Nghiên cứu tổng hợp và hoạt tính sinh học các dẫn xuất mới của alkaloid dừa cạn

Trong những năm 1950, sự phát hiện ra vinblastine Velban® và vincristine Oncovin®, hai alkaloid tự nhiên từ cây dừa cạn Madagascar Catharanthus roseus là một trong những ví dụ nổi bật n

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 PGS.TS Ngô Quốc Anh

2 TS Đoàn Duy Tiên

Hà Nội – 2018

L ời cam đoan

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi và các cộng

sự Các số liệu và kết quả nêu trong Luận án là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu trước đây Toàn bộ các thông tin trích dẫn trong Luận án đã được chỉ rõ nguồn gốc xuất xứ

Hà Nội, Ngày tháng năm 2018

Tác giả

Võ Ngọc Bình

L ời cảm ơn

Với lòng biết ơn sâu sắc, đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn tới tập thể thầy cô hướng

dẫn khoa học là PGS.TS Ngô Quốc Anh và TS Đoàn Duy Tiên - Viện Hóa học, Viện Hàn

lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giao đề tài và trực tiếp định hướng, chỉ bảo và

giúp đỡ tôi trong toàn bộ quá trình thực hiện Luận án

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các Thầy, các Cô, các cán bộ Viện Hóa học, Viện

Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giảng dạy, hướng dẫn tôi hoàn thành các

học phần và các chuyên đề trong Chương trình đào tạo

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ThS Nguyên Lê Anh, ThS Nguyễn Thị

Hằng, ThS Trần Thị Yến, CN Phạm Tùng Lâm và các cán bộ, nhân viên Trung tâm nghiên

cứu xuất sắc liên ngành về lĩnh vực các hợp chất thiên nhiên Việt Nam – Vương Quốc Anh,

Viện Hóa học đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện Luận án

Cuối cùng, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã động

viên, giúp đỡ tôi về mọi mặt trong suốt quá trình thực hiện Luận án

Tác giả

Võ Ngọc Bình

“All sciences are vain and full of errors that are not born of

MỤC LỤC

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt vii

Danh mục các bảng x

Danh mục các hình vẽ, sơ đồ xi

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Microtubule - Một đích tác dụng quan trọng của các thuốc điều trị ung thư 3 1.1.1 Định nghĩa 3

1.1.2 Động học của microtubule 4

1.1.3 Các nhóm thuốc chống ung thư theo cơ chế tác dụng lên microtubule 6 1.2 Vinca alkaloid 9

1.2.1 Giới thiệu về vinca alkaloid 9

1.2.2 Tổng hợp các vinca alkaloid 10

1.2.2.1 Bán tổng hợp 11

1.2.2.2 Tổng hợp toàn phần 16

1.2.2.3 Sinh tổng hợp và công nghệ sinh học 18

1.2.3 Mối quan hệ cấu trúc – hoạt tính của vinca alkaloid 18

1.2.3.1 Những thay đổi trên phần khung vindoline 19

1.2.3.2 Những thay đổi trên phần khung velbanamine 21

1.2.4 Ứng dụng lâm sàng của vinca alkaloid 27

1.3 Định hướng và mục tiêu của luận án 27

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM 30

2.1 Hóa chất và thiết bị 30

2.1.1 Hóa chất và dung môi 30

2.1.2 Thiết bị nghiên cứu 30

2.1.2.1 Phổ hồng ngoại IR 30

2.1.2.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR 30

2.1.2.3 Phổ khối lượng MS và HRMS 30

2.1.2.3 Năng suất quay cực riêng [α]D 31

2.2 Các phương pháp nghiên cứu 31

2.2.1 Các phương pháp tổng hợp hữu cơ 31

2.2.2 Phương pháp thử hoạt tính sinh học 31

2.2.3 Các phương pháp tinh chế và xác định cấu trúc 31

2.3. Tổng hợp một số dẫn xuất vinca alkaloid mới chứa mạch nhánh ketone α,β-không no 32

2.3.1. Tổng hợp anhydrovinblastine 12 32

2.3.2. Tổng hợp 18(S)-3’,5'-dimethoxyanilinecleavamine 77 33

2.3.3 Tổng hợp một số dẫn xuất vinca alkaloid mới chứa mạch nhánh ketone α,β-không no 34

2.4 Tổng hợp một số dẫn xuất vinca alkaloid mới từ 3’-cyanoanhydrovinblastine 88…… 46

2.4.1 Tổng hợp 3’-cyanoanhydrovinblastine 88 46

2.4.2 Tổng hợp các dẫn xuất alkaloid mới thông qua việc khử có chọn lọc dẫn xuất 3’-cyanoanhydrovinblastine 88 48

2.4.2.2 Tổng hợp chất 3'R-cyano-(4’S,5’-dihydro)-anhydrovinblastine 92a 48

2.4.2.2 Tổng hợp chất 3'R-cyano-(4’R,5’-dihydro)-anhydrovinblastine 92b 49

2.4.2.3 Tổng hợp chất (3'R-aminomethyl)-(4’S,5’-dihydro)-anhydrovinblastine 92c 51

2.4.2.4 Tổng hợp chất cyano-4-deacetyl-anhydrovinblastine 92d và 3'S-cyano-4-deacetyl-3-hydroxymethyl-anhydrovinblastine 92e 52

2.4.3 Tổng hợp một số dẫn xuất alkaloid mới thông qua việc khử alkyl hóa của aminomethyl 92c 54

2.5 Thử nghiệm hoạt tính sinh học của các chất nghiên cứu 61

2.5.1. Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào in vitro 61

2.5.1.2 Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào in vitro trên dòng tế bào ung thư biểu mô KB và ung thư gan HepG2 61

2.5.1.2 Thử nghiệm hoạt tính sinh học trên dòng tế bào ung thư bạch huyết cấp tính ở người HL-60 62

2.5.2 Phương pháp mô hình mô phỏng Docking phân tử 65

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 68

3.1. Tổng hợp dẫn xuất vinca alkaloid mới chứa mạch nhánh ketone α,β-không no 68

3.2 Tổng hợp các dẫn xuất vinca alkaloid mới từ 3’-cyanoanhydrovinblastine

88… 84

3.2.1 Tổng hợp các dẫn xuất vinca alkaloid mới thông qua việc khử chọn lọc 3’-cyanoanhydrovinblastine 88 84

3.2.2 Tổng hợp các dẫn xuất vinca alkaloid mới thông qua việc khử alkyl hóa aminomethyl 92c 99

3.3 Đánh giá hoạt tính sinh học của các chất nghiên cứu 102

3.3.1. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào in vitro 102

3.3.1.1 Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư biểu mô KB và ung thư gan HepG2… 102

3.3.1.2 Đánh giá hoạt tính sinh học trên dòng tế bào ung thư bạch huyết cấp tính ở người HL-60 106

3.3.2 Kết quả Docking 115

3.3.2.1 Kết quả docking phân tử sử dụng phần mềm Autodock 4.0 116

3.3.2.2 Kết quả docking phân tử sử dụng phần mềm Patchdock 117

KẾT LUẬN 120

NHỮNG ĐIỂM MỚI CỦA LUẬN ÁN 121

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ 122

TÀI LIỆU THAM KHẢO 123

PHỤ LỤC 139

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

COSY Correlation Spectroscopy

CBPI Cytochalasin B proliferation index

13C-NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy

D

DEPT Distortioless Enhancement by Polarisation Tranfer

DMSO Dimethyl sulfoxide

ESI-MS Electrospray Ionization Mass Spectroscopy

EI-MS Electron Ionization Mass Spectroscopy

EtOAc Ethyl acetate

EtOH Ethanol

F

FDA Fluorescein diacetate

H

HRMS Hight resolution Mass Spectroscopy

1H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation

HMBC Heteronuclear Multiple bond Correlation

s: singlet d: double t: triplet q: quartet qui: quintet m: multiplet dd: double doublet br: broad

Hep-G2 Human Heptocellular carcinoma

NMR Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

NOESY Nuclear Overhauser Enhancement Spectroscopy

NIS N-Iodosuccinimide

P

PAS Precondylocarpine acetate synthase

PDB Protein data bank

PBS Phosphate buffered saline

R

T

TMS Tetramethyl silan

THF Tetrahydrofuran

TFA Trifluoroacetic acid

TLC Thin Layer Chromatography

Bảng 3.8 Các thành phần năng lượng (kcal/mol) tương tác giữa các phân tử trong dãy

đầu tiên với tubulin 116

Bảng 3.9 Các thành phần năng lượng (kcal/mol) tương tác giữa các phân tử trong dãy thứ

2 với tubulin 116

Bảng 3.10 Hằng số ức chế (Ki, nM) và độ lệch chuẩn trung bình (RMSD, Å) dung sai

tương tác giữa các phân tử trong dãy đầu tiên với tubulin 117

Bảng 3.11 Hằng số ức chế (Ki, nM) và độ lệch chuẩn trung bình (RMSD, Å) dung sai

tương tác giữa các phân tử trong dãy đầu thứ 2 với tubulin 117

Bảng 3.12 Kết quả docking của các phối tử dãy đầu tiên với tubulin tại vùng vinca bằng

cách sử dụng phần mềm Patchdock 118

Bảng 3.13 Kết quả docking của các phối tử dãy thứ 2 với tubulin tại vùng vinca bằng

cách sử dụng phần mềm Patchdock 119

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ

Hình 1.1 Cấu trúc và các quá trình polymer hóa, khử polimer hóa microtubule 3

Hình 1.2 Microtubule trong hai tế bào xương osteosarcoma trong kỳ trung gian của chu kỳ tế bào Microtubule có màu đỏ, chromatin có màu xanh lam và các centromeres có màu xanh lá cây 4

Hình 1.3 Động học của microtubule 6

Hình 1.4 Các nhóm thuốc chống ung thư theo cơ chế tác dụng lên microtubule và vị trí liên kết của chúng trên microtubule 7

Hình 1.5 Vị trí gắn kết của vinblastine (màu xanh) và colchicine (màu vàng) trên tubulin 7

Hình 1.6 Cây dừa cạn Catharanthus roseus 9

Hình 1.7 Một số alkaloid dừa cạn được sử dụng trong lâm sàng 10

Hình 1.8 Sự oxi hóa vinblastine 1 thành vincristine 2 11

Hình 1.9 Tổng hợp vindesine 3 11

Hình 1.10 Sinh tổng hợp vinblastine 1 từ Catharanthine 6 và vindoline 7 12

Hình 1.11 Tổng hợp anhydrovinblastine theo Potier và các cộng sự 12

Hình 1.12 Tổng hợp anhydrovinblastine theo Vukovic 13

Hình 1.13 Tổng hợp vinblastine từ anhydrovinblastine theo Potier 13

Hình 1.14 Tổng hợp vinblastine theo Kutney 14

Hình 1.15 Tổng hợp in situ vinblastine từ catharanthine và vindoline theo Dale Boger 14

Hình 1.16 Sự chuyển hóa chloroindolenine 21 thành vinblastine 1 15

Hình 1.17 Sự chuyển hóa amin bậc 3 24 thành vinblastine 1 15

Hình 1.18 Chuyển hóa của anhydrovinblastine N-oxide 26 hoặc chloro-indolenine 30 thành vinorelbine 4 16

Hình 1.19 Tổng hợp vinflunine 5 16

Hình 1.20 Sự chuyển hóa của chloroindolenine 31 và 34 thành vinblastine 1 17

Hình 1.21 Tổng hợp toàn phần vinblastine theo Boger và các cộng sự, 2009 18

Hình 1.22 Các dẫn xuất được biến đổi trên phần vindoline: vinglycinate 42, vinzolidine 43, vintriptol 44, vinepidine 45, vinfosiltine 46 và 47 21

Hình 1.23 Sự thay đổi cấu trúc vinblastine tại vị trí 12’ 22

Hình 1.24 Các dẫn xuất thế của vinblastine ở trị trí C-14’ 22

Hình 1.25 Sự thay đổi trên phần velbanamine 23

Hình 1.26 Sự thay đổi cấu trúc vòng C’ trên phần khung velbanamine 23

Hình 1.27 Các dẫn xuất 7’(8’)-homo-anhydrovinblastine mới từ vinorelbine 24

Hình 1.28 Các dẫn xuất muối ammoni bậc IV của anhydrovinblastine và vinorelbine 24

Hình 1.29 Sự thay đổi cấu trúc trên vòng D’ 25

Hình 1.30 Các dẫn xuất 4’-ureavinblastine 26

Hình 1.31 Tổng hợp dẫn xuất kiểu vinblastine 66 theo Boger, 2016 26

Hình 1.32 Cấu trúc tia X của phức vinblastine kết hợp tubulin 28

Hình 3.1 Tổng hợp các hợp chất lai anhydrovinblastine và vinorelbine – phomopsin A 68

Hình 3.2 Một số hợp chất ketone α,β-không no trong tự nhiên 69

Hình 3.3 Hợp chất lai giữa ketone α,β-không no và vinca alkaloid 70

Hình 3.5 Cấu trúc và đánh số theo IUPAC trên phần vindoline 74

Hình 3.6 Cấu trúc và đánh số theo IUPAC trên phần velbanamine 76

Hình 3.7 Một phần phổ COSY (CDCl3) của hợp chất 81b 78

Hình 3.8 Phổ 1H NMR (CDCl3) của hợp chất 81b 79

Hình 3.9 Phổ khối phân giải cao HR-EI-MS của hợp chất 81b 80

Hình 3.10 Cấu trúc hợp chất 82b và cách đánh số theo IUPAC 81

Hình 3.11 Phổ khối phân giải cao HR-EI-MS của hợp chất 82b 81

Hình 3.13 Phổ DEPT (CDCl3) của hợp chất 82b 83

Hình 3.14 Hợp chất 85, 86 và 87 84

Hình 3.15 Phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS của hợp chất 88 86

Hình 3.16 Phổ IR của hợp chất 3’-cyanoanhydrovinblastine 88 86

Hình 3.18 Phổ NOESY (CDCl3) của 3’-cyanoanhydrovinblastine 88 88

Hình 3.19 Sự khử hợp chất 88 sử dụng xúc tác hydrogenation Pd/C 90

Hình 3.20 Phổ IR của hợp chất 3'R-cyano-(4’S,5’-dihydro)-anhydrovinblastine 92a 91

Hình 3.21 So sánh tương quan phổ 1H NMR của 92a và 88 92

Hình 3.22 Phổ NOESY của 3'R-cyano-(4’S,5’-dihydro)-anhydrovinblastine 92a 92

Hình 3.23 Sự khử hợp chất 88 sử dụng LiAlH4 93

Hình 3.24 So sánh một phần phổ 1H NMR (CDCl3) của hợp chất 88, 92d và 92e 93

Hình 3.25 Sự khử hợp chất 88 bằng NaBH3CN với xúc tác Ni2B 94

Hình 3.26 Phổ IR của 3'R-cyano-(4’R,5’-dihydro)-anhydrovinblastine 92b 94

Hình 3.27 So sánh tương quan phổ 1H NMR (CDCl3) của 3'R-cyano-(4’R,5’-dihydro)-anhydrovinblastine 92b và 88 95

Hình 3.28 Phổ NOESY của 3'R-cyano-(4’R,5’-dihydro)-anhydrovinblastine 92b 95

Hình 3.29 Sự khử hợp chất 88 sử dụng NaBH4, xúc tác CoCl2 96

Hình 3.30 Phổ IR của hợp chất 92c 96

Hình 3.31 Phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS của hợp chất 92c 97

Hình 3.32 So sánh một phần phổ 1H NMR của hợp chất (3'S-aminomethyl)-(4’S,5’-dihydro)-anhydrovinblastine 92c và 88 97

Hình 3.33 Cấu trúc và đánh số theo IUPAC của các hợp chất 93a-f 100

Hình 3.34 Phổ 1H NMR của hợp chất 93a 101

Hình 3.35 Phổ khối phân giải cao của hợp chất 93a 101

Hình 3.37 Sự tăng sinh sau khi xử lý với vinca alkaloid (A) và vinca alkaloid mới (B) với nồng độ khác nhau (NC = 0,1% DMSO, 1, 10, 100, 1000 nM) trong 24 giờ 108

Hình 3.38 Tế bào apoptosis sau khi xử lý với vinca alkaloid (A) và alkaloids mới (B) với nồng độ khác nhau (NC = 0,1% DMSO, 1, 10, 100, 1000 nM) trong 24 giờ 110

Hình 3.39 Sự chết tế bào sớm sau khi xử lý với vinca alkaloid (A) và alkaloid mới (B) với nồng độ khác nhau (NC = 0,1% DMSO, 1, 10, 100, 1000 nM) trong 24 giờ 111

Hình 3.40 Kiểm soát chu kỳ tế bào sau khi xử lý với vinca alkaloid được tạo thành (A) và alkaloid mới (B) với nồng độ khác nhau (NC = 0,1% DMSO, 1, 10, 100, 1000 nM) trong 24 giờ 113

Hình 3.41 Tubulin – 83a 118

Hình 3.42 Tubulin-92b 119

Sơ đồ 3.1 Quy trình chung tổng hợp các hợp chất 76a-c 71

Sơ đồ 3.2 Tổng hợp các vinca alkaloid chìa khóa 12 và 77 71

Sơ đồ 3.3 Cơ chế của phản ứng Vukovic 72

Sơ đồ 3.4 Tổng hợp các vinca alkaloid mới chứa mạch nhánh ketone α,β-không no 73

Sơ đồ 3.5 Tổng hợp 3’-cyanoanhydrovinblastine 88 85

Sơ đồ 3.7 Một con đường thử nghiệm tổng hợp 3’-cyanoanhydrovinblastine 88 89

Sơ đồ 3.10 Cơ chế phản ứng khử nitril thành amin 92c 98

Sơ đồ 3.11 Cơ chế phản ứng khử liên kết đôi tại C4’-C5’ 98

Sơ đồ 3.12 Tổng hợp các dẫn xuất vinca alkaloid mới thông qua việc khử alkyl hóa aminomethyl 92c 99

Sơ đồ 3.13 Cơ chế của phản ứng alkyl hóa aminomethyl 92c 99

MỞ ĐẦU

Ung thư là một nhóm các bệnh được đặc trưng bởi sự phát triển không kiểm soát và

sự lan truyền của các tế bào bất thường Tỷ lệ ung thư trên toàn thế giới ước tính khoảng 14 triệu trường hợp mới mỗi năm [1] Trong năm 2017, khoảng 600.920 người Mỹ chết vì ung thư, gần 1.650 người chết mỗi ngày Ung thư là nguyên nhân phổ biến thứ hai gây tử vong ở

Mỹ chỉ sau bệnh tim, chiếm gần 1/4 số ca tử vong [2] Tại Việt Nam, số trường hợp mắc mới ung thư tăng nhanh từ 68.000 ca năm 2000 lên 126.000 năm 2010 và dự kiến sẽ vượt qua 190.000 ca vào 2020 Mỗi năm có khoảng 115.000 người chết vì ung thư, tương ứng 315 người/ngày Các nguồn lực to lớn đang được đầu tư trên khắp thế giới để phát triển các chiến lược phòng ngừa, chẩn đoán và điều trị ung thư [3] Các công ty dược phẩm và các tổ chức chính phủ, phi chính phủ đều tham gia tích cực vào việc phát hiện và phát triển các chất chống ung thư [4]

Trong số các phương pháp điều trị hiện nay, hóa trị liệu là một phương pháp điều trị ung thư sử dụng một hoặc nhiều thuốc kháng ung thư - gây độc tế bào Một trong các loại thuốc chống ung thư, được sử dụng ngày nay trong hóa trị liệu, tác động đến chu kỳ

tế bào để ức chế sự phát triển của tế bào ung thư và sau đó gây ra sự chết tế bào theo chương trình (apoptosis) Do đó, hai cách tiếp cận thường được sử dụng: nhắm mục tiêu DNA (ngăn ngừa sự tổng hợp hoặc làm hỏng DNA) hoặc hạn chế các chức năng của thoi phân bào [5] Trong đó, thuốc tác dụng lên microtubule là một trong những loại thuốc trị liệu được sử dụng rộng rãi nhất trong điều trị ung thư Hiệu quả của chúng đã được chứng minh để điều trị nhiều loại ung thư ở người, bao gồm ung thư vú, phổi, buồng trứng và tuyến tiền liệt, cũng như các khối u ác tính về huyết học và ung thư ở trẻ

em [6-7]

Phần lớn các thuốc ức chế phân bào là các hợp chất tự nhiên ngăn chặn sự phân bào bằng cách tương tác với microtubule, một protein thiết yếu của tế bào Trong những năm 1950, sự phát hiện ra vinblastine (Velban®) và vincristine (Oncovin®), hai alkaloid

tự nhiên từ cây dừa cạn Madagascar (Catharanthus roseus) là một trong những ví dụ

nổi bật nhất của loại hợp chất này, các vinca alkaloid gây chết tế bào bởi apoptosis bằng cách ức chế động học của microtubule Kể từ đó, những nỗ lực để thay đổi cấu trúc ban đầu của các phân tử này đã dẫn tới sự phát triển và sau đó là sử dụng lâm sàng của ba

vinca alkaloid tổng hợp vindesine (Eldesine®), vinorelbine (Navelbin®) và vinflunine (Javlor®)

Xuất phát từ cơ sở các kết quả nghiên cứu và tính cấp thiết trong thực tiễn, chúng

tôi đã thực hiện luận án: “Nghiên cứu tổng hợp và hoạt tính sinh học các dẫn xuất

mới của alkaloid dừa cạn” với mục tiêu tổng hợp được các dẫn xuất mới của alkaloid

dừa cạn và đánh giá hoạt tính kháng ung thư của chúng

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Microtubule - Một đích tác dụng quan trọng của các thuốc điều trị ung thư

Microtubule một thành phần của bộ khung tế bào bao gồm các tiểu đơn vị α và

β-tubulin Heterodimer này liên quan đến nhiều quá trình sinh học tế bào như tín hiệu tế

bào, vận chuyển nội bào, duy trì hình dạng tế bào và sự phân cực tế bào [8] Do vai trò của chúng trong sự phân bào, chúng trở thành một mục tiêu quan trọng để phát triển thuốc chống ung thư Trong mục này, chúng tôi giới thiệu ngắn gọn về hệ tubulin-microtubule, động học của microtubule và sơ lược về các nhóm thuốc chống ung thư theo cơ chế tác dụng lên microtubule

1.1.1 Định nghĩa

Microtubule – là thành phần chính của bộ khung tế bào - là polymer protein hình ống dài, dạng sợi, được tìm thấy trong tất cả các tế bào nhân chuẩn Chúng có vai trò rất quan trọng trong việc phát triển và duy trì hình dạng tế bào, trong tín hiệu tế bào, vận chuyển các túi, ty thể và các thành phần khác trong tế bào, sự di động của tế bào, trong

sự phân chia tế bào, sự nguyên phân và sự phân cực của tế bào

Hình 1.1 Cấu trúc và các quá trình polymer hóa, khử polimer hóa microtubule [9]

Hình 1.2 Microtubule trong hai tế bào xương osteosarcoma trong kỳ trung gian của

chu kỳ tế bào Microtubule có màu đỏ, chromatin có màu xanh lam và các centromeres

có màu xanh lá cây [10]

Có thể xem microtubule là các cấu trúc phân cực bao gồm các tiểu đơn vị dị dimer

(heterodimer) α-tubulin và β-tubulin được sắp xếp lại với nhau thành các chuỗi tiền tơ

(protofilament) Một microtubule đơn bao gồm 10-15 protofilament (thường là 13 trong

tế bào động vật có vú) liên kết với nhau để hình thành một ống xoắn rỗng rộng 24 nm (kích thước 4 nm × 5 nm × 8 nm và khối lượng 100.000 daltton) với hai đầu kí hiệu là (+)

và (-) [10-14]

1.1.2 Động học của microtubule

Một điều quan trọng trong tính chất của các đại phân tử này là đặc tính động học của nó Có thể tạm hiểu là sự thay đổi cấu trúc theo thời gian Có 2 kiểu động học trong cấu trúc là: (a) “dynamic instability” cấu trúc của microtubule có thể dài ngắn tuỳ theo chu kỳ; (b) “treadmilling” đầu (+) dài ra, sau đó đầu (-) ngắn lại, nhưng chiều dài tổng thể không đổi Đáng chú ý là các microtubule cấu tạo nên các sợi siêu vi, nơi bám

của các chromosome trong quá trình phân bào Các sợi siêu vi microtubule này có tính động học rất lớn, 4-100 lần so với sự thay đổi cấu trúc của các microtubule thông thường

Các chức năng sinh học của các microtubule trong tất cả các tế bào được xác định

và được điều chỉnh phần lớn bởi các động học polimer hóa của chúng [15-18] Microtubule cho thấy hai loại động học không cân bằng, cả với các hệ thống microtubule

tinh khiết trong in vitro và trong các tế bào (Hình 1.3) Một loại tính chất động học rất

nổi bật trong tế bào được gọi là "dynamic instability", là một quá trình trong đó các đầu microtubule riêng lẻ chuyển đổi giữa các giai đoạn tăng trưởng và rút ngắn [19] Hai đầu của một mictubule không tương đương, một đầu được gọi là đầu dương tăng trưởng

và rút ngắn nhanh hơn và rộng hơn đầu kia (đầu âm) Sự thay đổi độ dài theo thời gian

ở các đầu của một nhóm các microtubule do quá trình “dynamic instability” được minh họa trong hình 1.3a, 1.3b Các microtubule trải qua thời gian tương đối dài của sự kéo dài, thời gian ngắn của sự rút ngắn nhanh và thời kỳ các động học suy giảm hoặc tạm dừng, khi các microtubule không phát triển cũng không thể rút ngắn được

Kiểu động học thứ nhất, “Dynamic instability” được đặc trưng bởi bốn yếu tố chính: tốc độ tăng trưởng microtubule, tốc độ rút ngắn, tần suất chuyển đổi từ trạng thái tăng trưởng hoặc tạm dừng sang rút ngắn (quá trình chuyển đổi này được gọi là

“catastrophe”) và tần suất chuyển đổi từ rút ngắn sang tăng trưởng hoặc tạm dừng (gọi

là “rescue”) Các khoảng thời gian tạm dừng được xác định hoạt động khi bất kỳ sự thay đổi độ dài microtubule nào có thể xảy ra thấp hơn độ phân giải của kính hiển vi quang học Yếu tố được gọi là “dynamicity” rất hữu ích để mô tả tổng thể nhìn thấy bằng mắt thường tốc độ trao đổi của các tubulin dimer với các đầu microtubule

Kiểu động học thứ hai, được gọi là “treadmilling” (Hình 1.3c), là sự tăng trưởng

ở đầu của một đầu microtubule và sự rút ngắn ở đầu đối diện [20-24] Nó liên quan đến dòng nội tại của các tiểu đơn vị tubulin từ đầu dương của microtubule đến đầu âm và được tạo ra bởi sự khác biệt trong các nồng độ tiểu đơn vị quan trọng ở các đầu microtubule đối diện (Nồng độ tiểu đơn vị tới hạn là nồng độ các tiểu đơn vị tubulin tự

do trong trạng thái cân bằng với đầu của microtubule) Tính chất này xảy ra trong các tế

bào cũng như trong in vitro và có thể đặc biệt quan trọng trong sự phân bào

“Treadmilling” và “dynamic instability” là những tính chất tương thích và một tập hợp microtubule đặc trưng có thể thấy chủ yếu là tính chất “treadmilling”, tính “dynamic instability” hoặc hỗn hợp cả hai Các cơ chế kiểm soát mức độ mà một tập hợp

microtubule biểu hiện một hoặc một tính chất khác được hiểu một cách không rõ ràng nhưng có thể liên quan đến thành phần tubulin của quần thể vi thể, mức độ biến đổi sau dịch mã của tubulin và đặc biệt, các hoạt động của các protein điều hòa

Hình 1.3 Động học của microtubule [10]

1.1.3 Các nhóm thuốc chống ung thư theo cơ chế tác dụng lên microtubule

Các loại thuốc ức chế phân bào tác dụng lên microtubule thường được phân thành hai nhóm chính Một nhóm được biết đến như là các chất làm bất ổn định microtubule (microtubule-destabilizing), ức chế quá trình polimer hóa microtubule ở nồng độ cao và hầu hết các chất này liên kết với một trong hai vùng microtubule hoặc vùng vinca hoặc vùng colchicine Các chất liên kết trên vùng vinca bao gồm các vinca alkaloid (vinblastine, vincristine, vinorelbine, vindesine và vinflunine), cryptophycin và dolastatin (eribulin, spongistatin, rhizoxin, maytansinoid và tasidotin) Chất liên kết trên vùng colchicine bao gồm colchicine và các chất tương tự, podophyllotoxin,

combretastatin, CI-980, 2-methoxyoestradiol, phenylahistin (diketopiperazine), steganacin và curacin [25-26] Một số tác nhân làm mất ổn định microtubule bao gồm hemiasterlin, estramustine, noscapine, thuốc diệt cỏ như carbendazim, các thuốc thần kinh như phenytoin và các thành phần thực phẩm như sulphoraphane được tìm thấy trong rau cải [27-28], liên kết với các vị trí mới trên tubulin

Hình 1.4 Các nhóm thuốc chống ung thư theo cơ chế tác dụng lên microtubule và vị

trí liên kết của chúng trên microtubule [29]

Hình 1.5 Vị trí gắn kết của vinblastine (màu xanh) và colchicine (màu vàng) trên tubulin [30]

Nhóm thứ hai là các chất làm ổn định microtubule (microtubule-stabilizing), tăng cường polimer hóa ở nồng độ cao bao gồm taxane, paclitaxel và docetaxel (Taxotere®), epothilone, ixabepilone (Ixempra®) và patupilone, disodermolit, eleutherobin,

BẤT ỔN ĐỊNH MICROTUBULE ỔN ĐỊNH MICROTUBULE

sarcodictyin, cyclostreptin, dictyostatin, laulimalide, rhazinilam, peloruside A, một số steroid và polyisoprenyl benzophenone Hầu hết các chất ổn định microtubule liên kết

với cùng một vị trí liên kết taxoid trên β-tubulin, nằm trên bề mặt bên trong của

microtubule [31] Tuy nhiên, hai trong số các tác nhân, laulimalide và peloruside A, không bị thay thế bởi paclitaxel và vì lý do này được cho là liên kết với một vị trí mới trên microtubule [32-33] Có tổng số hàng trăm hợp chất đã được báo cáo kìm hãm sự phân bào bởi tác động của chúng đối với các microtubule Trong tất cả các trường hợp

đã được nghiên cứu, cơ chế phổ biến nhất là ức chế động học microtubule [34-35]

Bảng 1.1 Một số thuốc ức chế phân bào theo vị trí liên kết trên microtubule và ứng

dụng trong trị liệu

Vùng liên kết Tên biệt dược Ứng dụng trị liệu Tài liệu tham

khảo Vùng Vinca Vinblastine (Velban) Bệnh Hodgkin, ung thư tế bào

huyết, ung thư phổi

[43-45]

tế bào không nhỏ, ung thư vú

[39, 46]

Vùng Colchicine Colchicine Các bệnh không gây ung thư

(gout, sốt Địa trung hải gia đình)

[47-48]

Combretastatin (AVE8062A, CA-1-P, CA-4-P, N-

acetylcolchicinol-O-phosphate, ZD6126)

Methoxybenzene- sulphonamide (như ABT-751, E7010)

Vị trí Taxane Paclitaxel (Taxol),

TL00139 và các chất tương tự paclitaxel

Ung thư buồng trứng, vú và phổi, ung thư Kaposi

BMS- 247550, epothilone B và D)

1.2.1 Giới thiệu về vinca alkaloid

Cây dừa cạn Catharanthus roseus (L.) G DON (Vinca rosea L.) là loài cây có nguồn gốc từ Madagasca thuộc họ Apocynaceae được trồng chủ yếu ở các nước có khí

hậu ấm, ban đầu được trồng làm cây cảnh vì nó có hoa màu hồng hoặc màu trắng rất đẹp, hơn nữa nó cũng đã trở thành chè thuốc và dược liệu chữa trị nhiều loại bệnh Từ lâu, cây dừa cạn là vị thuốc dân gian được người dân các nước châu Phi và châu Á dùng

để chữa trị nhiều loại bệnh như tiểu đường, cao huyết áp, làm thuốc giảm đau, chữa bệnh thiếu vitamin C,… [74-75]

Hình 1.6 Cây dừa cạn Catharanthus roseus

Hình 1.7 Một số alkaloid dừa cạn được sử dụng trong lâm sàng

Alkaloid dừa cạn (Vinca alkaloid) là một họ các hợp chất indole dạng dimer được

chiết xuất hoặc bán tổng hợp từ cây dừa cạn Catharanthus roseus, đại diện cho một

trong những lớp chất chống ung thư quan trọng nhất Hoạt tính chống ung thư của alkaloid dừa cạn được phát hiện từ những năm 50 của thế kỷ 20 Hơn 40 năm sau đó,

hai loại thuốc vinblastine 1 và vincristine 2 vẫn được sử dụng rộng rãi trong điều trị ung

thư và các dẫn chất bán tổng hợp, chẳng hạn như vindesine (Eldesine®) 3, vinorelbine

(Navelbine®) 4 và gần đây hơn là một dẫn xuất chứa flo, vinflunine (Javlor®) 5 (Hình

1.7) đã lần lượt được nghiên cứu và đưa vào sử dụng trong lâm sàng

1.2.2 Tổng hợp các vinca alkaloid

Một vấn đề lớn đối với việc đưa vào sản xuất thương mại các sản phẩm thiên

nhiên làm thuốc là tính sẵn có của nó Vinblastine 1 và vincristine 2 được phân lập với

hiệu suất rất thấp từ lá C roseus Phần lớn các thuốc đưa vào điều trị được sản xuất

bằng phương pháp bán tổng hợp, phương pháp tổng hợp toàn phần cũng đã được các nhà khoa học chú ý mặc dù gặp phải những thách thức về sự phức tạp cấu trúc Sự phát triển các vinca alkaloid bằng công nghệ sinh học cũng đang được nghiên cứu

1.2.2.1 Bán tổng hợp

Hiệu suất phân lập của vincristine 2 theo thứ tự là 0,0003% từ lá khô C roseus

Vinblastine 1 thu được với hiệu suất cao hơn (0,01%) và do đó được sử dụng để tổng hợp vincristine bằng cách oxy hóa nhóm N-methyl indoline [76] Vindesine 3 cũng được tổng hợp từ vinblastine 1 bằng phương pháp phân giải với hydrazine và sau đó là quá

trình khử liên kết N-N mới hình thành [77]

Hình 1.8 Sự oxi hóa vinblastine 1 thành vincristine 2

Hình 1.9 Tổng hợp vindesine 3

Một thách thức lớn trong quá trình tổng hợp vinca alkaloid là kiểm soát sự tạo

thành cấu hình lập thể tuyệt đối S tại C18' gây hoạt tính độc tế bào tốt hơn so với cấu hình lập thể R [78-79]

Bước đột phá lớn trong việc tổng hợp các hợp chất này là phát hiện rằng

vinblastine 1 có thể thu được bằng cách ghép nối vindoline 7 với catharanthine 6 Ưu điểm của phương pháp này đó là cathanranthine 6 và vindoline 7 là hai trong số những

alkaloid phân lập được với số lượng lớn nhất từ Catharanthus roseus

Hình 1.10 Sinh tổng hợp vinblastine 1 từ Catharanthine 6 và vindoline 7

Potier và cộng sự đã lần đầu tiên tổng hợp thành công một alkaloid kiểu

vinblastine gọi là anhydrovinblastine 12 mang cấu hình tự nhiên S tại C18’ và cấu hình

lập thể tương đối tự nhiên giữa C18’ và C2', bằng việc áp dụng phản ứng Polonovski cải

tiến (Hình 1.11) Theo đó, muối trifluoroacetate 9 trải qua sự phân mảnh ở liên kết C5’ cho sản phẩm trung gian 10, sau đó được cộng hợp với vindoline Sau khi khử iminium thu được anhydrovinblastine 12 với hiệu suất 50%

C18'-Hình 1.11 Tổng hợp anhydrovinblastine theo Potier và các cộng sự

Cấu hình của trung tâm bậc bốn C-18’ tạo ra phụ thuộc mạnh vào nhiệt độ phản

ứng Ở nhiệt độ rất thấp (-50 °C), các cation 10 vẫn giữ được hình dạng ban đầu của

catharanthine do đó thúc đẩy sự hình thành các hợp chất 12 (18'S) trong khi ở nhiệt độ cao, chủ yếu là tạo thành hợp chất 13 (18'R) [80]

Hình 1.12 Tổng hợp anhydrovinblastine theo Vukovic

Vukovic và cộng sự đã phát triển một phương pháp hiệu quả để ghép nối giữa catharanthine và vindoline với sự có mặt của các ion sắt III trong môi trường nước có

tính axit, anhydrovinblastine (18'S) được tạo thành với hiệu suất 77% (Hình 1.12) [81]

Gần đây, phản ứng ghép nối giữa catharanthine 6 và vindoline 7 tạo thành anhydrovinblastine 12 cũng được thực hiện bằng cách sử dụng xúc tác enzym oxi hóa

khử laccases, trong bầu khí quyển oxi, sau đó là sự khử của cation enaminium trung gian bởi NaBH4 Anhydrovinblastine 12 thu được với hiệu suất 56% [82]

Việc phân lập được anhydrovinblastine trong C roseus [83-84] đã xác nhận giả

thuyết sinh tổng hợp đề xuất trước đó bởi Potier và cộng sự

Anhydrovinblastine từ đó được xem như là một tiền chất quan trọng để tổng hợp các vinca alkaloid bisindole Ví dụ đầu tiên về tổng hợp vinblastine từ anhydrovinblastine đã được thực hiện bởi Potier và cộng sự (Hình 1.13) [85]

Hình 1.13 Tổng hợp vinblastine từ anhydrovinblastine theo Potier

Tổng hợp này dựa trên sự hydro hóa 4'-anhydrovinblastine 12 thành desoxyleurosidine 16, tiếp theo là quá trình oxy hóa bằng phản ứng Polonovski để tạo thành enamine 17 Quá trình oxy hóa có kiểm soát enamine 17 bởi triacetate tali cho

imminium 18 sau đó khử bằng NaBH4 tạo thành vinblastine 1 trong 4 bước với hiệu

suất 30%

Hình 1.14 Tổng hợp vinblastine theo Kutney

Quy trình tổng hợp này sau đó đã được cải tiến bởi Kutney bằng cách thay thế NaBH4 bởi NADH trong phản ứng Polonovski-Potier Các enamine 17 hình thành được

oxy hóa chọn lọc bởi Fe3+ thành imminium sau đó khử thu được vinblastine (hiệu suất tổng cộng 40% ) [86] (Hình 1.14) Một phương pháp khác, anhydrovinblastine được chuyển hóa thành vinblastine (21%) bằng kháng thể đơn dòng antivinblastine [87]

Hình 1.15 Tổng hợp in situ vinblastine từ catharanthine và vindoline theo Dale Boger

Dale Boger và cộng sự đã ứng dụng phương pháp Vukovic và kết hợp với việc phát

triển một phương pháp oxy hóa in situ vị trí C-4’ sử dụng hệ Fe (III)/NaBH4/không khí, thu

được vinblastine 1 (41%) và leurosidine 20 (21%) trong một giai đoạn (Hình 1.15) [88]

Nghiên cứu này là nỗ lực để nâng cấp các quá trình tổng hợp phòng thí nghiệm lên quy mô lớn hơn nhằm đảm bảo cung cấp các vinca alkaloid cần thiết cho nghiên cứu tiền lâm sàng hoặc lâm sàng

Hình 1.16 Sự chuyển hóa chloroindolenine 21 thành vinblastine 1

Hai con đường bán tổng hợp khác cũng đã được sử dụng để tạo ra liên kết

C-18'S/C-15 của vinblastine 1 từ vindoline tự nhiên 7 và các hợp chất có thể dẫn tới sự hình thành

phần velbanamine của các alkaloid bisindole Phản ứng liên quan đầu tiên của

chloroindolenine 21 với bạc tetrafluoroborat và vindoline 7 và dẫn đến sản phẩm trung gian

22 tạo ra vinblastine 1 sau khi được đóng vòng và khử nhóm chức bảo vệ (Hình 1.16) [89]

Hình 1.17 Sự chuyển hóa amin bậc 3 24 thành vinblastine 1

Con đường bán tổng hợp thứ hai (Hình 1.17), phương pháp ghép nối dựa trên sự

phân cắt không oxi hóa của amin bậc ba 24 trải qua sự phân mảnh sau khi xử lý với

ClCO2CH2C6H4NO2 và vindoline 7 [90] Các dimer indole-indoline 24 sau đó chuyển hóa thành hydroxy aldehyde 25 tạo thành vinblastine 1 sau khi hydro hóa và khử iminium 19

Hình 1.18 Chuyển hóa của anhydrovinblastine N-oxide 26 hoặc chloro-indolenine 30

thành vinorelbine 4

Anhydrovinblastine 12 không chỉ là hợp chất trung gian cho việc bán tổng hợp vinblastine 1 mà nó cũng là tiền chất của hai loại thuốc chống ung thư bán tổng hợp vinorelbine 4 (Navelbine®) và vinflunine 5 Ban đầu, vinorelbine đã thu được từ anhydrovinblastine N-oxit 26 bởi phản ứng Polonovski-Potier tiếp theo là thủy phân các

muối bisiminium [91] Phương pháp này đã được cải thiện hơn nữa với các chloro-hoặc

bromo-indolenine của anhydrovinblastine 30 [92-93] Vinflunine thu được bằng cách

halogen hóa vinorelbine trong môi trường siêu axit (HF/SbF5) [94]

Hình 1.19 Tổng hợp vinflunine 5

1.2.2.2 Tổng hợp toàn phần

Một trong những thách thức trong tổng hợp toàn phần các vinca alkaloid là tính phức tạp về cấu trúc của chúng Tổng hợp toàn phần bất đối xứng đã được thực hiện

bằng các con đường khác nhau [95] nhưng tổng hợp toàn phần của (+)-catharanthine ít được đề cập [96]

Tổng hợp toàn phần de novo của vinblastine 1 thu được bằng cách ghép nối

chloroindolenine 31 với vindoline 7 được tổng hợp từ 7-mesyloxyquinolin 32 (Hình 1.20) [97] Đầu tiên muối iminium trung gian được hình thành sau khi hoạt hóa 31 bằng axit trifluoroacetic

và sau đó xảy ra sự thế electrophilic với vindoline 7 đã dẫn đến dimer 33, dimer này sau đó được đóng vòng tạo thành vinblastine 1 sau khi khử nhóm bảo vệ của alcohol bậc ba và nhóm amin

Hình 1.20 Sự chuyển hóa của chloroindolenine 31 và 34 thành vinblastine 1

Tương tự, (+)-vincristine 2 đã được thông qua để tổng hợp thông qua sự ghép

nối chọn lọc lập thể của demethylvindoline và carbomethoxyvelbanamine [98] Một

phương pháp linh hoạt tạo ra vinblastine 1 và để tổng hợp một loạt các chất tương tự tại C-4' từ hợp chất trung gian 35 cũng được phát triển bởi Fukuyama và các cộng sự thông qua sự kết hợp của chloroindolenine 34 với vindoline (7) (Hình 1.20) [99]

Trong một chiến lược tổng hợp toàn phần khác (Hình 1.21) theo Boger và các

cộng sự, vindoline 7 được ghép nối với catharanthine 6 trong một bước [88] Đầu tiên, vindoline 7 tổng hợp toàn phần trong 11 bước, từ N-methyl-6-methoxytryptamine 36 để tổng hợp hợp chất trung gian 37, hợp chất 37 được kết hợp với dẫn xuất 38 cho oxadiazole 39 Phản ứng then chốt của phương pháp này là bước đóng vòng song song

nội phân tử [4 + 2] / [3 + 2] Sự mất đi của một phân tử nitơ dẫn đến chất trung gian

carbonyl 40, trải qua đóng vòng 1,3-lưỡng cực tạo ra hợp chất 41 có khung pentacyclic

của vindoline Một số bước khử - oxi hóa dẫn đến vindoline 7, ghép nối 7 với catharanthine 6 thu được vinblastine 1

Hình 1.21 Tổng hợp toàn phần vinblastine theo Boger và các cộng sự, 2009

1.2.2.3 Sinh tổng hợp và công nghệ sinh học

Hiện tại, các phương pháp tiếp cận công nghệ sinh học trong nuôi cấy tế bào thực vật chưa thể cung cấp giải pháp tức thời cho việc sản xuất các vinca alkaloid Sinh tổng hợp vinblastine và vincristine rất phức tạp và đã được đánh giá tổng quan bởi Van der Heijden [100], O'Connor [101] và El-Sayed [102] Bắt đầu từ tryptophan và geraniol, ít nhất 35 chất trung gian, 30 enzim, 2 gen điều hòa, 7 nội bào và khoang nội bào tham gia vào quá trình sản xuất vinblastine

Năm 2018, nhóm nghiên cứu hóa sinh của Sarah E O’Connor và cộng sự đã xác định được hai enzyme quan trọng PAS và DPAS [103], hoàn tất quá trình tìm kiếm các bước sinh tổng hợp chất chống ung thư vinblastine ở cây dừa cạn Nghiên cứu này mở ra tương lai sản xuất dược chất quý này trên quy mô lớn bằng công nghệ sinh học

1.2.3 Mối quan hệ cấu trúc – hoạt tính của vinca alkaloid

Mối quan hệ cấu trúc và hoạt tính của các vinca alkaloid đã được đánh giá tổng quan bởi Pearce [104], Borman và Kuehne [105] Kể từ khi khám phá ra tính chất chống ung thư,

nhiều dẫn xuất vinca alkaloid đã được tổng hợp trong ngành dược phẩm với mục đích nâng cao các hoạt tính của chúng để cho ra các loại thuốc mới có hiệu quả lâm sàng rộng hơn

Trong số các vinca alkaloid tự nhiên hai chất được sử dụng nhiều trong lĩnh vực

điều trị ung thư đó là vinblastine 1 và vincristine 2 chiết xuất từ C roseus cho thấy rằng,

dù cấu tạo hóa học giống nhau nhưng phổ tác dụng lại khác nhau Vinblastine 1 sử dụng chủ yếu để điều trị bệnh Hodgkin, còn vincristine 2 chủ yếu sử dụng trong điều trị bệnh

bạch cầu ở trẻ em Tác dụng của phụ của chúng cũng rất khác nhau, vinblastine chủ yếu gây giảm bạch cầu còn vincristine lại gây độc cho thần kinh Cấu hình không gian tự

nhiên của hầu hết các vinca alkaloid tự nhiên có hoạt tính ở vị trí C-18’ là cấu hình S và

cấu hình không gian tương đối ở C-18’ và C-2’ là cực kỳ cần thiết để một hợp chất có

hoạt tính, chỉ những hợp chất có cấu hình trùng với cấu hình tự nhiên của vinblastine 1

mới có hoạt tính Hoạt tính vẫn còn nhưng giảm đi nhiều nếu như cả hai cấu hình ở 18’ và C-2’ đều ngược với cấu hình tự nhiên [79] Các dẫn xuất epime ở C-20’ đều giảm hoạt tính [79]

C-Trong gần 40 năm, hàng trăm dẫn xuất đã được tổng hợp và đánh giá về hoạt tính chống ung thư Hầu hết các sản phẩm này thu được bằng cách thay đổi “phần dưới” vindoline, mang một số nhóm chức phản ứng Những thay đổi về cấu trúc ở “phần trên” velbanamine ít hơn nhưng cho thấy rằng ngay cả một sự thay đổi nhỏ cũng có thể làm thay đổi đáng kể các hoạt tính sinh học

1.2.3.1 Những thay đổi trên phần khung vindoline

Nhiều dẫn xuất đã được thay đổi trên phần khung vindoline, bao gồm vindesine

3, vedcinat 42 và vinzolidine 43, đã được tổng hợp và đánh giá hoạt tính (Hình 1.22) Vialcinate 42, được thay thế bằng một glycine ở vị trí C-4 của vindoline, là chất tương

tự vinblastine đầu tiên được đưa vào thử nghiệm lâm sàng giai đoạn I năm 1967 [106]

Sau đó, sự thay đổi ở vị trí C-3 dẫn tới dẫn xuất amido vindesine 3, [77] có thể coi là tiền chất của vinzolidine 43 [104] và vintriptol 44 [107] Vinepidine 45, tương ứng với

4'-epi-4'-deoxyvincristine cũng được phát triển vì ái lực của nó với tubulin tăng so với

vinblastine 1 [104] Tuy nhiên, không có hợp chất bán tổng hợp nào có lợi ích rõ rệt trong các đánh giá lâm sàng so với vinblastine 1 và vincristine 2 Sau năm 1990, chỉ có

một số dẫn xuất mới đã được tổng hợp và đánh giá với mục đích phát hiện các loại thuốc chống ung thư mới có hiệu quả lâm sàng Các chất này bao gồm các dẫn xuất

aminophosphonate vinfosiltine 46 (Hình 1.22) được lựa chọn vì hiệu lực cao đáng kể

của nó cả trong in vitro và trong in vivo so với vinblastine 1 và vincristine 2 [108]

Vinfosiltine 46 được thiết kế dựa trên sự tương tự giữa axit α-amino phosphonic

và các axit amin tự nhiên Tuy nhiên, không có bằng chứng về lợi ích rõ rệt trong các thử nghiệm lâm sàng giai đoạn II so với các vinca alkaloid khác và sự phát triển của

vinfosiltine đã được ngưng vào năm 1995 [109] Anhydrovinblastine tự nhiên 12, tiền

chất sinh học của các vinca alkaloid dimer, đã được đưa vào các thử nghiệm lâm sàng giai đoạn I vào năm 1999 để điều trị khối u khối rắn tiến triển, bao gồm ung thư phổi (NSCLC) [110] nhưng sự phát triển đã ngưng vào năm 2005 [111]

Gần đây, các thay đổi ở vị trí C-3 của anhydrovinblastine được thực hiện với sự hình thành của các dẫn xuất amide, este, ether và carbamate và đánh giá hoạt tính của

chúng trong in vitro và in vivo, cho thấy nhóm carbonyl ở vị trí đó rất quan trọng đối

với hoạt tính [112] Một trong những hợp chất này

(3-decarbomethoxy-acetyloxylmetyl-anhydrovinblastine 47) ít độc tính hơn so với vinca alkaloid cổ điển trong in vitro nhưng

trong in vivo lại có hiệu quả chống ung thư cao hơn so với vinorelbine đối với sarcoma 180

ở chuột cũng như tính dược động học tốt hơn (Hình 1.22), hoạt tính của nó được so sánh với

vinflunine 5 [113]

Hình 1.22 Các dẫn xuất được biến đổi trên phần vindoline: vinglycinate 42, vinzolidine 43, vintriptol 44, vinepidine 45, vinfosiltine 46 và 47

1.2.3.2 Những thay đổi trên phần khung velbanamine

Hai bài đánh giá tổng quan [39, 114] cho thấy hiệu quả của sự thay đổi trên phần velbanamine của khung vinblastine Cho đến nay, chỉ có rất ít các dẫn xuất được thế ở vòng A'

(chủ yếu ở 12' ) đã được biết đến Không có dẫn xuất nào trong số chúng có bất kỳ cải thiện đáng kể hoạt tính chống ung thư [113] Tuy nhiên, ứng dụng tiến bộ của hóa học kim loại chuyển tiếp cho phép chuyển hóa nhóm chức một cách linh hoạt trên các vinca alkaloid ở vị trí 12' Các dẫn xuất mới được tổng hợp từ 12'-iodovinblasitine, 12'-iodovincristine và 12'-iodovinorelbine [115] sử dụng xúc tác kim loại chuyển tiếp Trong số các hợp chất này, chỉ những hợp chất có nhóm kị nước nhỏ cho thấy độc tính trên các dòng tế bào MCF-7 và HeLa tương tự như các hợp chất gốc

Hình 1.23 Sự thay đổi cấu trúc vinblastine tại vị trí 12’

Các hợp chất 48 và 49 cho thấy hoạt tính chống ung thư in vivo trên mô hình bạch

cầu chuột P388 tốt hơn vinorelbine (Hình 1.23) Ngoài ra, hợp chất 49 cho thấy có sự

giảm đáng kể tốc độ tăng trưởng của bốn khối u ngoại lai [116] Dựa trên tính chất dược

lý đầy hứa hẹn của nó, hợp chất 49 đã được đưa vào các thử nghiệm lâm sàng giai đoạn

I vào năm 2008 ở những bệnh nhân có khối u rắn tiến triển [116] Tương tự, các dẫn xuất vinflunine được thế ở vị trí C-12' có độc tính tế bào đối với dòng tế bào A549

Hình 1.24 Các dẫn xuất thế của vinblastine ở trị trí C-14’

Vị trí C-14' cũng được thay thế bằng các halogen trên catharanthine trước khi

ghép nối với vindoline Tuy nhiên, tất cả các hợp chất thu được 50a-d cho thấy hoạt tính thấp hơn so với vinblastine 1 (Hình 1.24) Các tác giả giải thích điều này bằng sự bất lợi

về không gian đối với sự tương tác với tubulin, điều này không hoàn toàn phù hợp trong

trường hợp dẫn xuất fluor 50d [117]

Kể từ những năm 1970, đã có rất nhiều nghiên cứu cấu trúc - hoạt tính được thực hiện trên phần khung velbanamine, chủ yếu ở các vòng C’, D’

Hình 1.25 Sự thay đổi trên phần velbanamine

Hình 1.26 Sự thay đổi cấu trúc vòng C’ trên phần khung velbanamine

Vinorelbine 4 được bán tổng hợp từ anhydrovinblastine trong đó vòng C’ đã được

cắt ngắn đi một carbon (từ kiểu tryptamin chuyển thành kiểu gramin) Dẫn xuất mới này

đã thể hiện hoạt tính kháng tế bào ung thư rất mạnh và tỏ ra có ít tác dụng phụ hơn vinblastine và vincristine Với con đường tổng hợp ngắn gọn, vinorelbine sau đó đã nhanh chóng được chuyển sang sản xuất và thương mại hoá bởi hãng dược phẩm Pierre Fabre dưới tên biệt dược là Navelbine® trong những năm 80 để điều trị ung thư phổi và ung thư vú [114, 118]

Từ vinorelbine 4, một dãy dẫn xuất mới với cầu gramin hở 51 đã được tổng hợp

để thử hoạt tính chống ung thư Kết quả này được dựa trên giả thuyết rằng các dẫn xuất này mới chính là dạng chuyển hoá có hoạt tính sinh học và chúng được tạo ra khi các

phân tử vinorelbine tương tác với thụ thể vinblastine trên tubulin Tuy vậy, trên thực tế không một dẫn xuất mới nào thuộc dãy này chứng tỏ có hoạt tính ức chế tổng hợp tubulin cũng như độc tính tế bào đáng kể Việc lược giản phần lớn vòng C’ và chỉ giữ lại cầu

«tryptamin» hay «gramin» (dẫn xuất 52) cũng dẫn đến loại bỏ hoàn toàn hoạt tính chống

ung thư của các dẫn xuất này [114, 118]

Ngược lại, đã có những công bố về nghiên cứu mở rộng vòng C’ tại vị trí 7’ và

18’ Dẫn xuất 7’a-homo-vinblastine 53 thể hiện hoạt tính kháng tế bào ung thư ở nồng

độ dưới µM và độc tính tế bào gần tương tự vinblastine trên một số dòng tế bào ung thư

khác nhau trong khi dẫn xuất 18’a-homo-vinblastine 54 lại có hoạt tính thấp trong cùng

điều kiện thực nghiệm [114, 118]

Hình 1.27 Các dẫn xuất 7’(8’)-homo-anhydrovinblastine mới từ vinorelbine

Fanny Roussi và cộng sự công bố tổng hợp các dẫn xuất

7’-homo-anhydrovinblastine 55, 8’-homo-7’-homo-anhydrovinblastine 56 mới từ vinorelbine Nghiên cứu

tương quan cấu trúc hoạt tính cho thấy của thụ thể vinca trên tubulin chấp nhận tốt hơn đối với kích cỡ của nhóm thế tại vị trí 7’ so với vị trí 8’ Kết quả thử nghiệm trên hai

dòng tế bào HCT116 và K562 cho thấy dẫn xuất 55 (IC50 = 6 và 5 nM) có hoạt tính độc

tế bào mạnh hơn nhiều so với chính vinorelbine (IC50 = 35 và 20 nM) [119-120]

Hình 1.28 Các dẫn xuất muối ammoni bậc IV của anhydrovinblastine và vinorelbine

Ngô Quốc Anh và cộng sự công bố tổng hợp các dẫn xuất muối ammoni bậc IV

57 của anhydrovinblastine và vinorelbine bằng cách gắn các chuỗi peptit từ 1 đến 3 axit

amin lên amin bậc 3 trên phần velbanamine Hầu hết các dẫn xuất đều thể hiện hoạt tính ức chế tổng hợp microtubule cũng như độc tính mạnh đối với dòng tế bào KB Nghiên cứu tương quan cấu trúc hoạt tính cho thấy các mạch nhánh peptit lấp đầy một

không gian «trống» tại vùng ranh giới giữa hai tiểu đơn vị tubulin α và β [121-122]

Hình 1.29 Sự thay đổi cấu trúc trên vòng D’

Trong nhiều năm, những thay đổi của vòng D’ luôn được quan tâm bởi các dẫn xuất mới này có hoạt tính sinh học cao Tác dụng chống ung thư của các alkaloid dừa cạn rất phụ thuộc vào các thay đổi cấu trúc thực hiện ở ví trí 4’và 20’ Sự vắng mặt của

nhóm hydroxyl tại C4’ không ảnh hưởng tới hoạt tính sinh học (chất 58, 59, 60)

Các dẫn xuất 61a-e và 62 mang các nhóm thế halogen (flour hoặc chlor), alcohol,

ketone đều thể hiện hoạt tính ức chế polymer hóa tubulin ở ngưỡng µM tương tự như các chất tham chiếu, tuy nhiên lại không thể hiện tương quan rõ ràng với kết quả thử độc tính trên các dòng tế bào nghiên cứu Các chất tương tự ở C-4' của vinblastine