THỬ NGHIỆM BRONOPOL TRONG ĐIỀU TRỊ TRÙNG QUẢ DƯA (Ichthyophthyrius multifiliis) VÀ VI KHUẨN TRÊN CÁ TRA (Pangasius hypophthalmus)

THỬ NGHIỆM BRONOPOL TRONG ĐIỀU TRỊ TRÙNG QUẢ DƯA Ichthyopthyrius multifiliis VÀ VI KHUẨN TRÊN CÁ TRA Pangasius hypophthalmus Thực hiện bởi: TRẦN PHƯƠNG ĐẠI Luận văn được đệ trình để

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM

KHOA THỦY SẢN

-oOo -

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

THỬ NGHIỆM BRONOPOL TRONG

ĐIỀU TRỊ TRÙNG QUẢ DƯA

THỬ NGHIỆM BRONOPOL TRONG ĐIỀU TRỊ

TRÙNG QUẢ DƯA (Ichthyopthyrius multifiliis)

VÀ VI KHUẨN TRÊN CÁ TRA

(Pangasius hypophthalmus)

Thực hiện bởi:

TRẦN PHƯƠNG ĐẠI

Luận văn được đệ trình để hoàn tất yêu cầu cấp bằng Kỹ Sư Nuôi trồng Thủy Sản

Người hướng dẫn: LƯU THỊ THANH TRÚC

Thành phố Hồ Chí Minh

2007

TÓM TẮT

Đề tài nghiên cứu: “Thử nghiệm Bronopol trong điều trị trùng quả dưa

(Ichthyophthyrius multifiliis) và vi khuẩn trên cá Tra (Pangasius hypophthalmus)” được tiến hành từ ngày 01/03/2007 đến 01/08/2007 tại Trại thực

nghiệm và Phòng thí nghiệm Bệnh Học Thủy Sản, Khoa Thủy Sản, Trường Đại Học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

Thí nghiệm được tiến hành nhằm đánh giá hiệu quả của thuốc Bronopol trong

việc diệt trùng quả dưa (Ichthyophthyrius multifiliis) và vi khuẩn trên cá Tra (Pangasius hypophthalmus) Chúng tôi tiến hành 4 thí nghiệm:

Thí nghiệm 1: Xác định LC50-24h của Bronopol trên cá Tra

Kết quả sau khoảng thời gian 24 giờ chúng tôi ghi nhận LC50 của Bronopol với

cá Tra là 13,07ppm

Thí nghiệm 2: Khảo sát tỉ lệ chết ở các liều khác nhau bằng phương pháp tắm

Kết quả thu được là ở cả 2 liều Bronopol 10ppm và 20ppm tắm 30 phút không ảnh hưởng đến tỷ lệ sống của cá tra

Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng diệt trùng quả dưa (Ichthyophthyrius

multifiliis) của Bronopol

Các liều 10ppm Bronopol tắm 30 phút, 2 giờ và 20ppm Bronopol tắm 30 phút,

2 giờ đều làm giảm trùng quả dưa Trong đó liều 20ppm Bronopol tắm trong 2 giờ với khả năng diệt trùng quả dưa thì cho kết quả tốt nhất

Thí nghiệm 4: Khảo sát khả năng diệt khuẩn của Bronopol

Kết quả là với nồng độ 10ppm Bronopol tắm 2 giờ và liều 20ppm tắm 30 phút

và 2 giờ thì có hiệu quả làm giảm tổng vi khuẩn hiếu khí trong nước

Hầu như ở các liều trên không hiệu quả trong việc làm giảm tổng số vi khuẩn hiếu khí trên cá

ABTRACT

Research topic: “Evaluate effects of Bronopol against protozoa

(Ichthyophthyrius multifiliis) and bacteria infection on Tra catfish (Pangasius hypophthalmus)”

The experiment was conducted at the Fisheries Faculty’s Experimental Farm and Aquatic Animal Pathology Lab, Nong Lam University, Thu Duc district, Ho Chi Minh City from March 1th, 2007 to August 1th, 2007 To achieve the objectives four experiments have been carried out:

Experiment 1: Study on LC50-24h of Bronopol for Tra Catfish (Pangasius

hypophthalmus)

After 24 hours, LC50-24h of Bronopol on Tra Catfish is 13,07ppm

Experiment 2: Determine on mortality of fish in bath methods with Bronopol

Use 10ppm and 20ppm of Bronopol in 30 minute bath that most of fish was comletely heathy

Experiment 3: Study on effective concentration of Bronopol in protozoa

(Ichthyophthyrius multifiliis) on Tra Catfish (Pangasius hypophthalmus)

Bronopol has been proved effective for the control of Ichthyophthyrius

multifiliis with 10ppm of Bronopol in 30 minute and 2 hour bath and 20ppm of

Bronopol in 30 minute and 2 hour bath Administered daily at concentration of 20ppm in 2 hours bath in water was completely effective to removing

Ichthyophthyrius multifiliis from the skin and gills

Experiment 4: Study on effective concentration on Tra catfish (Pangasius

hypoththalmus) in bacteria

The data also showed that application of Bronopol was significantly reduced the total aerobic bacterial populations in water However, bath treatment with Bronopol was unsuccessful significantly reduced the total aerobic bacterial population in treated fish The further experiment should be conducted by using the fish which cultured in pond and investigated the accumulation of Bronolpol in fish

CẢM TẠ

Chúng tôi kính gửi lòng biết ơn chân thành đến:

- Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh

- Ban Chủ Nhiệm Khoa Thủy Sản

- Quý thầy cô trong Khoa Thủy Sản đã tận tình giảng dạy, cung cấp và truyền đạt cho chúng tôi những kiến thức quý báu trong quá trình thực tập

- Quý Thầy Cô và các anh chị ở Trại thực nghiệm Khoa Thủy Sản Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM đã tạo điều kiện thuận lợi cho chúng tôi hoàn thành tốt đề tài này

- Trung Tâm Nghiên Cứu Virbac và anh Trần Anh Hoàng Sử đã giúp đỡ chúng tôi hoàn thành tốt đề tài này

- Toàn thể các bạn trong lớp nuôi trồng thủy sản 29 và các bạn ngoài lớp đã giúp đỡ chúng tôi trong thời gian làm đề tài

Đặc biệt chúng tôi gửi lòng biết ơn sâu sắc đến cô Lưu Thị Thanh Trúc đã tận tình hướng dẫn giúp đỡ chúng tôi hoàn thành tốt luận văn này

MỤC LỤC

Đề Mục Trang

Trang tựa i

Tóm tắt ii

Abstract iii

Cảm tạ iv

Mục lục v

Danh sách các chữ viết tắt viii

Danh sách các bảng ix

Danh sách các đồ thị và hình ảnh x

I GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt Vấn Đề 1

1.2 Mục Tiêu Đề Tài 1

II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

2.1 Đặc Điểm Sinh Học Cá Tra 2

2.1.1 Phân loại 2

2.1.2 Phân bố 2

2.1.3 Hình dạng 2

2.1.4 Môi trường sống 2

2.1.5 Đặc điểm dinh dưỡng 2

2.1.6 Đặc điểm sinh trưởng 3

2.1.7 Đặc điểm sinh sản 3

2.2 Sơ lược về Malachite Green 4

2.2.1 Đặc điểm và tác dụng trong thủy sản 4

2.2.2 Tác hại Malachite Green 4

2.2.3 Lý do Malachite Green vẫn được sử dụng 5

2.3 Sơ Lược Về Bronopol 5

2.3.1 Tên gọi và công thức cấu tạo 5

2.3.2 Đặc điểm lý hóa học của Bronopol 6

2.3.2.1 Hình dạng bên ngoài 6

2.3.2.2 Tỷ trọng 6

2.3.2.3 Áp suất bốc hơi 6

2.3.2.4 Tính bền vững 6

2.3.2.5 Độ hòa tan 7

2.3.2.6 Điểm nóng chảy 7

2.3.3 Sự Chuyển Hóa Trong Môi Trường 7

2.3.3.1 Thủy phân 7

2.3.3.2 Sự thoái biến 8

2.3.3.3 Nguy hại với môi trường 8

2.3.4 Tính độc của Bronopol 9

2.3.4.1 Đối với loài chim 9

2.3.4.2 Đối với động vật dưới nước 9

2.3.4.3 Sự tích tụ 10

2.2.4.4 Nguy hiểm tiềm tàng 11

2.3.5 Những nghiên cứu về Bronopol trong thủy sản 12

2.3.6 Ứng dụng Bronopol trong thủy sản 12

2.4 Sơ lược về vi khuẩn trên động vật thủy sản 13

2.4.1 Đặc tính chung của vi khuẩn 13

2.4.2 Một số loài vi khuẩn gây bệnh cho động vật thủy sản 14

2.5 Sơ lược trùng quả dưa (Ichthyopthyrius multifiliis) 17

2.5.1 Đặc điểm hình dạng, sinh trưởng và phát triển 17

2.5.2 Dấu hiệu bệnh lý 19

2.5.3 Phân bố và lan truyền bệnh 19

III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

3.1 Thời Gian và Địa Điểm Thực Hiện 20

3.2 Vật Liệu 20

3.2.1 Dụng cụ 20

3.2.2 Hóa chất và môi trường 20

3.2.2.1 Thuốc và Hóa chất 20

3.2.2.2 Môi trường 20

3.2.3 Cá thí nghiệm 20

3.2.4 Hệ thống đinh danh vi khuẩn 20

3.3 Phương pháp nghiên cứu 21

3.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát LC50-24h của Bronopol đối với cá Tra 21

3.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát tỉ lệ cá chết ở các nồng độ Bronopol bằng phương pháp tắm 21

3.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng diệt trùng quả dưa của Bronopol trên cá Tra 22

3.3.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát khả năng diệt khuẩn của Bronopol 23

3.3.5 Phương pháp phân lập vi khuẩn và định danh vi khuẩn 24

3.3.5.1 Phân lập vi khuẩn 24

3.3.5.2 Đếm số lượng vi khuẩn 25

3.3.5.3 Làm thuần 25

3.3.6 Các phương pháp tiến hành để định danh 25

3.3.6.1 Nhuộm Gram 25

3.3.6.2 Thử nghiệm Oxidase 27

3.3.6.3 Thử nghiệm Catalase 27

3.3.6.4 Thử nghiệm về khả năng di động của vi khuẩn 28

3.3.6.5 Định danh vi khuẩn 28

3.3.7 Bảo quản giống vi khuẩn 34

IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36

4.1 Các thông số môi trường 36

4.1.1 Nhiệt độ nước 36

4.1.2 Hàm lượng Oxygen 36

4.1.3 Độ pH 36

4.1.4 Hàm lượng NH3 36

4.2 Thí nghiệm 1: Khảo sát LC50-24h của Bronopol đối với cá Tra 37

4.3 Thí nghiệm 2: Khảo sát tỉ lệ cá chết ở các nồng độ Bronopol bằng phương pháp tắm 38

4.4 Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng diệt trùng quả dưa của Bronopol trên cá Tra 39

4.5 Thí nghiệm 4: Khảo sát khả năng diệt khuẩn trên cá Tra 44

4.5.1 Tổng vi khuẩn hiếu khí trong nước 44

4.5.2 Tổng vi khuẩn hiếu khí trên cá 44

4.6 Kết quả định danh vi khuẩn 46

V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 51

5.1 Kết luận 51

5.2 Đề nghị 51

VI TÀI LIỆU THAM KHẢO 52

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

PCA : Plate Count Agar

ONPG : O – Nitrophenyl β – D – Galactopyrannoside

IDS 14 GNR : Identification System with 14 biochemical reationsfor

identification of non fastidious Gram negative rods

EPA : United states enviromental protection agency

DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ BIỂU ĐỒ

2.1 Thời gian bán hủy của Bronopol khi được chuẩn bị trong dung

dịch đệm lỏng 300ppm .6

2.2 Độ hoà tan của Bronopol ở 22 – 250C trong một số chất hoà tan thông thường 7

2.2 Độc tố của Bronopol với các loài động vật .10

3.1 Số thứ tự các đĩa giấy sinh hóa trong giếng 28

3.2 Thuốc thử và kết quả phản ứng sinh hóa trong các giếng 30

4.1 Tỉ lệ cá chết với các nồng độ của Bronpol khi khảo sát LC50-24h 37

4.2 Tỉ lệ cá chết với các nồng độ của Bronpol bằng phương pháp tắm trong 5 ngày 38

4.3 Tỷ lệ sống của cá trong thời gian thí nghiệm trị trùng quả dưa 43

4.4 Tổng vi khuẩn hiếu khí trong nước (log cfu/ml) trong thời gian thí nghiệm 44

4.5 Tổng vi khuẩn hiếu khí trên cá (log cfu/g) trong thời gian thí nghiệm .44

4.6 Tỉ lệ sống của cá trong thời gian thí nghiệm khả năng diệt khuẩn 45

4.7 Kết quả định danh vi khuẩn từ nước trong bể nuôi 47

4.8 Kết quả định danh vi khuẩn từ cá .48

DANH SÁCH ĐỒ THỊ VÀ HÌNH ẢNH

4.1 Tương quan tuyến tính LC50-24h của Bronopol 38

4.2 Cường độ cảm nhiễm trên da trước và sau thí nghiệm 39

4.3 Tỉ lệ cảm nhiễm trên da trước và sau thí nghiệm 40

4.4 Cường độ cảm nhiễm trên mang trước và sau thí nghiệm 41

4.5 Tỉ lệ cảm nhiễm trên mang cá trước và sau thí nghiệm 42

4.6 Phần trăm hình thái khác nhau của vi khuẩn 46

HÌNH NỘI DUNG TRANG 2.1 Trùng quả dưa 17

2.2 Vòng đời của trùng quả dưa 18

3.1 Cá Tra thí nghiệm 21

3.2 Bể nhựa bố trí thí nghiệm LC50-24h và thí nghiệm phương pháp tắm 22

3.3 Bể xi măng bố trí thí nghiệm khả năng diệt trùng quả dưa và vi khuẩn của Bronopol 24

4.1 Trùng quả dưa trên da trước và sau thí nghiệm 40

4.2 Trùng quả dưa trên mang trước và sau thí nghiệm 41

4.3 Cá Tra nhiễm trùng quả dưa 43

4.4 Tổng vi khuẩn hiếu khí trên đĩa thạch sau khi ủ ở 300C trong 24 giờ 45

4.5 Các loại khuẩn lạc phân lập được trong quá trình thí nghiệm 46

4.6 Các hình dạng khác nhau của vi khuẩn 47

4.7 Cá Tra có biểu hiện bệnh thận mủ 49

4.8 Các phản ứng sinh hóa trong giếng định danh 50

4.9 Phản ứng sinh hóa của mẫu vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 50

1.1 Đặt Vấn Đề

Trong những năm gần đây, ngành thủy sản nói chung và nuôi trồng thủy sản nói riêng đã có những bước phát triển mạnh mẽ, không những giải quyết nhu cầu đạm ngày càng cao của con người mà còn đem lại nguồn lợi lớn về kinh tế để phát triển đất nước

Mặt hàng thủy sản nước ta ngày càng được ưa chuộng và đã được xuất khẩu sang nhiều nước trên thế giới Bên cạnh con tôm là đối tượng xuất khẩu chủ lực thì cá tra hiện nay cũng là loài thủy sản có giá trị kinh tế cao, đang được nuôi phổ biến và phát triển mạnh

cả về diện tích nuôi và sản lượng ở Đồng bằng sông Cửu Long trong các ao, lồng bè Tuy nhiên, do việc mở rộng diện tích không theo qui hoạch cùng với việc sử dụng các loại thuốc, hóa chất ngày càng nhiều trong việc phòng và trị bệnh thì ngoài tác dụng mong muốn còn gây tác hại xấu đến môi trường và đáng quan tâm hơn cả là dư lượng thuốc còn tồn đọng trên cá có nguy cơ ảnh hưởng đến sức khỏe con người

Malachite Green là loại thuốc được sử dụng phổ biến rất có hiệu quả trong việc điều trị nấm, vi khuẩn, kí sinh trùng trên cá nhưng vào năm 2003 theo QĐ 20/2003/QĐ-BTS chất này đà bị cấm sử dụng Do đó, vấn đề đặt ra là phải có một chất mới để thay thế trong việc trị bệnh cá mà không gây hại đến sức khỏe người

Trước tình hình đó, Bronopol là chất đã được nghiên cứu có thể thay thế Malachite Green có thể sử dụng để trị bệnh cá và được đánh giá là một chất không gây ung thư có thể làm chất tẩy trùng, diệt khuẩn trên cá

Xuất phát từ nội dung trên, được sự phân công của Trường Đại Học Nông Lâm,

chúng tôi thực hiện đề tài:“Thử nghiệm Bronopol trong điều trị trùng quả dưa

(Ichthyophthyrius multifiliis) và vi khuẩn trên cá Tra (Pangasius hypophthalmus)”

1.2 Mục Tiêu Đề Tài

- Khảo sát LC50-24h của Bronopol trên cá Tra

- Khảo sát tỉ lệ cá chết ở các nồng độ Bronopol bằng phương pháp tắm

- Khảo sát khả năng diệt trùng quả dưa của Bronopol trên cá Tra

- Khảo sát khả năng diệt khuẩn của Bronopol trên cá Tra

II TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Đặc Điểm Sinh Học Cá Tra

Cá tra phân bố ở lưu vực sông Mê Kông Cá trưởng thành chỉ thấy trong

ao nuôi, rất ít gặp trong địa phận Việt Nam do cá có tập tính di cư ngược dòng sông Mê Kông để sinh sống và tìm nơi sinh sản tự nhiên

2.1.3 Hình dạng

Thân dài, hẹp ngang, đầu nhỏ vừa phải Miệng rộng có răng sắc nhọn trên các xương hàm, xương lá mía và xương khẩu cái Mắt tương đối to Có 2 đôi râu trong đó đôi râu hàm trên ngắn hơn 1/2 chiều dài đầu, râu hàm dưới ngắn hơn chiều dài đầu Gai trên cùng mang thưa và ngắn nên không có tác dụng lọc thức

ăn như cá ăn sinh vật phù du Vây lưng và vây ngực có gai cứng mang răng cưa

ở mặt sau Vây mỡ nhỏ, vây hậu môn tương đối dài Da trơn không có vảy, hơi xanh trên lưng

2.1.4 Môi trường sống

Cá tra sống chủ yếu trong môi trường nước ngọt, có thể sống được ở môi trường nước lợ với nồng độ muối 7 - 10 %o , có thể chịu đựng được nước phèn với pH >5, dễ chết ở nhiệt độ thấp dưới 15oC nhưng chịu nóng tới 39oC Cá tra

có số lượng hồng cầu trong máu nhiều hơn các loài cá khác

Cá có cơ quan hô hấp phụ là bóng khí và da nên chịu đựng được môi trường có oxy thấp

2.1.5 Đặc điểm dinh dưỡng

Cá tra khi hết noãn hoàng thì thích ăn mồi tươi sống Vì vậy, chúng ăn thịt lẫn nhau ngay trong bể ấp và chúng vẫn tiếp tục ăn nhau nếu cá ương không được cho ăn đầy đủ, thậm chí cá vớt trên sông vẫn thấy chúng ăn nhau trong đáy vớt cá bột Ngoài ra khi khảo sát cá bột vớt trên sông còn thấy trong dạ dày chúng có rất nhiều phần cơ thể và mắt các con cá khác

Dạ dày của cá phình to hình chữ U và co giãn được, ruột cá tra ngắn, không gấp khúc lên nhau mà dính vào màng treo ruột ngay dưới bóng khí và tuyến sinh dục Dạ dày to và ruột ngắn là đặc điểm của cá thiên về ăn thịt Ngay khi hết noãn hoàng cá thể hiện rõ tính ăn thịt lẫn nhau

Khi cá lớn thể hiện rõ tính ăn rộng, ăn đáy và ăn tạp thiên về động vật nhưng dễ chuyển đổi thức ăn Trong điều kiện thiếu thức ăn cá có thể sử dụng các loại thức ăn bắt buộc khác như mùn bã hữu cơ, thức ăn có nguồn gốc động vật

2.1.6 Đặc điểm sinh trưởng

Cá tra có tốc độ tăng trưởng tương đối nhanh, còn nhỏ cá tăng nhanh về chiều dài Cá ương trong ao sau 2 tháng đã đạt chiều dài 10 – 12 cm (khoảng 14 – 15 g) Từ khoảng 2,5 kg trở đi, mức tăng trọng lượng nhanh hơn so với tăng chiều dài cơ thể

Cỡ cá 10 tuổi trong tự nhiên tăng trọng rất ít và có thể sống trên 20 năm, kích thước tối đa đạt được là 1,8 m

Nuôi trong ao 1 năm cá đạt 1 - 1,5 kg/con (năm đầu tiên), những năm về sau cá tăng trọng nhanh hơn, có khi đạt tới 5 – 6 kg/năm tùy môi trường, loại thức ăn sử dụng

2.1.7 Đặc điểm sinh sản

Tuổi thành thục của cá đực là 2 tuổi và cá cái là 3 tuổi, trọng lượng cá thành thục lần đầu từ 2,5 – 3 kg Trong tự nhiên chỉ gặp cá thành thục trên sông thuộc địa phận Campuchia và Thái Lan

Cá tra không có cơ quan sinh dục phụ nên nhìn hình dáng bên ngoài thì khó phân biệt được đực, cái Ở thời kì thành thục, tuyến sinh dục ở cá đực phát triển lớn gọi là buồng tinh, cá cái gọi là buồng trứng Tuyến sinh dục của cá tra bắt đầu phân biệt đực cái từ giai đoạn II tuy màu sắc chưa khác nhau nhiều Các giai đoạn sau, buồng trứng tăng về kích thước, hạt trứng màu vàng, tinh sào có

hình dạng phân nhánh, màu hồng chuyển dần sang màu trắng sữa

Mùa vụ thành thục của cá trong tự nhiên bắt đầu từ tháng 5 - 6 dương lịch,

cá có tập tính di cư đẻ tự nhiên trên khúc sông có điều kiện sinh thái thích hợp thuộc địa phận Campuchia và Thái Lan, không đẻ tự nhiên ở phần sông Việt Nam Cá đẻ trứng dính vào giá thể thường là rễ của loài cây sống ven sông Gimenilasiatica sau 24 giờ thì trứng nở thành cá bột và trôi về hạ nguồn

Trong sinh sản nhân tạo có thể nuôi thành thục sớm và cho đẻ sớm hơn trong tự nhiên (từ tháng 3 dương lịch hàng năm), cá tra có thể tái phát dục 1 - 3 lần trong 1 năm Sức sinh sản tuyệt đối từ 200.000 đến vài triệu trứng Sức sinh sản tương đối 135.000 trứng/kg cá cái

Trứng sắp đẻ có đường kính trung bình 1mm sau khi đẻ ra và hút nước có thể tới 1,5 - 1,6 mm

2.2 Sơ Lược Về Malachite Green

2.2.1 Đặc điểm và tác dụng trong thủy sản

Malachite Green có tên hóa học là Triphenylmethane Malachite Green

là 1 loại bột rất mịn có màu xanh được dùng để nhuộm tơ, vải, giấy,

da Malachite Green cũng được dùng trong phòng thí nghiệm để nhuộm vi trùng và bào tử của nó Malachite Green được xem là chất diệt trùng, sát nấm

(loại Saprolegnia ssp) và sát ký sinh trùng nhóm nguyên sinh vật (Protozoa)

Malachite Green đã được giới nuôi trồng thủy sản trên thế giới sử dụng 1 cách rộng rãi từ lâu để phòng và trị bệnh cho cá tôm và hến Tại Canada trước

1992 các trại sản xuất cá giống cũng thường sử dụng Malachite Green để ngăn ngừa trứng cá bị nhiễm nấm

2.2.2 Tác hại Malachite Green

Khi vào cơ thể cá, Malachite Green sẽ bị phân hủy ra thành chất chuyển hóa là Leucomalachite Green Thời gian đào thải của Malachite Green nhanh, ngược lại chất Leucomalachite Green có thể tồn tại trong 1 thời gian rất lâu dài trong thịt và nhất là trong mỡ của cá đã bị nhiễm độc

Thí nghiệm cho thấy Malachite Green và Leucomalachite Green làm hại gan, làm biến đổi tuyến giáp trạng, gây ra tình trạng mất máu, làm đột biến thay

đổi gene (mutagenic) và gây cancer (carcinogenic) trên loài chuột thí nghiệm

Qua việc thẩm định các kết quả trên, giới khoa học đưa ra kết luận rằng Malachite Green và Leucomalachite Green là hai chất nguy hại có tiềm năng gây ung thư cho người

Theo các giới y tế Hồng Kông thì trong thực tế, Malachite Green chỉ có thể gây hại nghiêm trọng đến sức khỏe nếu chúng ta ăn mỗi ngày 1 số lượng cá khổng lồ như 290 kg cá nước ngọt hay 7 kg lươn nuôi mà thôi Malachite Green

đã được cả thế giới sử dụng trong việc nuôi cá tôm từ nhiều năm nay nhưng thật

sự mới bắt đầu bị cấm từ năm 1992 trở lại đây Tác hại của nó trên sức khỏe chúng ta chỉ là những suy diễn và phỏng đoán qua các thí nghiệm ở loài chuột Năm 2002 Canada cũng như nhiều quốc gia khác đã nhận thấy chất Malachite Green có thể là mối đe dọa cho sức khỏe nên bắt đầu đề ra những chương trình thử nghiệm Malachite Green ở các loại cá tôm nuôi bày bán ở thị trường Các quốc gia trong khối Liên hiệp Âu châu và Úc Châu ấn định ngạch

số tối đa của Malachite Green và Leucomalachite Green trong thủy sản là phải

ở mức 2 phần tỉ (ppb), tức là không được vượt quá 0,002 mg/kg Hoa Kỳ và Canada thì không chấp nhận sự hiện diện của bất kỳ 1 dư lượng nào dù là thật thấp của Malachite Green và Leucomalachite Green

2.2.3 Lý do Malachite Green vẫn được sử dụng

Malachite Green là 1 chất rẻ tiền, dễ tìm mà lại cho kết quả rất tốt trong vấn đề nuôi trồng thủy sản Các chất thay thế Malachite Green thì còn hiếm thấy, khó mua và đắt tiền cho nên 1 số người nuôi cá ở các quốc gia Á châu và Việt Nam vẫn lén xài chất xanh Malachite 1 cách bất hợp pháp

Ngày nay ở Việt Nam cũng đã cấm việc dùng chất Malachite Green trong việc nuôi trồng thủy sản Tuy nhiên, các hộ nuôi trồng thủy sản vẫn lén sử dụng để sát trùng ao hồ, để tắm cá trước khi thả chúng vào lồng nhằm mục đích ngừa cá bị nhiễm nấm hoặc nhiễm ký sinh trùng

2.3 Sơ Lược Về Bronopol

2.3.1 Tên gọi và công thức cấu tạo

Tên hóa học: 2-bromo-2 nitropropane-1,3 diol

Công thức phân tử: C3H6BrNO4

Công thức cấu tạo:

2.3.2 Đặc điểm lý hóa học của Bronopol

Ở dạng dung dịch lỏng, Bronopol rất bền vững khi pH của hệ thống ở mức acid hay trung hòa Trong điều kiện thiếu hụt chất đệm, dung dịch Bronopol tự bền vững hóa pH tối ưu cho sự ổn định của Bronopol là pH = 4 và

dữ liệu từ nghiên cứu dung dịch pha loãng của Bronopol (0,03%) thời gian bền vững giảm đi một nửa ở nhiệt độ 22 – 25oC và pH= 4 là vượt quá 5 năm, pH tăng cao dung dịch Bronopol trở nên kém bền vững hơn, nhiệt độ cũng ảnh hưởng đáng kể đến độ bền vững của Bronopol trong những hệ thống kiềm

Bảng 2.1: Thời gian bán hủy của Bronopol khi được chuẩn bị trong dung dịch

60oC 2 năm < 2 ngày < 1 ngày

Thời gian này xuất phát từ phân tích sắc ký quang phổ lỏng áp suất cao trong dung dịch pha loãng

2.3.2.5 Độ hòa tan

Bronopol hòa tan tốt trong nước, hòa tan tốt trong dung môi phân cực, hòa tan thấp trong dung môi không phân cực, và thuận lợi phân chia nhiều phần trong nước Với thời gian tồn tại ngắn của Bronopol trong môi trường sẽ giảm bớt những mầm bệnh tiềm tàng trong nguồn nước ngầm

Bảng 2.2: Độ hòa tan của Bronopol ở 22 – 250C trong một số chất hòa tan thông

thường

Chất hòa tan % khối lượng/thể tích

Nước Methanol Ethanol Isopropanol Ethylene Glycol Propylen Glycol Dipropylene Glycol Dầu hạt gòn

Dầu Olive Parrafin lỏng

Vì là vật chất nguyên chất, Bronopol có điểm nóng chảy vào khoảng

130oC Tuy nhiên do đặc điểm polymorphic, Bronopol trải qua giai đoạn tái sắp xếp lactic ở 100 - 1500C và điều này thường được giải thích nhầm là điểm nóng chảy Ở 1400C, Bronopol bị phân hủy tỏa nhiệt, giải phóng ra hydrogen bromide

và nitrogen oxide

2.3.3 Sự chuyển hóa trong môi trường

2.3.3.1 Thủy phân

Sự thủy phân có tương tác chặt chẽ với nhiệt độ và pH Sự thủy phân

có hoặc không xảy ra rõ ràng tùy thuộc vào điều kiện

Một nghiên cứu chỉ ra rằng dưới những điều kiện khác nhau, Bronopol bền và không bị thủy phân ở các điều kiện tự nhiên đặc trưng Khi ở nhiệt độ cao 30, 40, 50 và 60oC dưới ánh sáng bao quanh phòng thí nghiệm và ở nồng độ 2.000ppm hoặc cao hơn, thời gian bán rã được tính ở nhiệt độ 20oC thì trong 18 năm ở pH = 4 và 1,5 năm ở pH = 6 và gần 2 tháng ở pH = 8

Ở nhiệt độ và pH cao hơn trong các ứng dụng công nghiệp thì sự thủy phân có thể tăng nhanh hơn

Sự gia tăng phân hủy Bronopol ở nồng độ thấp đã được xác định trong nghiên cứu sự phân hủy Bronopol trong nước biển Bronopol 300ppm cho thấy

sự phân hủy nhanh chóng vào ban đầu mà đạt đến trạng thái gần cân bằng trước khi phân hủy 50% Trái lại, ở nồng độ thấp hơn mức 50 và 20ppm cho thấy thời gian bán hủy theo thứ tự là 13 và 8 giờ

Sự quan trọng của ánh sáng đối với sự phân hủy của Bronopol cũng được chứng minh khi dung dịch Bronopol 200ppm ở pH = 6 được trữ trong vòng 1 tháng ở 30oC Trong điều kiện che tối, khả năng hoạt hóa của Bronopol

là 72% nhưng trong điều kiện chiếu sáng chỉ có 5% là hoạt hóa Sự phân hủy của Bronopol trong nước sinh hoạt nhanh hơn trong nước cất

Trong một nghiên cứu về sự phân hủy của Bronopol đối với ánh sáng, dung dịch Bronopol được pha loãng còn 5ppm cho thấy thời gian bán hủy là 24 giờ dưới điều kiện chiếu sáng liên tục ở pH = 4 và 25oC Chỉ có 13% còn sót lại sau 3 ngày và phân hủy hoàn toàn vào ngày thứ 7

Ở nhiệt độ 60oC thời gian bán hủy từ 4 ngày ở pH = 4 và chỉ 3 giờ ở

pH = 8 Dưới điều kiện càng tăng lên sự thoái biến càng mạnh mẽ và sản phẩm thủy phân chính là formaldehyde Sản phẩm chuyển hóa khác tạo ra đó là 2-hydroxymethy - 2 nitro propane-1,3 diol; 2 – bromo - nitroethanol Những sản phẩm thủy phân khác chưa nhận ra được có thể là polyme bromide, nitrite, …

2.3.3.2 Sự thoái biến

Việc nghiên cứu cho thấy sự chuyển hóa Bronopol dưới nước nhanh chóng ở pH = 4 dưới tác động của tia X chiếu liên tục, còn một nửa của nó vẫn hoạt động sau khoảng thời gian 24 giờ Cùng một thời gian tương đương dưới tác động của ánh sáng tự nhiên thì gần đúng 2 ngày Tris - hydroxymethyl-nitromethane được cho là thoái biến chính (đến khoảng 60%) Một thoái biến khác nhưng chưa được tìm thấy, sản phẩm cực hóa tương đối (thành phần B) tăng lên đều đặn và khi kết thúc sau 168 giờ (1tuần) là tăng lên khoảng 30% của lượng Bronopol, thành phần B không được cho là thoái biến Việc tăng liên tục nồng độ CO2 chuyển hóa từ nguyên tử carbon trung tâm của Bronopol chỉ ra rằng 1 phản ứng nhỏ nhất dẫn đến thoái biến trên diện rộng Mặc dù CO2 tăng lên cùng với thành phần B chưa biết, sự hình thành của thành phần Bronopol và

CO2 xuất hiện xảy ra bằng các con đường riêng biệt

2.3.3.3 Nguy hại với môi trường

Những nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng Bronopol có thời gian bán hủy ngắn lúc phóng thích vào trong môi trường, việc kết thúc phụ thuộc vào

phản ứng quang hóa của hợp chất trong nước, số vị trí phản ứng mạnh và cũng được cho là thoái biến bởi vi khuẩn

Bronopol bền vững trong điều kiện bình thường Tuy nhiên dưới điều kiện nhiệt độ ấm áp và pH cao (như tác động trong 1 vài ứng dụng công nghiệp hoặc dưới điều kiện môi trường không điển hình) sự thủy phân nhanh chóng có thể xảy ra Dưới điều kiện nhiệt độ và pH cao, những sản phẩm thủy phân bao gồm formaldehyde và một số ít chất thoái biến khác

Trong ngành công nghiệp ở dưới nước sử dụng sản phẩm chứa Bronopol

có thể dẫn đến sự tiết ra trên bề mặt mặt nước Sự tiết ra này có thể ảnh hưởng bất lợi đến cuộc sống dưới nước Theo mô tả ở trên Bronopol không độc với các loài không xương sống ở nước ngọt, độc ở mức độ không đáng kể với cá nước ngọt, độc mạnh với loài không xương sống ở ở nước lợ và nước mặn, độc nhẹ với loài cá nước lợ và mặn

Khi mô tả rủi ro ảnh hưởng đến sinh vật dưới nước từ Bronopol thì việc đánh giá rủi ro về mặt định lượng vẫn chưa được xác định bởi những nguy hiểm tiềm tàng trong môi trường nước là thường xuyên

Nhiên liệu dùng của Bronopol có thể được kết hợp với giải phóng định

kì vào trong môi trường và phụ thuộc vào sự làm sạch của vật chứa Loại đất dùng có thể đưa đến kết quả là thấp nhất để nó không hiện diện trong môi trường Khả năng hấp thụ ở mức thấp trong đất và chất lắng tụ cho thấy sự hấp phụ thấp (25%) đối với đất cát, cát thịt và đất sét thịt, đất thịt có pH thấp hơn 3 loại đất còn lại cho thấy mức độ cao hơn một ít

2.3.4 Tính độc của Bronopol

2.3.4.1 Đối với loài chim

Việc nghiên cứu được tiến hành bằng cách đưa một lượng thuốc vào miệng một vài loài như vịt trời hoặc chim cút hoặc nghiên cứu LC50 trên một chế độ ăn uống ở một vài loài như vịt trời hoặc một vài loài chim phương bắc Kết quả cho thấy LD50 đối với loài vịt trời là 509,5 mg/kg được xem là độc nhẹ, còn LC50 đối với chim phương bắc và vịt trời là 4487,6ppm là độc nhẹ và 10000 ppm là gần như không độc Như vậy, Bronopol có độc tố từ độc nhẹ đến không độc với loài chim

2.3.4.2 Đối với động vật dưới nước

Với loài cá nước ngọt: Việc nghiên cứu được tiến hành trên loài cá ở

vùng lạnh như cá hồi hoặc một loài ở vùng nước ấm như cá chim xanh Kết quả

LC50 với cá hồi là 41,6ppm và cá chim xanh là 36,1ppm Như vậy, Bronopol độc

nhẹ với cá nước ngọt

Với các loài nước lợ và mặn: Độc tố được nghiên cứu LC50 với tôm ở giai đoạn Mysis là 0,77ppm là độc cao, với loài hàu là 59,6ppm sau 96 giờ thì phân hủy vỏ hàu là độc tố nhẹ

Bảng 2.3: Độc tố của Bronopol với các loài động vật

Tôm giai đoạn

Bronopol có tác dụng chống lại một số loại tảo như Schenedesmus ssp,

Nostoc ssp, Oodinuim ssp, Phormidium foveolarum và Chrorella emersonii với mức độ ức chế tối thiểu ở nồng độ 6 - 50ppm

Một nghiên cứu gần đây về ức chế sự tăng trưởng cuả tảo (OECD 201),

3 loài tảo (Selanastrum capriornutum, Schenedesmus subspicatus và Chlorella

vulgaris) đã cho 72 giờ IC50 trong khoảng 0,4 - 1,9 mg/l với giá trị trung bình là 1,2 mg/l

Trong một nghiên cứu sinh sản Dapnha kéo dài 21 ngày (OECD 202), Bronopol nồng độ 0,27ppm đã không giảm số lượng thế hệ con

2.3.4.3 Sự tích tụ

Cá hồi đại dương với trọng lượng trung bình là 32,4 g được ngâm trong thùng chứa Bronopol hòa tan (14C) với liều 21,91 mg/l nước ở 14oC trong thời gian 30 phút Sau khi kết thúc điều trị cá được chuyển sang nơi khác Nhóm 10

cá được chọn khi kết thúc giai đoạn điều trị sau 0 giờ, 6 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 72

giờ và 168 giờ Hàm lượng phóng xạ trong mẫu cơ, da bằng cách đốt cháy rồi đếm những tia lửa Tổng số trung bình của những chất bã còn sót lại là 259µg đương lượng/kg ở 0 giờ, 266µg đương lượng/kg ở 6 giờ, 255µg đương lượng/kg

ở 12 giờ, 194µg đương lượng/kg ở 24 giờ, 102µg đương lượng/kg ở 3 ngày và 39µg đương lượng/kg ở 7 ngày

Những nghiên cứu đã nhận ra thành phần cấu thành của những chất còn lại trong mẫu mô bằng cách so sánh với những mẫu xác thực trên những chất chuyển hóa của những chất đã biết trên động vật hữu nhũ và sản phẩm thoái biến của Bronopol Hàm lượng phóng xạ được chiết ra từ những mẫu với hiệu suất từ 79 - 93% Việc phân tích đã chỉ ra được chất chuyển hóa chính nhưng chưa xác định được tên

Cơ bản kết quả việc nghiên cứu trên cá hồi đã đưa ra được liều điều trị Bronopol (14C), liều giới hạn trung bình được đưa vào hấp thu là 80µg, 77µg

và 58µg ở 6 giờ, 12 giờ và 24 giờ riêng biệt sau khi kết thúc giai đoạn hiện diện Những giá trị này chỉ có ý nghĩa tượng trưng gần đúng 7%, 6% và 5% của lượng Bronopol hấp thu vào mỗi ngày có thể chấp nhận được

Một đánh giá rủi ro khi đưa tổng những chất cặn bã đưa vào trong cơ cùng với da từ cá được trị bệnh bằng Bronopol trong 14 ngày được kiểm soát Một trường hợp đã được ước tính trên vật đã hấp thụ tổng những chất cặn bã được xác định rằng những phần còn lại đã cạn kiệt vào ngày thứ 14

2.3.4.4 Nguy hiểm tiềm tàng

Nghiên cứu cho rằng có những tiềm tàng trong ứng dụng của những sản phẩm chứa Bronopol cả trong thương mại và công nghiệp Tại hoặc gần nơi ứng dụng Bronopol theo nghiên cứu có sự hiện diện của Bronopol bay lên, kết quả kiểm tra ở người là có sự hiện diện Bronopol trong da và trong đường hô hấp từ những làn khói và hơi nước Những ý kiến dự đoán sỡ dĩ có sự hiện diện trên là

do mở những hủ nhựa chứa chất lỏng như chất bột giấy, chất dính, chất phủ lớp

áo ngoài, những thỏi thuốc màu Ngoài ra, còn có sự hiện diện ở những người bảo trì các thiết bị như những hệ thống nước và các thiết bị công nghiệp khác khi các thiết bị này được rửa với Bronopol Tuy nhiên họ cho rằng sự hiện diện Bronopol trong nghề nghiệp là không vượt quá giới hạn cho phép, thậm chí là sự hiện diện thấp được cho là suốt thời gian ứng dụng

Những nghiên cứu cũng nhận ra rằng sự tiềm tàng của formadehyde trong sản phẩm chứa Bronopol khi formadehyde được nhận ra là chất chuyển hóa của Bronopol dưới điều kiện kiềm Tuy nhiên, nghiên cứu cũng không quan tâm nhiều về sự hiện diện của formadehyde bởi tỷ lệ phân hủy của Bronopol là thấp Khi trộn với nước thì thời gian bán hủy của Bronopol thành formadehyde

là 18 năm ở pH = 4; 1,5 năm ở pH = 6; và 2 tháng ở pH = 8 ở 200C Theo tổ chức an toàn và sức khỏe nghề nghiệp đặt ra là formadehyde cho phép có thể

chấp nhận được là 0,75ppm tại nơi làm việc Tiêu chuẩn cũng qui định rằng những hoạt động cho phép tiến hành nếu việc kiểm tra hàm lượng dưới 0,5ppm

2.3.5 Những nghiên cứu về Bronopol trong thủy sản

Bronopol được báo cáo là có hoạt tính chống lại nhiều loại vi khuẩn nhưng kém hoạt động hơn đối với nấm mốc và nấm men Kiểu hoạt động kháng khuẩn chính xác của Bronopol thì không được biết tường tận Người ta tin rằng Bronopol gây nên sự ức chế enzym dehydrogenase chứa thiol mà enzym này là màng bao, gây nên tình trạng bất hình thành và mất nối kết tế bào Không có dữ liệu nào về ảnh hưởng phụ của Bronopol trên động vật trong phòng thí nghiệm Những nghiên cứu về độ độc của liều sử dụng lặp lại được thực hiện trong những năm đầu 1970 khi những chỉ tiêu về huyết áp và điện tim không được kiểm tra định kỳ Hậu quả là có thể có vài ảnh hưởng của Bronopol bị bỏ sót

Không có dữ liệu về trao đổi chất, dược lý hay sự giảm các dư lượng được cung cấp đối với Bronopol ở những đối tượng nghiên cứu Ở động vật hữu nhũ, Bronopol nhanh chóng chuyển hóa và được tiết ra ngoài, sự tích lũy qua báo cáo là không xảy ra dư lượng Bronopol không được chuyển hóa đã không thể phát hiện trong huyết tương hay nước tiểu ở bất kỳ thời điểm nào Sự biến dưỡng của nó cũng được cho là nhanh chóng và hoàn toàn

Bronopol cũng cho thấy nhanh chóng bị thủy phân trong dung dịch Vì

sự tăng trưởng các loài cá hồi đến kích cỡ thương phẩm kéo dài tối thiểu 12 tháng từ khi nở, điều này có thể kết luận rằng dư lượng Bronopol được sử dụng

để xử lý trứng trong một khoảng thời gian sẽ biến mất

Những nghiên cứu về mức chịu đựng đối với đối tượng nghiên cứu được thiết lập đối với trứng cá hồi Tỷ lệ chết cho thấy sự khác nhau rõ ràng giữa những điểm và những lô trứng khác nhau ở cùng một vị trí Tuy nhiên, tỉ lệ chết tổng cộng vào thời điểm nở trong những nhóm có xử lý Bronopol thì có thể ngang bằng với những nhóm có xử lý với Malachite Green và thấp hơn đáng kể đối với nhóm đối chứng không có xử lý

2.3.6 Ứng dụng Bronopol trong thủy sản

Hiện giờ Bronopol được đề nghị sử dụng trong việc xử lý tắm trứng cá hồi nuôi để kiểm soát việc lây nhiễm nấm với liều 50 mg Bronopol/l nước trong

30 phút trong suốt quá trình ấp trứng đã xử lý tắm trứng 8 lần, mỗi lần 30 phút

Một thử nghiệm được tiến hành đánh giá sự hữu dụng của Bronopol như

thế nào khi ngăn cản sự lây nhiễm Saprolegnia trên cá hồi rainbow Bronopol là

một nhân tố gây ức chế enzym Tám mươi cá bố mẹ được sử dụng thử nghiệm trong thí nghiệm này, thí nghiệm được thực hiện sau khi vuốt trứng cá Nhóm 80

cá được phân thành 4 nhóm, mỗi nhóm 20 cá bố mẹ và được nuôi ở những khu vực nước chảy riêng biệt Hai nhóm được chữa trị bằng Bronopol ở nồng độ 20

mg/l trong 30 phút mỗi ngày, 2 nhóm còn lại chỉ sử thuốc để trấn an trong vòng

15 ngày

Kết quả là cá được xử lý Bronopol thì mức độ lây nhiễm tiếp là zero cho tới cuối thời gian thử nghiệm so với 40% và 70% cho mỗi nhóm bị nhiễm vào lúc bắt đầu thử nghiệm, trong khi đó nhóm cá không được xử lý cho thấy sự gia tăng nhiễm bệnh từ 35% lên 55% và 45% lên 74% cho mỗi nhóm Những bệnh trên cá không được xử lý có thể lây nhiễm từ nước sông được sử dụng trong hệ thống nước chảy trong suốt thời gian thử nghiệm, trong khi đó những cá được

xử lý với Bronopol có khả năng bảo vệ chống lại sự lây nhiễm Những phản ứng phụ không xảy ra khi sử dụng Bronopol

2.4 Sơ Lược Về Vi khuẩn Trên Động Vật Thủy Sản

2.4.1 Đặc tính chung của vi khuẩn

Vi khuẩn (Bacteria, từ tiếng Hy Lạp Baktron có nghĩa là cái gậy) được hiểu theo hai nghĩa Theo nghĩa rộng vi khuẩn bao gồm tất cả các vi sinh được xếp trong nhóm Schizomycetes (Bergey, 1957) Theo nghĩa hẹp thì vi khuẩn không bao gồm nhóm niêm vi khuẩn (Myxobacteriales), xạ khuẩn (Actiromycetales) và xoắn thể (Sporochaetales) Vi khuẩn có một số đặc điểm sau:

¾ Hình thái:

Vi khuẩn có ba hình thái: Cầu khuẩn, trực khuẩn, xoắn khuẩn

Cầu khuẩn nói chung không có tiêm mao, không có khả năng di động Ở

động vật thủy sản thường gặp Streptococus, Staphylococus Kích thước thay đổi

trong khoảng 0,5 – 1 µm

Trực khuẩn có hình que, kích thước khoảng 0,5 – 1,0 x 1 – 4µm, ở động

vật thủy sản thường gặp Pseudomonas, Aeromonas, Vibrio

Xoắn khuẩn gồm tất cả các vi khuẩn có hai vòng xoắn trở lên, kích thước khoảng 0,5 – 3 x 5 – 40 µm, ít gây bệnh ở động vật thủy sản

nhuộm màu Khi già do xuất hiện các không bào và cá thể ẩn nhập và các cơ quan con khác: Mezoxom, Riboxom, không bào có các hạt dự trữ, các hạt sắc tố

Nhân tế bào: Nhân ở dạng nguyên thủy Không phân hoá thành khối rõ rệt như tế bào vi sinh vật khác (nấm men, nấm mốc, lục tảo .)

Tiêm mao và khả năng di động: Một số loài vi khuẩn có khả năng di động nhờ cơ quan đặc biệt gọi là tiêm mao Tiêm mao là sợ nguyên sinh chất rất mảnh có chiều rộng 0,01 - 0,05 m, chiều dài 6 - 9 m có khi đến 80 - 90 m, những loài vi khuẩn không có tiêm mao chúng không có khả năng di động

Bào tử và sự hình thành bào tử: Một số loài vi khuẩn trong giai đoạn phát triển nhất định có khả năng hình thành bào tử, dạng hình tròn hay hình bầu

dục, thường gặp ở hai giống Bacillus và Clostridium Mỗi tế bào chỉ hình thành

một bào tử, có sức sống rất cao, chịu đựng được điều kiện khắc nghiệt (Bergey, 1957)

2.4.2 Một số loài vi khuẩn gây bệnh cho động vật thủy sản

Bệnh vi khuẩn là một trong những bệnh thường gặp và có ảnh hưởng lớn trong nuôi trồng thuỷ sản Có nhiều bệnh do vi khuẩn sống trong môi trường nước gây ra, nhưng cũng có nhiều bệnh do các tác nhân từ môi trường bên ngoài gây ra như: thức ăn, người nuôi, dụng cụ nuôi Sau đây là một số giống loài vi khuẩn gây bệnh phổ biến trong nuôi trồng thủy sản:

Họ Cytophagaceae:

Flexibacter columnaris: Bệnh trụ ở cá (Columnaris Disease)

Flexibacter psychrophirus: Bệnh vi khuẩn ở cá nước lạnh (Bacteria

cold water disease)

Flexibacter maritimus: Bệnh ở cá nước mặn (Salt water colum maris) Myxococus pisciolas: Bệnh thối mang cá

Cytophaga sp: Bệnh vi khuẩn dạng sợi trên tôm

Flexibacter sp: Bệnh vi khuẩn dạng sợi trên tôm

Họ Flavobacteriaceae:

Flavobacterium branchiophila: Bệnh thối mang cá

Flavobacterium sp: Bệnh vi khuẩn dạng sợi trên tôm

Leucothrix mucor: Bệnh vi khuẩn dạng sợi trên tôm

Leucothrisx spp.: Bệnh vi khuẩn dạng sợi trên tôm

Thiothris sp: Bệnh vi khuẩn dạng sợi trên tôm

Họ Enterobacteriaceae:

Edwadsiella tarda: Bệnh nhiễm trùng máu do Edwadsiella

Edwadsiella ictaluri: Bệnh nhiễm trùng máu ở cá trê sông

Yersinia ruckeri: Bệnh đỏ miệng ở cá

Proteus rettgeri: Bệnh xuất huyết ở cá

Serratia liquefaciens: Bệnh xuất huyết ở cá

Serratia plymuthica: Bệnh nhiễm trùng thứ cấp

Citrobacter freundii: Bệnh nhiễm trùng thứ cấp

Họ Vibrionaceae:

Aeromonas samonicida: Bệnh nhọt cá

Aeromonas hydrophyla: Bệnh xuất huyết đốm đỏ ở cá, bệnh đốm nâu

tôm càng xanh

Aeromonas caviae: Bệnh xuất huyết cá biển, bệnh đỏ thân ở ấu trùng

tôm, bệnh mòn vỏ kitin ở tôm, xuất huyết ở cá biển

Aeromonas sobria: Bệnh xuất huyết đốm đỏ ở cá, bệnh đốm nâu tôm

càng xanh

Vibrio alginoliticus: Bệnh đỏ thân ở ấu trùng tôm, bệnh đỏ thân và mòn

vỏ kitin ở tôm Bệnh xuất huyết ở cá biển

Vibrio anguillaram: Bệnh đỏ thân và mòn vỏ kitin ở tôm Bệnh xuất

huyết ở cá

Vibrio harveyi: Bệnh phát sáng, đỏ thân và ăn mòn vỏ kitin ở giáp xác

Vibrio parahaemolyticus: Bệnh phát sáng, đỏ thân, ăn mòn vỏ kitin ở

Pseudomonas fluorescens: Bệnh xuất huyết ở cá

Pseudomonas dermoalba: Bệng trắng đuôi ở cá giống

Pseudomonas putida: Bệnh xuất huyết ở cá

Pseudomonas anguilliseptica: Bệnh xuất huyết ở cá chình

Pseudomonas chlororaphis: Bệnh xuất huyết ở cá chình

Alteromonas spp: Bệnh xuất huyết ở cá chình

Họ Corynebacteraceae:

Renibacterium salmoninarum : Bệnh nhiễm khuẩn thận cá

Carnobacterium piscicola: Vi khuẩn cơ hội gây bệnh

Lactococcus salmoninarum: Vi khuẩn cơ hội gây bệnh

Lactococcus piscium: Vi khuẩn cơ hội gây bệnh

Họ Streptococcaeae:

Strretococcus innac: Bệnh xuất huyết ở cá

Stretococcus spp: Bệnh xuất huyết ở cá

Staphylococcus spp: Bệnh xuất huyết ở cá

Họ Bacilaceae:

Clostridium botulinum: Bệnh dịch hoá ở cá

Eubacterum tarantellus: Bệnh thần kinh

Họ Mycobacteriaceae:

Mycobacterium marium: Bệnh đốm đỏ ở cá, tôm

Mycobacterium fortuitum: Bệnh đốm đỏ ở cá, tôm

Mycobacterium chelonea: Bệnh đốm đỏ ở cá, tôm

Họ Nacardiaceae:

Nocardia astreroides: Bệnh đốm đỏ ở cá, tôm

Nocardia kampachi: Bệnh đốm đỏ ở cá, tôm

(Bùi Quang tề, 1997)

2.5 Sơ Lược Trùng Quả Dưa (Ichtyopthyrius multifiliis)

2.5.1 Đặc điểm hình dạng, sinh trưởng và phát triển

Trùng có dạng giống quả dưa, đường kính 0,5-1 mm, toàn thân có nhiều lông tơ nhỏ, nhiều đường sọc, vằn sọc Giữa thân có một hạch lớn hình móng ngựa và một hạch nhỏ Trùng mềm mại, có thể biến đổi hình dạng chút ít khi vận động, ở trong nước ấu trùng bơi lội nhanh hơn ấu trùng trưởng thành

Hình 2.1: Trùng quả dưa (Bùi Quang Tề, 2001)

Chu kì sống của trùng gồm 2 giai đoạn: giai đoạn dinh dưỡng và giai đoạn bào nang

Giai đoạn dinh dưỡng: Khi ấu trùng kí sinh ở da, mang, ở giữa các tổ chức thượng bì hút chất dinh dưỡng của kí chủ để sinh trưởng, đồng thời kích thích các tổ chức của kí chủ hình thành một đốm mủ trắng Trùng trưởng thành tiến hành hoạt động sinh sản, chui ra khỏi đốm mũ trắng, rời kí chủ và chuyển sang giai đoạn bào nang

Giai đoạn bào nang: Trùng rời kí chủ bơi lội tự do trong nước một thời gian rồi dừng lại ở ven bờ ao hoặc tựa vào cây cỏ thủy sinh, tiết ra chất keo bao lấy cơ thể hình thành bào nang Trùng bắt đầu sinh sản phân đôi thành rất nhiều

ấu trùng có đường kính 18 -22 µm Ấu trùng tiết ra loại men Hyaluronidaza phá

vỡ bào nang chui ra ngoài, bơi trong nước tìm kí chủ mới

Hình 2.2: Vòng đời của trùng quả dưa

5 Ấu trùng ra khỏi bào nang vận động trong nước tìm kí chủ

6 Cá bị nhiễm trùng quả dưa

2.5.2 Dấu hiệu bệnh lý

Cá bệnh thường xuất hiện các đốm nhỏ trên da, mang, vây do có nhiều trùng bám Cá bệnh thường tiết nhiều dịch nhầy, làm cơ thể có màu sắc nhợt nhạt, nổi lờ đờ trên mặt nước, bơi lờ đờ yếu ớt Lúc đầu cá tập trung gần bờ nơi

có cỏ rác, quẫy nhiều do ngứa ngáy Trùng bám ở mang, phá hoại biểu mô làm

cá ngạt thở Khi cá yếu quá, chỉ còn ngoi đầu lên để thở, đuôi bất động cắm xuống nước

Bệnh gây ảnh hưởng đến chức năng sinh lý, sinh hóa của cá Prôtêin trong huyết thanh giảm tới 2,5 lần, hoạt động của gan, thận bị rối loạn, lượng tích lũy protêin bị giảm, ảnh hưởng quá trình trao đổi amino axit

2.5.3 Phân bố và lan truyền bệnh

Bệnh phân bố khắp nơi trên thế giới Các loài cá nước ngọt thường mắc bệnh này Ở Việt Nam đã phát hiện thấy trùng quả dưa ở cá trắm cỏ, chép, mè trắng, mè hoa, trôi, rô phi, cá thát lát, cá tra nuôi, trê vàng, trê phi Tỉ lệ cảm nhiễm 70 - 100%, cường độ cảm nhiễm từ 5-10 trùng/ lame là cá đã bệnh nguy hiểm

III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời Gian và Địa Điểm Thực Hiện

Đề tài được thực hiện từ ngày 01/03/2007 đến ngày 01/08/2007 tại trại thực nghiệm Khoa Thủy Sản và Phòng thí nghiệm Bệnh Học Thủy Sản, Khoa Thủy Sản,Trường Đại Học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

- PCA (Plate Count Agar): được dùng để phân lập vi khuẩn có trong mẫu

- NB (Nutrient Broth): được dùng để nuôi tăng sinh vi khuẩn

3.2.3 Cá thí nghiệm

Cá dùng cho thí nghiệm là cá tra (Pangasius hypophthalmus) có trọng lượng

trung bình 6 – 7 g được lấy tại Ấp Bình Mỹ B, Xã Bình Thạnh – Huyện Cao Lãnh – Tỉnh Đồng Tháp Trong suốt quá trình thí nghiệm cá được cho ăn 2% trọng lượng thân mỗi ngày với thức ăn viên có độ đạm 30%

3.2.4 Hệ thống định danh

Vi khuẩn được định danh bằng 14 thử nghiệm định danh trực khuẩn Gram (-) (IDS 14GNR)

3.3 Phương Pháp Nghiên Cứu

Thí nghiệm được chia làm 4 phần:

3.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát LC 50-24h của Bronopol đối với cá tra

™ Bố trí thí nghiệm

Cá tra có trọng lượng từ 6 - 7 g được bố trí trong bể composite có kích thước

60 x 30 x 50cm với mật độ 30 cá/bể Thí nghiệm gồm 3 nghiệm thức như sau:

+ Nghiệm thức 1: đối chứng (không sử dụng thuốc)

+ Nghiệm thức 2: liều Bronopol 10ppm

+ Nghiệm thức 3: liều Bronopol 20ppm

Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần và bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên Nước được sử dụng là nước máy đã được trữ 2 - 3 ngày để bay hết mùi Chlorine

Hình 3.1: Cá Tra thí nghiệm

™ Phương pháp thu thập và phân tích số liệu

Các chỉ tiêu về nồng độ oxy hòa tan (DO), nồng độ ammonia, pH , nhiệt độ nước được kiểm tra bằng bộ test Sera và nhiệt kế

Tỷ lệ chết của cá ở các lô thí nghiệm 2 giờ, 4 giờ, 8 giờ, 12 giờ, 24 giờ sau khi sử dụng thuốc được thu thập, phân tích bằng công cụ phân tích thống kê trong Excel và đưa ra đồ thị tương quan tuyến tính Từ đó tính được LC50 của Bronopol đối với cá tra

3.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát tỉ lệ cá chết ở các nồng độ khác nhau của Bronopol bằng phương pháp tắm

™ Bố trí thí nghiệm

Tương tự như thí nghiệm 1, cá tra cũng được bố trí trong bể với mật độ 30

+ Nghiệm thức 1: đối chứng (không sử dụng thuốc và không thay nước) + Nghiệm thức 2: liều Bronopol 10ppm tắm 30 phút

+ Nghiệm thức 3: liều Bronopol 20ppm tắm 30 phút

Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần và bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên Nước được sử dụng là nước máy đã được trữ 2 - 3 ngày để bay hết mùi Chlorine

™ Phương pháp thu thập và phân tích số liệu

Các chỉ tiêu về nồng độ oxy hòa tan (DO), nồng độ ammonia, pH, nhiệt độ nước được kiểm tra bằng bộ test Sera và nhiệt kế

Tỷ lệ chết của cá được ghi nhận trong 5 ngày thí nghiệm ở các nồng độ thuốc khác nhau và phân tích bằng phần mềm thống kê SPSS 11.0 theo trắc nghiệm DUNCAN với độ tin cậy 95% để tìm sự sai khác có ý nghĩa thống kê giữa các nghiệm thức

Hình 3.2: Bể nhựa bố trí thí nghiệm LC50-24h và thí nghiệm phương pháp tắm

3.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng diệt trùng quả dưa của Bronopol

™ Bố trí thí nghiệm

Cá tra có trọng lượng 6 - 7 g được bố trí ngẫu nhiên vào dàn bể xi măng có kích thước 1 x 2 x 1m với mật độ 150 cá/bể Thí nghiệm gồm 5 nghiệm thức như sau:

+ Nghiệm thức ĐC: đối chứng (không sử dụng thuốc và không thay nước)

+ Nghiệm thức B-10/30’: liều Bronopol 10ppm tắm 30 phút

+ Nghiệm thức B-20/30’: liều Bronopol 20ppm tắm 30 phút

+ Nghiệm thức B-10/2h: liều Bronopol 10ppm tắm 2 giờ

+ Nghiệm thức B-20/2h: liều Bronopol 20ppm tắm 2 giờ

Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần

Cá trong mỗi bể đều được gây cảm nhiễm với trùng quả dưa bằng cách cho vào mỗi bể 10 cá đã mắc bệnh trùng quả dưa

™ Phương pháp thu thập số liệu

Các chỉ tiêu về nồng độ oxy hòa tan (DO), nồng độ ammonia, pH, nhiệt độ nước được kiểm tra bằng bộ test Sera và nhiệt kế

Trước thí nghiệm và sau 5 ngày sử dụng Bronopol bắt ngẫu nhiên 20 cá trong từng bể kiểm tra và đếm số lượng trùng quả dưa trên mang và da Tính tỷ lệ cảm nhiễm và cường độ cảm nhiễm trên cá

Tỷ lệ cảm nhiễm và cường độ cảm nhiễm được tính như sau:

Số cá nhiễm trùng quả dưa

Tỷ lệ cảm nhiễm = x 100

Số cá kiểm tra

Cường độ cảm nhiễm: số lượng trùng quả dưa/1 cung mang (hoặc trên lame)

Các số liệu về tỷ lệ cảm nhiễm, cường độ cảm nhiễm trùng quả dưa, tỷ lệ sống của cá được thu thập và phân tích bằng phần mềm thống kê SPSS 11.0 theo trắc nghiệm DUNCAN với độ tin cậy 95% để tìm sự sai khác có ý nghĩa thống kê giữa các nghiệm thức

3.3.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát khả năng diệt khuẩn của Bronopol

™ Bố trí thí nghiệm

Cá tra có trọng lượng 6 - 7 g được bố trí trong bể xi măng có kích thước 1 x

2 x 1m với mật độ 150 cá/bể Thí nghiệm gồm 5 nghiệm thức như sau:

+ Nghiệm thức ĐC: đối chứng (không sử dụng thuốc và không thay nước)

+ Nghiệm thức B-10/30’: liều Bronopol 10ppm tắm 30 phút

+ Nghiệm thức B-20/30’: liều Bronopol 20ppm tắm 30 phút

+ Nghiệm thức B-10/2h: liều Bronopol 10ppm tắm 2 giờ

+ Nghiệm thức B-20/2h: liều Bronopol 20ppm tắm 2 giờ

Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần và bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên

Hình 3.3: Bể xi măng bố trí thí nghiệm đánh giá khả năng diệt trùng quả dưa và vi

khuẩn của Bronopol

™ Phương pháp thu thập và phân tích số liệu

Các chỉ tiêu về nồng độ oxy hòa tan (DO), nồng độ ammonia, pH, nhiệt độ nước được kiểm tra bằng bộ test Sera và nhiệt kế

Mẫu nước trước và sau 5 ngày sử dụng Bronopol được thu để phân tích tổng

số vi khuẩn hiếu khí và tiến hành định danh

Mẫu cá trước và sau 5 ngày sử dụng Bronopol được thu để phân tích tổng số

vi khuẩn hiếu khí và tiến hành định danh một số loài vi khuẩn hiện diện trên cá

Các số liệu về tỷ lệ sống, tổng số vi khuẩn hiếu khí trong nước và trên cá được thu thập và phân tích bằng phần mềm thống kê SPSS 11.0 theo trắc nghiệm DUNCAN với độ tin cậy 95% để tìm sự sai khác có ý nghĩa thống kê giữa các nghiệm thức Số liệu về tổng số vi khuẩn hiếu khí được chuyển về dạng log cfu/mL trước khi phân tích thống kê

3.3.5 Phương pháp phân lập và định danh vi khuẩn

3.3.5.1 Phân lập vi khuẩn

Mẫu nước trong các bể thí nghiệm được thu và pha loãng với nước muối sinh

lý theo tỷ lệ nước trong bể:nước muối sinh lý là 1:9 Kế đến lấy 0,3mL từ hỗn hợp 1 + với 2,7 ml nước muối sinh lý pha loãng đến nồng độ 10-3 Cứ mỗi nồng độ pha loãng được cấy vào 2 đĩa petri có chứa môi trường PCA và đem ủ ở nhiệt độ 30oC

từ 18 – 24 giờ Sau đó tiến hành phân lập dựa trên hình dạng, kích thước và màu sắc của khuẩn lạc

Hệ vi khuẩn cộng sinh trên cá thường được tìm thấy ở lớp nhớt, mang và ruột Chúng tôi tiến hành mổ 5 cá/bể lấy 2g da, mang, nội tạng cho vào 18mL nước muối sinh lý đã tiệt trùng và đồng nhất mẫu Sau đó pha loãng hỗn hợp ban đầu pha loãng đến nồng độ 10-4 Cứ mỗi nồng độ pha loãng được cấy vào 2 đĩa petri có chứa môi trường PCA và đem ủ ở nhiệt độ 30oC từ 18 – 24 giờ Sau đó tiến hành phân lập dựa trên hình dạng, kích thước và màu sắc của khuẩn lạc

Nguyên tắc của phương pháp này là cấy một thể tích xác định huyền phù cần nghiên cứu lên môi trường đặc trong đĩa petri và sau đó đếm số khuẩn lạc mọc lên sau khi ủ

Cách tính số lượng vi khuẩn:

X (cfu/mL) = (C x D / V) x 10

cfu (Colony Forming Unit): đơn vị khuẩn lạc

C: Tổng số lượng khuẩn lạc trung bình trên 2 đĩa petri ở nồng độ pha loãng đếm được

dạng, kích cỡ, màu sắc

3.3.6 Các phương pháp tiến hành để định danh

3.3.6.1 Nhuộm Gram

a Nguyên tắc:

Do sự khác nhau về cấu trúc vách tế bào Ở vi khuẩn Gram (+) có một vách

tế bào peptidoglucan dày, vách này sẽ giữ lại thuốc nhuộm Crystal violet trong quá trình rửa mẫu bằng cồn 95% và sẽ bắt màu tím Còn ở vi khuẩn Gram (-) chỉ có vách peptidoglucan ở một phía của tế bào nên dưới tác động của cồn 95%, thuốc nhuộm Crystal violet bị tẩy sạch tạo điều kiện cho vi khuẩn bắt màu hồng với loại thuốc nhuộm thứ hai là Fuchsin

Nhúng khay chứa lame vào hộp thuốc nhuộm Crystal violet, để yên 1 phút rồi rửa lại bằng nước cho thật sạch đến khi không còn thấy màu nữa

Nhúng khay tiếp vào hộp thuốc có Lugol , để yên 1 phút sau đó rửa nhanh bằng nước

Tiếp tục nhúng khay vào cồn 95% cho đến khi thấy sạch màu, rửa nhanh bằng nước

Cho tiếp khay vào hộp thuốc nhuộm Fuchsin đợi 30 giây, rửa nhanh bằng nước cho đến khi thật sạch

Trải đều các lame lên giấy thấm để thấm khô Sau đó nhỏ một giọt dầu kính lên phết nhuộm và xem ở vật kính x100

c Đọc kết quả:

Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím, Gram (-) bắt màu hồng

Khi quan sát kính hiển vi cần xem hình dáng, cách sắp xếp các vi khuẩn

d Một số nguyên nhân gây sai lệch kết quả nhuộm Gram:

Vi khuẩn quá già : các sản phẩm của quá trình trao đổi chất làm sai lệch kết quả

Vết bôi quá dày không thể tẩy màu hết