Cấu trúc triple_helix của collagen loại I bao gồm hai chuỗi xoắn α1 giống hệt nhau và một chuỗi α2 . Trong cơ thể sinh vật, hầu hết chuỗi xoắn α3 được kết hợp vào hỗn hợp có chứa loại III collagen ( có trong da và lưới sợi) hoặc loại IV collagen ( có trong xương, gân và giác mạc). Trong hầu hết các cơ quan đặc biệt là trong gân, collagen loại I có chức năng tạo nên độ giãn, chắc. Trong xương, nó tham gia xây dựng cấu trúc của xương, đảm bảo khả năng chòu tải trọng, độ cứng chắc của xương.
Loại II
Collagen loại II là thành phần đặc trưng và chiếm hàm lượng cao trong sụn trong
suốt. Tuy nhiên, hàm lượng collagen loại II này ngày càng chiếm tỉ lệ lớn trong tổng số collagen ( khoảng 80%) khi được tìm thấy trong các cơ quan như : thủy tinh thể, các biểu mô giác mạc, dây sống, ...Cấu trúc triple_helix của collagen loại II được đặc trưng bởi ba chuỗi xoắn α1 hình thành một phân tử “ homotrimeric” tương tự nhau về kích thước và cả chức năng sinh học như của collagen loại I.
Những sợi collagen khác trong sụn đóng vai trò kết hợp với collagen loại II, cũng như loại XI và IX nhằm để giới hạn đường kính trong khoảng từ 15 – 50nm. Khác với collagen loại I , chuỗi xoắn collagen loại II chứa hàm lượng hydrolysine khá cao, cân bằng nồng độ của proteoglycan – một thành phần đặc trưng ở dạng ngậm nước của sụn trong suốt.
Loại III
Giống như loại II, collagen loại II cũng được tạo thành từ 3 chuỗi xoắn α1. Collagen loại III được phân bố rộng rãi trong các mô ngoại trừ xương. Nó là thành phần quan trọng của những sợi lưới trong các mô hở ở phổi, gan, lá lách, ... Phân tử “Homotrimeric” thường kết hợp với collagen loại I tạo thành một thành phần phong phú trong các mô đàn hồi.
Bảng 1.5 Sự phân bố acid amin của 3 chuỗi α trong collagen loại I và loại III
α1 ( loại I)
α2 ( loại I)
α1 ( loại III)
Loại V và XI
Collagen loại V và XI như là một phân nhóm nhỏ trong collgen dạng sợi,cấu trúc của hai loại collagen này là một “heterotrimer” đặc trưng bởi 3 chuỗi xoắn α1 , va α2ø, α3 khác nhau. Điều đáng chú ý là chuỗi xoắn α3 trong cấu trúc loại collgen XI được mã hóa bởi các gen tương tự như chuỗi α1 trong cấu trúc collagen loại II, chỉ khác ở kích thước của glycosylation và hydroxylation. Sự kết hợp giữa sự giống và khác nhau của cấu trúc hai loại collagen này xuất hiện khá nhiều trong các mô.
Theo những nghiên cứu trước đây cho thấy, collagen loại V là một hình thức đặc thù của collagen loại I và loại III ở trong xương, giác mạc và nằm xen kẽ trong cơ bắp, gan , phổi. Collagen loại XI cũng phân phối rộng trong cơ sụn như loại II. Một lượng lớn phía cuối đầu amino non- collagen của chúng chỉ được tổng hợp một phần và sự hợp nhất của hai loại collagen để tạo thành cấu trúc “heterotrimer” được cho là để kiểm soát khả năng lắp ráp, sinh trưởng và đường kính của chúng. Kể từ đó, cấu trúc triple helix được cho là một màn che trong các mô, chúng được đặt ở trung tâm hơn là trên bề mặt. Do vậy, collagen loại V có chức năng như là một cấu trúc sợi cốt lõi cùng với loại I và III xung quanh trục trung tâm. Tương tự như mô hình này, collagen loại XI được cho hình thức cốt lõi của những sợi collagen loại II.
1.3.2 “Fibril – Associated Collagens with Interrupted Triple helices”:FACIT collagen
Cấu trúc cơ bản của những loại collagen này được đặc trưng bởi những phần thuộc
collgen bò gián đoạn bởi những chuỗi ngắn không xoắn và những phân tử “ trimer” hóa có liên quan đến bề mặt của các sợi khác nhau.
Loại IX
Collagen loại IX được phân bố trong sụn và thủy tinh thể như collagen loại II. Collagen này thuộc loại “ heterotrimeric”, cấu trúc bao gồm 3 chuỗi xoắn α1, α2 và α3 khác nhau tạo thành ba đoạn xoắn hai bên hình cầu. Phân tử collagen loại IX được đặt dọc theo bề mặt của sợi collagen loại II theo hướng đối song với nhau. Sự tương tác này được ổn đònh bởi liên kết cộng hóa trò từ lysine đến đầu amino của collagen loại II.
Loại XII và XIV
Collagen loại XII và loại XIV có cấu trúc gồm 3 chuỗi xoắn α1 kết hợp với nhau, các loại collagen này được phân bố chủ yếu trong xương da, gân phổi, thành mạch máu,...cũng như collagen loại XIX và XX, chức năng của các collagen này vẫn chưa dược tìm hiểu rõ.
1.3.3 Collagen vi sợi
Collagen loại VI được tạo thành từ 3 chuỗi xoắn α1, α2 và α3 khác nhau với cấu trúc xoắn mở rộng và kéo dài dạng hình cầu. Chuỗi xoắn α3 gần như là dài gấp đôi các chuỗi khác vì chiều dài đầu amino và cacboxyl khá lớn. Những sợi ban đầu kết hợp bên trong tế bào theo hướng đối song với nhau, từng cặp chồng chéo lên nhau, sau đó sắp xếp bốn phần song song nhau. Trong mạng lưới ngoại bào, chúng tập hợp thành những tổ hợp sợi và hình thành mạng lưới vi sợi độc lập trong hầu hết các mô liên kết, ngoại trừ trong xương.
1.3.4 Collagen chuỗi ngắn
Collagen loại X là thành phần đặc trưng của sụn trong xương sườn, xương sống,…, nó được tạo thành từ 3 chuỗi xoắn α3 giống nhau, cấu trúc mạng lưới hình lục giác với đầu cacboxyl lớn và đầu amino ngắn. Chức năng của collagen loại X vẫn chưa được tìm hiểu sâu, các nhà nghiên cứu vẫn đang thảo luận về vai trò của nó trong quá trình hóa xương sụn và vôi hóa.
Collagen loại VIII có cấu trúc giống như collagen loại X nhưng có sự phân phối khác biệt nhau, vì thế mà chức năng của nó cũng khác. Quá trình hình thành mạng lưới trong collagen này được thực hiện bằng các nội mô tế bào hình thành nên cấu trúc hình lục giác.
1.4 TÍNH CHẤT CỦA COLLAGEN
Collagen là một protein cấu trúc. Chính vì vậy collagen cũng có đầy đủ các tính chất hóa lý của một protein.
1.4.1 Tác dụng với nước
Collagen không hòa tan trong nước mà nó hút nước để nở ra, nguyên nhân là do
tương tác giữa các mạch polypeptide làm cho phân tử có những vùng kỵ nước và vùng phân cực mang điện tích sẽ tạo nên khả năng háo nước làm trương nở collagen. Cứ 100g collagen khô có thể hút được khoảng 200g nước. Collagen kết hợp với nước nở ra trong nước, độ dày tăng lên chừng 25% nhưng độ dài tăng lên không đáng kể, tổng thể tích của phân tử collagen tăng lên 2 – 3 lần.
1.4.2 Tác dụng với acid và kiềm
Collagen có thể tác dụng với acid và kiềm, do trên mạch của collagen có gốc
carboxyl và amin. Hai gốc này quyết đònh hai tính chất của nó. Trong điều kiện có acid tồn tại, ion của nó tác dụng với gốc amin, điện tích trên carboxyl bò ức chế (hình thành acid yếu có độ ion hóa thấp). Trái lại gốc amin bò ion hóa tạo NH3+.
1.4.3 Sự biến tính
Dưới tác dụng của các chất hóa học như axit, bazơ, muối, các dung môi như ancohol, các tác nhân vật lý như khuấy trộn cơ học, nghiền, tia cực tím,… Cấu trúc xoắn bậc ba của collagen bò biến đổi làm cho các liên kết hydro, các liên kết ion bò phá vỡ nhưng không phá vỡ được liên kết peptid, tức là cấu trúc bậc một vẫn giữ nguyên.
Sau khi bò biến tính Collagen thường có các tính chất sau :
Độ hòa tan giảm do làm lộ các nhóm kỵ H2O vốn ở bên trong phân tử protein.
Tức là khi collagen chưa biến tính, các acidamin có các nhóm kỵ nước nằm bên trong phân tử collagen. Khi bò biến tính, phân tử Collagen lúc này chỉ là trình tự sắp xếp các acidamin mạch thẳng, làm cho các nhóm kỵ nước lộ ra ngoài nên độ hòa tan cả collagen bò giảm đi.
Khả năng giữ nước giảm, cấu trúc bậc bốn giúp cho collagen có khả năng
hydrat hóa tạo thành màng hydrat bao quanh. Khi biến tính mất đi cấu trúc bậc bốn thì khả năng hydrat hóa không còn, vì thế nên collagengiữ õnước kém.
Hoạt tính sinh học ban đầu mất đi. Điều này là hiển nhiên vì hoạt tính sinh học
của một protein được quyết đònh bởi các cấu trúc bậc hai, bậc ba và bậc bốn. Khi cấu trúc này mất đi, protein chỉ là các polypeptid, và không có hoạt tính sinh học.
Hoạt tính sinh học ban đầu mất đi. Điều này là hiển nhiên vì hoạt tính sinh học
của một protein được quyết đònh bởi các cấu trúc bậc hai, bậc ba và bậc bốn. Khi cấu trúc này mất đi, protein chỉ là các polypeptid, và không có hoạt tính sinh học.
Tăng độ nhạy đối với sự tấn công của enzyme protease do làm xuất hiện các
liên kết peptide ứng với trung tâm hoạt động của protease.
Tăng độ nhớt hiện tại.
Mất khả năng kết tinh, collagen có khả năng kết tinh trong các môi trường muối hoặc cồn. Ở các điều kiện pH nhất đònh dung dòch collagen không bền và kết
tinh gọi là pH đẳng điện. Khi bò biến tính điểm đẳng điện của protein không còn và chúng khó có thể kết tinh.
1.4.4 Tính kỵ nước
Do các gốc kỵ nước của acidamin trong chuỗi polypeptid của collagen hướng ra ngoài, các gốc này liên kết với nhau tạo liên kết kỵ H2O. Độ kỵ nước có thể giải thích là do các acidamin có chứa gốc R-không phân cực nên nó không có khả năng tác dụng với nước. Tính kỵ nước sẽ ảnh hưởng rất nhiều đến tính tan của collagen.
1.4.5 Tính chất của dung dòch keo
Khi hòa tan protein thành dung dòch keo thì nó không đi qua màng bán thấm. Hai yếu tố đảm bảo độ bền của dung dòch keo là :
Sự tích điện cùng dấu của các protein.
Lớp vỏ hydrat bao quanh phân tử protein.
Khi dung dòch keo không bền, sẽ có hai dạng kết tủa : kết tủa thuận nghòch và kết tủa không thuận nghòch.
Kết tủa thuận nghòch: sau khi chúng ta loại bỏ các yếu tố gây kết tủa thì protein vẫn có thể trở lại trạng thái dung dòch keo bền như ban đầu.
kết tủa không thuận nghòch: sau khi chúng ta loại bỏ các yếu tố gây kết tủa thì protein không trở về trạng thái dung dòch keo bền vững như trước nữa.
Dung dòch collagen có độ nhớt cao trong khoảng pH = 2 -5 , trong đó pH = 2 cho độ nhớt cao nhất, điều này giúp cho việc nghiên cứu, tách chiết collagen.
1.4.6 Tính chất Hydrat hóa của collagen
Trong quá trình hydrat hóa, protein tương tác với nước qua các nối peptid hoặc các gốc R ở mạch bên nhờ liên kết hydro. Nồng độ protein, pH, nhiệt độ, thời gian, lực ion, sự có mặt của các thành phần khác là những yếu tố ảnh hưởng đến các phản ứng protein – protein và protein – nước. Khi nồng độ protein tăng thì lượng nước hấp thụ tống số tăng, pH thay đổi dẫn đến thay đổi mức độ ion hóa và sự tích điện trên bề mặt phân tử Collagen, làm thay đổi lực hút và lực đẩy giữa các phân tử này và khả năng liên kết với nước.
Khi nhiệt độ tăng thì khả năng giữ nước của Collagen giảm do làm giảm các liên kết hydro. Ngoài ra, bản chất và nồng độ các ion gây ảnh hưởng đến lực ion trong môi trường và sự phân bố điện tích trên bề mặt phân tử Collagen nên cũng ảnh hưởng đến khả năng hydrat hóa. Người ta nhận thấy có sự cạnh tranh của phản ứng giữa nước, muối và các nhóm ngoại của acid amin. Khi nồng độ muối thấp, tính hydrat hóa của protein có thể tăng do sự đính thêm các ion giúp mở rộng mạng lưới protein. Tuy nhiên khi nồng độ muối cao, các phản ứng muối – nước trở nên nổi trội hơn, làm giảm liên kết protein – nước và protein bò “sấy khô”.
1.5 CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ VÀ PHÂN TÍCH COLLAGEN
1.5.1 Phương pháp điện di trên gel SDS-polyacrylamide (SDS-PAGE) để xác đònh trọng lượng phân tử collagen.
1.5.2 Xác đònh sự biến tính của collagen theo nhiệt độ bằng phương pháp biến đổi độ nhớt (Denaturation temperature determined by viscosity method).
Collagen trên phổ hồng ngoại có thể thấy trên hình. Nhóm amide A phát
hiện ở peak có cường độ 3330 cm-1, nhóm amide B được thấy ở peak có cường độ 3080 cm-1. Trên quang phổ còn thấy xuất hiện sự dao động của amide bậc I ở 1650 cm-1, amide bậc II ở 1545 cm-1 và amit bậc III ở 1237 cm-1. Cấu trúc của protein và amide bậc III chứng minh sự tồn tại của kết cấu có hình xoắn ốc (Surewicz và Mantsch, 1988, Muyonga, 2004).
Trong các công trình nghiên cứu, qui trình thu nhận collagen gồm 3 giai đoạn chính :
Giai đoạn phá vỡ tế bào:
- Các phân tử collagen không có khả năng đi qua màng tế bào, vì vậy cần
phá vỡ cấu trúc tế bào để chuyển collagen vào dung dòch. Các biện pháp được sử dụng có thể là các biện pháp cơ học như tiến hành ngiền với bột thủy tinh hoặc cát thạch anh, sau đó tiến hành đồng hóa (homogenizator). Thiết bò này có chày thủy tinh gắn với motor quay và có thể điều chỉnh tốc độ quay theo yêu cầu. Các tế bào nằm giữa chày thủy tinh và thành cối sẽ bò phá vỡ.
- Sử dụng các dung môi hữu cơ như butanol, acetone kết hợp với các chất tẩy rửa. Các hóa chất này giúp cho việc phá vỡ các bào quan của tế bào.
Giai đoạn tách chiết collagen:
- Sau khi phá vỡ cấu trúc tế bào, việc tách chiết collagen được tiến hành dễ
dàng hơn, collagen có thể được chiết tách bằng acid hoặc bằng enzyme, quá trình tách chiết collagen được thực hiện trong các reactor ở nhiệt độ lạnh và trong điều kiện vô trùng, kết hợp khuấy trộn liên tục để đảm bảo collagen thu được có chất lượng tốt.
Giai đoạn tinh sạch collagen:
- Trong dòch chiết thô, ngoài collagen còn có các protein tạp, các lipid, muối khoáng, để loại các thành phần này cần sử dụng các biện pháp khác nhau.
- Để loại muối khoáng thường dùng phương pháp thẩm tích. Thẩm tích là sự khuyếch tán vi phân qua màng vốn không thấm đối với những chất keo hòa tan ( protein, một số polysaccaride...) nhưng thấm đối với các dung dòch tinh thể ( các muối của hợp chất hữu cơ có trọng lượng phân tử thấp,...). Để loại các protein tạp có thể tiến hành kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính hoặc các dung môi hữu cơ hay dùng các phương pháp sắc ký trao đổi ion, điện di, phương pháp lọc gel,…
2.1.1 Qui trình chiết tách collagen từ da heo [6]
Thuyết minh qui trình công nghệ :
Da heo sau khi thu nhận sẽ qua quá trình xử lý ngâm với dung dòch Na2SO4, sau đó tiến hành cạo lông rồi cho qua quá trình rửa với nước theo tỉ lệ H20 : da = 6 : 1(w/w). Tiến hành rửa lần 1 trong vòng 30 phút, sau đó rửa tiếp lần 2 và 3, mỗi lần được thực hiện trong vòng 20 phút, nhiệt độ 300C. Quá trình rửa giúp loại bớt các tạp chất như phần thòt dư, máu, mỡ thừa, nhầy nhớt,… để chuẩn bò cho các quá trình tiếp theo.
Sau khi tiến hành rửa với nước, da heo sẽ được loại béo bằng dung dòch isopropyl kết hợp với bổ sung chất hoạt động bề mặt không ion. Tiến hành bổ sung chất hoạt động bề mặt 2 lần vào dung dòch chứa da heo và ngâm trong vòng 6h, trường hợp loại béo bằng dung dòch isopropyl ta tiến hành trong vòng 10h.
Da heo sau khi được loại chất béo sẽ được trích ly bằng dung dòch NaOH 3% (w/v) và monomethylamine 1,9%(v/v) để tách chiết collagen, quá trình được tiến hành ở nhiệt độ 200C trong vòng 1 tuần để đảm bảo collagen có chất lượng tốt.
Để kết tủa collagen vừa được trích ly ta dùng dung dòch acid HCl 5M. Đến đây collagen thô đã được kết tủa, pH lúc này bằng 4,6 – 4,7. Để thu được collagen sạch ta tiến hành ly tâm lấy phần tủa hòa tan lại trong dung dòch dòch acid acetic 0.1M, quá trình được thực hiện ở 40C trong vòng 72h, tiến hành ly tâm lần nữa ta thu được collagen thành phẩm.
Những kết quả phân tích collagen trên da heo :
Kết quả cho thấy collagen được thu nhận từ da heo có cấu trúc chủ yếu gồm hai chuỗi α1 và α2. Ứng với mỗi chuỗi có 8 peptide khác nhau và những peptide này được phân tích giữa sự kết hợp trao đổi ion và sắc ký lọc gel để xác đònh thành phần các acid amin có trong mỗi chuỗi. Kết quả cũng cho thấy chuỗi collagen được đặc trưng bởi vò trí và trọng lượng phân tử của các acid amin.
Bằng các phương pháp xác đònh cho thấy collagen từ da heo có nhiệt độ biến tính ở 370C, nhiệt độ biến tính của collagen có liên quan đến các thành phần acid amin, đặc biệt là các thành phần proline, hydroxyproline, glycine. Nhiệt độ biến tính này còn phụ thuộc vào điều kiện nhiệt độ môi trường sống động vật.
2.1.2 Qui trinh chiết tách collagen từ gân chân gà [7]
Thuyết minh qui trình công nghệ :
Nguyên liệu là gân chân gà sau khi được cắt nhỏ được ngâm với dung dòch CH3COONa để loại đi các protein hòa tan và các carbonhydrat trong thời gian 3 ngày. Dung dòch thu được ta tiến hành trích ly để thu được collagen bằng cách bổ sung dung dòch đệm citrat 0,15M.
Dung dòch sau khi trích ly được đem đi lọc để loại đi các tạp chất rắn khác, sau đó tiến hành thẩm tích dung dòch vừa thu được để loại đi các muối ra khỏi hỗn hợp để tinh sạch collagen.
Thẩm tích là sự khuếch tán vi phân qua màng vốn không thấm đối với những chất keo hòa tan ( protein, một số polysaccaride...) nhưng thấm đối với các dung dòch tinh thể ( các muối của hợp chất hữu cơ có trọng lượng phân tử thấp,...). Các tinh thể có thể khuếch tán từ dung dòch có nồng độ thấp hơn (thường là dung dòch rửa) vào dung dòch keo. Trong khi đó, các ion và các chất phân tử nhỏ sẽ chuyển từ dung dòch keo vào dung dòch có nồng độ thấp hơn.
Trong quá trình tách chiết và tinh sạch protein, để loại muối ra khỏi dung dòch protein thì dung dòch protein được cho vào các túi đặc hiệu làm bằng nguyên liệu bán thấm, thường là dùng các túi cellophan. Sau đó đặt cả túi vào bình chứa lượng lớn, H20 hay lượng lớn dung dòch đệm được pha loãng.
Ở đây tác giả dùng dung dòch Na2HPO4 0,02M. Vì màng cellophan là màng bán thấm có kích thước lỗ chỉ cho các chất có trọng lượng phân tử nhỏ đi qua các dung dòch đệm loãng. Như vậy, muối sẽ khuếch tán vào dung dòch đệm loãng ( di chuyển theo hướng giảm nồng độ), còn dung dòch đệm loãng sẽ di chuyển từ dung dòch rửa vào túi chứa protein. Protein là những đại phân tử không thể vượt qua túi thẩm tích và được giữ lại trong túi.
Sau khi thẩm tích , tiến hành rửa lại và sau đó kết tinh sẽ thu được collagen thành phẩm.
2.1.3 Qui trình chiết tách Collagen từ da mực [7]
Thuyết minh qui trình công nghệ :
Da mực sau khi được rửa sạch được làm khô rồi cho dung dòch NaOH 0,1M vào để tiến hành loại những hợp chất noncollagenous protein và màu. Sau đó tiến hành rửa và trích ly bằng dung dòch acid acetic trong vòng 3 ngày .
Hỗn hợp sau khi trích ly sẽ được tiến hành ly tâm với tốc độ 50000 vòng / phút trong vòng 1h để thu lấy phần dòch, phần dòch chiết thu được là dòch lỏng, hơi sánh gọi là acid-soluble collagen.
Để kết tinh collagen, cho NaCl sẵn vào dòch chiết đến nồng độ 0.8M. Đến đây collagen thô đã được kết tủa. Để thu được collagen sạch, ta tiến hành ly tâm với tốc độ 50000 vòng / phút trong vòng 1h rồi tiến hành sấy lạnh thu được sản phẩm collagen dạng bột.
2.1.4 Quy trình trích ly collagen từ da cá tuyết (Baltic cod) [9]
Thuyết minh qui trình công nghệ
Nguyên liệu là da cá được cắt nhỏ tới đường kính khoảng 3mm bằng máy nghiền, sau đó tiến hành khuấy trộn với dung dòch acid acetic nồng độ 0,1÷ 0,5M với tỉ lệ 1:6 ÷ 1:40 ở nhiệt độ lạnh trong vòng 2h.
Tiến hành đồng nhất hóa dung dòch vừa khuấy trộn ở nhiệt độ trong thời gian 4 phút, tốc độ đồng nhất là 6000 vòng / phút.
Sau đó dung dòch được tiếp tục khuấy trộn trong thời gian 24h ở nhiệt độ rồi được đưa qua máy đồng nhất hóa với thông số kó thuật giống như giai đoạn đầu.
Sau khi hỗn hợp đã được đồng nhất với nhau ta tiến hành ly tâm thu lấy phần dòch có chứa collagen, quá trình ly tâm được tiến hành ở nhiệt độ lạnh trong thời gian 20 phút, tốc độ ly tâm đạt 6000 vòng / phút.
Các quá trình được tiến hành ở nhiệt độ lạnh và trong điều kiện vô trùng để tránh da cá bò biến tính ảnh hưởng đến chất lượng collagen.
Những kết quả phân tích collagen trên da cá tuyết
Thuyết minh qui trình công nghệ :
Da, xương, và vây được bảo quản ở 25oC đến khi sử dụng. Tất cả quá trình tiền xử lý đến tách chiết đều tiến hành ở 4oC.
- Mục đích: quá trình loại tạp chất nhằm mục đích loại đi các chất non-
collagen ( chất béo, chất màu, chất gây mùi tanh,...) để chuẩn bò cho các quá trình tiếp theo.
- Các biến đổi của nguyên liệu: da cá có quá trình hút nước, trương nở, lúc này trọng lượng của da cá tăng lên.
- Thiết bò và thông số công nghệ : lần loại tạp chất đầu tiên, ta tiến hành xử lý bằng dung dòch NaOH 1%, sau đó da cá được cho xử lý tiếp với dung dòch Butyl alcohol 10% để loại tiếp tạp chất.
Sau quá trình loại tạp chất, collagen được tách chiết bằng dung dòch acid acetic 0.5M trong 3 ngày. Quá trình chiết collagen được thực hiện trong các bình reactor ở nhiệt độ lạnh, trong điều kiện vô trùng, khuấy trộn liên tục để đảm bảo chiết được collagen có chất lượng tốt. Sau quá trình chiết collagen ta tiến hành ly tâm thu lấy phần dòch, cả hai phần dòch chiết thu được là dung dòch lỏng, hơi sánh gọi là acid-soluble collagen. Phần bã thu được cũng được chiết lần hai với dung dòch aid acetic 0.5M trong vòng 2-3 ngày.
Để kết tinh collagen, cho NaCl sẵn vào dòch chiết đến nồng độ 0.9M. Đến đây collagen thô đã được kết tủa. Để thu được collagen sạch, ta tiến hành ly tâm, lấy phần tủa hòa tan vào dung dòch acid acetic 0.5M. Tiến hành thẩm tích thu được collagen sạch. Collagen sạch được làm lạnh và bảo quản ở nhiệt độ lạnh.
Trong quá trình tách chiết và tinh sạch protein, để loại muối ra khỏi dung dòch protein thi dung dòch protein được cho vào các túi đặc hiệu làm bằng nguyên liệu bán thấm, thường là dùng các túi cellophan. Sau đó đặt cả túi vào bình chứa lượng lớn, H20 hay lượng lớn dung dòch đệm được pha loãng ( có thể dùng đệm phosphat có pH = 7, nồng độ 0.01M). Vì màng cellophan là màng bán thấm có kích thước lỗ chỉ cho các chất có trọng lượng phân tử nhỏ đi qua các dung dòch đệm loãng. Như vậy, muối sẽ khuếch tán vào nước hoặc dung dòch đệm loãng ( di chuyển theo hướng giảm nồng độ), còn nước hay dung dòch đệm loãng sẽ di chuyển từ dung dòch rửa vào túi chứa protein. Protein là những đại phân tử không thể vượt qua túi thẩm tích và được giữ lại trong túi.
Sau khi tiến hành thẩm tích ta thực hiện ly tâm collagen vừa thu được, sau đó tiến hành sấy thăng hoa để thu được sản phẩm :
- Các biến đổi nguyên liệu: tách nước khỏi vật liệu bằng cách biến nước
trong vật liệu thành đá, sau đó biến nước đá thành hơi nước mà không qua trạng thái lỏng.
- Thiết bò: Hệ thống sấy thăng hoa tuần hoàn
* Hạ nhiệt độ sản phẩm sấy xuống dưới điểm đông lạnh (-10oC÷-20oC)
và được đặt trong bình chân không có áp suất gần với áp suất chân không tuyệt đối, khi đó nước thoát ra khỏi sản phẩm sấy ở trạng thái rắn, tức là thăng hoa ẩm.
* Mô hình hệ thống thiết bò sấy thăng hoa gồm 5 bộ phận: bình thăng
hoa, bình ngưng của máy lạnh, máy nén của máy lạnh, bình ngưng-đóng băng, bơm chân không. Quá trình sấy thăng hoa gồm 3 giai đoạn: giai đoạn đông lạnh, giai đoạn thăng hoa và giai đoạn sấy ẩm dư. Sấy thăng hoa có ưu điểm giảm thời gian sấy xuống 3 lần, không ảnh hưởng lớn đến giá trò dinh dưỡng và mùi vò sản phẩm, tuy nhiên chi phí năng lượng riêng cao hơn các phương pháp khác khoảng 50-60%.
Những kết quả phân tích collagen trích chiết từ da cá
Trong nghiên cứu này, tác giả đã sử dụng phương pháp điện di SPS-PAGE theo phương pháp của Weber và Osborn ( 1969) để xác đònh chuỗi collagen. Trong đó chuỗi collagen được hòa tan vào Sodium photphat 0.02M ( pH = 7.2) chứa 1% Sodium dodecyl sunphat ( SDS) và 3.5 ure. Tiến hành điện di trên 3.5% gel với đệm photphate 0.1M (pH = 7.2) chứa 1% SDS. Tác giả đã đo nhiệt độ biến tính của hỗn hợp collagen 0.03% hòa tan vào acid acetic 0.1M tại một số nhiệt độ. - Nhiệt độ biến tính collagen của da cá rất thấp : 26.5oC ( cá Pecca), 25.6oC(cá thu), 25oC (cá mập), thấp hơn khoảng 10 oC so với collagen của da cá heo ( 37oC).
Nhìn chung, tác giả đã đưa ra phương pháp tách chiết đơn giản, dễ thực hiện, chỉ là tách chiết dựa trên các hoá chất thông dụng, không quá đắt tiền, các thiết bò cũng thông dụng trong phòng thí nghiệm. Tác giả cũng khảo sát được cấu trúc chuỗi collagen gồm α1, α2, và α3. Khảo sát được nhiệt độ biến tính của collagen da cá và so sánh với collagen da heo. Tuy nhiên cũng có một số nhược điểm là khi sử dụng butyl alcohol trong quá trình rửa da cá loại tạp chất, phải qua công đoạn chưng cất thu hồi dung môi. Butyl alcohol không được khuyến cáo sử dụng trong thực phẩm. Tác giả khảo sát cấu trúc collagen nhưng chưa xác đònh được trọng lượng phân tử của chúng, chưa xác đònh thành phần acid amin trong collagen.
Thuyết minh qui trình công nghệ :
Quá trình tiền xử lý tạp chất vẫn sử dụng dung dòch NaOH 1% và butyl alcohol 10% . Bên cạnh việc tách chiết bằng acid acetic, qui trình còn sử dụng enzyme pepsine. Da cá sau khi rửa sạch tạp chất sẽ được chiết với dung dòch acid acetic 0,5M trong vòng 3 ngày. Ly tâm lấy phần dòch cho kết tủa với NaCl bổ sung đệm tris – HCl (pH = 7,5) thu được collgen thô. Còn phần bã được chiết tiếp bằng hỗn hợp acid acetic 0,5M và enzyme pepsin 10%(w/v) trong 2 ngày , ở 40C . Điểm đẳng điện của enzyme pepsin trong khoảng pH = 1, pepsin thủy phân mạnh các liên kết peptide nối mạch do các nhóm amin của các acid amin thơm trong trong phân tử protein tạo thành. Sản phẩm được tách ra là các peptide và các acid amin tự do. Trong môi trường acid, pepsin hoạt động thích hợp nhất trong khoảng pH = 1.5 – 2 , pepsin có độ bền tối đa ở pH = 4-5, ở vùng pH này, hoạt lực của pepsin thấp, từ pH = 5,6 thì hầu như không có hoạt tính protease. Dung dòch pepsin trong H20 ở dạng pepsinogen và được hoạt hóa bởi H+ với pH = 1.5 – 2, chúng tiến hành phân giải gần 30% mạch peptide và thủy phân protein thành polypeptide.
Tiến hành ly tâm lấy phần dòch này với dung dòch Na2HPO4 0,02M (pH= 7.2) trong 3 ngày. Sau đó, dòch thẩm tách được ly tâm, lấy phần kết tủa hòa tan vào acid acetic 0,5M . Kết tủa collagen bằng NaCl bổ sung đệm tris – HCl (pH = 7,5). Ly tâm lấy phần tủa hòa tan vào dung dòch acid acetic 0,5M để loại bỏ các tạp chất không tan trong acid. Tiến hành thẩm tích loại bỏ acid acetic, làm khô lạnh thu được sản phẩm collagen.
Kết quả phân tích collagen
Đối với phương pháp sử dụng enzyme để chiết collagen, ta nhận thấy collagen
không tan hoàn toàn trong acid nhưng tan hoàn toàn trong enzyme pepsin. Hiệu suất chiết bằng enzyme đạt 44,7% trong khi đó chiết bằng acid acetic chỉ đạt 10,7%. Việc bổ sung enzyme giúp cho sự phá vỡ các màng tế bào nhanh và mạnh hơn. Vì thế collagen dễ dàng được tách ra và cho hiệu suất cao.
Kết quả cũng cho thấy rằng nhiệt độ biến tính của collagen ở da cá nóc là 280C thấp hơn collagen ở da heo. Thành phần acid amin trong collagen ở loài cá nóc gồm 19 loại, trong đó hàm lượng glycine chiếm 30% cho thấy được glycine là thành phần amino acid chủ yếu trong collagen.
Bảng 2.1 Thành phần a.a của dung dòch collagen da cá nóc chiết bằng enzyme pepsine.
Thành phần acid amin
Số gốc / 1000 gốc
Hydroxyproline
67
Acid aspartic
50
Threonine
25
Serin
48
Glutamic acid
87
Proline
103
Glycine
351
Alanine
106
Cystein
2
Valine
17
Methionine
14
Isoleucine
12
Leucine
23
Tyrosine
4
Phennylalnine
10
Trytophan
0
Lysine
19
Histidine
8
Arginine
54
Tổng
1000
2.1.8 Năm 2009, Zhang Liu Li đã có các nghiên cứu trên loài cá da trơn (Largefin longbabel)
Trong nghiên cứu này, quá trình tẩy rửa được tiến hành ở 40C, trong điều kiện khuấy trộn. Da được ngâm với dung dòch NaOH 0,1M với tỉ lệ 1/20 (w/v) trong vòng 24h. Tiến hành thay dung dòch một lần sau 24h để loại bớt tạp chất non-collagen, chất béo, chất màu và mùi tanh. Rửa lại với nước cho sạch. Sau đó tiếp tục loại béo bằng dung dòch butyl ancohol 15%(v/v), tỉ lệ 1÷ 20 thực hiện 2 lần trong vòng 12h. Rửa lại với nước lạnh cho sạch, sau đó tiếp tục tẩy màu với dung dòch H2O2 3%, rửa 2 lần trong vòng 24h. Rửa lại với nước lạnh cho sạch.
Sau khi được xử lý, da được chiết với dung dòch acetic 0,5M có khuấy trộn, tỉ lệ nguyên liệu / dung dòch là 1/15, thực hiện trong thời gian 24h ở nhiệt độ lạnh 40C, sau đó dòch chiết được ly tâm lạnh. Phần bã được chiết tiếp lần 2 bằng dung dòch acid acetic trong thời gian 12h. Ly tâm dòch chiết, tất cả 2 phần dòch chiết được thêm NaCl đến nồng độ 0,7M để kết tủa collagen. Ly tâm lấy phần kết tủa đem tinh sạch.
Lượng collagen thô được hòa tan hoàn toàn vào dung dòch acid acetic 0,5M để loại bỏ các tạp chất không tan trong acid. Dung dòch được thẩm tách với acid acetic 0,1M trong 3 ngày, thay acid mỗi ngày. Phần kết tủa được làm lạnh khô bằng thiết bò đông khô khô (Labconco Freezone 2,5L, USA) thu được sản phẩm collagen sạch acid soluble collagen (ASC).
Phần bã sau khi đã chiết 2 lần với acid acetic, đem chiết tiếp tục với dung dòch acid acetic 0.5M chứa 15%(w/w) pepsin trong thời gian 30 phút ở nhiệt độ 40C, khuấy liên tục. Cho kết tủa và tinh sạch như trên, thu được collagen sạch pepsin soluble collagen (PSC).
Ngoài các phương pháp phân tích collagen như tiến hành chạy sắc kí điện di, đo độ nhớt và nhiệt độ biến tính của collagen, tác giả còn nghiên cứu sâu thêm về collagen bằng cách đo phổ hấp thu tử ngoại của dung dòch collagen bằng quang phổ kế. Kết quả cho thấy rằng mặc dù protein có bước sóng hấp thu cực đại ở vùng tử ngoại gần là 280nm nhưng collagen không có bước sóng nào trong vùng này. Cả collagen ASC và PSC đều hấp thu ở bước sóng là 233nm. Bên cạnh đó, tác giả còn tiến hành đo phổ hồng ngoại FTIR để xác đònh bước sóng hấp thu của các amide của cả 2 loại collagen là ASC và PSC.
CHƯƠNG 3 : ỨNG DỤNG CỦA COLLAGEN
3.1 ỨNG DỤNG COLLAGEN TRONG CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM
3.1.1 Ứng dụng collagen trong công nghiệp sản xuất bánh kẹo
3.1.2 Ứng dụng collagen trong công nghiệp sản xuất sữa và các sản phẩm từ sữa
3.1.3 Ứng dụng collagen trong công nghiệp sản xuất đồ uống
3.1.3 Ứng dụng collagen trong công nghiệp chế biến thòt
3.2 ỨNG DỤNG TRONG Y HỌC VÀ DƯC PHẨM