Ứng dụng chỉ thị phân tử xây dựng cây phát sinh chủng loài cam bố hạ

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM BÙI THỊ NGA Tên đề tài: ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ XÂY DỰNG CÂY PHÁT SINH CHỦNG LOÀI CAM BỐ HẠ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Ngành : Cơng nghệ sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2013 - 2017 Thái Nguyên - năm 2017 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM BÙI THỊ NGA Tên đề tài: ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ XÂY DỰNG CÂY PHÁT SINH CHỦNG LOÀI CAM BỐ HẠ KHÓA LUẬN TỐT NGIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Ngành : Công nghệ sinh học Lớp : 45 - CNSH Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2013 - 2017 Giảng viên hƣớng dẫn : TS Nguyễn Văn Duy TS Nguyễn Tiến Dũng Thái Nguyên - năm 2017 i LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình học tập nghiên cứu để hồn thành khóa luận tốt nghiệp ngồi nỗ lực, cố gắng thân, nhận đƣợc giúp đỡ, hƣớng dẫn, bảo động viên thầy cơ, bạn bè gia đình Nhân dịp hồn thành khóa luận: Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tri ân sâu sắc thầy cô Trƣờng Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, đặc biệt ban lãnh đạo khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm trƣờng tạo điều kiện cho thực tập tốt nghiệp khoa Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo TS Nguyễn Văn Duy tận tình hƣớng dẫn, trực tiếp bảo kĩ làm việc giúp đỡ suốt thời gian thực đề tài hồn thành khố luận Tơi xin gửi lời cảm ơn tới TS Nguyễn Tiến Dũng cán phòng thí nghiệm - Thực hành Sinh học phân tử thầy cô Khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm trƣờng Đại học Nông Lâm hƣớng dẫn kĩ làm việc, tận tình bảo, tạo điều kiện tốt để học tập nghiên cứu Cuối xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, bạn bè ngƣời bên cạnh động viên, giúp đỡ tơi suốt thời gian thực khố luận Trong trình thực tập, nhƣ trình làm báo cáo thực tập, khó tránh khỏi sai sót Đồng thời trình độ lí luận nhƣ kinh nghiệm thực tiễn hạn chế nên báo cáo khơng thể tránh khỏi thiếu sót, tơi mong nhận đƣợc ý kiến đóng góp thầy, để báo cáo đƣợc hồn thiện Tơi xin chân thành cảm ơn! Thái nguyên, ngày tháng Sinh viên Bùi Thị Nga năm 2017 ii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Thành phần dinh dƣỡng 100 gram cam tƣơi Bảng 2.2: Diện tích, suất, sản lƣợng cam giới 10 Bảng 2.3: Tình hình sản xuất cam số nƣớc vùng châu Á năm 2014 11 Bảng 2.4: Tình hình sản xuất cam, quýt nƣớc ta giai đoạn 2010 - 2015 12 Bảng 3.1: Kế t quả thu thâ ̣p mẫu 24 Bảng 3.2: Trình tự mồi ISSR sử dụng 25 Bảng 3.3: Các thiết bị sử dụng nghiên cứu 25 Bảng 3.4: Danh mục loại hóa chất sử dụng đề tài 26 Bảng 3.5: Thành phần phản ứng ISSR 28 Bảng 3.6: Chu trình nhiê ̣t phản ƣ́ng PCR 29 Bảng 4.1: Kết xác định nồng độ DNA tổng số mẫu cam thu thập 31 Bảng 4.2: Thống kê sản phẩm PCR - ISSR mồi T1 33 Bảng 4.3: Thống kê sản phẩm PCR - ISSR mồi T2 35 Bảng 4.4: Thống kê sản phẩm PCR - ISSR mồi T3 37 Bảng 4.5: Bảng tổng hợp phân đoạn sản phẩm PCR 38 Bảng 4.6: Hệ số tƣơng đồng di truyền cuả 16 mẫu cam nghiên cứu 39 iii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 3.1: Minh họa phân đoạn đồng hình, phân đoạn đa hình PCR - ISSR 29 Hình 4.1: Hình ảnh kết điện di kiểm tra DNA tổng số mẫu cam 30 Hình 4.2: Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR - ISSR mồi T1 32 Hình 4.3: Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR - ISSR mồi T2 34 Hình 4.4: Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR - ISSR mồi T3 36 Hình 4.5: Sơ đồ mơ tả quan hệ di truyền 16 mẫu cam nghiên cứu 40 iv DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism Bp Base pair - Cặp bazơ nitơ cs Cộng CTAB Cetyl trimetyl ammonium bromide ctv Cộng tác viên DNA Deoxyribonucleic acid EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid et al et alii (và ngƣời khác) FAO Food and Agriculture Organization ISSR Inter - simple sequence repeat KT Kích thƣớc NTSYSpc Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System PCR Polymerase Chain Reaction RAPD Random Amplified Polymorphic DNA RFLP Restriction fragment length polymorphism SSR Simple sequence repeat TAE Tris - acetate - EDTA TE Tris - EDTA UPGMA Unweighted Pair Group Method with Arithmetic VAC Vƣờn ao chuồng VACR Vƣờn ao chuồng ruộng v MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC CÁC BẢNG ii DANH MỤC CÁC HÌNH iii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT iv MỤC LỤC v Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài 1.2.1 Mục tiêu tổng quát 1.2.2 Mục tiêu cụ thể 1.3 Ý nghĩa khoa học thực tiễn 1.3.1 Ý nghĩa khoa học đề tài 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn đề tài Phần TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan cam, quýt 2.1.1 Nguồn gốc phân loại 2.1.2 Giá trị cam, quýt 2.1.3 Cây cam Bố Hạ 2.2 Tình hình sản xuất cam, quýt giới Việt Nam 10 2.2.1 Tình hình sản xuất cam, quýt giới 10 2.2.2 Tình hình sản xuất cam, quýt Việt Nam 12 2.3 Các kĩ thuật sinh học phân tử đánh giá đa dạng di truyền 12 2.3.1 Chỉ thị di truyền, thị phân tử thị DNA 12 2.3.2 Kĩ thuật RAPD 13 2.3.3 Kĩ thuật ISSR 16 2.3.4 Một số kĩ thuật khác 17 2.4 Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền cam, quýt giới 18 2.4.1 Tình hình nghiên cứu giới 18 2.4.2 Tình hình nghiên cứu nƣớc 22 2.4.3 Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền số loài khác 22 vi Phần ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 3.1 Đối tƣợng nghiên cứu phạm vi nghiên cứu 24 3.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 24 3.1.2 Phạm vi nghiên cứu 25 3.2 Vật liệu, thiết bị hóa chất nghiên cứu 25 3.2.1 Vật liệu nghiên cứu 25 3.2.2 Thiết bị nghiên cứu 25 3.2.3 Hóa chất 25 3.3 Nội dung nghiên cứu 26 3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 26 3.4.1 Phƣơng pháp tách chiế t DNA 26 3.4.2 Phƣơng pháp xác đinh ̣ kiểm tra sản phẩm DNA tổ ng số 27 3.4.3 Phƣơng pháp ISSR 28 3.4.4 Phƣơng pháp phân tić h đa hin ̀ h 29 3.5 Các phƣơng pháp xử lí số liệu 29 Phần KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 30 4.1 Kết tách chiết DNA tổng số từ mẫu cam thu thập 30 4.2 Kết so sánh cam Bố Hạ với giống cam khác thị phân tử ISSR 32 4.2.1 Kết so sánh cam Bố Hạ với giống cam khác thị ISSR - T1 32 4.2.2 Kết so sánh cam Bố Hạ với giống cam khác thị ISSR - T2 34 4.2.3 Kết so sánh cam Bố Hạ với giống cam khác thị ISSR - T3 36 4.3 Kết đánh giá hệ số di truyền xây dựng phát sinh chủng loài mẫu cam phân tích 38 Phần KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43 5.1 Kết luận 43 5.2 Kiến nghị 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Cam, quýt loại ăn phổ biến giới nói chung Viê ̣t Nam nói riêng Cam, quýt có lịch sử phát triển lâu đời đƣợc trồng khắ p các vùng sinh thái của thế giới Ở nƣớc ta cam đƣợc trồng phổ biến tỉnh nhƣ: Tuyên Quang (cam sành Hàm Yên ), Bắ c Giang (cam Bố Ha )̣ , Hà Giang (cam sành), Hòa Bình (cam Cao Phong ), Nghê ̣ An (cam Vinh), Hà Tĩnh (cam Bù ), Yên Bái (cam canh), quýt tiếng đƣợc trồng Bắc Kạn viê ̣c trồ ng cam , quýt đã mang la ̣i thu nhâ ̣p cao cho nông dân đóng góp mô ̣t phầ n k hông nhỏ vào viê ̣c phát triể n kinh tế chung của cả nƣớc, nâng cao chấ t lƣơ ṇ g cuô ̣c số ng cho ngƣời dân Mỡi vùng địa lí khác sẽ phát triển giống cam khác ảnh hƣởng của điề u kiê ̣n tƣ̣ nhiên nhƣ: vị trí, đấ t đai, diê ̣n tić h, khí hậu, sơng ngòi, biể n q trình chọn lọc tự nhiên tạo nên đa dạng mặt di truyền cho giống cam Đánh giá đa dạng di truyền hữu ích cho việc nghiên cứu thử nghiệm lí thuyết chất tác động lên biến thể gene, nguyên liệu tiến hố, nhƣ cơng cụ để tìm hiểu mối quan hệ sinh vật, đa dạng nhƣ khác chúng Để có thể đánh giá đô ̣ tƣơng đồ ng di truyề n của các giố ng cam có nhiề u cá ch nhƣ: sƣ̉ du ̣ng chỉ thi ̣hiǹ h thái (kiể u hin ̀ h: màu sắc, kích thƣớc, hàm lƣợng…), thị sinh hóa (protein: dạng khác enzyme ) nhiên các đă ̣c điể m hình thái đƣợc hình thành từ kết tƣơng tác giữakiể u gene và môi trƣờng nên chiụ ảnh hƣởng nhiều từ mơi trƣờng , thị sinh hóa có nhiều hạn chế số lƣợng enzyme có thể phát hiê ̣n đƣơ ̣c gel , enzyme có cấ u tạo đa phân tƣ̉ kế t phức tạp phụ thuộc o môi trƣờng và mơ nghiên cƣ́u v ậy đƣợc sử dụng đánh giá đa dạng Các thị phân tử có độ xác cao , nhanh chóng và không phu ̣ thuô ̣c vào các đă ̣c điể m hin ̀ h thái Hiê ̣n có mô ̣t số phƣơng pháp đƣơ ̣c sƣ̉ du ̣ng đánh giá đa da ̣ng di truyề n cam nhƣ : ISSR, SSR, RAPD, RFLP Trong số đó RAPD và ISSR kĩ thuâ ̣t đƣơ ̣c sƣ̉ du ̣ng rô ̣ng raĩ Qua thời gian vùng cam Bố Hạ với giống cam quý đặc sản dần bị thối hóa, mai nhiều nguyên nhân Viê ̣c đánh giá đa hin ̀ h di truyề n , xây dựng phát sinh chủng loài cam là cầ n thiế t nhằ m cung cấ p các thông tin , ứng dụng công tác nghiên cứu chọn giống , sƣ̉ du ̣ng hơ ̣p lí bảo tồn nguồn gene quý tƣ̣ nhiên và sản xuấ t Chính vậy, để đánh giá đƣợc đa dạng di truyền , xây dƣ̣ng phát sinh chủng loài cam B ố Hạ so với giống cam khác điạ bàn tỉnh Tuyên Quang, Bắc Giang, Thái Nguyên tiế n hành thƣ̣c hiê ̣n đề tài : “ Ƣ́ng du ̣ng thị phân tử xây dựng phát sinh chủng loài cam Bố Hạ” 1.2 Mục tiêu đề tài 1.2.1 Mục tiêu tổng quát So sánh cam Bố Hạ với giống cam Hàm Yên (Tuyên Quang) thị phân tử, xây dựng phát sinh chủng loài cam Bố Hạ 1.2.2 Mục tiêu cụ thể - Tách chiết đƣợc DNA tổng số từ cam đủ điều kiện để thực phân tích sinh học phân tử - Ứng dụng đƣợc thị phân tử DNA phân tích mối quan hệ di truyền cam Bố Hạ so với cam Hàm Yên (Tuyên Quang) - Xây dƣ̣ng đƣơ ̣c phát sinh chủng loài tƣ̀ các giố ng nghiên cƣ́u 1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 1.3.1 Ý nghĩa khoa học đề tài - Cung cấp thông tin khoa học so sánh cam Bố Hạ với cam Hàm Yên (Tuyên Quang) thị phân tử DNA - Tạo tiền đề cho việc nghiên cứu bảo tồn, khai thác phát triển cam Bố Hạ, Bắc Giang 36 4.2.3 Kết so sánh cam Bố Hạ với giống cam khác thị ISSR - T3 Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR sử dụng mồi ISSR - T3 mẫu phân tích thể hình 4.4 bảng 4.4 dƣới đây: Hình 4.4: Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR - ISSR mồi T3 (L: Ladder 1kb, 1: 1, 2: 6, 3: 9, 4: 12, 5: 21, 6: 22, 7: CSI1, 8: CSI2, 9: CSI3, 10: CSI4, 11: CSI5, 12: CBH, 13: BH, 14: OC3, 15: OC4, 16: OV5) 37 Bảng 4.4: Thống kê sản phẩm PCR - ISSR mồi T3 Mồi T3 Mẫu Lần Lần Lần băng (260, 480, 700, 1100, băng (260, 480, 750, băng (260, 480, 750, 1400, 1500 bp) 1500 bp) 1500 bp) băng (260, 375, 480, 700, băng (700, 1100 bp) băng (750, 1500 bp) 750bp) băng (750 bp) băng (375, 480, 1100 bp) băng (1500 bp) 12 băng băng băng 21 băng (480, 700 bp) băng (700, 750 bp) băng 22 băng (375 bp, 480, 700 băng (260, 750, 1100 bp) băng (1500 bp) bp) CSI1 băng (260 bp) băng (480, 700, 750 bp) băng (750, 1400 bp) CSI2 băng (375, 480, 700 bp) băng (375, 1400 bp) băng (375, 1400 bp) CSI3 băng (260, 480 bp) 3băng (480, 750, 1400 bp) băng (700, 1400 bp) CSI4 băng (480, 700 bp) băng (260, 480, 1100, băng (480, 750, 1100, 1500 bp) 1400 bp) băng (700, 750 bp) băng (1100bp) CSI5 băng (260, 480 bp) CBH băng (260, 480, 700, 1500 băng (480, 700, 1100 bp) 1băng (1400 bp) bp) BH băng (375, 480, 700 bp) băng (750, 1400 bp) OC3 băng (480, 700, 750, 1400 băng (1100 bp) bp) OC4 băng (375, 700, 750 bp) băng (480, 1100 bp) băng (480, 700, 750, 1400 bp) băng (480, 1100, 1400 băng (375, 480, 1400 bp) bp) OV5 băng (700, 1500, 2000 bp) băng (700, 750, 1100, băng (700, 750, 1100 bp) 1400 bp) Kết điện di kết thống kê bảng 4.4 cho thấy, mồi ISSR - T3 có phân đoạn DNA đƣợc khuếch đại với kích thƣớc dao động từ 260 - 1500 bp Ở phân đoạn 260 bp có 10 mẫu có sản phẩm khuếch đại (đƣờng chạy số 2, 3, 6, 7, 8, 38 9, 10, 11, 12 13) Phân đoạn có kích thƣớc 375 bp có mẫu xuất băng vạch (đƣờng chạy số 3, 4, 7) Phân đoạn 480 bp có 12 mẫu đƣợc khuếch đại (đƣờng chạy số 2, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 16) Ở phân đoạn lớn 700 bp 13 mẫu đƣợc khuếch đại (đƣờng chạy số 2, 3, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 16 17) Phân đoạn 750 bp có mẫu khơng có sản phẩm khuếch đại (đƣờng chạy số 5) Phân đoạn 1100 bp, 10 mẫu xuất băng vạch (đƣờng chạy số 2, 3, 4, 7, 12, 13, 14, 15, 16 17) Phân đoạn 1400 bp đƣờng chạy từ số đến 17 có băng vạch tƣơng ứng với 10 mẫu đƣợc khuếch đại Phân đoạn lớn 1500 bp, mẫu xuất băng vạch (đƣờng chạy số 2, 3, 4, 7, 11 13) Từ kết phân tích nhận thấy mồi ISSR - T3 thể đƣợc đa hình cao (chiếm 100%) với mẫu nghiên cứu 4.3 Kết đánh giá hệ số di truyền và xây dựng phát sinh chủng loài các mẫu cam phân tích Từ kết phân tích đa hình di truyền dựa thị phân tử ISSR trên, tổng hợp phân đoạn sản phẩm PCR mẫu cam phân tích nhƣ bảng sau: Bảng 4.5: Bảng tổng hợp các phân đoạn sản phẩm PCR Mồi T1 Mồi T2 Mồi T3 KT (bp) 12 21 22 SCI1 SCI2 SCI3 Mẫu SCI4 SCI5 CBH BH OC3 OC4 OV5 250 + + + + - + - + - + - + + - + + 500 + + + + + + + + + + + + + + + + 750 + + + - - + - - + + + + + + + - 1000 + + + - - + + + + + - - - - - + 1500 + - + - - + - - - + - - - + - - 2000 + - + - - + - - - - - - - - - - 500 + + + + + + + + + + + + + + + + 1000 + - - - + - - - - - - - - - - - 260 + + - - + + + + + + + + - - - - 375 - + + - + + - - - - - - - - - - 480 + - + - - + + + + + + + + + + - 700 + + - - + + + + + - + + + + + + 750 + + + - + + + + + + + + + + + + 1100 + + + - - + - - - + + + + + + + 1400 - - - - - - + + + + + + + + + + 1500 + + + - - + - - - - + - - - - Chú thích: + Xuất băng vạch; - Khơng có băng vạch 39 Từ bảng tổng hợp trên, sử dụng phần mềm NTSYSpc phiên 2.1 xây dựng đƣợc bảng hệ số tƣơng đồng di truyền phát sinh chủng lồi mẫu cam phân tích nhƣ sau: Bảng 4.6: Hệ số tƣơng đồng di truyền cuả 16 mẫu cam nghiên cứu Giống (Kí 12 21 22 CSI1 CSI2 CSI3 CSI4 CSI5 CBH BH OC3 OC4 OV5 hiệu) 1,00 0,68 1,00 0,75 0,68 1,00 12 0,31 0,50 0,43 1,00 21 0,37 0,68 0,37 0,68 1,00 22 0,93 0,75 0,81 0,25 0,43 1,00 CSI1 0,50 0,56 0,37 0,56 0,75 0,43 1,00 CSI2 0,56 0,62 0,43 0,62 0,68 0,50 0,93 1,00 CSI3 0,56 0,62 0,43 0,50 0,68 0,50 0,93 0,87 1,00 CSI4 0,75 0,68 0,62 0,43 0,50 0,68 0,75 0,81 0,81 1,00 CSI5 0,43 0,50 0,31 0,62 0,68 0,37 0,81 0,75 0,87 0,68 1,00 CBH 0,50 0,56 0,50 0,68 0,62 0,43 0,75 0,81 0,68 0,62 0,68 1,00 BH 0,68 0,75 0,56 0,50 0,56 0,62 0,68 0,75 0,75 0,81 0,75 0,81 1,00 OC3 0,56 0,50 0,56 0,50 0,56 0,50 0,68 0,62 0,75 0,68 0,75 0,68 0,75 1,00 OC4 0,56 0,62 0,56 0,62 0,56 0,50 0,68 0,75 0,75 0,68 0,75 0,81 0,87 0,87 1,00 OV5 0,50 0,68 0,50 0,68 0,62 0,43 0,75 0,81 0,68 0,62 0,56 0,75 0,68 0,68 0,81 1,00 40 Hình 4.5: Sơ đồ mơ tả quan hệ di truyền 16 mẫu cam nghiên cứu (Coefficient: Hệ số tƣơng đồng di truyền) Cây phân loại hình 4.4 đƣợc tạo phân tích 16 mẫu nghiên cứu với mồi ISSR cho thấy hệ số tƣơng đồng di truyền mẫu cam nghiên cứu dao động khoảng từ 0,52 - 0,93; chứng tỏ mẫu cam có đa hình cao mặt di truyền Sơ đồ cho thấy 16 mẫu cam đƣợc chia làm nhóm chính: Nhóm I: Là mẫu (1, 6, 22) cam sành Hàm Yên So đƣợc tạo phƣơng pháp vi ghép đỉnh sinh trƣởng năm 2015 Nhóm nằm riêng biệt so với mẫu cam lại Khoảng cách di truyền so với mẫu cam lại nhóm II 0,48 Nhóm II: Bao gồm 12 mẫu cam Trong nhóm tiếp tục đƣợc chia thành nhóm phụ, bao gồm nhóm phụ C mẫu cam sành So đƣợc tạo phƣơng pháp vi ghép đỉnh sinh trƣởng năm 2001 (mẫu 12 21) nhóm phụ D mẫu 41 cam Bố Hạ cam Vinh trồng Thái Nguyên, với sai khác di truyền 0,41 (hệ số tƣơng đồng di truyền 0,59) - Nhóm phụ I: Bao gồm mẫu cam đƣợc tạo phƣơng pháp vi ghép đỉnh sinh trƣởng năm 2001 (mẫu 12 21) - Nhóm phụ II: Bao gồm 10 mẫu cam chủ yếu mẫu cam Bố Hạ, đƣợc chia tiếp thành cụm (cụm e cụm f) có sai khác di truyền 0,28 (hệ số tƣơng đồng di truyền 0,72) + Cụm e: Bao gồm mẫu cam sành Bố Hạ (CSI1 - CSI5) Mẫu CSI4 đƣợc chia thành nhánh khác biệt với mẫu lại hệ số tƣơng đồng di truyền 0,73 sai khác ảnh hƣởng trình chọn lọc tự nhiên dẫn tới thay đổi kiểu gene Tiếp theo mẫu CSI5 lại đƣợc chia thành nhánh khác biệt với mẫu CSI1, CSI2 CSI3 (hệ số tƣơng đồng di truyền 0,81) Cuối mẫu lại đƣợc chia thành hai nhánh nhỏ với hệ số tƣơng đồng di truyền 0,89 CSI1 CSI2 có hệ số tƣơng đồng lớn cụm e 0,93 + Cụm f: Bao gồm mẫu (4 mẫu cam chanh mẫu cam Vinh) Cụm f đƣợc chia thành nhánh với sai khác di truyền 0,27 (hệ số tƣơng đồng di truyền 0,73) Nhánh bao gồm mẫu cam chanh (CBH, BH, OC3 OC4) Nhánh lại đƣợc chia nhỏ thành nhánh với hệ số tƣơng đồng di truyền 0,77 mẫu CBH (cam chanh Bố Hạ) nằm tách biệt với mẫu lại với hệ sai khác 0,23 Ba mẫu BH, OC4 OC3 tiếp tục đƣợc chia thành nhánh với hệ số sai khác di truyền 0,19 (hệ số tƣơng đồng di truyền 0,81) Mẫu cam OC3 (cam chanh Hàm Yên) nằm nhánh khác biệt với OC4 BH (cam chanh Bố Hạ) Nhánh thứ hai cụm f mẫu cam Vinh trồng Thái Nguyên (OV5) Từ kết cho thấy cam sành Bố Hạ với cam sành Hàm Yên - Tuyên Quang đƣợc tạo từ phƣơng pháp vi ghép đỉnh sinh trƣởng năm 2015 thuộc hai nhánh phát sinh chủng lồi khác nhau, nhƣng lại có quan hệ gần gũi với cam sành Hàm Yên tạo phƣơng pháp vi ghép đỉnh sinh trƣởng năm 2001 (hệ số tƣơng đồng di truyền 0,60) Điều chứng tỏ cam sành Hàm Yên đƣợc tạo phƣơng pháp vi ghép đỉnh sinh trƣởng năm 2001 cam sành Bố Hạ có quan hệ họ hàng gần gũi 42 Cam chanh Bố Hạ cam Vinh trồng Thái Nguyên có hệ số tƣơng đồng di truyền cao 0,73 (tƣơng ứng 73% giống nhau) Kết cho thấy cam Vinh trồng Thái Nguyên có nguồn gốc xuất xứ gần lai cam Bố Hạ với loại cam khác Cam chanh Hàm Yên có hệ số tƣơng đồng di truyền tƣơng đối cao với cam chanh Bố Hạ (giống đến 81%) Cam chanh Bố Hạ (OC4) trồng Thái Nguyên với cam chanh Bố Hạ có hệ số tƣơng đồng di truyền 0,87 (sai khác di truyền 0,13) Sự sai khác phản ánh ảnh hƣởng trình chọn lọc tự nhiên lên kiểu gene 43 Phần KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Đã tách chiết DNA tổng số từ mẫu cam thu thập Đã so sánh cam Bố Hạ với giống cam khác thị phân tử ISSR Đã đánh giá hệ số di truyền xây dựng phát sinh chủng loài mẫu cam phân tích - Hệ số tƣơng đồng di truyền mẫu cam dao động khoảng từ 0,52 0,93 - Từ sơ đồ phân loại cho thấy 16 mẫu cam đƣợc chia thành nhóm với hệ số sai khác di truyền Nhóm I: Là mẫu cam sành Hàm Yên So đƣợc tạo phƣơng pháp vi ghép đỉnh sinh trƣởng năm 2015 Khoảng cách di truyền so với mẫu cam lại nhóm II 0, 48 Nhóm II: Bao gồm 12 mẫu cam Trong nhóm đƣợc chia thành nhóm phụ, bao gồm nhóm phụ C mẫu cam sành So đƣợc tạo phƣơng pháp vi ghép đỉnh sinh trƣởng năm 2001 nhóm phụ D mẫu cam Bố Hạ cam Vinh trồng Thái Nguyên, với sai khác di truyền 0,41 (hệ số tƣơng đồng di truyền 0,59) - Nhóm phụ I: Bao gồm mẫu cam đƣợc tạo phƣơng pháp vi ghép đỉnh sinh trƣởng năm 2001 - Nhóm phụ II: Bao gồm 10 mẫu cam chủ yếu mẫu cam Bố Hạ, đƣợc chia tiếp thành cụm (cụm e cụm f) + Cụm e: Bao gồm mẫu cam sành Bố Hạ (CSI1 - CSI5) Mẫu CSI4 đƣợc chia thành nhánh khác biệt với mẫu lại Tiếp theo mẫu CSI5 lại đƣợc chia thành nhánh khác biệt với mẫu CSI1, CSI2 CSI3 Cuối mẫu lại đƣợc chia thành hai nhánh nhỏ 44 + Cụm f: Bao gồm mẫu (4 mẫu cam chanh mẫu cam Vinh) Cụm f đƣợc chia thành nhánh Nhánh bao gồm mẫu cam chanh (CBH, BH, OC3 OC4) Nhánh lại đƣợc chia nhỏ thành nhánh con, mẫu CBH (cam chanh Bố Hạ) nằm tách biệt với mẫu lại Ba mẫu BH, OC3 OC4 tiếp tục đƣợc chia thành nhánh Mẫu cam OC3 (cam chanh Hàm Yên) nằm nhánh khác biệt với OC4 BH (cam chanh Bố Hạ) Nhánh thứ hai cụm f mẫu cam Vinh (OV5) 5.2 Kiến nghị Kết hợp số kĩ thuật phân tích quan hệ di truyền khác nhƣ SSR, RFLP, để xác định mối quan hệ di truyền giống cam nhằm đạt đƣợc kết tin cậy cao 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tiếng Việt Nguyễn Thị Thanh Bình, Hồng Thị Hằng, Nơng Văn Hải (2004), “Nghiên cứu đa hình số giống tằm dâu kỹ thuật RADP”, Tạp chí Di truyền học Ứng dụng, 1, 30 - 35 Nguyễn Minh Châu (2009), Giới thiệu giống ăn phổ biến miền Nam, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội Đƣờng Hồng Dật (2003), Cam, chanh, quýt, bưởi kỹ thuật trồng, Nxb Lao động - xã hội.) Bùi Huy Đáp (1960), Cây ăn nhiệt đới, 1, Nxb Nông thôn Nguyễn Văn Giang, Vũ Ngọc Lan, Tống Văn Hải (2013), “Nghiên cứu đa dạng di truyền khoai Môn - Sọ thị phân tử DNA”, Tạp chí Khoa học Phát triển, 11(1), - 6 Vũ Mạnh Hải (2000), Tài liệu tập huấn ăn quả, Viện Nghiên cứu Rau Hồ Sỹ Hạnh, Võ Hành, Đặng Diễm Hồng (2006), “Sử dụng kỹ thuật RAPD PCR để xác định mối quan hệ di truyền số loài thuộc chi Calothrix (Cyanobacteria) phân lập đƣợc từ đất trồng tỉnh Đắc Lắc”, TC Sinh học 28(1), 68 - 74 Nguyễn Hữu Hiệp, Trần Nhân Dũng, Đặng Thanh Sơn, Nguyễn Văn Đƣợc (2004), “Đa dạng sinh học giống có múi huyện Gò Quao, tỉnh Kiên Giang”, TC Khoa học - Trường Đại học Cần Thơ, 1, 111 - 121 Vũ Văn Hiếu, Nông Thị Huệ, Nguyễn Thị Oanh, Ninh Thị Thảo, Vũ Quang Sáng, Nguyễn Thị Phƣơng Thảo (2015), “Phân tích đa dạng di truyền mẫu giống cam sành Hà Giang thị RAPD ISSR”, Tạp chí Khoa học Phát triển, 13(6), 867 - 875 46 10 Nguyễn Thị Lang, Hồ Phú Yên, Trần Khắc Thi, Bùi Chí Bửu (2007), “Đánh giá đa dạng di truyền dƣa leo phƣơng pháp RAPD marker”, TC Nông nghiệp Phát triển Nông thôn, 1, 28 - 31 11 Nguyễn Đức Thành (2014), “Các kĩ thuật thị DNA nghiên cứu chọn lọc thực vật”, Tạp chí sinh học, 36(3), 265 - 294 12 Hoàng Ngọc Thuận (2004), Kỹ thuật chọn tạo trồng cam quýt, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội 13 Trần Thị Thu Thủy (2016), Đánh giá đa hình di truyền số giống cam kĩ thuật RAPD ISSR, Khóa luận tốt nghiệp, Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, 38 - 58 14 Trần Thế Tục (1967), Điều tra ăn quả, Nxb Nông thôn 15 Vũ Huyền Trang, Hồng Đăng Hiếu, Phạm Bích Ngọc, Chu Hoàng Hà (2014), “Đánh giá đa dạng quần thể dó bầu (Aquilaria crassna Pierre) Việt Nam thị phân tử ISSR”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, 30(4), 58 - 65 II Tiếng Anh 16 Akkaya M S., Bhagwat A A., Cregan P B (1992), “Length polymorphism of simple sequence repeat DNA in soybean”, Genetics, 132, 1131 - 1139 17 Barkley N A., Dean R E., Pittman R N., Wang M L et al (2007), “Genetic diversity of cultivated and wild - type peanuts evaluated with M13 - tailed SSR markers and sequencing”, Genet Res., 89, 93 - 106 18 Beedanagari SR, Dove SK, Wood BW, and Conner PJ (2005), “A first linkage map of pecan cultivars based on RAPD and AFLP markers”, Theor Apll Genet, 110(6), 1127 - 1137 19 Cheeng H Y., Yang W C., Hsiao J Y (2001), “Genetic diversity and relationship among peach cultivars based on random amplified microsatellite polymorphism (RAMP)”, Bot Bull Acad Sin., 42, 201 - 206 20 Constantinos Tripolitsiotis, Nikoloas Nikoloudkis, Arthanasios Linos, Marianna Hagidimmitriou (2013), “Molecular Characterization and Analysis of the 47 Greek Citrus Germplasm”, Notulae Botanicae Horti Agrobotanici Cluj Napoca, 41(2), 463 - 471 21 Dehesdtani A, Kazemitabar SK, Rahimian H (2007), “Assessment of genetic diversity of navel sweet orange cultivars grown in Mazandaran province using RAPD markers”, Asian Journal of Plant Sciences, 6(7), 1119 - 1124 22 Deqiu Fang, Robert R Krueger and Mikeal L Rosose (1998), “Phylogenetic relationships among selected citrus germplasm accessions revealed by Intersimple sequence repeat (ISSR) markers”, Journal of the American Society for Horticultural Science, 123(4), 612 - 617 23 De Pasquale F, Siragusa M, Abbate L, Tusa N, De Pasquale C, Alonzo G (2006), “Characterization of five sour orange clones through molecular markers and leaf essential oils analysis”, Scientia Horticulturae, 109, 54 59.) 24 Doyle and Doyle, Doyle and Dickson, and Cullings (1987), CTAB/Chloroform - Isoamyl Alcohol DNA Extraction Protocol 25 Ebtsam M Hamza (2013), “Genetic Diversity of Some Citrus Varieties Based on Microsatellite and RAPD Molecular Markers in Egypt”, World Journal of Agricultural Sciences, 9(4), 316 - 324 26 Haa A R C (1984), “Effect of the rootstock on the composition of citrus trees and fruit”, Plant physiol., 23, 309 - 330 27 He C., Poysa V., Yu K., (2003), “Development and characterization of simple sequence repeat (SSR) markers and their use in determining relationships among Lycopersicon esculentum cultivars”, Theor Appl Genet., 106, 363 373 28 Helvécio Della Coletta Filho, Marcos Antonio Machado, M Luiza P.N Targon and Jorgino Pompeu Jr (2000), “The use of random amplified polymorphic DNA to evaluate the genetic variability of Ponkan Madarin (Citrus Reticulata Blanco) accessions”, Genetics and Molecular Biology, 23(1), 169 - 172 48 29 Huang C H., Lian C F., Chang L., Lan T (1990), “Incidence and spread of citrus likubin in relation to the population fluctuation of Diaphorina citrus”, Plant protection Bullentin Taipei, 32(3), 552 - 563 30 Hume H H (1957), Citrus fruit, New York, The Macmilan company 31 Hvarleva T, Kapari-Isala T, Papayiannis L, Atanassov A, Hadjinicoli A, Kyriakou A (2008), “Characterization of Citrus cultivars and clones in Cyprus through Microsatellite and RAPD Analysis”, Biotechnol Biotechnol Eq, 22 (3), 787 794 32 Lamine M., A Chebaane, A Milki (2015), “Genetic diversity analysis in Tunisian Maltaise orange (Citrus sinensis L.)”, Journal of New Sciences, 14(2), ISSN, 2286 - 5314 33 Lamyaa M Sayed, M F Maklad (2015), “Molecular characterization and genetic diversity of some egyptian citrus cultivars using RAPD and ISSRs markers”, Egypt J Genet Cytol., 44, 387 - 403 34 Madhumathi C., Purushotham K., Chandhrasekhar R., Gopal K., Sekhar M.R., Shankar T.G (2016), “Assessment of molecular diversity in Elite Sweet Orange (Citrus sinensis L Osback) accessions using RAPD markers”, Electronic journal of Plant Breeding, 7(2), 332 - 340 35 Mariniello L, Sommella MG, Cozzolino A, Pierro PD, Ercolini D, Porta R (2004), “Identification of campania Citrus Limon L by random amplified polymorphic DNA markers”, Food Biotechnol., 18(3), 289 - 297 36 Martasari C., Karsinah and Reflinur (2012), “Characterization of Indonesian „Siam‟ cultivar (Citrus nobilisLour.) by morphological and ISSR markers”, ARPN Journal of Agricultural and Biological Science,7, 830 - 835 37 Maya M.A., M.G Rabbani, M.G Mahboob and Y Matsubara (2012), “Assessment of Genetic Relationship among 15 Citrus Fruits Using RAPD”, Asian Journal of Biotechnology, 4(1), 30 - 37 49 38 Mirko Siragusa, Fabio De Pasquale, Loredana Abbate, and Nicasio (2006), “Identification of Sour Orange Accessions and Evaluation of Their Genetic Variability by Molecular Marker Analyses”, HortScience, 41(1), 84 - 89 39 Oliveira E.C., Amaral Jỳnior A.T., Gonỗalves L.S.A., Pena G.F., Freitas Jỳnior S.P., Ribeiro R.M., Pereira M.G (2010), “Optimizing the efficiency of the touchdown technique for detecting inter-simple sequence repeat markers in corn (Zea mays)”, Genetic and Molecular Research, 9(2), 835 - 842 40 Olufowote J O., Xu Y., Chen X., Goto M et al (1997) “Comparative evaluation of within - cultivar variation of rice (Oryza sativa L.) using microsatellite and RFLP markers”, Genome, 40(3), 370 - 378 41 Orozco C C, Chalmers K J, Waugh R, and Powell W (1994), “Detection of diversity and selective gene introngression in coffee using RAPD markers”, Theor Appl Genet., 87, 934 - 940 42 Raymod P P (1979), Horticulture, Priciples and practical Applications, Prentice, HAL, INC, USA 43 Reuther W (1973), Climate and citrus behaviour in the citrus industry, 3, University of California 44 Reuther W et al (1978), The citrus industry, 1, Puplication of University of California, USD 45 Reuther W et al (1989), The citrus industry, 2, Puplication of University of California, USA 46 Richard Ray Lance Walheim (1980), Citrus - how to seleet, Grow and Enjoy, Fisher Publishing 47 Sanchez de la Hoz M P., Davila J P., Loarce Y., Ferrer E.( 1996), “Simple sequence repeat primers used in polymerase chain reaction amplifications to study genetic diversity in barley”, Genome, 39, 112 - 117 48 Santos JRP, Teixeira MA, Cares JE, Faleiro FG, Costa DC (2010), “Contrastant banana accessions for resistance to the burrowing nemtade, based on molecular markers RAPD”, Euphytica, 172, 13 - 20 50 49 Shahsavar A.R., K Izadpanah, E Tafazoli, B.E Sayed Tabatabaei (2007), “Characterization of citrus germplasm including unknown variants by inter simple sequence repeat (ISSR) markers”, Scientia Horticulturae, 112, 310 314 50 Shahzadi K., S.Naz Ilyas (2016), “Genetic diversity of Citrus germplasm in Pakistan based on Random Amplyfied Polymorphic DNA (RAPD) markers”, The Journal of Animal & Plant Sciences, 26(4), 1094 - 1100 51 Sun G, bond M, Martin R, and Dong Z (2003), “RAPD polymorphism in spring wheat cultivars and line with different level of Fusarium resistance”, Theor Appl Genet., 106, 1059 - 1067 52 Swingle W T (1965), The citrus Industry, University of California Press, California, 221 - 234 53 Tanaka (1954), Dible plant, Tokyo Japan 54 Wakana A., Uemoto S (1988), “Adventive Embryogenesis in citrus rutaceae”, Amer J Bot., 75, 1033 - 1047 55 Wakana A Kira (1998), The citrus production in the worl, Tokyo, Janpan 56 Wu K S., Tanksley S D (1993), “Abundane, polymorphism and genetic mapping of microsatellites rice”, Mol Gene Genet., 241, 225 - 235 57 Wu K S., Jones R., Danneberger L., Scolnik P (1994), “Detection of microsatellite polymorphism without cloning.”, Nucleic Acids Res., 22, 3257 - 3258 ... HỌC NÔNG LÂM BÙI THỊ NGA Tên đề tài: ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ XÂY DỰNG CÂY PHÁT SINH CHỦNG LOÀI CAM BỐ HẠ KHÓA LUẬN TỐT NGIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Ngành : Cơng nghệ sinh học Lớp :... 4.2 Kết so sánh cam Bố Hạ với giống cam khác thị phân tử ISSR 32 4.2.1 Kết so sánh cam Bố Hạ với giống cam khác thị ISSR - T1 32 4.2.2 Kết so sánh cam Bố Hạ với giống cam khác thị ISSR - T2 ... sánh cam Bố Hạ với giống cam Hàm Yên (Tuyên Quang) thị phân tử, xây dựng phát sinh chủng loài cam Bố Hạ 1.2.2 Mục tiêu cụ thể - Tách chiết đƣợc DNA tổng số từ cam đủ điều kiện để thực phân tích sinh