do an collagen ky thuat hoa hoc

Hydroxyproline được hình thành sau quá trình điềuchỉnh proline khi được kết hợp vào vị trí Y trong chuỗi Gly-X-Y.Hydroxyproline có công thức phân tử là C5H9NO3, khác với proline,trong cô

CHƯƠNG 1: COLLAGEN

1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ COLLAGEN

1.1.1 Khái quát về Collagen [2]

 Collagen là một protein có cấu trúc bậc 4 điển hình, docác đơn vị tropocollagen

cấu trúc bậc 3 tổ hợp theo các hướng dọc và ngang làm collagencó nhiều mức cấu trúc Collagen là loại protein cấu trúc chính yếu,chiếm khoảng 25% - 35% tổng lượng protein trong cơ thể ở cácđộng vật có xương sống Collagen được phân bố trong các bộphận như da, cơ, gân, sụn, răng, hệ thống mạch máu của độngvật và có mặt trong các lớp màng liên kết bao quanh các cơ vàlà thành phần chính của dây chằng và gân, Khoảng 10% proteintrong cơ ở động vật có vú là collagen, các protein ngoại bào (hơn90% trong gân, xương và khoảng 50% trong da) có chứa collagen

 Trong thành phần của da, collagen chiếm khoảng 70% cấutrúc da và được phân

bố chủ yếu ở lớp hạ bì của da, tạo ra một hệ thống nâng đỡ,hỗ trợ các đặc tính cơ học của da như : sức căng, độ đàn hồi, duytrì độ ẩm, Nó đóng vai trò kết nối tế bào, kích thích quá trìnhtrao đổi chất, tạo độ đàn hồi cho da Sự suy giảm về số lượng vàchất lượng collagen sẽ dẫn đến hậu quả lão hóa của cơ thể màsự thay đổi trên làn da, khuôn mặt là dấu hiệu dễ nhận biếtnhất: làn da bị khô, nhăn nheo bắt đầu từ các đường nhănmảnh trên khóe mắt, khóe miệng, lâu dần thành nếp nhănsâu, các đường nét khuôn mặt bị chùng nhão và chảy xệ Tùytheo từng độ tuổi, điều kiện sống và tác động của môi trường,

da có thể bị lão hóa hoặc tổn thương , khi đó sợi collagen sẽ mấtdần tính đàn hồi và săn chắc do cấu trúc collagen bị phá hủy.Chính vì vậy mà collagen đóng vai trò là một trong những chất quan

trọng hàng đầu của ngành thẩm mỹ, đặc biệt là chăm sóc da,phẫu thuật thẩm mỹ, phẫu thuật bỏng

 Collagen cũng được phân bố ở giác mạc, và tồn tạidưới dạng tinh thể Trong

mô cơ, collagen chiếm khoảng từ 1% đến 2% Trong cơ thể người,collagen chiếm từ 20 – 25% protein của cơ thể

 Collagen là thành phần chính của mô liên kết, có chứcnăng tạo độ vững chắc

và đàn hồi Collagen có tác dụng giống như một chất keo liênkết các tế bào lại với nhau để hình thành các mô và cơ quannền tảng trong cơ thể Collagen cung cấp cho các mô liên kếtnhững đặc tính nổi trội nhờ vào sự hiện diện rộng khắp và sựsắp xếp mang tính cấu trúc của nó Theo quan điểm y sinh, collagenđóng vai trò quan trọng trong sự phát triển, hàn gắn vết thương, làthành phần hoạt hoá các tiểu cầu trong máu và sự hình thànhmạch Thêm vào đó sự phát triển của một số bệnh di truyềnđược xác định là do sự đột biến trong cấu trúc gen của collagen.Những rối loạn trong quá trình tổng hợp hoặc phân giải collagenđều được ghi lại như là nguyên nhân của nhiều căn bệnh phứctạp như chứng viêm khớp, xơ gan, bệnh đái đường và ung thư cũngnhư những bệnh có liên quan đến sự lão hoá Collagen phân bốkhắp nơi trong cơ thể, từ chỗ gân nối bắp chân với gót chân chotới giác mạc Trong gân và dây chằng, collagen có tác dụngtruyền lực từ cơ sang xương và tích trữ năng lượng đàn hồi Chínhnhờ tính chất này mà cơ thể có thể di chuyển, vận động mộtcách nhịp nhàng và uyển chuyển Collagen còn là chất nền hữu

cơ có trong xương và men răng giúp chúng chống lại sự rạn nứt.Nó là thành phần chính trong da, mạch máu, các cơ Bên cạnh các

chức năng cơ học, ở giác mạc, thủy tinh thể, trật tự cấu trúccủa các sợi collagen tạo nên sự trong suốt duy trì thị lực

 Collagen được xem như một vật liệu mang tính xây dựng.Sự linh hoạt của nó

là nhờ vào cấu trúc cấp bậc phức tạp, tạo nên sự đa dạng trongtính chất nhằm phục vụ những chức năng nhất định Xét về mặtkinh tế, nguồn nguyên liệu giàu collagen dùng để sản xuất ragelatine- chất có nhiều ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau:thực phẩm, y học và dược phẩm, mỹ phẩm, công nghệ nhiếp

ảnh,

1.1.2 Lịch sử phát triển của Collagen

Theo tiếng Hy Lạp, collagen có nghĩa là “người sản xuấtkeo hồ”, nói đến quá trình nấu da và gân của ngựa cùng nhữngloài động vật khác để thu được hồ Keo dán collagen đã đượcngười Ai Cập sử dụng cách đây 4000 năm và người Mỹ sử dụngnó cách đây khoảng 1500 năm

Từ hơn 2000 năm trước, con người đã biết sử dụng môliên kết và sản phẩm của nó trong chế biến thực phẩm để tạo

ra các sản phảm dạng gel, các chất dính Người Ai Cập cổ đại đãsản xuất ra được collagen và những nghiên cứu cho thấy trongnhững thế kỉ tiếp theo đã thật sự xuất hiện collagen trong cácbữa tiệc, ví dụ trong món cá hồi hay bánh hoa quả,

Năm 1682, một người Pháp tên Papin đã công bố mộtkết quả là đã thu được một hỗn hợp giống jelly từ xương Từ năm

1700, thuật ngữ collagen trở nên thông dụng

Năm 1754, bài báo đầu tiên trong lĩnh vực chất dính đượccông nhận ở Anh về việc sản xuất chất dán của một người thợlàm đồ gỗ Các chất hồ dán tự nhiên được sản xuất trên thànhphần cơ bản là collagen và một vài chất khác

Năm 1850, công nghiệp sản xuất collagen xuất hiện tạiMỹ, nguồn nguyên liệu chính lúc này là xương.

Năm 1871, một phát hiện quan trọng của bác sĩ ngườiAnh Richard Leach Maddox về ứng dụng của collagen đã đưa đếnbước đột phá trong ngành công nghiệp hình ảnh, vị bác sĩ đã cảitiến “dry plate” với một lớp gelatin – bạc bromua và còn nhạy hơnkhi so với “wet plate” Sau đó nghiên cứu của Charles Bennet đãtiếp tục hoàn thiện phương pháp dùng “dry plate” Ưu điểm lớnnhất của phương pháp này là giảm rất nhiều thời gian trong côngnghiệp nhiếp ảnh

Cuối thế kỉ 19, khi ngành công nghiệp sản xuất collagenxuất hiện đã làm tăng thêm các ứng dụng của collagen trongcác ngành công nghiệp khác và ổn định tính chất sản phẩm

Năm 1930, ngành sản xuất collagen được phát triển mạnhmẽ khi da heo được xem như là một nguồn nguyên liệu thu nhậncollagen Ngành công nghiệp sản xuất collagen ở Châu Âu chỉmới bắt đầu khoảng những năm 1930 nhưng Châu Âu lại trởthành khu vực sản xuất collagen quan trọng nhất trên thế giới

Năm 1950, công nghiệp sản xuất collagen có nhữngbước phát triển đáng kể về kĩ thuật, từ đó là nền tảng chocác tiêu chuẩn trong sản xuất và chất lượng sản phẩm ngày nay Ngày nay, sự hiểu biết về acid amin và protein nói chung,collagen cũng như gelatin nói riêng ngày càng nhiều Thêm vàođó là những tiến bộ trong kĩ thuật đã giúp sản phẩm collagenđạt an toàn vệ sinh, chất lượng theo tiêu chuẩn quốc tế và yêu

cầu nghiêm ngặt của các yếu tố kĩ thuật

1.1.3 Nguồn gốc thu nhận Collagen

 Trong những năm trước đây, để đáp ứng nhu cầu trongcông nghiệp, collagen

được trích ly chủ yếu từ da, xương của các loài gia súc và lợn.Khoảng thời gian gần đây, sự bùng phát của các loại bệnhtruyền nhiễm như bệnh bò điên (Bovine Spongiform Encephalopathy –BSE, Tranmissible Spongiform Encephalopathy – TSE) và bệnh lở mồmlong móng (Food and Mouth Disease – FMD) ở lợn và gia súc đã hạnchế phạm vi sử dụng của collagen có nguồn gốc từ những loàiđộng vật trên bởi vì những bệnh truyền nhiễm có khả năng lâytruyền sang con người thông qua các mô của động vật Bên cạnhđó, ở một số quốc gia, collagen trích ly từ lợn không được sử dụng

vì rào cản tôn giáo Với những nguyên nhân trên, các nhà khoahọc đang tập trung vào các nghiên cứu của họ để tìm ra nhữngnguồn collagen thay thế Da, xương, vây, vảy của cả những loài cánước ngọt, đặc biệt là cá da trơn: cá tra, cá ba sa, cá biển, dagà, da ếch, da mực,…có thể được sử dụng như những nguồn thaythế

 Trong số những nguồn thay thế, cá cung cấp mộtnguồn nguyên liệu thô tốt

nhất vì:

- Dễ tìm, sẵn có để sử dụng

- Không có sự lây truyền bệnh

- Không gặp phải trở ngại về mặt tôn giáo

- Có khả năng thu được collagen với hiệu suất cao Khoảng 70% tổng trọng lượng cơ thể của cá bị bỏ đi dướidạng các phế phẩm như da, xương, vây, đầu, vảy, ruột,…trong suốtquá trình chế biến Việc tận dụng những chất thải này có thểnâng giá trị kinh tế của các loài cá lên

 Dựa vào thành phần % của tổng lượng collagen tính trêntổng lượng protein,

các loài cá được chia thành 3 nhóm:

 Nhóm có hàm lượng collagen thấp: tổng lượngcollagen chiếm

đến 5 % so với tổng lượng protein

 Nhóm có hàm lượng collagen trung bình : tổng lượngcollagen

chiếm từ 5  10 % tổng lượng protein

 Nhóm có hàm lượng collagen cao: tổng lượngcollagen trên

10 % tổng lượng protein

Thịt của những loài cá khác nhau chứa hàm lượng khácnhau của collagen hòa tan trong acid (acid soluble collagen) và collagenkhông hòa tan (insoluble collagen) Hàm lượng collagen tổng cộng daođộng từ 0,3  2,99 % so với trọng lượng tươi của các mô, tương ứngvới phạm vi từ 1,58  13,39 % so với tổng lượng protein

Bảng 1.1 Thành phần collagen trong thịt cá

Loại cá Collagen hòa tan

trong acid (so với trọng lượng

tươi)

Collagen không hòatan (so với trọng lượngtươi)

Collagen tổng (so với trọng lượngtươi)

Collagen tổng (so với protein tổng) Cá chim

Cho đến nay, hầu hết các loại mỹ phẩm trên nềncollagen đều có chứa protein chiết xuất từ gia súc Bởi sự bộcphát của bệnh bò điên BSE (Bovine Spongiform Encephalopathy – madcow disease), collagen từ gia súc đang dần rút khỏi phạm vi sử dụng,thay vào đó là nguồn collagen được trích từ cá, đặc biệt là cá datrơn: cá tra, cá ba sa Nguồn collagen được chiết tách từ nguồnnguyên liệu này có nhiều đặc điểm tốt hơn cho việc ứng dụngtrong thực phẩm, y học và mỹ phẩm Trong công nghệ sản xuấtmỹ phẩm, mỹ phẩm trên nền collagen từ gia súc có tốc độ hấpthụ rất chậm trên da người Đối mặt với vấn đề này, liệu pháptiêm collagen vào da được giới thiệu Tuy nhiên, những bất lợi củacách thức này là đắt tiền, đau đớn và đi kèm với nó là nhữngrủi ro nguy hiểm cho con người Hiện nay, các nhà khoa học Phần

Lan đã phát triển một tiến trình trích ly collagen từ cá Khônggiống với những loại collagen thu được từ những phương pháp trướcđây, collagen từ cá được hấp thụ hoàn toàn trên da người Vì cásống trong phạm vi rộng lớn với các điều kiện về nhiệt độ, độsâu và áp suất khác nhau Điều này có nghĩa là collagen trích từ

da cá có một sức chống chịu đặc biệt với các phá hủy lý vàhóa học

Đối với các thuốc hay thức uống có chứa collagen, collagentừ cá cũng được chứng minh là có tốc độ hấp thụ vào máunhanh hơn gấp 1,5 lần so với collagen từ lợn

Đồ thị so sánh khả năng hấp thụ vào máu của collagen

trích ly từ cá và từ lợn

 Việt Nam là một nước đang phát triển, có nền nôngnghiệp với các sản phẩm

So sánh khả năng hấp thụ vào máu giữa collagen từ cá và collagen từ lợn

Thời gian sau khi sử

phong phú Trong đó, các sản phẩm từ cá chiếm một phần lớntrong kim ngạch xuất khẩu Những năm gần đây, việc nuôi cá datrơn : cá tra, cá ba sa rất phát triển, đặc biệt ở Đồng bằng sôngCửu Long Trong quá trình chế biến cá, song song với những chínhphẩm dùng cho việc xuất khẩu (chủ yếu là fillet) là một khốilượng lớn các phụ phẩm như da, xương, vây,… Đây là những nguồngiàu collagen, có thể sử dụng thay thế cho những nguồn cung cấpCollagen cổ điển như da, xương từ lợn, bò Việc tận dụng nhữngnguồn này sẽ góp phần làm tăng giá trị kinh tế của các loàicá da trơn ở nước ta

1.2 CẤU TẠO COLLAGEN

1.2.1 1.2.1 Thành phần hóa học của Collagen [1]

 Thành phần protein trong collagen có gần đầy đủ cácloại acid amin, bao gồm

tất cả 20 loại acid amin ( Schrieber và Gareis,2007) Thành phần acidamin có thể thay đổi tùy theo nguồn gốc của collagen, nhưng vẫntồn tại một vài tính chất chung và duy nhất cho tất cả collagen Trong thành phần collagen không chứa cystein vàtrytophan, nhưng chứa một lượng lớn glycine (Gly), chiếm khoảng 33%và proline (Pro), chiếm tỉ lệ 12% và hydroxyproline (Hyp), chiếm tỉlệ 22% (Theo Balian và Bowes 1977) Collagen là một trong số ítnhững protein có chứa hydroxylysine (Hyl), ngoài ra trong thành phầnCollagen còn chứa khoáng, chiếm tỉ lệ 1%

Bảng 1.2 So sánh thành phần các acid amin trong collagen và các loại protein khác

(số gốc/1000 gốc)

 Hydroxyproline là một acid amin đặc trưng của collagenmà các loại protein

khác không có Hydroxyproline được hình thành sau quá trình điềuchỉnh proline khi được kết hợp vào vị trí Y trong chuỗi Gly-X-Y.Hydroxyproline có công thức phân tử là C5H9NO3, khác với proline,trong công thức cấu tạo của Hyp có gắn nhóm OH nằm ở vị trícacbon gamma, acid amin này có vai trò quan trọng trong sự ổn địnhcấu trúc của collagen, là dẫn xuất của proline trong quá trình hìnhthành chuỗi collagen có sự xúc tác của enzyme hydroxylase proline

và sự có mặt của Vitamin C để giúp bổ sung thêm Oxy, thiếuvitamin C sẽ làm chậm quá trình tổng hợp hydroxyproline, ảnhhưởng đến quá trình xây dựng cấu trúc protein gây ra những rốiloạn trong cơ thể.

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của hydroxyproline

 Phân tử collagen bao gồm 3 chuỗi xoắn lại với nhau tạothành collagen triple-

helix tạo thành cấu trúc 3D- một mô hình lý tưởng cho các liênkết hydro giữa các chuỗi ( Te Nijenhuis, 1997) Mỗi chuỗi trong triple-helix quay theo chiều kim đồng hồ Triple-helix dài xấp xỉ 300nm vàchuỗi có khối lượng phân tử khoảng 105 kDa (Papon, Leblon vàMeijer, 2007) Triple-helix được ổn định bởi liên kết hydro nội giữacác chuỗi Trong cấu trúc phân tử collagen, do tương tác giữa cácmạch polypeptide làm cho phân tử có những vùng kỵ nước vàvùng phân cực mang điện tích sẽ tạo nên khả năng háo nước

làm trương nở collagen Sự biến tính collagen làm cho các cầu nối

bị tách một phần hoặc hoàn toàn gây nên sự tách rời cácchuỗi do phá hủy các liên kết hydro, chính điều này làm mất đicấu trúc triple-helix Mô hình “ triple-helice” của collagen dựa trênnhững nghiên cứu về hiện tượng nhiễu xạ sợi Chuỗi nhiễu xạ sợithể hiện trên mức trung bình của toàn bộ phân tử collagen , vàmô hình đặc trưng thể hiện đó là sự sắp xếp lặp đi lặp lại củacác chuỗi polypeptid, thông thường là Gly-Pro-Hyp

 Một đặc điểm đặc trưng của collagen là sự sắp xếpđều đặn của các amino acid

trong mỗi mắt xích của từng chuỗi xoắn ốc collagen này Mỗi sợicollagen này được cấu tạo từ ba chuỗi polypeptid nối với nhau giốngnhư sợi dây thừng Cấu trúc của collagen tương tự như hình xoắn ốc,mỗi một chuỗi polypeptid trong collagen được cấu tạo từ các acidamin theo một trật tự, thông thường là Gly – Pro – Y, hoặc Gly – X –Hyp

Hình 1.3 Trình tự sắp xếp các acid amin trong phân tử Collagen

Trong đó X, Y là những đơn vị aminoacid khác nhau, cóthể là proline (Pro) và hydroxyproline ( Hyp) chiếm khoảng 1/6 chiềudài chuỗi Glycine chiếm gần 1/3 trong tổng số các amino acid vànó được phân bố một cách đều đặn tại vị trí mỗi 1/3 xuyên suốttrong phân tử collagen Do glycine có các nhánh phụ nhỏ nhất nênsự lặp lại của nó cho phép các chuỗi polypeptide kết hợp chặtchẽ với nhau hình thành nên một đường xoắn ốc với khoảngtrống nhỏ ở phần lõi Tổng cộng chỉ riêng proline, hydroxyprolinevà glycine đã chiếm ½ chuỗi Collagen Các acid amin còn lại chiếm

½

Bảng 1.3 Sự phân bố các amino acid trong chuỗi polypeptide

Triple helix Tỉ lệ so với tổng bộ ba(%)

Ngoài ra, trong phân tử collagen có những vùnggồm khoảng 9  26 amino acid tại các điểm đầu mút amino haycarboxyl của chuỗi Các vùng này không sáp nhập với cấu trúcxoắn ốc và được gọi là telopeptide.

1.2.2 Cấu trúc phân tử Collagen [1]

 Phân tử collagen là một protein hình trụ, có cấutrúc bậc 4, do các đơn vị

tropocollagen cấu trúc bậc 3 tổ hợp theo các hướng dọc và nganglàm collagen có nhiều mức cấu trúc Đơn vị cơ bản của collagenlà “Tropocollagen”, liên kết với nhau tạo thành những sợi nhỏ.Tropocollagen là một cấu trúc dạng sợi hình ống chiều dài khoảng300nm, đường kính 1.5nm, gồm ba sợi polypeptide (còn gọi là 3 chuỗiα) cuộn lại với nhau, mỗi chuỗi  cuộn thành đường xoắn ốc theohướng từ phải sang trái với 3 gốc trên một vòng xoắn, hay còngọi là proline I ( xoắn trái với 3.3 gốc aminoacid/ vòng, liên kếtpeptid có hình thể cis ), ba chuỗi này xoắn lại với nhau theo hướngtừ trái sang phải tạo thành đường bộ ba xoắn ốc (triple helix) haycòn gọi là proline II ( xoắn trái với 3 gốc aminoacid/ vòng, liên kếtpeptid có hình thể trans), khoảng cách giữa hai gốc tính từ hìnhchiếu của chúng lên các trục là 0,31nm Hai cấu trúc này có thểchuyển đổi cho nhau và thường thì dạng II trong môi trường nước thìbền hơn

Hình 1.4 Cấu trúc của Tropocollagen ( triple helix )

Các chuỗi collagen sắp xếp song song theo chiều dọc liênkết với nhau bằng các liên kết ngang tạo thành các sợi theo chukỳ nhất định Chúng được sắp xếp so le nhau một khoảng 67nm vàcó 1 khoảng trống 40nm ở giữa những phân tử liền kề nhau.Nhờ vào cấu trúc có trật tự, độ bền vốn có của các chuỗixoắn ốc được chuyển sang các sợi collagen, cung cấp cho các môđộ cứng, độ đàn hồi và những đặc tính cơ học riêng Vì thếcollagen rất chắc, dai và bền

Hình 1.5 Liên kết ngang giữa các phân tử

Tropocollagen

Các tropocollagen sẽ liên kết ngang với nhau theo kiểucộng hóa trị và chính nhờ vào liên kết này mà các phân tửtropocollagen hình thành nên sợi collagen Các sợi collagen rất dài vàmảnh, chúng sắp xếp tạo thành mạng collagen

 Bước 1: Tổng hợp chuỗi alpha, giai đoạn trước procollagen trênriboxom và trong mạng lưới nội chất.

 Bước 2: Sự tổ hợp 3 chuỗi alpha hình thành procollagen

 Sự hình thành cầu nối disulphide giữa các phần củachuỗi polypeptide tại đầu C-

 Ba chuỗi alpha liên kết lại, hình thành chuỗi xoắn ốc,tạo procollagen

 Bước 6: Tạo các liên kết ngang giữa các phân tử collagenđứng cạnh nhau.

Hình 1.7 Sự hình thành chuỗi xoắn ốc nội phân tử và giữa

các chuỗi polypeptide

Mỗi chuỗi polypeptide có khối lượng phân tử khoảng 100

kDa, tạo nên tổng khối lượng phân tử của collagen khoảng 300 kDa.Chuỗi  được cấu tạo bởi khoảng 1000 amino acid Các chuỗi khác nhau (1, 2 và 3) ở thành phần amino acid Sự phân bố củacác chuỗi 1, 2 và 3 trong các phân tử collagen khác nhau tùythuộc vào sự khác nhau về gene

1.2.3 Cấu trúc sợi của collagen [3]

 Phần lớn collagen trong mạng lưới ngoại bào được tìmthấy ở dạng sợi, bao

gồm những sợi mảnh, nhỏ Thông qua quá trình tạo sợi, các phântử collagen tổ hợp với nhau hình thành nên các vi sợi (microfibril) baogồm từ 4  8 phân tử collagen hoặc với số lượng nhiều hơn sẽ tạothành các sợi (fibril) Những sợi này có đường kính từ 10  500 nmtùy thuộc vào loại mô và giai đoạn phát triển Các sợi collagen sẽthiết lập nên các sợi lớn hơn (fiber) và cao hơn nữa là các bó sợi(fiber bundle).

Hình 1.8 Cấu trúc sợi của collagen

 Sợi collagen là các tổ hợp có cấu trúc bán kết tinhcủa các phân tử collagen

Các vi sợi kết hợp tạo nên sợi lớn hơn Các sợi lớn hơn sẽ kếthợp với nhau tạo thành những bó sợi collagen Các sợi collagenđược sắp xếp với những cách thức kết hợp và mức độ tập trungkhác nhau trong các mô khác nhau để cung cấp các đặc tính khácnhau của mô

Các chuỗi collagen sắp xếp song song theo chiều dọctạo thành các sợi với tính chu kỳ nhất định Chúng được sắp xếp

Chuỗi polypepti de

Phân tử collag en

Vi sợi Sơ

ïi

Bó sợi

so le nhau một khoảng 67 nm và có một khoảng trống khoảng 40

nm giữa những phân tử liền kề nhau

Nhờ vào cấu trúc có thứ bậc, độ bền vốn cócủa các chuỗi xoắn ốc được chuyển sang các sợi collagen, tạo chocác mô có được độ cứng, độ đàn hồi và những đặc tính cơ họcriêng biệt

Có vài liên kết bên trong mỗi chuỗi triple helix vàmột số lượng biến thiên các liên kết ngang giữa các chuỗi đểhình thành nên những tổ hợp có trật tự (như sợi collagen) Các bósợi lớn hơn được tạo nên nhờ vào sự trợ giúp của một vài loạiprotein (bao gồm những loại collagen khác nhau), glycoprotein vàproteolycan để hình thành các loại mô khác nhau từ sự sắp xếpluân phiên của những thành phần trên Sự không hòa tan củacollagen là một trở ngại cho việc nghiên cứu nó cho tới khi người

ta phát hiện tropocollagen có thể được trích ly từ những động vậtcòn non do chưa xảy ra liên kết ngang hoàn toàn Tuy nhiên, sựphát triển của kỹ thuật hiển vi (Electron Microscopy (EM) và AtomicForce Microscopy (AFM)) và sự nhiễu xạ tia X đã cho phép các nhànghiên cứu thu được những hình ảnh chi tiết về cấu trúc củacollagen Những tiến bộ này có ý nghĩa quan trọng trong việc hiểuđược cách thức mà collagen tác động lên mạng lưới tế bào, sựxây dựng, phát triển, phục hồi, thay đổi của mô trong quá trìnhphát triển

Hình 1.9 Sự sắp xếp của phân tử collagen trong một sợi

1.3 PHÂN LOẠI COLLAGEN [4]

 Tính đến thời điểm hiện tại, có 42 loại chuỗi polypeptideđược nhận dạng

Chúng được mã hóa bởi 41 loại gene khác nhau, tạo thành 27 loạicollagen Họ collagen được phân loại thành những phân họ khácnhau dựa vào sự tổ hợp của các siêu phân tử Sự phân bố trongcác mô của những loại protein khác nhau thể hiện tính đa dạng vàphạm vi đáng chú ý, từ những loại collagen riêng biệt như collagen

II, X có trong sụn đến những loại collagen dạng sợi phân bố rộngkhắp như collagen I và V Những loại collagen khác nhau thực hiệnnhững chức năng chuyên dụng trong các mô và có phương thứcsắp xếp riêng biệt của các siêu phân tử Một số loại được cấutạo từ một tam phân (homotrimer), trong khi đó những loại khácđược cấu tạo từ nhiều tam phân Loại collagen phong phú nhất lànhững collagen dạng sợi hình thành những nền tảng cấu trúc của

da, gân, xương, sụn và những loại mô khác

Hình 1.10 Một vài dạng sinh học của collagen

Dựa theo cấu trúc và cách tổ chức sắp xếp các phântử trong chuỗi, collagen được phân chia thành 7 nhóm chính : collagendạng hình sợi, FACIT collagen, collagen dạng mạng, collagen dạng giữchặt, collagen chuyển màng, collagen màng nền và các loại collagencó chức năng duy nhất khác Những loại collagen này khác nhauvề chiều dài của chuỗi xoắn ốc cũng như bản chất và kích cỡcủa những phần không xoắn ốc

Bảng 1.4 Phân loại và vị trí phân bố các loại collagen

dây chằng,giác mạc,

thể,

Collagen dạng

sợi

máu, lưới sọicủa cámô( phổi, gan,lách,

V α1(V), α2(V),α3(V) Phổi, giác mạc,

α2(VI),α3(VI) thành mạchSụn, phổi,

máu,

chuyển tiếpbiểu bì - da,niêm mạcmiệng, Dạng mạng lưới

chằng, gan,

mạch máu,phổi, cơ vân,

của con người

mạc, phôi da,xương ức sụn,gân,

máu,

Collagen chuyển

màng

tóc, ruột, sụnbào, phổi,gan,

tiếp biểu bì –da,

sợi, các tébào cơ trơn,thận, tụy,

sợi, phiếnkeratin,

Collagen loại I là phổ biến nhất và thường ở trong cácmô liên kết như da, xương, gân Collagen loại II hầu như tồn tại ởcác mô sụn Collagen loại III lại phụ thuộc rất lớn vào độ tuổi củađộng vật, da heo còn trẻ chứa tới 50%, theo thời gian tỷ lệ nàygiảm 5÷ 10% Những loại colagen khác chỉ hiện diện với lượng rấtnhỏ và chỉ ở một vài cơ quan đặc biệt

Hơn 90% collagen trong cơ thể là các collagen loại I, II, III và

IV Những bệnh tật liên quan đến collagen là do sự khuyết tật vềgene ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp, sự sắp xếp cũng như cácquá trình khác trong sự sản sinh collagen một cách bình thường

1.3.1 Collagen dạng sợi

Collagen dạng sợi cổ điển bao gồm các loại I, II, III, V, XI.Những loại collagen này có khả năng kết hợp tạo thành một tổhợp cấu trúc siêu phân tử được định hướng cao, đó là chuỗi sợi

so le bậc 4 với đường kính từ 25 – 400nm Dưới kính hiển vi điện tử,những sợi này được xác định bởi một mô hình đặc trưng với mộtdải chu kỳ khoảng 70nm ( được gọi là chu trình D) dựa vào sự sắpxếp so le của mỗi đơn phân collagen riêng biệt.

 Loại I Collagen loại I là collagen chiếm thành phần và

được nghiên cứu nhiều

nhất Nó chiếm hơn 90% khối lượng của xương và là thành phầnchính của mô liên kết trong gân, da, dây chằng, giác mạc, chiếmthành phần rất ít trong sụn, thủy tinh thể,

Cấu trúc triple_helix của collagen loại I bao gồm hai chuỗixoắn α1 giống hệt nhau và một chuỗi α2 Trong cơ thể sinh vật,hầu hết chuỗi xoắn α3 được kết hợp vào hỗn hợp có chứa loại IIIcollagen ( có trong da và lưới sợi) hoặc loại IV collagen ( có trongxương, gân và giác mạc) Trong hầu hết các cơ quan đặc biệt làtrong gân, collagen loại I có chức năng tạo nên độ giãn, chắc.Trong xương, nó tham gia xây dựng cấu trúc của xương, đảm bảokhả năng chịu tải trọng, độ cứng chắc của xương

ba chuỗi xoắn α1 hình thành một phân tử “ homotrimeric” tương tựnhau về kích thước và cả chức năng sinh học như của collagen loạiI

Những sợi collagen khác trong sụn đóng vai trò kết hợpvới collagen loại II, cũng như loại XI và IX nhằm để giới hạn đường

kính trong khoảng từ 15 – 50nm Khác với collagen loại I , chuỗi xoắncollagen loại II chứa hàm lượng hydrolysine khá cao, cân bằng nồngđộ của proteoglycan – một thành phần đặc trưng ở dạng ngậmnước của sụn trong suốt.

 Loại III

Giống như loại II, collagen loại II cũng được tạo thành từ 3chuỗi xoắn α1 Collagen loại III được phân bố rộng rãi trong các môngoại trừ xương Nó là thành phần quan trọng của những sợi lướitrong các mô hở ở phổi, gan, lá lách, Phân tử “Homotrimeric”thường kết hợp với collagen loại I tạo thành một thành phần phongphú trong các mô đàn hồi

Bảng 1.5 Sự phân bố acid amin của 3 chuỗi α trong collagen loại I và loại III

α1 ( loại I) α2 ( loại I) α1 ( loại III)

Theo những nghiên cứu trước đây cho thấy, collagenloại V là một hình thức đặc thù của collagen loại I và loại III ởtrong xương, giác mạc và nằm xen kẽ trong cơ bắp, gan , phổi.Collagen loại XI cũng phân phối rộng trong cơ sụn như loại II Mộtlượng lớn phía cuối đầu amino non- collagen của chúng chỉ đượctổng hợp một phần và sự hợp nhất của hai loại collagen để tạothành cấu trúc “heterotrimer” được cho là để kiểm soát khả nănglắp ráp, sinh trưởng và đường kính của chúng Kể từ đó, cấutrúc triple helix được cho là một màn che trong các mô, chúng đượcđặt ở trung tâm hơn là trên bề mặt Do vậy, collagen loại V cóchức năng như là một cấu trúc sợi cốt lõi cùng với loại I và IIIxung quanh trục trung tâm Tương tự như mô hình này, collagen loại XIđược cho hình thức cốt lõi của những sợi collagen loại II.

1.3.2 “Fibril – Associated Collagens with Interrupted Triple

 Loại IX

Collagen loại IX được phân bố trong sụn và thủy tinh thểnhư collagen loại II Collagen này thuộc loại “ heterotrimeric”, cấu trúcbao gồm 3 chuỗi xoắn α1, α2 và α3 khác nhau tạo thành ba đoạnxoắn hai bên hình cầu Phân tử collagen loại IX được đặt dọc theobề mặt của sợi collagen loại II theo hướng đối song với nhau Sựtương tác này được ổn định bởi liên kết cộng hóa trị từ lysineđến đầu amino của collagen loại II

 Loại XII và XIV

Collagen loại XII và loại XIV có cấu trúc gồm 3 chuỗi xoắnα1 kết hợp với nhau, các loại collagen này được phân bố chủ yếutrong xương da, gân phổi, thành mạch máu, cũng như collagen loạiXIX và XX, chức năng của các collagen này vẫn chưa dược tìm hiểurõ

1.3.3 Collagen vi sợi

Collagen loại VI được tạo thành từ 3 chuỗi xoắn α1, α2 và α3khác nhau với cấu trúc xoắn mở rộng và kéo dài dạng hìnhcầu Chuỗi xoắn α3 gần như là dài gấp đôi các chuỗi khác vìchiều dài đầu amino và cacboxyl khá lớn Những sợi ban đầu kếthợp bên trong tế bào theo hướng đối song với nhau, từng cặpchồng chéo lên nhau, sau đó sắp xếp bốn phần song song nhau.Trong mạng lưới ngoại bào, chúng tập hợp thành những tổ hợp sợivà hình thành mạng lưới vi sợi độc lập trong hầu hết các mô liênkết, ngoại trừ trong xương

1.3.4 Collagen chuỗi ngắn

Collagen loại X là thành phần đặc trưng của sụn trongxương sườn, xương sống,…, nó được tạo thành từ 3 chuỗi xoắn α3giống nhau, cấu trúc mạng lưới hình lục giác với đầu cacboxyl lớnvà đầu amino ngắn Chức năng của collagen loại X vẫn chưa được

tìm hiểu sâu, các nhà nghiên cứu vẫn đang thảo luận về vai tròcủa nó trong quá trình hóa xương sụn và vôi hóa.

Collagen loại VIII có cấu trúc giống như collagen loại Xnhưng có sự phân phối khác biệt nhau, vì thế mà chức năng củanó cũng khác Quá trình hình thành mạng lưới trong collagen nàyđược thực hiện bằng các nội mô tế bào hình thành nên cấu trúchình lục giác

1.4 TÍNH CHẤT CỦA COLLAGEN

Collagen là một protein cấu trúc Chính vì vậy collagencũng có đầy đủ các tính chất hóa lý của một protein

1.4.1 Tác dụng với nước

 Collagen không hòa tan trong nước mà nó hút nước đểnở ra, nguyên nhân là do

tương tác giữa các mạch polypeptide làm cho phân tử có nhữngvùng kỵ nước và vùng phân cực mang điện tích sẽ tạo nên khảnăng háo nước làm trương nở collagen Cứ 100g collagen khô cóthể hút được khoảng 200g nước Collagen kết hợp với nước nở ratrong nước, độ dày tăng lên chừng 25% nhưng độ dài tăng lênkhông đáng kể, tổng thể tích của phân tử collagen tăng lên 2 – 3lần

 Do nước phân cực tác dụng lên liên kết hydro trong liênkết phối trí của collagen

làm giảm tính vững chắc của sợi collagen từ 3 – 4 lần Khi nhiệt độtăng lên cao, tính hoạt động của mạch polypeptide tăng mạnh, làmcho mạch bị yếu và bắt đầu đứt thành những mạch polypeptidetương đối nhỏ Khi nhiệt độ tăng lên trong khoảng 60 – 650Ccollagen hút nước bị phân giải Nhiệt độ phân giải của collagentrong nguyên liệu chưa xử lý tương đối cao Khi nguyên liệu đã khử

hết chất khoáng, thì nhiệt độ phân giải của nguyên liệu sẽgiảm xuống.

1.4.2 Tác dụng với acid và kiềm

Collagen có thể tác dụng với acid và kiềm, do trênmạch của collagen có gốc

carboxyl và amin Hai gốc này quyết định hai tính chất của nó Trongđiều kiện có acid tồn tại, ion của nó tác dụng với gốc amin, điệntích trên carboxyl bị ức chế (hình thành acid yếu có độ ion hóathấp) Trái lại gốc amin bị ion hóa tạo NH3+

NH3 +

…Cl

NH3 +

…Cl-

NH3 +…Cl-

NH

2 + …Na - COO

môi trường acid, kiềm có độ hút nước cao hơn trong nước nguyênchất Ngoài ra acid và kiềm có thể làm cho collagen biến đổi nhưsau:

 Cắt đứt mạch muối (liên kết giữa –NH3+…COO-) làm đứtmạch peptide trong mạch chính

 Làm đứt liên kết hydrogen giữa gốc –CO…NH– của mạchxung quanh nó

 Làm acid amin bị phân hủy giải phóng amoniac

Cùng với những biến đổi đó, điểm đẳng điện của collagenhạ xuống thấp, (vì những biến đổi đó mang tính chất thủy phânlàm cho các nhóm gốc có tính hoạt động tăng lên nhiều)

Acid và kiềm đều có thể phân hủy collagen, nhưng sự phânhủy của collagen cho tới nay vẫn chưa có khái niệm chính xác Đểbiểu thị sự biến đổi chính xác của collagen dưới tác dụng củaacid, kiềm nói chung đều dùng độ keo phân giải làm chỉ tiêu Độkeo phân giải là chỉ số keo sinh thành sản phẩm có thể tan trongnước (thường là trong điều kiện đun nóng), những sản phẩm nàydưới nồng độ tương ứng tiến hành làm lạnh có thể biến thànhkeo

Theo kết quả nghiên cứu tác dụng của vôi đối với collagencó thể làm tăng độ phân giải của nó rất mạnh, trong điều kiện

COO

-NH3+ +H3N

+H3N NH3+OOC

Na+ -OH H+

HO- H+ Cl- H+ OH

-H+ OH- Na

HO- H+ Cl- H+ OH

-nhiệt độ thường thời gian dài có thể xúc tiến sự phân giải củacollagen (tùy độ phân giải của nó rất thấp) lúc nhiệt độ tănglên hoặc xử lý bằng kiềm thì độ phân giải tăng lên.

Collagen phân giải biến thành gelatin, căn cứ vào giảthuyết của Hofmeister phản ứng sẽ tiến hành như sau:

C102H149N31O38 + H2O C102H151N31O39

Ngoài ra, Collagen trong dung dịch muối trung tính cùng vớigốc –COOH và –NH2 tạo thành các hợp chất muối Tác dụng phângiải collagen của NaCl so với Na2SO4 mạnh hơn ( do độ điện ly củaNaCl lớn hơn) Nhiều thực nghiệm cho thấy rằng tác dụng củatrypsine đối với collagen đã xử lý ( như đun nóng, ngâm acid, kiềm ,muối, tác dụng của pepsin, tác dụng cơ học, ) thì nó có tác dụngphân giải, với điều kiện thích hợp nhất là ở nhiệt độ 370C, pH =8,1 – 8,2

1.4.3 Sự biến tính

Dưới tác dụng của các chất hóa học như axit, bazơ, muối,các dung môi như ancohol, các tác nhân vật lý như khuấy trộn cơhọc, nghiền, tia cực tím,… Cấu trúc xoắn bậc ba của collagen bị

to ;xt

to

biến đổi làm cho các liên kết hydro, các liên kết ion bị phá vỡnhưng không phá vỡ được liên kết peptid, tức là cấu trúc bậcmột vẫn giữ nguyên

Sau khi bị biến tính Collagen thường có các tính chất sau :

 Độ hòa tan giảm do làm lộ các nhóm kỵ H2O vốn ởbên trong phân tử protein

Tức là khi collagen chưa biến tính, các acidamin có các nhóm

kỵ nước nằm bên trong phân tử collagen Khi bị biến tính,phân tử Collagen lúc này chỉ là trình tự sắp xếp cácacidamin mạch thẳng, làm cho các nhóm kỵ nước lộ ra ngoàinên độ hòa tan cả collagen bị giảm đi

 Khả năng giữ nước giảm, cấu trúc bậc bốn giúpcho collagen có khả năng

hydrat hóa tạo thành màng hydrat bao quanh Khi biến tínhmất đi cấu trúc bậc bốn thì khả năng hydrat hóa khôngcòn, vì thế nên collagengiữ õnước kém

 Hoạt tính sinh học ban đầu mất đi Điều này là hiểnnhiên vì hoạt tính sinh học

của một protein được quyết định bởi các cấu trúc bậc hai,bậc ba và bậc bốn Khi cấu trúc này mất đi, protein chỉ làcác polypeptid, và không có hoạt tính sinh học

 Hoạt tính sinh học ban đầu mất đi Điều này là hiểnnhiên vì hoạt tính sinh học

của một protein được quyết định bởi các cấu trúc bậc hai,bậc ba và bậc bốn Khi cấu trúc này mất đi, protein chỉ làcác polypeptid, và không có hoạt tính sinh học

 Tăng độ nhạy đối với sự tấn công của enzyme protease

do làm xuất hiện các

liên kết peptide ứng với trung tâm hoạt động của protease

 Tăng độ nhớt hiện tại.

 Mất khả năng kết tinh, collagen có khả năng kết tinhtrong các môi trường muối hoặc cồn Ở các điều kiện

pH nhất định dung dịch collagen không bền và kết

tinh gọi là pH đẳng điện Khi bị biến tính điểm đẳng điệncủa protein không còn và chúng khó có thể kết tinh

1.4.4 Tính kỵ nước

Do các gốc kỵ nước của acidamin trong chuỗi polypeptid củacollagen hướng ra ngoài, các gốc này liên kết với nhau tạo liênkết kỵ H2O Độ kỵ nước có thể giải thích là do các acidamin cóchứa gốc R-không phân cực nên nó không có khả năng tácdụng với nước Tính kỵ nước sẽ ảnh hưởng rất nhiều đến tính tancủa collagen

1.4.5 Tính chất của dung dịch keo

Khi hòa tan protein thành dung dịch keo thì nó không đi quamàng bán thấm Hai yếu tố đảm bảo độ bền của dung dịch keolà :

 Sự tích điện cùng dấu của các protein

 Lớp vỏ hydrat bao quanh phân tử protein

Khi dung dịch keo không bền, sẽ có hai dạng kết tủa : kếttủa thuận nghịch và kết tủa không thuận nghịch

 Kết tủa thuận nghịch: sau khi chúng ta loại bỏ các yếutố gây kết tủa thì protein vẫn có thể trở lại trạngthái dung dịch keo bền như ban đầu

 kết tủa không thuận nghịch: sau khi chúng ta loại bỏcác yếu tố gây kết tủa thì protein không trở về trạngthái dung dịch keo bền vững như trước nữa

Dung dịch collagen có độ nhớt cao trong khoảng pH = 2 -5 ,trong đó pH = 2 cho độ nhớt cao nhất, điều này giúp cho việcnghiên cứu, tách chiết collagen

1.4.6 Tính chất Hydrat hóa của collagen

Trong quá trình hydrat hóa, protein tương tác với nước quacác nối peptid hoặc các gốc R ở mạch bên nhờ liên kết hydro.Nồng độ protein, pH, nhiệt độ, thời gian, lực ion, sự có mặt củacác thành phần khác là những yếu tố ảnh hưởng đến cácphản ứng protein – protein và protein – nước Khi nồng độ proteintăng thì lượng nước hấp thụ tống số tăng, pH thay đổi dẫn đếnthay đổi mức độ ion hóa và sự tích điện trên bề mặt phân tửCollagen, làm thay đổi lực hút và lực đẩy giữa các phân tử nàyvà khả năng liên kết với nước

Khi nhiệt độ tăng thì khả năng giữ nước của Collagengiảm do làm giảm các liên kết hydro Ngoài ra, bản chất vànồng độ các ion gây ảnh hưởng đến lực ion trong môi trường vàsự phân bố điện tích trên bề mặt phân tử Collagen nên cũngảnh hưởng đến khả năng hydrat hóa Người ta nhận thấy có sựcạnh tranh của phản ứng giữa nước, muối và các nhóm ngoạicủa acid amin Khi nồng độ muối thấp, tính hydrat hóa của proteincó thể tăng do sự đính thêm các ion giúp mở rộng mạng lướiprotein Tuy nhiên khi nồng độ muối cao, các phản ứng muối –nước trở nên nổi trội hơn, làm giảm liên kết protein – nước vàprotein bị “sấy khô”

1.5 CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ VÀ PHÂN TÍCH COLLAGEN

Có nhiều phương pháp đánh giá và phân tích collagen :phân tích độ nhớt, độ ẩm, hàm lượng tro, xác định khối lượngphân tử, vi sinh, phân tích thành phần protein trong collagen (Xác

định tổng nitơ bằng phương pháp Kjeldahl), phân tích thành phần axitamin.

1.5.1 Phương pháp điện di trên gel SDS-polyacrylamide PAGE) để xác định trọng lượng phân tử collagen

Điện di theo phương pháp SDS- PAGE của phương pháp củaKittiphattanabawon, Benjakul, Visessanguan, Nagai, Tanaka, (2005), sửdụng Buffer System là máy điện di đứng, loại mini- PROTEAN Tetra cellcủa hãng BIORAD

Mẫu collagen được hòa tan trong dung dịch acid acetic 0,5Mđến nồng độ 2,5 mg/ml Chỉnh pH của dung dịch collagen bằng

sodium phosphate 0,2 M đến giá trị pH 4,4 Sau đó, hòa dung dịch mẫu này vào hổn hợp chứa 1% SDS (sodium dodecyl sunfate) và urea 3,5M (pH 7,2), khuấy trộn liên tục ở nhiệt độ phòng Hỗn hợp

được ly tâm để loại bỏ tạp chất không tan Dung dịch này đượctrộn theo tỉ lệ 1/1(v/v) với dung dịch đệm (0,5M tris-HCl, pH 6,8 chứa

4% SDS, 20% glycerol).

Tạo giếng: Chúng ta pha resolving gel 7% và stacking gel 5%sau đó lần lượt bơm vào giếng và cài lược tạo các miệng giếng Dung dịch mẫu được bơm vào các miệng giếng của máyđiện di, đổ dung dịch đệm vào bể, chỉnh dòng điện khoảng 20mA/gel Sau khi điện di, gel được nhuộm màu bằng dung dịch chứaCo-omassie blue R-250 0,05% (w/v) trong methanol 15% (v/v) và acetic 5%(v/v), trong 1 – 2 giờ và tẩy màu bằng dung dịch methanol 30% (v/v)và acetic 5% (v/v) cho đến khi xuất hiện các vạch protein Proteinchuẩn được điện di để so sánh có trọng lượng phân tử từ 75 – 250kDa

1.5.2 Xác định sự biến tính của collagen theo nhiệt độ bằng phương pháp biến đổi độ nhớt (Denaturation temperature determined by viscosity method)

Độ nhớt của dung dịch collagen được xác định theo phươngpháp của L.S Senaratne và cộng sự (2006)

Thông qua việc đo độ nhớt của dung dịch collagen, chúng taxác định nhiệt độ biến tính của collagen Nhiệt độ biến tính củacollagen là nhiệt độ tại đó giá trị độ nhớt giảm đi một nửa

Dung dịch collagen 0,03 % trong acetic acid 0,1N, được khuấyđều cho tan hết Tiến hành đo độ nhớt trong một bể điều nhiệt.Nhiệt độ được gia tăng rất chậm khoảng 1oC/ph Bắt đầu đo ở

33oC và kết thúc ở 50oC Một phút lấy giá trị một lần

Độ nhớt của dung dịch collagen được xác định tương ứng

ở các mức nhiệt độ Độ nhớt tương đối được tính như sau:

Trong đó:

ht: độ nhớt đo được tại mỗi mức nhiệt độ

hmax: độ nhớt lớn nhất

hmin: độ nhớt nhỏ nhất

Đường cong biến tính nhiệt được xây dựng bằng cách vẽđồ thị độ nhớt tương đối theo nhiệt độ Nhiệt độ biến tính chínhlà nhiệt độ mà tại đó độ nhớt tương đối giảm đi một nửa

Hình 1.11 Đường cong biến tính nhiệt của 2 loại collagen thu được từ

da cá và da lợn trong axit axetic 0,1N và nồng độ collagen là 0,03%

1.5.3 Phân tích hàm lượng hydroxyproline

Hydroxyproline là một acid amin đặc trưng của collagen.Chúng không có trong bất kỳ một loại protein nào khác, ngoạitrừ một lượng nhỏ trong elastin Do đó, có thể định lượng collagenthông qua định lượng hydroxyproline và nhân với hệ số chuyển đổi14,7 (Sadowska, Kolodziejska, & Niecikowska, 2003)

Quy trình xác định hydroxyproline được thực hiện theophương pháp của Ignat’eva, Danilov, Averkiev, Obrezkova, Lunin, Sobol,

2005

Cấu trúc của hydroxyproline có chứa vòng pyrrolidine, nócó thể bị oxy hóa để hình thành vòng pyrrole Vòng pyrrole nàytác dụng với tác chất Ehrlich, 4–(N,N– dimethylamino) benzaldehydetạo thành hợp chất quinoid có màu (màu sắc phụ thuộc vào

nhóm thế và thay đổi từ màu cam đến màu hoa cà) Thực hiệnphương pháp so màu để tính hàm lượng hydroxyproline.

1.5.4 Đo phổ hồng ngoại infrared (IR) spectroscopy.

Phổ hồng ngoại IR là một trong những kỹ thuật phổđược sử dụng rộng rãi nhất, là phương pháp đo độ hấp thụ củamẫu thử ở các bước sóng khác nhau của tia hồng ngoại Mục đíchchính của việc phân tích phổ IR là xác định các nhóm chức hóahọc có trong mẫu thử Những nhóm chức khác nhau sẽ hấp thụnhững bước sóng riêng biệt Với nhiều thiết bị phụ tùng, máyphổ hồng ngoại có thể làm việc với nhiều dạng mẫu từ khí,lỏng đến rắn Phân tích phổ IR là một công cụ phổ biến và quantrọng để làm sáng tỏ cấu trúc và xác định các hợp chất

Hình 1.12 Phổ hồng ngoại collagen trong dung dịch axit

Collagen trên phổ hồng ngoại có thể thấy trên hình.Nhóm amide A phát

hiện ở peak có cường độ 3330 cm-1, nhóm amide B được thấy ởpeak có cường độ 3080 cm-1 Trên quang phổ còn thấy xuất hiệnsự dao động của amide bậc I ở 1650 cm-1, amide bậc II ở 1545 cm-1

và amit bậc III ở 1237 cm-1 Cấu trúc của protein và amide bậc IIIchứng minh sự tồn tại của kết cấu có hình xoắn ốc (Surewicz vàMantsch, 1988, Muyonga, 2004).

CHƯƠNG 2: CÁC PHƯƠNG PHÁP SẢN XUẤT COLLAGEN