công nghiệpnhuộm làm tăng độ màu vải nhuộm Trong nông nghiệp, oligochitosan làm thuốctăng trưởng thực vật và kích thích gây tạo kháng sinh thực vật, thuốc diệt nấm bệnhcho thực vật, gia tăng hệ số nhân và sinh khối tươi cho cây nuôi cấy mô.

Trong khoa học kỹ thuật, chitosan làm dung dịch tăng độ khuyếch đại củakính hiển vi, xử lý nước thải công nghiệp và sinh hoạt: thu hồi ion kim loại, protein,phenol, thuốc trừ sâu, thuốc nhuộm…[15], [25]

1.2 Tổng quan về nano chitosan

Chitosan được sử dụng làm nguyên liệu điều chế hạt nano chitosan trongnhững năm gần đây Với nhiều tính năng như tính tương thích sinh học, phân hủysinh học, bám dính màng và không độc hại, nó trở thành nguyên liệu cho nhiều ứngdụng dược sinh học [31]

Nano chitosan do có kích thước siêu nhỏ (từ 10 đến 1000 nm) nên dễ dàng điqua màng tế bào, có thể đưa vào cơ thể qua nhiều đường khác nhau như dùng ngoài

da, dùng bằng đường miệng, qua mũi… Nano chitosan có diện tích và điện tích bềmặt cực lớn nên được ứng dụng nhiều trong sinh y học mang thuốc, vaccin, vectơchuyển gen, chống khuẩn, thuốc điều trị ung thư… Khi sử dụng nano chitosan làmchất dẫn thuốc, thuốc điều trị được bảo vệ bởi những hạt nano chitosan khỏi sựphân huỷ sinh học, những hạt này có tác dụng thấm sâu vào cơ thể do kích thước rấtnhỏ có thể đưa thuốc đến đúng mục tiêu điều trị, do đó nano chitosan làm chất dẫnthuốc có hiệu quả điều trị rất cao [28]

Trên thế giới, hầu hết những công trình nghiên cứu gần đây đều nhằm mụcđích chế tạo ra những chất mang nano để dẫn truyền thuốc, protein, gen và pháttriển vectơ chitosan hướng đích thuốc trên những tế bào ung thư Một số đề tài tiêubiểu là điều chế hạt chitosan composit với acid polyacrylic để điều khiển và kéo dàithời gian phóng thích thuốc, điều chế nano chitosan với cholesterol để dẫn thuốcđến mắt, biến tính với N-trimetyl mang protein làm hệ thống dẫn truyền đường mũi,tạo phức với acid deoxycholic để dẫn truyền gen [11] Ngoài ra, nano chitosan cònđược nghiên cứu về khả năng diệt khuẩn [9], [24], ứng dụng trong thực phẩm chức

Trang 12

năng [5], [6] Nhiều công trình cũng tiến hành nghiên cứu về kích cỡ, điện tích bềmặt hạt nano chitosan vì đây là những đặc tính rất quan trọng quyết định hiệu quảgây nhiễm gen, gắn kết các phân tử protein trên hạt nano [12] Tuy nhiên, các kếtquả đạt được rất khác nhau [10], [20], [21], [30], [32].

Ở nước ta, số lượng bài nghiên cứu về nano chitosan rất ít Mức độ cập nhậtcủa các nghiên cứu trong nước so với các nghiên cứu của các nhà khoa học kháctrên thế giới còn thấp, chỉ có nhóm của PGS TS Nguyễn Anh Dũng [2] và nhómcủa TS Trần Đại Lâm [3] nghiên cứu về vấn đề này Các khảo sát này bước đầu chothấy những kết quả khả quan trong việc ứng dụng chitosan làm chất mang vaccin,thuốc Tuy nhiên, những nghiên cứu này chưa đi sâu vào khảo sát thực nghiệm vàđánh giá kết quả tạo hạt nano chitosan, chưa đáp ứng được hết những tiềm năng tolớn mà công nghệ tạo hạt nano chitosan hứa hẹn sẽ mang đến cho con người

1.3 Các phương pháp chế tạo nano chitosan

Hiện nay có nhiều phương pháp tạo nano chitosan Phương pháp được sửdụng nhiều nhất là tạo gel ion, ưu điểm của phương pháp này là quá trình chuẩn bịđơn giản và không cần phải sử dụng dung môi hữu cơ hay sử dụng lực nén lớn, do

đó phương pháp này được nghiên cứu rộng rãi trong tổng hợp chất dẫn thuốc vàthực phẩm chức năng [28]

Những yếu tố ảnh hưởng đến tính chất hạt nano chitosan như kích thước hạt

và sự tích điện bề mặt là khối lượng phân tử và độ deacetyl hoá của chitosan Hiệuquả thu giữ thuốc của hạt nano chitosan phụ thuộc vào giá trị pKa và độ hoà tan củathuốc Thuốc kết hợp với chitosan qua tương tác tĩnh điện, liên kết hidro, …

Sự lựa chọn phương pháp tổng hợp nano chitosan còn phụ thuộc vào bảnchất của những phân tử hoạt động cũng như những yêu cầu dẫn truyền khác nhau[11]

Trang 13

Bảng 1.1 Tóm tắt phương pháp điều chế hạt nano chitosan làm chất dẫn các

loại thuốc, protein hoặc gen khác nhau.

Phương pháp điều chế nano chitosan Thuốc/ protein/ gen

Gel ion Insulin, ricin, BSA, cyclosporine APhương pháp giọt tụ/kết tủa DNA/doxorubicin

Hợp nhất giọt nhũ tương Acid gadopentetic

Theo S.A Agnihotri (2004), có 5 phương pháp chủ yếu để tạo hạt nanochitosan là: Phương pháp khâu mạch nhũ tương (emulsion cross-linking), phươngpháp giọt tụ/kết tủa (coacervation/precipitation), phương pháp hợp nhất giọt nhũtương (emulsion-droplet coalescence), phương pháp tạo gel ion (ionic gelation) vàphương pháp mixen đảo (reverse micellar) [4]

1.3.1 Phương pháp khâu mạch nhũ tương

Hỗn hợp nhũ tương nước trong dầu (w/v) được tạo ra bằng cách phân tándung dịch chitosan trong dầu Những giọt lỏng được làm bền bởi chất hoạt động bềmặt Dung dịch nhũ tương sau đó được khâu mạch bằng tác nhân tạo nối thích hợpnhư glutaraldehid Hai nhóm –CHO của glutaraldehid sẽ phản ứng với nhóm –NH2

của chitosan để khâu mạch tạo hạt nano chitosan

Hình 1.2 Sơ đồ tạo hạt bằng phương pháp khâu mạch nhũ tương

1.3.2 Phương pháp giọt tụ/kết tủa

Trang 14

Phương pháp này sử dụng tính chất của chitosan là không tan trong dungdịch kiềm Bởi vậy, chitosan sẽ bị kết tủa, tạo giọt ngay khi dung dịch chitosan tiếpxúc với dung dịch kiềm Dung dịch kiềm có thể là NaOH, NaOH-metanol hoặcetandiamin Dung dịch chitosan sẽ được một thiết bị nén phun vào dung dịch kiềm

để tạo hạt nano

Hình 1.3 Sơ đồ tạo hạt bằng phương pháp giọt tụ.

1.3.3 Phương pháp hợp nhất giọt nhũ tương

Phương pháp này lần đầu được sử dụng vào năm 1999 Phương pháp này sửdụng nguyên tắc của cả hai phương pháp: tạo nối ngang nhũ tương và kết tủa Thay

vì sử dụng tác nhân tạo nối ngang, kết tủa tạo ra bằng cách cho các giọt chitosan kếthợp với các giọt NaOH Một hệ nhũ tương bền chứa dung dịch chitosan cùng vớithuốc tạo ra trong paraffin lỏng Đồng thời, một hệ nhũ tương bền khác chứa dung

Trang 15

dịch chitosan và NaOH cũng được tạo ra theo cách như trên Khi cả hai hệ nhũtương này được trộn lại với tốc độ khuấy cao, các giọt từ mỗi hệ sẽ va chạm mộtcách ngẫu nhiên, hợp lại và kết tủa thành những hạt nhỏ.

Hình 1.4 Sơ đồ tạo hạt bằng phương pháp hợp nhất giọt nhũ tương.

1.3.4 Phương pháp tạo gel ion

Cơ chế của phương pháp này dựa trên tương tác tĩnh điện giữa chitosan tíchđiện dương và một polyanion như tripolyphosphate Kỹ thuật này có ưu điểm là giaiđoạn chuẩn bị đơn giản và thực hiện trong môi trường nước Đầu tiên chitosan đượchoà tan vào dung dịch acid acetic Sau đó chitosan được trộn lẫn với polyanion để

Trang 16

tạo hạt nano chitosan dưới điều kiện khuấy từ liên tục tại nhiệt độ phòng Kíchthước và điện tích bề mặt có thể kiểm soát bằng cách sử dụng những tỷ lệ chitosan

và polyanion khác nhau

Hình 1.5 Sơ đồ tạo hạt bằng phương pháp tạo gel ion.

1.3.5 Phương pháp mixen đảo

Trong phương pháp này, người ta hòa tan chất hoạt động bề mặt vào dungmôi hữu cơ để tạo ra những hạt mixen đảo Dung dịch lỏng chứa chitosan và thuốcđược thêm từ từ với tốc độ khuấy không đổi để tránh làm đục dung dịch Pha lỏngđược giữ sao cho hỗn hợp trở thành pha vi nhũ trong suốt Sau đó tác nhân tạo nốingang dược thêm vào và khuấy qua đêm Cô quay loại dung môi Phần còn lại phântán lại trong nước Dung dịch muối thích hợp được thêm vào để kết tủa chất hoạtđộng bề mặt Hỗn hợp được ly tâm Phần dung dịch ở trên chứa hạt nano mangthuốc được chiết ra, cho qua màng thẩm tách 1 giờ Đông cô chất lỏng thu được cho

ta bột thuốc

Trang 17

Hình 1.6 Sơ đồ tạo hạt bằng phương pháp mixen đảo.

1.4 Ứng dụng của hạt nano chitosan

1.4.1 Chất mang dẫn truyền thuốc

1.4.1.1 Phân loại theo con đường sử dụng

Hạt nano chitosan có kích thước nhỏ nên nó thích hợp cho nhiều con đường

sử dụng thuốc khác nhau [28]

• Sử dụng bên ngoài đường tiêu hóa

Các hạt nano có thể được dùng trong tĩnh mạch bởi vì đường kính của cácmao mạch máu nhỏ nhất là khoảng 4 µm Sự phân bố sinh học của các hạt nano cóthể thay đổi tùy thuộc vào kích cỡ, điện tích bề mặt và tính kỵ nước của chúng Cáchạt có bán kính lớn hơn 100 nm sẽ bị hấp thu nhanh chóng bởi hệ lưới-nội mô tronggan, lá lách, phổi và tủy xương Ngược lại, những hạt nhỏ hơn có xu hướng có thờigian luân chuyển kéo dài

Các loại thuốc hứa hẹn nhất đã được nghiên cứu rộng rãi để dẫn truyền theocách này là những tác nhân kháng ung thư Sau khi tiêm vào tĩnh mạch, nhiều hệthống hạt nano bao gồm nano chitosan có xu hướng tích lũy lại trong một số khối u(Brasseur, 1980; Kreuter, 1994) Những hạt nano chitosan mang doxorubicin làmchậm sự tăng trưởng của khối u và nâng cao tỷ lệ sống sót của những con chuột bị

Trang 18

cấy khối u Ngoài ra, những hạt nano chitosan có kích thước nhỏ hơn 100 nm đượctạo ra cho thấy đã tránh khỏi hệ lưới-nội mô và luân chuyển trong máu được lâuhơn.

Dẫn truyền những dược chất kháng bệnh như là kháng khuẩn, kháng virus,kháng nấm và kháng ký sinh là một hướng sử dụng khác của hạt nano (Bender,1996; Page-Clisson, 1998; Soma, 2000) Chỉ số điều trị của thuốc kháng nấm thấp,thời gian bán hủy của những dược chất kháng virus ngắn và khả năng thâm nhậpvào tế bào bị bệnh trong khoang nội bào của thuốc kháng sinh kém làm cho nhữnghạt nano trở thành những ứng viên dẫn truyền lý tưởng Những hạt nano một mặtnâng cao hiệu quả điều trị, mặt khác làm giảm tác dụng phụ độc hại của thuốc Trên

lý thuyết, nano chitosan là hệ thống chất mang hấp dẫn cho những loại thuốc này vìchúng có nhiều thuận lợi như có bề mặt ưa nước và kích thước nano nhỏ hơn

100 nm Ngoài ra, sử dụng trong cơ và dưới da cũng có thể là hướng dẫn truyềnkhác của hạt nano bởi vì khả năng giảm kích ứng tại điểm tiêm và bảo vệ thuốckhông bị enzym phân hủy (Little, 1962)

• Sử dụng qua đường uống

Ý tưởng hạt nano có thể bảo vệ thuốc không bị enzym phân hủy trong bộmáy tiêu hóa dẫn đến sự phát triển các hạt nano thành những hệ thống dẫn truyềnnhững phân tử lớn, protein và polynucleotid Phương pháp này được nghiên cứurộng rãi sau một báo cáo rằng lượng đường trong máu của những con chuột mắcbệnh tiểu đường giảm sau khi uống những hạt nano insulin (Damge,1990) Kíchthước hạt nhỏ hơn 500 nm là một yếu tố then chốt cho phép vận chuyển qua niêmmạc ruột theo cơ chế endocytotic Bên cạnh enzym, màng nhầy ngăn cản sựkhuyếch tán của thuốc và hạt nano, những rào cản hấp thụ biểu mô là chướng ngạichính chống lại sự hấp thụ thuốc protein qua thành ruột Do đó, hoạt tính của thuốc

có thể được cải thiện bằng cách kiểm soát kích thước hạt cùng với kéo dài thời gianlưu giữ thuốc trong bộ máy tiêu hóa Trong số những hạt nano polyme, hạt nanochitosan là chất dẫn thuốc lý tưởng vì chúng làm tăng mức hấp thu thuốc

Trang 19

Khả năng cải thiện mức hấp thu của chitosan đã được nghiên cứu rộng rãi.Đặc tính bám dính của chitosan là do tương tác giữa chitosan tích điện dương vàniêm mạc tích điện âm Điều này làm kéo dài thời gian tương tác của thuốc và bềmặt hấp thụ

• Sử dụng đường mắt

Các hạt nano được nhận thấy là chất mang tiềm năng để dẫn truyền đườngmắt sau nhiều quan sát thấy rằng nhiều loại hạt nano có khuynh hướng bám chặtvào bề mặt biểu mô mắt Kết quả kéo dài thời gian lưu giữ, tốc độ đào thải thuốcchậm hơn so với những phương pháp điều trị mắt truyền thống, do đó cải thiệndược tính của thuốc Vì vậy, những hạt nano đã được dùng để dẫn thuốc khángviêm, kháng dị ứng cho những mục tiêu điều trị viêm mắt

Chitosan đã được sử dụng như là chất mang dẫn thuốc điều trị chứng viêmmắt bởi vì tác động thúc đẩy mức hấp thu thuốc Chitosan không chỉ gia tăng thờigian tương tác với giác mạc qua tương tác tĩnh điện giữa điện tích dương của nó vàniêm mạc tích điện âm, nó còn có khả năng xuyên qua lớp niêm mạc, nâng caodược tính của thuốc Nhóm của Felt (1999) tìm thấy dung dịch chitosan kéo dài thờigian lưu giữ thuốc kháng sinh trên giác mạc của thỏ Những tác động tương tự cũngđược quan sát thấy khi sử dụng những hạt nano chitosan Những hạt này được giữtrên giác mạc và kết mạc của thỏ ít nhất 24 giờ Nhóm của De Campos (2001) pháthiện thấy sau khi sử dụng những hạt nano chitosan trên thỏ, hầu hết thuốc được tìmthấy trong những mô ngoài mắt, giác mạc và kết mạc trong khi chỉ một lượng thuốcnhỏ được tìm thấy trong những mô trong mắt, mống mắt và chất dịch lỏng

1.4.1.2 Phân loại theo ứng dụng trong điều trị bệnh

• Hoạt tính kháng ung thư

Mitra (2001) nghiên cứu nhốt thuốc kháng ung thư doxorubicine để ức chếkhối u trên chuột Kết quả cho thấy nếu tiêm doxorubicine độc lập thì khối u ởchuột vẫn tăng lên 900 mm3 sau 50 ngày và chết, trong khi đó ở thí nghiệm ly giảichậm doxorubicine trong hạt nano chitosan kích thước khối u giảm chỉ còn 170

mm3 và chuột vẫn sống sau 90 ngày thí nghiệm

Trang 20

L Qi (2006) nghiên cứu hoạt tính kháng ung thư trực tiếp của hạt nanochitosan dựa trên cơ chế polycation gây phá vỡ màng tế bào ung thư và hoạt tínhcảm ứng apoptosis trên hai dòng tế bào ung thư là sarcoma S 180 và hepatoma H

22 Kết quả cho thấy hiệu quả làm giảm khối lượng tế bào ung thư với liều uống 2,5mg/kg hạt nano chitosan trên S 180 và H 22 là 52-59% và liều 0,5mg/kg là 43-53%,trong khi đó chitosan chỉ là 30%

Kết quả cũng cho thấy kích thước hạt nano càng nhỏ thì hiệu quả kháng ungthư càng cao Hoyoung (2008) nghiên cứu PEG-hạt nano chitosan làm tá chất thuốcchống tới tế bào đích ung thư Kích thước hạt nano khoảng 350 nm Hiệu quả chốngung thư khi sử dụng hạt nano chitosan rất cao trên tế bào gây ung thư phổi ở chuộtA549 đồng thời làm giảm độc tính của thuốc chống ung thư [3]

• Ứng dụng trong ly giải chậm thuốc

Angela (2001) nghiên cứu thải chậm thuốc cyclosporin A (Cry A) bằng cáchhấp phụ trong dung dịch chitosan và hạt nano chitosan Lượng thuốc phóng thíchtrong thí nghiệm hấp phụ trên hạt nano chitosan luôn luôn gấp 2,5-3 lần so với đốichứng là dung dịch Cry A Kết quả là nồng độ Cry A trong máu thỏ thí nghiệm luônluôn cao hơn so với nhóm đối chứng và hấp phụ trong dung dịch chitosan

El-Shabori (2002) nghiên cứu chế tạo hạt nano chitosan để cố định thuốccycloporin A để uống, kích thước hạt nano là 150 nm Kết quả cho thấy hiệu suấtmang thuốc là 94%, nồng độ cycloporin A trong máu là 2760 ng/ml cao gấp 2,5 lần

so với hạt nano sodium glycolate Hoạt tính của cyclosporin A cố định trong hạtnano chitosan tăng 72%, gelatin nano chitosan chỉ tăng 18%, riêng sodiumglicholate lại giảm tới 36% so với đối chứng

Xinge Zhang (2008) nghiên cứu làm tăng khả năng hấp thu insulin qua niêmmạc mũi bằng hạt nano chitosan và PEG-nano chitosan, kích thước hạt nano là 150-

300 nm Hiệu quả hấp thu insulin qua niêm mạc mũi thỏ ở mẫu PEG-nano chitosancao hơn so với PEG-chitosan là 30-40% Kích thước hạt nano càng nhỏ, diện tích bềmặt hạt càng lớn và điện tích dương trên bề mặt càng cao là nguyên nhân ảnhhưởng đến khả năng hấp thu insulin vào máu qua niêm mạc mũi Shedaghi (2008)

Trang 21

hạt nano chitosan trimetyl để làm vật liệu li giải chậm insulin Kết quả cho thấyđộng học ly giải của insulin nhốt trong hạt nano chitosan trimetyl ổn định và kéo dàihơn.

Kevin (2001) sử dụng hạt nano chitosan mang thuốc doxobucin (DOX),anthracyline

Zing Zhang (2007) nghiên cứu phức hợp nano oleyl-chitosan (OCH) mangthuốc thải chậm doxorubicine trong phòng trị ung thư Hiệu suất hấp phụ thuốc là52,6% Động học ly giải chậm thuốc phụ thuộc pH môi trường được ghi nhận tronghình cho thấy lượng pH 7,4 tốc độ ly giải thấp hơn trong môi trường acid pH 3,8

Shadeghi (2008) nghiên cứu hấp phụ insulin trên vật liệu nano chitosan, nanodietylmetylchitosan (DEMC) và nano trimetylchitosan (TMC) Kết quả về động học

ly giải chậm insulin khá ổn định cho cả ba vật liệu hạt nano [3]

1.4.2 Chất mang dẫn truyền vaccine

Một lượng lớn protein kháng nguyên và chữa bệnh đã được phát hiện Tuynhiên, ứng dụng chúng còn khó khăn do phương pháp dẫn truyền protein thích hợpchưa có sẵn Việc tạo ra những chất mang để dẫn vaccine qua những lớp niêm mạc,

ví dụ niêm mạc ruột và mũi đã được thử nghiệm Được dùng làm chất mangvaccine, chitosan được chuyển thành những dạng khác nhau: dạng viên, dạng hạt,hạt micro và hạt nano Các thông tin tích lũy trong những năm qua cho thấy tầmquan trọng của kích thước và lợi thế của hạt nano so với hạt micro Cụ thể hơn, cácnhà nghiên cứu đã tìm thấy số lượng hạt nano qua biểu mô ruột nhiều hơn số lượnghạt micro Do đó, việc điều chế những hạt nano chitosan làm chất mang dẫn truyềnvaccine đã thu hút được nhiều chú ý [7]

Ana Vila (2004) nghiên cứu sử dụng hạt nano chitosan để mang vaccintetanus qua niêm mạc mũi Kích thước hạt nano là 350 nm, điện tích là +40 mV, cóhiệu suất mang vaccin tetanus là 50-60% Kháng thể IgG ở thí nghiệm sử dụng hạtnano chitosan cao gấp lần so với sử dụng kháng nguyên tetanus tự do sau 2 tuần,tăng gấp 15 lần sau 12 tuần và 25 lần sau 24 tuần Kháng thể đặc hiệu ở thí nghiệm

Trang 22

sử dụng hạt nano chitosan cao hơn so với đối chứng gấp 2,5 lần và tăng lên theothời gian từ 2-24 tuần [3].

Amadi (2007) nghiên cứu sử dụng trimetyl nano chitosan làm tá chất chomột tiểu đơn vị (subunit) của vaccin cúm H3N2 Kích thước hạt nano chitosan là

800 nm Hiệu suất hấp phụ kháng nguyên (LE) là 78%, khả năng hấp phụ khángnguyên (LC) là 13% (w/w) Kết quả miễn dịch cho thấy là các chỉ số miễn dịch HI,IgG ở thí nghiệm trimetyl nano chitosan là 103 và 105 cao hơn so với antigen trongđệm PBS là 0,8.102 và 103, và chỉ số IgG trong thí nghiệm sử dụng nano chitosancũng cao hơn 102 lần so với tá chất là dung dịch trimetyl chitosan [3]

Những hạt nano được điều chế bằng phương pháp vi nhũ và phương pháp tạonối ngang cộng hoá trị đều không thích hợp cho việc sử dụng làm chất dẫn vaccine.Trong khi đó những hạt nano chitosan tạo nối ngang với TPP sử dụng làm chất dẫnvaccine đã được nghiên cứu rộng rãi

Điểm đến của vaccine có thể ảnh hưởng đến hiệu quả hấp thu Các hạt nanochitosan cho thấy là chất dẫn truyền hiệu quả cho những nhiều phân tử lớn quađường mũi, khí quản, miệng và niêm mạc mắt (Janes, 2001; Van der Lubben, 2001;Takeuchi, 2001; Dyer, 2002) [7]

1.4.3 Chất mang dẫn truyền gen

Những hệ thống dẫn truyền không virus (non-virus) trong liệu pháp gen đãđược đề xuất để thay thế những vector virus Chúng làm giảm tối thiểu phản ứngmiễn dịch từ vật chủ Hơn nữa, chúng định được mục tiêu, dễ bảo quản và sản xuấtlượng lớn Những lợi thế này tạo động lực cho sự phát triển của chúng Polymecation được nhận thấy là chất mang hứa hẹn trong số những hệ thống dẫn truyềngen không virus Chất mang gen polyme nổi lên với hiệu quả chuyển gen, xác địnhmục tiêu điều trị và khả năng tương thích sinh học tốt

Chitosan là một vector không virus thích hợp cho dẫn truyền gen Tương tácgiữa chitosan và DNA là tương tác tĩnh điện (Roy, 1997; MacLaughlin, 1998) Tương tác điện này mạnh đến nỗi phức chitosan-DNA không bị tách ra cho đến khi

nó vào trong tế bào Chitosan và những dẫn xuất của chitosan tụ lại bảo vệ DNA

Trang 23

khỏi sự phân hủy DNAse Những hạt nano chitosan/DNA có khoảng phân bố kích

cỡ hẹp được tạo ra bởi quá trình giọt tụ Những hạt nano chitosan/DNA có kíchthước từ 20-500 nm nhỏ hơn những hệ thống polyme khác nên thâm nhập vào tếbào thuận lợi hơn qua cơ chế endocytosis và/hoặc pynocytosis, làm tăng tốc độ gâynhiễm (Mao, 1997; Sato, 2001)

Những hệ thống dẫn truyền gen dựa trên chitosan cũng có thể gắn thêmligand để có tương tác tế bào cụ thể, như transferrin hoặc galactose (Mutara, 1996;Erbacher, 1998; Park, 2001; Christopher, 2001; Gao, 2003; Kim, 2004)

Kết quả nghiên cứu trong ống nghiệm và trong cơ thể sống đều cho thấy khihạt nano chitosan/DNA vào trong cơ thể, chúng nhanh chóng di chuyển khỏi máu

và bám trên những cơ quan khác nhau Kích cỡ hạt khác nhau thì phân bố trênnhững cơ quan khác nhau (Mao, 2001; Yoo, 2005) Hàng loạt nghiên cứu trong ốngnghiệm và trong cơ thể sống cho thấy chitosan là vật liệu thích hợp để dẫn truyềnvaccine DNA và gen không virus [7]

1.4.4 Ứng dụng trong thực phẩm chức năng

Sự phát triển những thực phẩm có hoạt tính sinh học có lợi cho sức khỏe tạo

ra cơ hội nâng cao sức khỏe cộng đồng Kết hợp những chất có hoạt tính sinh họcvào trong thực phẩm như peptid, vitamin là cách thức đơn giản để tạo ra những thựcphẩm chức năng mang lợi những lợi ích sinh lý và giảm thiểu những rủi ro bệnh tật.Tuy nhiên, hiệu quả ngăn chặn bệnh của những sản phẩm này nằm ở khả năng bảoquản được hoạt tính sinh học của những thành phần hoạt tính Đây là một tháchthức lớn bởi vì hầu hết các phân tử này có thời gian lưu giữ trong dạ dày ngắn, tínhthấm và độ tan kém trong ruột Hơn nữa chúng không bền trong những điều kiệnchế biến thực phẩm hoặc trong bộ máy tiêu hóa (pH, enzym, sự hiện diện của nhữngdưỡng chất khác) Những hệ thống bao giữ (encapsulation system) có thể được sửdụng để vượt qua những giới hạn này Tuy nhiên, vì được dùng trong những ứngdụng thực phẩm, những hệ thống dẫn truyền phải được công nhận là an toàn [5]

Trong số những hệ thống dẫn truyền này, hạt nano chitosan thu hút nhiều chú

ý trong những năm gần đây do khả năng bám dính vào niêm mạc và xuyên qua lớp

Trang 24

niêm mạc Kích thước nhỏ giúp chúng kéo dài thời gian lưu giữ trong bộ máy tiêuhóa Những công trình mới nhất cũng chỉ ra toàn bộ những hạt nano chitosan có thểđược hấp thu vào tế bào người [6].

Β-lactoglobulin (βlg), một loại protein chính trong sữa của động vật nhai lại,

đã được dùng nhiều trong thực phẩm do có giá trị dinh dưỡng Khả năng tạo gel,nhũ tương cho phép chúng trở thành nguyên liệu lý tưởng để bao giữ các hợp chất

có hoạt tính sinh học Nó còn có khả năng kháng lại sự phân rã do pepsin có trong

dạ dày

Lingyun Chen (2005) điều chế những hạt nano core-shell lactoglubulin làm chất mang dưỡng chất Những hạt nano chitosan được phủ lớpprotein βlg này có khả năng bảo vệ những chất dinh dưỡng chống lại acid và pepsintrong dạ dày Khi tiến vào đường ruột, lớp phủ βlg bị phân rã bởi pancreatin, còn hạtnhân chitosan bám vào trong thành ruột, tạo thuận lợi cho sự hấp thu dưỡng chất

chitosan/β-Như vậy hạt nano chitosan phủ βlg có hai tác dụng: lớp vỏ bảo vệ dưỡngchất trong dạ dày còn hạt nhân cải thiện thời gian lưu giữ dưỡng chất trong thànhruột, đồng thời điều khiển tốc độ phóng thích chúng

Protein thực phẩm đã được điều chế thành nhiều loại chất nền ở dạng gel, hạtmicro, hạt nano đáp ứng yêu cầu cho những ứng dụng trong thực phẩm chức năng.Khả năng kiểm soát kích cỡ hạt protein quyết định tốc độ phóng thích dưỡng chất

và lượng hấp thu vào cơ thể Ở dạng gel và hạt micro, những dưỡng chất đượcphóng thích khỏi chất nền để hấp thu vào thành ruột Trong khi đó, hạt nano cảithiện khả năng hấp thu dưỡng chất bằng cách kéo dài thời gian lưu giữ trong thànhruột hoặc hấp thu trực tiếp bởi biểu mô ruột

Trang 25

Hình 1.7 Hình minh họa những cơ chế hấp thu dưỡng chất

1.4.5 Hoạt tính kháng khuẩn

Hoạt tính kháng khuẩn của chitosan được nghiên cứu trong nhiều tài liệu.Theo những nghiên cứu trước, hoạt tính kháng khuẩn của chitosan trong môi trườngacid là do sự proton hóa nhóm NH2 tại vị trí C2 của D-glucosamin Chitosan mangđiện dương sẽ tạo nối trên bề mặt tế bào vi khuẩn mang điện âm, phá vỡ màng bằngcách làm thoát những thành phần chứa bên trong hoặc bằng cách ức chế sự truyềndưỡng chất vào trong tế bào [24]

Hạt nano chitosan có diện tích tiếp xúc và điện tích dương lớn hơn chitosanthông thường nên có hiệu quả kháng khuẩn cao hơn nhiều lần so với chitosan L Qi(2004) nghiên cứu chế tạo nano chitosan để tăng hoạt tính kháng khuẩn Hạt nanochitosan được chuẩn bị bằng phương pháp tạo gel trong tripolyphosphat (TPP), kíchthước hạt 40 nm Các thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của hạt nano chitosan trên

4 loại vi khuẩn E coli, S typhimurium, S choleraesuis và S aureus cho thấy hoạt

Trang 26

tính kháng khuẩn tăng lên nhiều lần so với chitosan Nồng độ ức chế tối thiểu(MIC) của hạt nano chitosan là 1/8-1/32 μg/ml so với chitosan là 8-16 μg/ml vàkháng sinh doxycyline là 1/4-4 μg/ml.

Bảng 1.2 Chỉ số MIC (μg/ml ) và MBC (μg/ml) của chitosan, nano chitosan

(CNP), nano chitosan nhốt Cu (CNP-Cu) và doxycycline.

Hình 1.8 Ảnh hiển vi lực nguyên tử (AFM) của tế bào S choleraesuis sau khi

xử lý với nano chitosan theo thời gian Chưa xử lý (A), xử lý 30 phút (B), xử lý 1

giờ (C), xử lý 1,5 giờ (D), xử lý 2 giờ (E), xử lý 3 giờ (F).

Hình thái của vi khuẩn S choleraesuis xử lý với nano chitosan được chụp

bằng AFM (hình 1.8) Khi xử lý vi khuẩn với lượng hạt nano chitosan là 64 μg/mltrong 30 phút, những tế bào này bị bao quanh bởi hạt nano Khi xử lý được 60 phút,

Trang 27

tế bào từ dạng hình cầu bị thoái biến thành dạng đặc bất thường Khi xử lý lâu hơn,những tế bào này bị phá vỡ làm thoát những thành phần bên trong, tróc màng và

thủng Những tế bào S choleraesuis vỡ thành mảnh sau khi xử lý được 3 giờ [24].

Wen-Li Du (2009) cũng nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của những hạtnano chitosan tripolyphosphat mang nhiều kim loại khác nhau như Ag+, Cu2+, Zn2+,

Mn2+ và Fe2+ Những vi khuẩn được chọn để thử nghiệm là Escherichia coli 25922,

Salmonella choleraesuis ATCC 50020 và Staphylococcus aureus 25923 Nồng độ

ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) được tiến hành trongphòng thí nghiệm [9] Kết quả được nêu trong bảng 1.3

Bảng 1.3 Giá trị MIC và MBC ức chế E coli, S choleraesuis và S aureus

Hoạt tính kháng khuẩn của nano chitosan đặc biệt tăng khi nhốt Cu2+ và Zn2+

1.5 Tổng quan về protein bovine serum albumin (BSA)

1.5.1 Protein

Trang 28

Protein (Protit hay Đạm) là những đại phân tử được cấu tạo theo nguyên tắc

đa phân mà các đơn phân là axít amin Chúng kết hợp với nhau thành một mạch dàinhờ các liên kết peptide (gọi là chuỗi polypeptide) Các chuỗi này có thể xoắn cuộnhoặc gấp theo nhiều cách để tạo thành các bậc cấu trúc không gian khác nhau củaprotein [34]

1.5.1.1 Cấu trúc của protein

• Axit amin - đơn phân tạo nên protein

Protein là một hợp chất đại phân tử được tạo thành từ rất nhiều các đơn phân

là các axit amin Axit amin được cấu tạo bởi ba thành phần: một là nhóm amin

(-NH2), hai là nhóm cacboxyl (-COOH) và cuối cùng là nguyên tử cacbon trung tâmđính với 1 nguyên tử hyđro và nhóm biến đổi R quyết định tính chất của axit amin.Người ta đã phát hiện ra được tất cả 20 axit amin trong thành phần của tất cả cácloại protein khác nhau trong cơ thể sống Các axit amin được liệt kê đầy đủ dướibảng 1.4

Bảng 1.4 Tên các acid amin-đơn phân tạo nên protein

Trang 29

• Các bậc cấu trúc của protein

Người ta phân biệt ra 4 bậc cấu trúc của protein

•Cấu trúc bậc một : Các axit amin nối với nhau bởi liên kết peptit hình thànhnên chuỗi polypeptide Đầu mạch polypeptide là nhóm amin của axit amin thứnhất và cuối mạch là nhóm cacboxyl của axit amin cuối cùng Cấu trúc bậc mộtcủa protein thực chất là trình tự sắp xếp của các axit amin trên chuỗi polypeptide.Cấu trúc bậc một của protein có vai trò tối quan trọng vì trình tự các axit amintrên chuỗi polypeptide sẽ thể hiện tương tác giữa các phần trong chuỗipolypeptide, từ đó tạo nên hình dạng lập thể của protein và do đó quyết định tínhchất cũng như vai trò của protein Sự sai lệch trong trình tự sắp xếp của các axitamin có thể dẫn đến sự biến đổi cấu trúc và tính chất của protein

•Cấu trúc bậc hai : là sự sắp xếp đều đặn các chuỗi polypeptide trong khônggian Chuỗi polypeptide thường không ở dạng thẳng mà xoắn lại tạo nên cấu trúcxoắn α và cấu trúc nếp gấp β, được cố định bởi các liên kết hyđro giữa nhữngaxit amin ở gần nhau Các protein sợi như keratin, collagen (có trong lông, tóc,móng, sừng) gồm nhiều xoắn α, trong khi các protein cầu có nhiều nếp gấp βhơn

Trang 30

•Cấu trúc bậc ba : Các xoắn α và phiến gấp nếp β có thể cuộn lại với nhauthành từng búi có hình dạng lập thể đặc trưng cho từng loại protein Cấu trúckhông gian này có vai trò quyết định đối với hoạt tính và chức năng của protein.Cấu trúc này lại đặc biệt phụ thuộc vào tính chất của nhóm -R trong các mạchpolypeptide Chẳng hạn nhóm -R của cystein có khả năng tạo cầu đisulfur(-S-S-), nhóm -R của prolin cản trở việc hình thành xoắn, từ đó vị trí của chúng

sẽ xác định điểm gấp, hay những nhóm -R ưa nước thì nằm phía ngoài phân tử,còn các nhóm kị nước thì chui vào bên trong phân tử Các liên kết yếu hơn nhưliên kết hyđro hay điện hóa trị có ở giữa các nhóm -R có điện tích trái dấu

•Cấu trúc bậc bốn : Khi protein có nhiều chuỗi polypeptide phối hợp với nhauthì tạo nên cấu trúc bậc bốn của protein Các chuỗi polypeptide liên kết với nhaunhờ các liên kết yếu như liên kết hyđro

1.5.1.2 Chức năng của protein

Bảng 1.5 Các loại protein chức năng.

Loại protein Chức năng Ví dụ

Protein cấu trúc Cấu trúc, nâng

đỡ

Collagen và Elastin tạo nên cấu trúc sợi rấtbền của mô liên kết, dây chẳng, gân Keratintạo nên cấu trúc chắc của da, lông, móng

Trang 31

Protein tơ nhện, tơ tằm tạo nên độ bền vữngcủa tơ nhện, vỏ kén

Protein Enzyme

Xúc tác sinh học:

tăng nhanh, chọnlọc các phản ứngsinh hóa

Các Enzyme thủy phân trong dạ dày phângiải thức ăn, Enzyme Amylase trong nướcbọt phân giải tinh bột chín, Enzyme Pepsinphân giải Protein, Enzyme Lipase phân giảiLipid

Protein

Hormone

Điều hòa cáchoạt động sinh lý

Hormone Insulin và Glucagon do tế bào đảotụy thuộc tuyến tụy tiết ra có tác dụng điềuhòa hàm lượng đường Glucose trong máuđộng vật có xương sống

Protein vận

chuyển

Vận chuyển cácchất

Huyết sắc tố Hemoglobin có chứa tronghồng cầu động vật có xương sống có vai tròvận chuyển Oxy từ phổi theo máu đi nuôicác tế bào

Protein vận động

Tham gia vàochức năng vậnđộng của tế bào

và cơ thể

Actinin, Myosin có vai trò vận động cơ.Tubulin có vai trò vận động lông, roi của cácsinh vật đơn bào

Protein thụ quan

Cảm nhận, đápứng các kíchthích của môitrường

Thụ quan màng của tế bào thần kinh kháctiết ra (chất trung gian thần kinh) và truyềntín hiệu

Protein dự trữ Dự trữ chất dinh

dưỡng

Albumin lòng trắng trứng là nguồn cung cấpaxit amin cho phôi phát triển Casein trongsữa mẹ là nguồn cung cấp Acid Amin chocon Trong hạt cây có chứa nguồn protein dựtrữ cần cho hạt nảy mầm

1.5.2 Bovine serum albumin (BSA)

BSA là một protein albumin huyết thanh có nhiều ứng dụng trong hóa sinhhọc bao gồm thử nghiệm Elisa, kỹ thuật thấm miễn dịch, hóa mô miễn dịch Nócũng được sử dụng làm dưỡng chất trong nuôi cấy tế bào và vi khuẩn Trong hệ tiêuhóa, BSA được sử dụng để làm bền hóa một vài loại enzim trong suốt quá trình tiêuhóa DNA và ngăn cản enzim bám dính vào ống phản ứng BSA cũng thường được

Trang 32

sử dụng để định lượng protein khác bằng cách so sánh lượng protein chưa biết vớinhững lượng BSA đã biết BSA được sử dụng do nó bền, không ảnh hưởng đếnnhiều phản ứng sinh hóa và giá thành thấp vì nó dễ dàng tinh chế từ máu bò, mộtsản phẩm phụ trong ngành công nghiệp gia súc [33].

Trong luận văn này, chúng tôi chọn BSA làm protein mô hình (model protein)

để khảo sát khả năng hấp phụ protein trên hạt nano chitosan nhằm mục đích ứngdụng trong dẫn truyền thuốc

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 2.1 Hóa chất và dụng cụ-thiết bị

Trang 33

• NaOH 96%, Trung Quốc.

• HCl, Trung Quốc

• CH3COOH, 99,5%, Trung Quốc

• Nước khử ion, Merck (Công ty dược phẩm Domesco, Đồng Tháp cung cấp)

• Bovine serum albumin (BSA)

Trang 34

• Máy FE-SEM JSM 7401F, Nhật (Phòng thí nghiệm công nghệ nano, Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh).

• Máy TEM, JEM-1400, Nhật (Phòng Thí nghiệm trọng điểm quốc gia về Vậtliệu Polyme và Composit, ĐH Bách Khoa, Tp HCM)

• Máy nhiễu xạ tia X BRUKER XRD-D8 ADVANCE, Đức (Viện Khoa họcVật liệu ứng dụng)

• Máy đo phổ FT-IR BRUKER EQUINOX 55, Đức (Phòng thí nghiệm trungtâm, ĐH KHTN, Tp HCM)

• Máy đo phổ Raman HORIBA JOBIN YVON, Nhật (Phòng Thí nghiệm CôngNghệ Nano, Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh)

2.2 Nội dung nghiên cứu

Với mục tiêu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến kích thước và sự phân bốcủa hạt nano chitosan để thu được hạt nano chitosan có kích thước nhỏ, đồng đềulàm chất hấp phụ protein nhằm ứng dụng trong dẫn truyền thuốc, chúng tôi tiếnhành nghiên cứu các nội dung chính sau:

• Khảo sát đặc điểm nguyên liệu chitosan

• Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến kích thước và sự phân bố hạt nanochitosan

• Khảo sát đặc điểm hóa lý của hạt nano chitosan

• Khảo sát khả năng hấp phụ protein của hạt nano chitosan

Quá trình nghiên cứu tổng quát theo hình 2.1

Trang 35

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu.

2.2.1 Phân tích đặc điểm của nguyên liệu chitosan

Đặc điểm của nguyên liệu chitosan được khảo sát bằng nhiều phương phápkhác nhau như: phương pháp sắc ký thẩm thấu gel GPC để đo khối lượng phân tửchitosan, phương pháp chụp ảnh FE-SEM để xác định hình dạng nguyên liệu,phương pháp phổ nhiễu xạ tia X (XRD) để xem xét mức độ tinh thể của nguyên liệu

và phương pháp chụp phổ IR, Raman để xác định cấu trúc nguyên liệu ban đầu

TPP

(hoặc glutaraldehid)

Chitosan

1/ Ly tâm 17000 vòng/phút, 30 phút2/ Rửa với nước cất hai lần

3/ Đông cô tại -80 oC; 76 giờ; 0,001 mBar

Nano chitosan khô

Chụp phổ IR, RAMAN, XRD Chụp ảnh FESEM, TEM

Trang 36

Nhỏ từ từ TPP (hoặc glutaraldehid) vào dung dịch chitosan trong điều kiệnkhuấy từ tốc độ 1500 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ

Hình 2.2 Máy đo pH IQ Scientific Instruments (A), máy khuấy từ IKA RET

control-visc (B).

Dung dịch sau phản ứng được ly tâm bằng máy ly tâm UNIVERSAL 32RHETTICH ZENTRIFUGEN với tốc độ 17000 vòng/phút trong 30 phút thu hạt nanochitosan Rửa hạt nano, lặp lại nhiều lần với nước khử ion

Hình 2.3 Máy ly tâm UNIVERSAL 32R HETTICH ZENTRIFUGEN.

Trang 37

Hạt nano chitosan được đông khô bằng máy đông cô TELSTARLYOQUEST ở nhiệt độ -80 oC, áp suất 0,001 mBar trong 72 giờ tại công ty dượcphẩm Domesco, Đồng Tháp Sản phẩm bột nano chitosan thu được được bảo quảntrong tủ lạnh

Hình 2.4 Máy đông cô TELSTAR LYOQUEST.

Trong đề tài này, các yếu tố ảnh hưởng đến sự phân bố kích cỡ và kích cỡ hạt

đã được khảo sát nhằm tìm ra điều kiện thích hợp nhất để tạo hạt nano chitosan như:

• Phương pháp điều chế

• Tỷ lệ chitosan:TPP (CS/TPP)

• pH dung dịch

Các chỉ tiêu theo dõi gồm:

• Kích thước trung bình hạt nano chitosan (nm)

• Sự phân bố kích thước hạt (nm)

Hạt nano chitosan được chụp và xác định kích thước bằng kính hiển vi điện

tử quét phát xạ trường FE-SEM Sự phân bố kích thước hạt nano chitosan được xácđịnh bằng cách đo kích thước ngẫu nhiên của 30 hạt nano chitosan bằng phần mềmUTHSCSA Image Tool 3.00

Chỉ tiêu cần đạt: kích thước hạt nano chitosan từ 50-500 nm

Trang 38

Các đặc tính hóa lý của hạt nano chitosan cũng được khảo sát và đánh giádựa trên các phương pháp phân tích hóa lý như: FT-IR, Raman, XRD, FE-SEM vàTEM.

Thử nghiệm được lặp lại nhiều lần để kiểm tra độ chính xác của thử nghiệm.Kết quả được lựa chọn và trình bày như là kết quả đại diện

2.2.3 Phương pháp phân tích hóa lý

2.2.3.1 Phương pháp đo sắc ký thẩm thấu gel GPC

Khối lượng phân tử của nguyên liệu chitosan được đo trên máy sắc ký thẩmthấu gel-Gel Permeation Chromatography (GPC) AGILENT 1100 Series (hình 2.5)của Phòng Thí Nghiệm Trung Tâm, ĐH KHTN, Tp Hồ Chí Minh

Hình 2.5 Máy sắc ký thẩm thấu gel GPC AGILENT 1100 Series.

2.2.3.2 Phương pháp chụp ảnh FE-SEM

Ảnh kính hiển vi điện tử quét phát xạ trường - Field Emmission ScanningElectron Microscopy (FE-SEM) của chitosan và hạt nano chitosan được chụp bằngmáy FE-SEM JSM 7401F (hình 2.6) của Phòng Thí Nghiệm Công Nghệ Nano, ĐạiHọc Quốc Gia Tp Hồ Chí Minh

Trang 39

Hình 2.6 Hệ thống hiển vi điện tử quét phát xạ trường FE-SEM JSM 7401F.

2.2.3.3 Phương pháp chụp ảnh TEM

Ảnh kính hiển vi điện tử truyền qua - Transmission ElectronMicroscopy (TEM) của hạt nano chitosan chụp bằng máy JEM-1400 của PhòngThí Nghiệm Trọng Điểm Quốc Gia - Vật liệu Polyme và Composit (hình 2.7)

Trang 40

Hình 2.7 Hệ thống hiển vi điện tử truyền qua JEM-1400

2.2.3.4 Phương pháp nhiễu xạ tia X (XRD)

Mức độ tinh thể của chitosan và hạt nano chitosan được đánh giá thông quagiản đồ nhiễu xạ tia X của chúng Giản đồ nhiễu xạ tia X được đo trong khoảng 2θ

từ 4o đến 70o trên máy nhiễu xạ tia X BRUKER XRD-D8 ADVANCE (hình 2.8) củaViện Khoa Học Vật Liệu Ứng Dụng, T.p Hồ Chí Minh

Hình 2.8 Máy nhiễu xạ tia X Bruker XRD-D8 ADVANCE

2.2.3.5 Phương pháp phổ hồng ngoại biến đổi Furie FT-IR

Phổ IR của chitosan và nano chitosan được chụp bằng máy đo phổ

FT-IR BRUKER EQUINOX 55 của Phòng Thí Nghiệm Trung Tâm, ĐH KHTN, Tp

Hồ Chí Minh (hình 2.9) Để thu phổ, một lượng nhỏ chất cần khảo sát được trộn vớiKBr và nén thành dạng viên Phổ FT-IR đạt được trong khoảng tần số 399,255-4000,27 cm-1, độ phân giải là 4 cm-1

Định dạng
Số trang	105
Dung lượng	13,81 MB