KHẢO SÁT TỶ LỆ NHIỄM VIRÚT LỞ MỒM LONG MÓNG VÀ TỶ LỆ BẢO HỘ TRÊN HEO TIÊM PHÒNG VẮC – XIN AFTOPOR TẠI MỘT SỐ CƠ SỞ XÂY DỰNG AN TOÀN DỊCH Ở CỦ CHI, THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHẢO SÁT TỶ LỆ NHIỄM VI-RÚT LỞ MỒM LONG MÓNG VÀ TỶ LỆ BẢO HỘ TRÊN HEO TIÊM PHÒNG VẮC – XIN AFTOPOR TẠI MỘT SỐ CƠ SỞ XÂY DỰNG AN TOÀN DỊCH Ở CỦ CHI, THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Tác giả NGUYỄ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT TỶ LỆ NHIỄM VI-RÚT LỞ MỒM LONG MÓNG

VÀ TỶ LỆ BẢO HỘ TRÊN HEO TIÊM PHÒNG VẮC – XIN AFTOPOR TẠI MỘT SỐ CƠ SỞ XÂY DỰNG AN TOÀN DỊCH

KHẢO SÁT TỶ LỆ NHIỄM VI-RÚT LỞ MỒM LONG MÓNG

VÀ TỶ LỆ BẢO HỘ TRÊN HEO TIÊM PHÒNG VẮC – XIN AFTOPOR TẠI MỘT SỐ CƠ SỞ XÂY DỰNG AN TOÀN DỊCH

Ở CỦ CHI, THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

Tác giả

NGUYỄN HUỲNH DIỄM NGỌC

Khoá luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Bác sỹ ngành Bác Sỹ Thú Y

Giáo viên hướng dẫn:

Tiến Sĩ : NGUYỄN VĂN KHANH BSTY : HUỲNH THỊ THU HƯƠNG

Tháng 5 năm 2009

XÁC NHẬN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN

Họ tên sinh viên thực tập: NGUYỄN HUỲNH DIỄM NGỌC

“ Tên luận văn: KHẢO SÁT TỶ LỆ NHIỄM VI-RÚT LỞ MỒM LONG

MÓNG VÀ TỶ LỆ BẢO HỘ TRÊN HEO TIÊM PHÒNG VẮC – XIN

AFTOPOR TẠI MỘT SỐ CƠ SỞ XÂY DỰNG AN TOÀN DỊCH Ở CỦ CHI,

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH”

Đã hoàn thành luận văn theo yêu cầu của giáo viên hướng dẫn và các ý kiến

nhận xét, đóng góp của Hội đồng chấm thi tốt nghiệp khoa ngày………

LỜI CẢM ƠN

* Xin chân thành cảm ơn

Tiến sĩ: Nguyễn Văn Khanh

Bác sĩ thú y Huỳnh Hữu Thọ

Đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực tập và hoàn thành luận văn này

* Chân thành cảm ơn

Bác sĩ thú y Huỳnh Thị Thu Hương và các anh chị phòng siêu vi – huyết thanh

Đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn tốt nghiệp

Xin cảm ơn tất cả các cô chú anh chị công tác tại Trạm Chẩn Đoán Xét Nghiệm

và Điều Trị thuộc Chi Cục Thú Y Thành Phố Hồ Chí Minh đã hết lòng giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực tập tốt nghiệp

TÓM TẮT

Trong thời gian thực hiện đề tài “Khảo sát tỷ lệ bảo hộ và tỷ lệ nhiễm vi-rút lỡ mồm long móng serotype O trên heo tại một số cơ sở xây dựng an toàn dịch ở Củ Chi,

Tp Hồ Chí Minh” Từ ngày 11 tháng 11 năm 2008 đến ngày 11 tháng 3 năm 2009

Qua kết quả xét nghiệm 710 mẫu huyết thanh của 9 cơ sở chăn nuôi xây dựng

an toàn dịch, chúng tôi có kết luận sau:

1 Tỷ lệ bảo hộ chung đối với vi-rút LMLM serotype O trên heo là 76,9%

2 Tỷ lệ nhiễm vi-rút LMLM serotype O trên heo là 0,28%

3 Tỷ lệ bảo hộ do tiêm phòng và tỷ lệ nhiễm vi-rút LMLM serotype O trên heo:

- Tỷ lệ heo có đủ kháng thể bảo hộ đối với vi-rút LMLM do tiêm phòng tại các

cơ sở chăn nuôi đạt yêu cầu Cơ Sở An Toàn Dịch: cơ sở 1 đạt 90,63%, cơ sở 2 đạt 92,09%, cơ sở 5 đạt 100% và các cơ sở còn lại không đạt yêu cầu

- Tỷ lệ heo có đủ kháng thể bảo hộ đối với vi-rút LMLM do tiêm phòng theo qui mô chăn nuôi: qui mô dưới 500 con là 90,48%, qui mô từ 500 – 1000 con là 71,88% và qui mô trên 1000 con là 80,06%

- Tỷ lệ heo có đủ kháng thể bảo hộ đối với vi-rút LMLM do tiêm phòng theo nhóm heo sinh sản: nhóm heo hậu bị có tỷ lệ bảo hộ là 70,68%, nhóm heo nái có tỷ lệ bảo hộ là 78,08%, nhóm heo nọc có tỷ lệ bảo hộ là 100%

MỤC LỤC

Trang

Trang tựa i

LỜI CẢM ƠN ii

TÓM TẮT iv

MỤC LỤC v

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii

DANH SÁCH CÁC BẢNG ix

DẠNH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ, SƠ ĐỒ VÀ HÌNH x

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1.2 MỤC ĐÍCH 1

1.3 YÊU CẦU 2 U Chương 2 TỔNG QUAN 3

2.1 ĐẶC ĐIỂM CHUNG VÀ LỊCH SỬ PHÁT HIỆN BỆNH LỞ MỒM LONG MÓNG 3

2.1.1 Đặc điểm chung 3

2.1.2 Lịch sử phát hiện bệnh 3

2.2 - CĂN BỆNH HỌC 3

2.2.1 Hình thái cấu trúc 3

2.2.2.Đặc điểm nuôi cấy 4

2.2.3 Sức đề kháng 4

2.3 Dịch tể học 5

2.3.1 Phân bố của bệnh 5

2.3.2 Địa dư bệnh lý 5

2.3.3 Động vật cảm thụ 8

2.3.4 Chất chứa vi-rút 8

2.3.5 Đường xâm nhập 8

2.3.6 Phương thức lây lan 8

2.3.7 Cơ chế sinh bệnh 9

2.4 Triệu chứng 9

2.5 Bệnh tích 11

2.6 Chẩn đoán 12

2.6.1 Chẩn đoán lâm sàng: 12

2.6.2 Chẩn đoán ở phòng thí nghiệm: 12

2.6.2.1.Lấy mẫu bệnh phẩm 12

2.6.2.2 Một số phương pháp có thể được áp dụng để chẩn đoán bệnh LMLM .12

2.7 Phòng chống bệnh LMLM 13

2.7.1 Vệ sinh phòng bệnh 13

2.7.2 Phòng bằng vắc – xin 13

2.7.3 Các loại vắc-xin LMLM hiện dùng ở Việt Nam 14

2.7.4 Biện pháp chống dịch LMLM 15

2.8 Những quy định vùng An Toàn Dịch (Bệnh) và cơ sở An Toàn Dịch (Bệnh) động vật 15

2.8.1 Những quy định chung 15

2.8.2 Chương trình An Toàn Dịch của Chi Cục Thú Y Thành Phố 16

2.8.3 Chẩn đoán xét nghiệm đối với vùng và cơ sở An Toàn Dịch bệnh 17

Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

3.1 Thời gian và địa điểm 18

3.1.1 Thời gian 18

3.1.2 Địa điểm 18

3.2 Vật liệu 18

3.2.1 Mẫu xét nghiệm 18

3.2.2 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 18

3.2.3 Các bộ kít dùng trong chẩn đoán 18

3.3 Nội dung nghiên cứu 19

3.4 Phương pháp nghiên cứu 19

3.4.1 Phương pháp lấy mẫu xét nghiệm 19

3.4.2 Bố trí lấy mẫu huyết thanh để xét nghiệm 19

3.4.3 Phương pháp xét nghiệm 20

3.4.3.1 Kỹ thuật ELISA phát hiện kháng thể kháng vi-rút LMLM serotype O 20

3.4.3.2 Kỹ thuật ELISA phát hiện kháng thể protein FMD 3ABC trên heo 25

3.5 Công thức tính 28

3.6 Xử lý số liệu 28

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

4.1 Tỷ lệ bảo hộ chung đối với vi-rút LMLM serotype O trên heo 29

4.1.1.Tỷ lệ bảo hộ chung đối với vi-rút LMLM serotype O trên heo ở các cơ sở chăn nuôi trên địa bàn khảo sát 29

4.1.2.Tỷ lệ bảo hộ chung đối với vi-rút LMLM serotype O trên heo theo các qui mô chăn nuôi 31

4.1.3 Tỷ lệ bảo hộ chung đối với vi-rút LMLM serotype O trên heo theo nhóm heo sinh sản 32

4.2 Tỷ lệ nhiễm vi-rút LMLM serotype O trên heo 33

4.2.1 Tỷ lệ nhiễm vi-rút LMLM ở các CSCN 34

4.2.2 Tỷ lệ nhiễm vi-rút LMLM trên heo theo qui mô chăn nuôi 35

4.2.3 Tỷ lệ nhiễm vi-rút LMLM trên heo theo nhóm heo sinh sản 37

4.3 Tỷ lệ bảo hộ do tiêm phòng và tỷ lệ nhiễm vi-rút LMLM serotype O trên heo 38

4.3.1 Tỷ lệ bảo hộ do tiêm phòng và tỷ lệ nhiễm vi-rút LMLM serotype O trên heo ở các cơ sở xây dựng ATD 38

4.3.2 Tỷ lệ bảo hộ do tiêm phòng và tỷ lệ nhiễm vi-rút LMLM serotype O trên heo theo các qui mô chăn nuôi 39

4.3.3 Tỷ lệ bảo hộ do tiêm phòng và tỷ lệ nhiễm vi-rút LMLM serotype O trên heo theo nhóm heo sinh sản 39

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 41

5.1 Kết luận 41

5.2 Đề nghị 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO 42

PHỤ LỤC 44

PBS: Phosphate Buffer Salime

TMB: Tetra Methyl Benzidine

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 3.1: Bố trí lấy mẫu huyết thanh cần cho xét nghiệm LMLM 20 Bảng 4.1 Tỷ lệ bảo hộ chung đối với vi-rút LMLM serotype O giữa các CSCN 29 Bảng 4.2: Tỷ lệ bảo hộ chung đối với vi-rút LMLM serotype O trên heo theo qui mô chăn

nuôi 31

Bảng 4.3: Tỷ lệ bảo hộ chung đối với vi-rút LMLM serotype O theo nhóm heo sinh sản32 Bảng 4.4: Tỷ lệ nhiễm vi-rút LMLM giữa các CSCN 34 Bảng 4.5: Tỷ lệ nhiễm vi-rút LMLM trên heo theo qui mô chăn nuôi 35 Bảng 4.6: Tỷ lệ nhiễm vi-rút LMLM trên heo theo nhóm heo sinh sản 37 Bảng 4.7: Tỷ lệ bảo hộ do tiêm phòng và tỷ lệ nhiễm vi-rút LMLM serotype O ở các

cơ sở xây dựng ATD 38

Bảng 4.8: Tỷ lệ bảo hộ do tiêm phòng và tỷ lệ nhiễm vi-rút LMLM serotype O trên

heo theo các qui mô chăn nuôi 39

Bảng 4.9: Tỷ lệ bảo hộ do tiêm phòng và tỷ lệ nhiễm vi-rút LMLM serotype O trên

heo theo nhóm heo sinh sản 39

DẠNH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ, SƠ ĐỒ VÀ HÌNH

Trang

Biểu đồ 4.1: Tỷ lệ bảo hộ chung đối với vi-rút LMLM ở các CSCN 30

Biểu đồ 4.2: Tỷ lệ bảo hộ chung đối với vi-rút LMLM serotype O theo qui mô chăn nuôi 31

Biểu đồ 4.3: Tỷ lệ bảo hộ chung đối với vi-rút LMLM serotype O theo nhóm heo sinh sản 33

Biểu đồ 4.4: Tỷ lệ nhiễm virút LMLM ở các CSCN 34

Biểu đồ 4.5: Tỷ lệ nhiễm vi-rút LMLM trên heo theo qui mô chăn nuôi 36

Biểu đồ 4.6: Tỷ lệ nhiễm vi-rút LMLM trên heo theo nhóm heo sinh sản Error! Bookmark not defined. Sơ đồ 2.1: Cơ chế sinh bệnh 9

Sơ đồ 3.1: Tóm tắt qui trình phát hiện kháng thể kháng virus LMLM serotype o 22

Sơ đồ 3.2: Sơ đồ bố trí mẫu xét nghiệm kháng thể của huyết thanh heo 24

Sơ đồ 3.3: Tóm tắt quy trình phát hiện kháng thể kháng protein FMD 3ABC trên heo .26

Sơ đồ 3.4: Sơ đồ bố trí mẫu xét nghiệm kháng thể kháng protein 3ABC 28

Hình 2.1 Hình thái của virus FMD 4

Hình 2.2: Móng chân bị bong tróc .10

Hình 2.3 Biến chứng ở chân, heo tróc vành 10

Hình 2.4: Vú bị sung huyết 11

Hình 2.5: Vú có loét ở da 11

Hình 2.6: Loét ở kẻ móng 12

Hình 2.7: Mụn nước ở nướu răng 12

Hình 3.1: Hình vẽ minh họa cơ chế phản ứng ELISA 23

Hình 3.2: Cơ chế phản ứng phát hiện kháng thể kháng protein 3 ABC 27

Chương 1

MỞ ĐẦU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Cùng với sự phát triển của ngành nông nghiệp, ngành chăn nuôi truyền thống ở nước ta đặc biệt là chăn nuôi heo hiện nay phát triển theo qui mô công nghiệp từ nông thôn đến thành thị Chỉ riêng tại Thành Phố Hồ Chí Minh theo thống kê của Chi Cục Thú Y TP Hồ Chí Minh vào thời điểm tháng 6 năm 2008 tổng đàn heo tại các quận huyện thành phố khoảng 338.728 con

Hiện nay, bệnh trên heo diễn biến rất phức tạp nhất là các bệnh truyền nhiễm trong đó có bệnh lở mồm long móng Đây là bệnh truyền nhiễm cấp tính lây lan rất nhanh và mạnh trên mọi lứa tuổi của heo gây nhiều tổn thất cho người chăn nuôi

Để đáp ứng nhu cầu về nguồn thực phẩm tươi sạch, an toàn dịch bệnh, Uỷ Ban Nhân Dân Thành Phố, Sở Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn, Chi Cục Thú Y Thành Phố Hồ Chí Minh đang thực hiện đề án xây dựng cơ sở và vùng an toàn dịch bệnh trên huyện có tổng đàn heo cao là huyện Củ Chi

Được sự đồng ý của Bộ Môn Bệnh Lý – Ký Sinh, Khoa Chăn Nuôi Thú Y, dưới

sự hướng dẫn trực tiếp của Tiến Sĩ Nguyễn Văn Khanh và BSTY Huỳnh Thị Thu

Hương, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “ Khảo sát tỷ lệ nhiễm vi-rút lở mồm

long móng và tỷ lệ bảo hộ trên heo tiêm phòng vắc – xin Aftopor tại một số cơ sở xây dựng an toàn dịch ở Củ Chi, Thành Phố Hồ Chí Minh ”

1.2 MỤC ĐÍCH

Đánh giá mức độ bảo hộ đàn heo sau khi tiêm phòng vắc-xin phòng bệnh lở mồm long móng thuộc serotype O và tình hình nhiễm vi-rút lở mồm long móng trên heo tại các cơ sở chăn nuôi ở huyện Củ Chi, phục vụ cho công tác xây dựng vùng an toàn dịch tại Thành Phố Hồ Chí Minh

1.3 YÊU CẦU

Áp dụng kỹ thuật ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) để kiểm tra khả năng đáp ứng miễn dịch sau tiêm phòng đối với vi-rút lở mồm long móng trên mẫu huyết thanh heo và phát hiện kháng thể kháng protein 3 ABC của vi-rút LMLM

từ đó xác định tỷ lệ nhiễm vi-rút lở mồm long móng

1926, hai nhà khoa học Đức là Waldman và Trawtwein phát hiện type gây bệnh thứ ba

là type C Vì thế, đến năm 1926 bệnh LMLM có ba type là O,A,C và cho đến nay các type này được gọi là các type Châu Âu Vài năm sau ở Miền Nam Châu Phi phát hiện

ba type khác được đặt tên là SAT1, SAT2, SAT3 Sau đó, type vi-rút LMLM thứ bảy được phân lập ở Châu Á có tên là Asia1 (Trích dẫn của Lê Anh Phụng, 2002)

Hình 2.1 Hình thái của virus FMD

Vi-rút FMD có cấu trúc khối nhiều mặt (20 mặt đối xứng) và 12 đỉnh Phần capsid bên ngoài gồm 60 đơn vị và bao quanh chuỗi RNA có chiều dài khoảng 8400 base Trong mỗi đơn vị gồm 4 protein cấu trúc: VP1, VP2,VP3,VP4

Dưới kính hiển vi điện tử, vi-rút thường có dạng hình cầu hay hình quả dâu, đường kính 20-28 nm (Trần Thanh Phong,1996) Đặc điểm của bệnh LMLM là có nhiều type và dễ biến đổi kháng nguyên Các type này gây bệnh với các triệu chứng giống nhau nhưng không gây miễn dịch chéo, chỉ gây miễn dịch chéo giữa các type phụ trong type

2.2.2.Đặc điểm nuôi cấy

Trên thượng bì lưỡi bò, tế bào tuyến giáp hoặc tế bào thận gây bệnh tích tế bào sau 24-48 giờ nhưng không tạo thể bao hàm (Lê Anh Phụng, 2002)

Vi-rút chịu nhiệt kém, chết sau 5-10 phút ở nhiệt độ 60°C-70°C Vi-rút chết ngay ở 100°C Trong tủy xương, nước bọt và phủ tạng vi-rút sống 40 ngày Ngoài ra vi-rút có thể tồn lâu trong da muối và thịt đông lạnh

Do không có envelop nên vi-rút không nhạy cảm với những dung môi hoà tan lipid Vi-rút bền vững với ether, chloroform, các dẫn chất phenol và cồn ít có tác dụng

Vi-rút có thể bị phá huỷ bởi hầu hết các chất sát khuẩn: NaOH 2%, Formol 1- 2%, acid Citric 0,2% Và có thể dùng các loại acid nhẹ như: dấm ăn, phèn chua, chanh, khế để diệt vi-rút trên cơ thể con vật

2.3 Dịch tể học

2.3.1 Phân bố của bệnh

Bảy type LMLM không phân bố đều khắp thế giới

Các type SAT chỉ giới hạn ở vùng hạ Sahara của Châu Phi

Type O và A phân bố rộng nhất, chúng xuất hiện ở nhiều khu vực của Châu Phi, Nam Á, vùng Viễn Đông (thường là type O) và Nam Mỹ

Type C dường như chỉ hạn chế trong vùng tiểu lục địa Ấn Độ

Type Asia1 thường xuất hiện ở vùng Nam Á

Hiện nay Châu Âu, Bắc và Trung Mỹ, Úc Đại Lợi là những nơi không có bệnh LMLM xảy ra (Thái Thị Thủy Phượng, 2005)

2.3.2 Địa dư bệnh lý

™Tình hình bệnh LMLM trên thế giới

Vào cuối thế kỷ 19, đầu thế kỷ 20, nhiều ổ dịch LMLM xảy ra rải rác ở Châu

Âu Tuy nhiên đến đầu thập niên 1950, có khoảng 10.000 - 100.000 ổ dịch xảy ra mỗi

năm ở một số nước Tây Âu

Trong khoảng thời gian từ năm 1981-1985, bệnh LMLM xuất hiện ở 80 nước trên thế giới, trong đó có 43 ổ dịch địa phương Riêng vi-rút type A đã phân lập được ở

49 nước trên thế giới, trong đó có 30 ổ dịch địa phương như: Tây Ban Nha, Bồ Đào Nha, Đức và Italia Vi-rút type Asia1 tìm thấy ở Thổ Nhĩ Kỳ, 3 type SAT tìm thấy ở Cộng Hòa Ả RẬp, lục địa Châu Phi (FAO, 1990)

Từ năm 1992 đến năm 2001 chỉ có một vài ổ dịch nhỏ xảy ra ở Bungari, Ý, Nga, Thổ Nhĩ Kỳ (Grubman, 2002).Cuối năm 1999 và 2000, nhiều ổ dịch xảy ra ở một

số nước Đông Á, tác nhân gây bệnh của tất cả các ổ dịch này là dòng vi-rút LMLM serotype O Panasia Dòng vi-rút này có nguồn gốc từ Ấn Độ (1990) và lây lan sang Trung Quốc, Thổ Nhĩ Kỳ và Đông Âu vào năm 1999 và sau đó lan tới Đài Loan, Nam Triều Tiên, Nhật, Mongolia và miền Đông nước Nga (Grubman, 2004)

Năm 1999 – 2000 xảy ra dịch LMLM trên cừu dê ở Đài Loan nhưng qui mô dịch nhỏ hơn năm 1997, tác nhân gây bệnh là vi-rút type O, O/Taw/99 khác vi-rút phân lập được vào năm 1997 là O/Taw/97

Theo thông báo của OIE, năm 2004 có 48 quốc gia có dịch LMLM Serotype SAT1, SAT2, SAT3 được báo cáo ở Châu Phi và serotype Asia1 ở Châu Á Type O có

sự hiện diện của đầy đủ các subtype; type A, SAT1, SAT2 cho thấy có sự thay đổi lớn

về mặt di truyền học

Theo Gleeson (2002), trong 10 quốc gia Đông Nam Á, dịch LMLM nội vùng đã xảy ra trên 7 nước (Campuchia, Lào, Mã Lai, Myanma, Philippines, Thái Lan và Việt Nam) Trong vùng chỉ có 3 quốc gia được coi là không có dịch LMLM (Brunei, Indonesia, Singapore) Một số vùng của Philippines cũng được công nhận là không có hiện diện của bệnh LMLM Vi-rút LMLM serotype O đã gây bệnh trên 7 quốc gia này

Giai đoạn 1996 – 2000, serotype Asia1 được báo cáo ở các quốc gia trong vùng Đông Nam Á ngoại trừ Philippines và Việt Nam

Theo công bố của Tổ Chức Nông Lương Thế Giới (FAO, 2007) cho biết: Tháng 7/2005 dịch LMLM đã nổ ra ở Myanma với type được phát hiện là Asia1 Tháng 9/2005 1 trận dịch LMLM đã nổ ra ở Brazil và do type O gây ra Tháng 2/2006 dịch LMLM nổ ra ở Argentina và nước này đã phải hủy 4.098 con trâu, bò, 5 con heo, 533 con dê cừu trong đợt 1 và trong đợt dịch lần thứ 2 lại tiếp tục tiêu hủy 415 con trâu, bò Tháng 1/2007 dịch LMLM lại nổ ra ở Hàn Quốc và nước này đã phải tiêu hủy 466 con trâu, bò, 2.630 con heo và type O chính là type gây ra trận dịch này

O (Trích dẫn Thái Thị Thủy Phượng, 2000)

Từ năm 1976-1983, có 98 ổ dịch xuất hiện ở các tỉnh phía nam, giáp biên giới Campuchia Từ tháng 5-10 năm 1989, bệnh bùng phát tại 3 huyện của tỉnh Đồng Nai Năm 1990, bệnh xuất hiện ở 4 huyện của tỉnh Bình Thuận Trong giai đoạn này, tổng

số gia súc mắc bệnh lên đến trên 10.000 con (Cục Thú Y, 1990 ).Vi-rút gây bệnh ở Việt Nam giai đoạn 1975-1985 cũng thuộc type O (Lê Minh Chí, 1985)

Theo Lê Minh Chí (1999), giữa tháng 6/1999 bệnh bùng phát tại tỉnh Cao Bằng, sau đó bệnh tiếp tục xuất hiện tại số tỉnh thành trong cả nước Tính đến cuối tháng 12/1999, ở 55 tỉnh thành phố có 120.989 trâu bò bị mắc bệnh và 52 tỉnh có 132.494 heo mắc bệnh

Năm 2000, cả nước có 60 tỉnh thành có bệnh LMLM Dịch xảy ra trên 439 huyện và 3.773 xã làm 472.773 trâu bò và 74.800 heo mắc bệnh Trong thời gian này

có 17.431 trâu bò và 24.624 heo chết và bị hủy (Cục Thú Y, 2001)

Năm 2004, dịch LMLM đã xuất hiện ở 952 xã, phường thuộc 332 quận, huyện ở

48 tỉnh, thành phố với 71.736 trâu bò, 125 dê và 1.858 heo mắc bệnh (Cục Thú Y, 2005)

Đến tháng 11/2004 phát hiện bệnh LMLM type A trên heo nuôi tại 3 tỉnh Tiền Giang, Đồng Nai và Lâm Đồng Gần đây đã phát vi-rút LMLM type A trên các mẫu bệnh phẩm lấy từ các tỉnh: Đắc Lắc, Gia Lai, Quảng Ngãi, Bình Định, Bình Thuận, Ninh Thuận, Khánh Hoà, Long An, Đồng Nai, Lâm Đồng và Đồng Tháp (Cục Thú Y, 2004)

Trong 10 tháng đầu năm 2005, dịch bệnh LMLM xảy ra trên heo ở 25 tỉnh thành phố trong cả nước làm 3.967 con mắc bệnh, chết và tiêu huỷ 1.024 con (Cục Thú Y, 2005)

Đến năm 2006, bệnh LMLM xảy ra trên heo ở 474 xã, phường thuộc 124 quận, huyện của 41 tỉnh thành phố trong cả nước làm 15.398 trâu bò và 14.132 lợn mắc bệnh

Năm 2007, dịch LMLM xảy ra ở 143 phường, xã thuộc 81 quận, huyện của 30 tỉnh, thành phố với 4.608 trâu bò, 230 dê và 5.384 heo mắc bệnh Trong 1/2007, tại xã Vĩnh Lộc B, quận Bình Chánh đã phát hiện 1.057 heo mắc bệnh dương tính với vi-rút LMLM type O (Cục Thú Y, 2007)

Vào giữa tháng 6/2007, Trung tâm Chẩn Đoán Thú Y Trung ương đã cho kết quả xét nghiệm dương tính với vi-rút LMLM type Asia1 từ các mẫu bệnh phẩm của 2 tỉnh Quảng Trị và Thanh Hoá

Đến năm 2008, bệnh LMLM xảy ra ở 47 xã thuộc 25 huyện của 7 tỉnh, thành phố với 1.561 trâu bò và 22 heo mắc bệnh (Cục Thú Y, 2008)

2.3.3 Động vật cảm thụ

™ Trong tự nhiên: vi-rút gây bệnh cho gia súc và động vật hoang dã thuộc loài thú móng chẻ, mẫn cảm nhất là trâu bò, heo, hươu, nai, đến voi, tê giác, hươu cao cổ, nhím, chuột Người hiếm khi bệnh, ngựa và loài cầm thì không mắc bệnh

Mọi lứa tuổi đều mắc bệnh, nhất là ở thú non thường có tử số cao ở dạng cấp tính

™ Trong phòng thí nghiệm: bê non chưa bú mẹ bị tiêm vi-rút sẽ chết trong 38 giờ Chuột lang tiêm nội bì gang bàn chân, sau 12 giờ có sưng, nổi mụn làm bàn chân đau, đi bằng đầu gối Tiêm chuột bạch 7-10 ngày tuổi, vào phúc mạc sẽ làm chuột chết sau 24-36 giờ (Lê Anh Phụng, 2002)

2.3.5 Đường xâm nhập

Chủ yếu là đường tiêu hoá và hô hấp những vết xây xát hoặc vết thương ở da, nhất là ở vú (nơi thường xuất hiện mụn nước sơ phát trong bệnh tự nhiên) cũng là nơi vi-rút xâm nhập vào cơ thể (Nguyễn Lương, 1997)

2.3.6 Phương thức lây lan

™ Lây trực tiếp: thú mẫn cảm tiếp xúc với thú bệnh (nuôi nhốt, vận chuyển chung) Ở heo cần chú ý vì bài xuất nhiều vi-rút, một con heo bệnh bài xuất đến 400 triệu đơn vị gây nhiễm/ ngày gấp 3000 lần so với trâu bò, dê cừu Heo có thể bài thải vi-rút 10 ngày trước khi có triệu chứng

™ Lây gián tiếp: cũng là con đường quan trọng vi-rút có thể lây qua thức ăn, nước uống, dụng cụ chăn nuôi, người chăm sóc, qua phương tiện vận chuyển đặc biệt qua không khí (gió) (Theo Nguyễn Như Pho, 2002)

2.3.7 Cơ chế sinh bệnh

Vi-rút xâm nhập Niêm mạc hầu họng Mụn sơ phát (tại chỗ) 24-48h

Máu (VIREMIA) Sốt

Sơ đồ 2.1: Cơ chế sinh bệnh

Vi-rút xâm nhập vào cơ thể qua các tổn thương ở đường tiêu hoá và thượng bì đường hô hấp.Trước tiên nó nhân lên trong lớp thượng bì của vùng yết hầu, sau đó vi-rút nhân lên trong các mụn nước rồi vào máu gây sốt sẽ lan đến các cơ quan khác trong cơ thể Do tính hướng thượng bì và vi-rút chỉ ưa thích phát triển trên những tế bào thượng bì đang sinh sản của niêm mạc và da như: niêm mạc miệng, da chung quanh móng, da bầu vú

Vi-rút có thể theo tuần hoàn của thú mẹ qua nhau thai gây sẩy thai (Trần Thanh Phong, 1996) Ngoài ra vi-rút có thể theo máu đến tim gây viêm nội mạc hoại tử điểm, ảnh hưởng đến chức năng tim và cuối cùng suy tim rồi chết (tim da cọp) (gặp ở thú non) (Donalsan, 2000)

2.4 Triệu chứng

Con vật kém ăn, ủ rũ, sốt từ 2-3 ngày (40°C- 41°C) Một số bọng nước xuất hiện ở lưỡi, nướu răng, móng chân, kẻ chân, vành móng làm thú ăn không ngon và đi đứng khó khăn Có thể gặp mụn nước ở vú trên thú cái đang cho sữa

Từ 1-2 ngày sau khi hình thành mụn nước sẽ vỡ ra tạo thành một vết loét Các mụn nước trên lưỡi thường tụ thành mảng nên khi bong tróc sẽ bong tróc thành từng mảng lớn gây đau đớn và khó chịu cho thú Khi mụn nước ở miệng, lưỡi, chân vỡ ra

nếu không bị nhiễm trùng kế phát sẽ mau chóng lành vết thương và tạo thành những

sẹo

Riêng với lưỡi thì những gai lưỡi đươc thay thế bằng mô liên kết sợi, còn nếu bị

nhiễm trùng kế phát thì có thể làm cho móng dễ dàng bong tróc ra (Lê Anh Phụng, 2002)

Theo Trần Thanh Phong (1996) heo mắc bệnh thường có các biến chứng sau:

™ Biến chứng ở chân: gặp ở thú lớn hơn thú nhỏ, vi trùng sinh mủ tạo mủ ở

gang bàn chân và vành móng khiến thú khó đi đứng, nếu đứng không vững, trượt té sẽ

làm móng bị bong tróc ra Heo ở thời kỳ hồi phục cố gắng đi bằng đầu gối hay khuỷu

chân do cọ sát nhiều nên mạch máu ở đây bị vỡ, xuất huyết và nhiễm trùng dẫn đến

viêm khớp

Hình 2.2: Móng chẩn bị bong tróc Hình 2.3 Biến chứng ở chân, heo tróc vành

(Nguồn:http//ww.thepigsite.com/… móng và đi bằng đầu gối

/footandmouth- disease-fmd ) (Nguồn:www.aleffgroup.com/ /phtlb-

™ Biến chứng ở vú: các bọng nước ở vú, đặc biệt là ngay lỗ thoát sữa làm sữa

không thoát ra được gây viêm vú cấp tính với các biểu hiện sau: sốt, vú cương mạch,

căng đỏ Sữa trong bầu vú lên men trở nên đặc vàng đôi khi có máu hoặc biến đổi

thành chất trắng với nhiều cục casein bít kín kênh dẫn sữa gây chảy mủ ở vú

Hình 2.4: Vú bị sung huyết Hình 2.5: Vú có loét ở da

™ Viêm tử cung và sẩy thai: heo nái mang thai có thể sẩy do nhiễm trùng làm

một số heo chết ngay sau khi sanh hoặc chết trong bụng mẹ dẫn đến viêm tử cung do heo con chết trong bụng

™ Viêm màng phổi và ho ra máu: gặp ở heo con và heo lứa

™ Viêm màng tim và cơ tim: thường gặp ở heo con

™ Bệnh tích vi thể:

Các tế bào thượng bì gai của da thuộc lớp Stratum Spinosum (tầng Malpighi) bị thoái hoá tròn ra Do tế bào bị vỡ và tích tụ chất dịch phù thũng, các mụn nước được tạo thành là đặc điểm của bệnh Khi kiểm tra thấy sợi cơ tim bị thoái hoá, hoại tử, những trường hợp này thú bệnh thường chết đột ngột do những sợi cơ tim bị thoái hoá (Nguyễn Thị Ánh Tuyết, 2005)

Theo Lê Anh Phụng, ở Việt Nam cần chẩn đoán phân biệt với bệnh viêm bọng

nước trên heo (SVD: Swine Vesicular Disease)

2.6.2 Chẩn đoán ở phòng thí nghiệm

2.6.2.1.Lấy mẫu bệnh phẩm

Theo Lê Anh Phụng (2002) tuỳ trường hợp:

™ Thú bệnh: dịch mụn nước, tốt nhất là mụn chưa vỡ, sữa hoặc máu

™ Thú bệnh chết: máu, cơ tim, hoặc các cơ quan có bệnh tích

™ Thú không có triệu chứng: dịch hầu họng

2.6.2.2 Một số phương pháp có thể được áp dụng để chẩn đoán bệnh LMLM

™ Phân lập vi-rút: dùng môi trường tế bào tuyến giáp, sau 24 giờ quan sát có tình trạng huỷ hoại tế bào (CPE)

™ Phản ứng huyết thanh học

¡ Phản ứng kết hợp bổ thể: dùng kháng huyết thanh đối với mỗi serotype của vi-rút LMLM, chất bổ thể và hồng cầu cừu để phát hiện kháng nguyên trong mẫu bệnh phẩm nghi ngờ Phản ứng dương tính khi gây dung huyết 50% hồng cầu cừu ở hiệu giá pha loãng lớn hơn hoặc bằng 36

¡ Phản ứng trung hoà vi-rút: các dòng tế bào mẫn cảm thường là IB-RS 2, BHK 21 hoặc tế bào một lớp của thận heo hoặc dê con Kháng thể trung hòa được phát hiện sau 4-5 ngày thú mắc bệnh

¡ Phản ứng ELISA kẹp chả (dùng xác định serotype): nguyên tắc là dùng kháng thể thỏ chống lại mỗi serotype vi-rút LMLM được phủ trên bề mặt các giếng của đĩa phản ứng dùng làm kháng thể bẩy Cho hỗn hợp kháng nguyên- kháng thể đã ủ qua đêm ở 4°C vào Nếu trong huyết thanh xét nghiệm có kháng thể thì lượng kháng nguyên tự do còn để gắn vào kháng thể bẩy giảm Sau đó cho kháng thể chống vi-rút chế từ chuột lang vào, tiếp theo cho thêm kháng thể có gắn enzyme chống lại kháng thể chuột lang chế từ thỏ Cuối cùng cho chất tạo màu và sau 15 phút nhỏ dung dịch dừng phản ứng Đem đo ở máy đọc ELISA với bước sóng 492nm

¡ Phản ứng ELISA gián tiếp: dùng để phát hiện kháng thể kháng thành phần protein 3ABC của vi-rút LMLM trên heo

¡ Kỹ thuật PCR: sử dụng kỹ thuật phản ứng nhân gen để nhận biết chính xác RNA của vi-rút

2.7 Phòng chống bệnh LMLM

Đây là bệnh truyền nhiễm được Tổ Chức Thú Y Thế Giới (OIE) xếp vào bảng

A Khi bệnh xảy ra gây thiệt hại nghiêm trọng cho người chăn nuôi và một số ngành kinh tế ở nước ta

2.7.1 Vệ sinh phòng bệnh

Cần làm tốt công tác vệ sinh tiêu độc sát trùng chuồng trại, xử lý chất thải kỹ lưỡng cho thú nuôi trong nước và ở xung quanh vùng biên giới Giết loại gia súc mắc bệnh Tiêu độc sát trùng thường xuyên khu vực phát hiện gia súc bệnh Tiến hành tốt công tác kiểm dịch và kiểm soát giết mổ, các phương tiện vận chuyển động vật, vật dụng và thức ăn chăn nuôi

2.7.2 Phòng bằng vắc – xin

Theo quyết định số 38/2006/QĐ-BNN ngày 16/05/2006 của Bộ Nông Nghiệp

và Phát Triển Nông Thôn về việc ban hành quy định phòng bệnh Lở Mồm Long Móng trên gia súc, ở chương 2 điều 7 quy định về việc tiêm vắc-xin phòng bệnh gồm:

(1) Vùng tiêm phòng

Vùng được tiêm vắc-xin phòng bệnh bao gồm: vùng khống chế, vùng đệm, vùng có dịch xảy ra trong thời gian 2 năm gần đây, vùng có nguy cơ cao

(2) Đối tượng tiêm phòng

Đối tượng tiêm phòng bao gồm:

(a) Trâu, bò, dê, cừu, hươu, nai, heo nái, heo đực giống trên địa bàn vùng tiêm phòng

(b) Tất cả động vật cảm thụ khi đưa ra khỏi tỉnh đều phải tiêm phòng kể cả động vật đó nằm ngoài vùng tiêm phòng quy định trên ( phải sau khi tiêm 14 ngày hoặc đã tiêm phòng và còn miễn dịch)

(3) Thời gian tiêm phòng

(a) Tiêm phòng 2 lần trong một năm, lần thứ nhất cách lần thứ hai sáu tháng, lần thứ hai tiêm vào tháng 9-10

(b) Liều lượng, đường tiêm, quy trình sử dụng vắc-xin theo hướng dẫn của Cục Thú Y và nhà sản xuất

(4) Kinh phí tiêm phòng

Kinh phí tiêm vắc-xin phòng bệnh theo quy định của chính phủ

2.7.3 Các loại vắc-xin LMLM hiện dùng ở Việt Nam

Theo Trần Đình Từ (2000)

(a) Hãng Intervet (Hà Lan) giới thiệu ở Việt Nam 2 loại vắc-xin LMLM có tên thương mại:

• DECIVAC- FMD-ALISA dùng cho thú nhai lại

• DECIVAC- FMD-DOE dùng cho heo và thú nhai lại

(b) Hãng Mérial (Pháp-Mỹ) có 2 loại vắc-xin LMLM là:

•AFTOVAX dùng cho thú nhai lại

• AFTOPOR dùng cho thú nhai lại và heo

Giới thiệu về vắc-xin Aftopor:

Vắc-xin Aftopor là vắc-xin vô hoạt có nhũ dầu làm chất bổ trợ, chống bệnh LMLM ở heo và thú nhai lại (trâu, bò, dê, cừu) do công ty Mérial (Pháp) sản xuất Quy trình tiêm phòng cho heo theo đề nghị của nhà sản xuất

™ Quy trình tiêm phòng vắc-xin Aftopor

Vùng nguy cơ LMLM thấp Vùng nguy cơ LMLM cao Lần tiêm Thú mẹ không

chủng ngừa

Thú mẹ đã chủng ngừa

Thú mẹ không chủng ngừa

Thú mẹ đã chủng ngừa

Lần 1 Toàn đàn từ 14

ngày tuổi

Toàn đàn từ 2,5 tháng tuổi

Toàn đàn từ 14 ngày tuổi

Toàn đàn từ 2 tháng tuổi Lần 2 4-5 tuần sau 4-5 tuần sau 4-5 tuần sau 4-5 tuần sau Tái chủng Mỗi 6 tháng Mỗi 6 tháng Mỗi 4 tháng Mỗi 4 tháng

2.7.4 Biện pháp chống dịch LMLM

Theo quyết định số 64/2005/QĐ – BNN ngày 13/10/2005 Về ban hành mục các bệnh của động vật phải tiêm phòng, phải công bố dịch, phải kiểm tra định kỳ, cấm giết mổ xác chết, bắt buộc giết huỷ, bắt buộc giết mổ Có biện pháp khoanh vùng có dịch, quy định ranh giới của vùng bị uy hiếp và vùng an toàn để áp dụng tiêm vắc – xin, các biện pháp cần thiết nhằm bao vây tiêu diệt khi xảy ra bệnh LMLM

 Tiêu diệt

 Cách ly ngay những con trong chuồng với con mắc bệnh để theo dõi

 Xử lý thú bệnh: thịt cắt miếng 1-2 kg luộc chín chỉ được tiêu thụ trong vùng

có dịch, toàn bộ phủ tạng và máu được tiêu huỷ hoặc chôn sâu

 Tổ chức tiêm phòng vắc – xin ở những vùng trọng điểm, vùng có ổ dịch cũ, vùng bị uy hiếp theo kế hoạch hàng năm hoặc đột xuất (Lê Anh Phụng,1996)

2.8 Những quy định vùng An Toàn Dịch (Bệnh) và cơ sở An Toàn Dịch (Bệnh) động vật

Để phục vụ cho tiêu dùng trong nước (động vật và sản phẩm động vật), cần phải xây dựng vùng an toàn dịch (ATD) và cơ sở ATD, trước mắt là khống chế tiến đến thanh toán hai bệnh chủ yếu là LMLM và Dịch Tả Heo (DTH), hạn chế các bệnh truyền nhiễm khác xảy ra (căn cứ quyết định số: 66/2008/QĐ- BNN ngày 26/5/2008 của Bộ trưởng Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn (BNN và PTNT) về việc ban hành quy định xây dựng vùng ATD bệnh, cơ sở ATD bệnh động vật)

2.8.1 Những quy định chung

™ Vùng an toàn dịch bệnh: là vùng lãnh thổ (một huyện hay nhiều huyện; một tỉnh hay nhiều tỉnh) được xác định, ở đó không xảy ra ca bệnh nào trong thời gian quy

định cho từng bệnh hoặc nhiều bệnh và các hoạt động về thú y phải đảm bảo kiểm soát được dịch bệnh, kinh doanh, vận chuyển động vật, sản phẩm động vật, kiểm tra vệ sinh thú y giết mổ, Kiểm soát được nguồn động vật và sản phẩm động vật trong vùng ATD, cơ sở ATD

™ Cơ sở an toàn dịch bệnh: là cơ sở chăn nuôi gia súc, gia cầm (trại, nông trường, xí nghiệp) hoặc một xã, một phường mà ở đó không xảy ra ca bệnh nào trong thời gian quy định cho từng bệnh và các hoạt động chăn nuôi, thú y đảm bảo kiểm soát được dịch bệnh, kiểm soát được việc xuất, nhập động vật, sản phẩm động vật

™ Giám sát dịch bệnh: bao gồm việc theo dõi kiểm tra đánh giá tính chất, nguyên nhân xuất hiện, phương thức lây lan bệnh trong suốt quá trình chăn nuôi, vận chuyển, giết mổ động vật, sơ chế, kinh doanh sản phẩm động vật

™ Điều kiện vệ sinh thú y: là những yêu cầu, tiêu chuẩn về địa điểm, vị trí trang trại, chuồng nuôi, kho bảo quản, không khí, nước, môi trường; con giống, thức ăn chăn nuôi; dụng cụ chăn nuôi, chất thải theo quy định của Nhà Nước (Tài liệu Cục Thú Y, 2008)

2.8.2 Chương trình An Toàn Dịch của Chi Cục Thú Y Thành Phố

Thực hiện chương trình an toàn dịch bệnh của Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn (Bộ NN & PTNT), năm 2000 Chi Cục Thú Y TP.HCM Chương trình được thực hiện trong 5 năm (2006 – 2010)

Để thực hiện chương trình này vừa qua Chi Cục đã tiến hành các biện pháp như sau:

- Điều tra tình hình dịch tễ các quận huyện trên địa bàn TP.HCM như: Quận 12, Bình Chánh, Hóc Môn, Củ Chi, từ đó tổng hợp kết quả điều tra được để làm cơ sở xây dựng vùng ATD và cơ sở ATD Qua kết quả điều tra được để làm cơ sở xây dựng vùng ATD và cơ sở ATD phải đạt các điều kiện sau:

+ Tỷ lệ tiêm phòng phải đạt 100%

+ Tỷ lệ đáp ứng miễn dịch >90%

+ Không có trường hợp nhiễm bệnh LMLM

Sau đó tiến hành các biện pháp tiêm phòng bắc buộc bằng vắc-xin đối với bệnh LMLM heo trong địa bàn như sau:

+ Tiêm phòng cho heo con 21 ngày tuổi (khi heo chưa được tiêm phòng xin) và tiêm phòng nhắc lại sau 30 ngày

vắc-+ Heo con của heo mẹ đã được tiêm phòng thì tiêm phòng khi heo được 30-45 ngày tuổi

+ Heo nái tiêm phòng trước khi phối giống 3 tuần hoặc trước khi đẻ 4 tuần, tiêm phòng nhắc lại sau 6 tháng kể từ ngày tiêm phòng lần trước

+ Heo đực giống phải được tiêm phòng theo lịch tiêm phòng hằng năm, tiêm

phòng nhắc lại sau 6 tháng kể từ ngày tiêm phòng lần trước

2.8.3 Chẩn đoán xét nghiệm đối với vùng và cơ sở An Toàn Dịch bệnh

Sau thời gian tiêm phòng ít nhất là 15 ngày bắt đầu tiến hành lấy mẫu huyết thanh xét nghiệm:

- Phát hiện thú nhiễm bệnh LMLM bằng kỹ thuật ELISA

Bộ kit ELISA – Chekit – 3ABC Po (Bommeki Diagnostics, Hà Lan): Phát hiện kháng thể kháng thành phần protein 3ABC của vi-rút LMLM trên heo

- Đánh giá tỷ lệ bảo hộ của vắc- xin LMLM bằng kỹ thuật ELISA: ELISA kit – FMDV serotype O (Pirbright, Anh Quốc): Xác định kháng thể kháng vi-rút LMLM serotype O

- Tại các vùng và cơ sở ATD bệnh khi có gia súc bệnh chết mà nghi ngờ là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm thì chủ cơ sở chăn nuôi, Ban Chăn Nuôi Thú Y xã phải báo cáo cho trạm thú y huyện Sau khi thú y huyện kiểm tra, xác định là bệnh được đăng ký ATD bệnh phải lấy mẫu gởi chẩn đoán (đối với bệnh LMLM), sau đó tiêu hủy gia súc mắc bệnh Trong trường hợp nghi ngờ bệnh LMLM, sau khi lấy mẫu bệnh phẩm gởi xét nghiệm phải cách ly con vật cho đến khi có kết quả trả lời của phòng thí nghiệm, nếu dương tính thì tiến hành tiêu hủy, nếu âm tính thì cho chăn nuôi bình thường (Tài liệu Cục Thú Y, 2008)

Chương 3

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm

Thiết bị: tủ ấm, tủ lạnh, máy ly tâm, máy ủ, máy đọc ELISA, máy vi tính

Dụng cụ: găng tay, kéo, bông thấm, ống tiêm, bình trữ lạnh, ống đong chia độ, micropipette, vĩ 96 giếng

3.3 Nội dung nghiên cứu

™ Chỉ tiêu theo dõi:

¡ Tỷ lệ bảo hộ chung đối với vi-rút lở mồm long móng serotype O trên heo: ở các cơ sở chăn nuôi, theo nhóm sinh sản, theo quy mô chăn nuôi tại địa bàn khảo sát

¡ Tỷ lệ nhiễm bệnh lở mồm long móng trên heo: ở các cơ sở chăn nuôi, theo nhóm sinh sản, theo quy mô chăn nuôi tại địa bàn khảo sát

¡ Tỷ lệ bảo hộ do tiêm phòng và tỷ lệ nhiễm bệnh lở mồm long móng trên heo:

ở các cơ sở chăn nuôi, theo nhóm sinh sản, theo quy mô chăn nuôi tại địa bàn khảo sát

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Phương pháp lấy mẫu xét nghiệm

Mẫu huyết thanh: Sau khi cầm cột thú, dùng cồn 70° sát trùng vị trí lấy máu, dùng ống tiêm lấy máu ở tĩnh mạch tai hoặc tĩnh mạch chủ trước (khoảng 3-4 ml máu), chờ máu đông khô tự nhiên (30-40 phút) rồi cho vào bình có đá Trên mỗi mẫu phải có

ký hiệu riêng để tránh nhầm lẫn Sau khi về phòng xét nghiệm, mẫu được ly tâm để lấy huyết thanh cho vào eppendorf

Bảo quản mẫu:

- Mẫu tiến hành xét nghiệm ngay: bảo quản ở 2-8°C

- Mẫu chưa tiến hành xét nghiệm ngay: bảo quản lạnh ở -70°C

3.4.2 Bố trí lấy mẫu huyết thanh để xét nghiệm

Để tính toán số mẫu cần lấy chúng tôi dựa vào phần mềm Win-episcope 2.0 với các thông số như sau: tỷ lệ ước đoán lưu hành bệnh là 10%, tỷ lệ bảo hộ là 80%, sai số

là 5%, độ tin cậy là 95% (Theo Trạm Chẩn Đoán, Xét Nghiệm và Điều Trị, Chi Cục Thú Y Thành Phố Hồ Chí Minh)

Số lượng mẫu huyết thanh cần khảo sát được trình bày ở bảng 3.1

Bảng 3.1: Bố trí lấy mẫu huyết thanh cần cho xét nghiệm LMLM

Huyện Cơ sở Số mẫu huyết thanh heo

3.4.3.1 Kỹ thuật ELISA phát hiện kháng thể kháng vi-rút LMLM serotype O

Nguyên tắc: kỹ thuật ELISA ngăn trở để phát hiện kháng thể có trong huyết

thanh thú Nguyên tắc kỹ thuật này như sau:

- Sử dụng huyết thanh thỏ đặc hiệu kháng lại vi-rút FMD serotype O được gọi

là kháng thể bắt giữ vào giếng polystyrene (đĩa phản ứng)

- Kháng nguyên FMD serotype O đặc hiệu vô hoạt và huyết thanh thú xét nghiệm đươc pha loãng 1/25 kết hợp với nhau Nếu trong huyết thanh thú có kháng thể vi-rút FMD serotype O sẽ tạo thành phức hợp kháng nguyên – kháng thể làm giảm lượng kháng nguyên tự do và tuỳ lượng kháng thể trong huyết thanh mà lượng kháng nguyên tự do nhiều hay ít

- Cho hỗn hợp kháng nguyên - huyết thanh vào đĩa phản ứng và lượng kháng nguyên còn lại sẽ gắn với kháng thể dưới đáy giếng và được giữ lại sau khi rửa giếng

- Cho kháng thể kháng vi-rút LMLM chế từ chuột lang vào đĩa phản ứng, kháng thể chuột lang sẽ gắn kết với hỗn hợp kháng nguyên – kháng thể được giữ lại ở đáy giếng

- Cho hỗn hợp (conjugate gồm kháng thể IgG chuột lang có gắn với enzyme horseradish peroxidase HRP) vào giếng phản ứng và được giữ lại nếu có kháng thể chuột lang và sẽ tạo màu quan sát được khi cho kết hợp với dung dịch cơ chất/ chất tạo màu (substrate/ chromogen)

- Tuỳ lượng kháng nguyên mà có mức độ đậm nhạt màu khác nhau khi so sánh với các mẫu đối chứng chỉ chứa kháng nguyên tự do (cường độ màu được đọc bằng máy đọc ELISA với bước sóng 492nm) Màu càng đậm chứng tỏ kháng nguyên tự do càng nhiều và ngược lại

Lấy ra để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút

Ủ 1-8oC qua đêm Ủ 1-8oC qua đêm

Rửa đĩa phản ứng 3 lần với dung dịch rửa PBS Cho 50 μ l hỗn hợp huyết thanh và kháng nguyên từ đĩa ủ sang đĩa phản ứng (dán kín đĩa phản ứng lại)

Ủ và lắc 370C/60 phút Rửa đĩa phản ứng 3 lần với dung dịch rửa PBS (300 μ l/lần)

Cho 50 μ l kháng thể phát hiện (KT chuột lang) vào đĩa phản ứng

Ủ và lắc 370C/60 phút Cho 50 μ l conjugate (kháng kháng thể IgG chuột lang có

gắn enzyme horseradish peroxidase) vào đĩa phản ứng

Ủ và lắc 370C/60 phút Rửa đĩa phản ứng 3 lần với dung dịch rửa PBS (300 μ l/lần)

Cho 50 μ l dung dịch tạo màu phản ứng

Ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút Cho 50 μ l dung dịch dừng phản ứng (H2SO4 1,25M)

Đo mật độ quang (bước sóng 492nm)

Tính toán kết quả

Sơ đồ 3.1: Tóm tắt qui trình phát hiện kháng thể kháng virus LMLM serotype O

Hình 2.1: Hình vẽ minh họa cơ chế phản ứng ELISA

Kháng thể trong huyết thanh xét nghiệm ủ với kháng nguyên (virus FMD serotype O) Kháng thể virus FMD chế từ thỏ

Cho kháng thể kháng virus LMLM chế từ chuột lang

Cho conjugate (kháng kháng thể chuột lang có gắn enzyme)

Nếu có kháng thể chuột lang thì conjugate sẽ được giữ lại

Cho chất tạo màu phản ứng vào Tùy hàm lượng kháng nguyên có mặt mà mức độ hiện màu khác nhau

Hình 3.1: Cơ chế phản ứng phát hiện kháng thể kháng vi-rút LMLM serotype O