Ứng dụng chỉ thị phân tử chọn lọc cá thể BC3F1 của tổ hợp lai KD18 x KC25 mang QTL gen tăng số hạt trên bông

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH - KTNN ====== NGÔ THỊ THANH ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ CHỌN LỌC CÁ THỂ BC3F1 CỦA TỔ HỢP LAI KD18 x KC25 MANG QTL/GEN TĂNG SỐ HẠT TRÊN BÔNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Di truyền học Ngƣời hƣớng dẫn khoa học TS TRẦN ĐĂNG KHÁNH HÀ NỘI, 2016 LỜI CẢM ƠN Tôi xin trân trọng cảm ơn thầy, cô giáo trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2, thầy, cô giáo khoa Sinh – KTNN hết lòng giúp đỡ trình học tập trƣờng tạo điều kiện cho hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Đặc biệt xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Thầy giáo – TS Trần Đăng Khánh, ngƣời tận tình hƣớng dẫn trình học tập, nghiên cứu hoàn thành khóa luận Đồng cảm ơn anh chị Bộ môn Kĩ thuật Di truyền, Viện Di truyền Nông nghiệp, tạo điều kiện cho hoàn thành thực nghiệm thành công Trong trình nghiên cứu không tránh khỏi thiếu sót hạn chế, kính mong nhận đƣợc đóng góp ý kiến thầy giáo, cô giáo toàn thể bạn đọc để đề tài đƣợc hoàn thiện Tôi xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Sinh viên thực Ngô Thị Thanh LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu cá nhân tôi, số liệu kết nghiên cứu khóa luận trung thực không trùng lặp với đề tài khác Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực khóa luận đƣợc cảm ơn thông tin trích dẫn khóa luận đƣợc ghi rõ nguồn gốc Tác giả Ngô Thị Thanh MỤC LỤC MỞ ĐẦU1 Lý chọn đề tài Mục đích nghiên cứu Phạm vi nghiên cứu Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn NỘI DUNG Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nguồn gốc lúa 1.2 Phân loại lúa 1.3 Giới thiệu QTL 1.4 Chỉ thị phân tử ứng dụng thị phân tử công tác chọn giống 1.4.1.Chỉ thị phân tử 1.4.2.Ứng dụng thị phân tử công tác chọn giống 12 1.5 Trình bày tổng quan tình hình nghiên cứu nƣớc 15 1.5.1.Trên Thế giới 15 1.5.2.Tại Việt Nam 19 Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 21 2.1.1 Các giống lúa nghiên cứu 21 2.1.2 Mồi ADN 22 2.2 Nội dung nghiên cứu 22 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 22 2.3.1 Phƣơng pháp lai hữu tính – lai trở lại giống 22 2.3.2.Phƣơng pháp nghiên cứu phòng thí nghiệm 25 2.3.3 Phƣơng pháp xử lí số liệu 31 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 32 3.1 Kết 32 3.1.1 Khảo sát đa hình hai giống bố mẹ 32 3.1.2 Kết tách chiết tinh ADN 32 3.1.3 Sử dụng thị phân tử đa hình chọn lọc cá thể quần thể BC3F1 33 3.2 Thảo luận 36 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ KIẾN NGHỊ 37 4.1 Kết luận 37 4.2 Kiến nghị 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 PHỤ LỤC 40 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT AND : Axit Deoxyribonucleic AFLP : Amplified Fragment Length Polymorphism - Đa hình chiều dài đoạn đƣợc nhân chọn lọc RAPD : Random Amplification of Polymorphic DNA - Đa hình ADN đƣợc nhân ngẫu nhiên RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism – Đa hình chiều dài mảnh phân cắt giới hạn STS : Sequence Tagged Site – Xác định vị trí trình tự đƣợc đánh dấu RGA : Resistance Gene Analog – Vùng tƣơng đồng gen kháng SNP : Single Nucleotide Polymorphisms – Đa hình nucleotide đơn SSR : Simple Sequence Repeat - Sự lặp lại trình tự đơn giản Bp : Base pair – Cặp bazơ nitơ cDNA : Complementary DNA – Thƣ viện ADN bổ trợ Cs : Cộng CTPT : Chỉ thị phân tử dNTP : Deoxynucleotide triphosphate MABC : Marker Assisted Backcrossing – Chọn lọc nhờ thị phân tử kết hợp lai trở lại MAS : Marker Assisted Selection – Chọn lọc nhờ thị phân tử NST : Nhiễm sắc thể PCR : Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi trùng hợp QTL/ QTLs : Quantity Trait Loci(s) - Locus kiểm soát tính trạng số lƣợng TBE Tris-Boric Acid-EDTA : DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH BẢNG Bảng 2.1 Các thị cho đa hình giống KD18 x KC25 vị trí QTL/gen 22 Bảng 2.2 Thành phần chất dùng cho phản ứng PCR 27với mồi SSR 27 Bảng 2.3 Chƣơng trình chạy phản ứng PCR 27 HÌNH Hình 1.1 Một số QTL/gen đƣợc phát 12 NST lúa Thế giới 18 Hình 3.1 Kết chạy điện di gel Agarose 3% 33 Hình 3.2 Kết điện di gel agarose 0,8% 34 Hình 3.3 Hình ảnh điện di Polyacrylamide 4,5% BC3F1 với thị RM445 35 Hình 3.4 Kết chạy điện di gel Polyacrylamide 4,5% với thị RM21615 Hình 3.5 Kết chạy điện di gel Polyacrylamide 4,5% với thị RM500 35 MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Cây lúa (Oryza sativa L.) nguồn thức ăn cho khoảng 2/3 dân số giới lƣơng thực quan trọng Việt Nam Việt Nam nƣớc xuất gạo đứng hàng đầu giới, nguồn thu ngoại tệ lớn nông nghiệp xuất Theo số liệu thống kê năm 2014, Việt Nam với diện tích khoảng 7,8 triệu sản xuất đƣợc 44,84 triệu thóc, đảm bảo an ninh lƣơng thực Quốc gia mà xuất đƣợc 6,52 triệu (Bộ Nông nghiệp PTNT, 2014) [2] Tuy nhiên, năm gần trình đô thị hóa, công nghiệp hóa diễn nhanh chóng, diện tích đất trồng lúa ngày bị thu hẹp chịu ảnh hƣởng cực đoan từ biến đổi khí hậu làm suất lúa bị sụt giảm rõ rệt, bên cạnh áp lực dân số ngày tăng đòi hỏi nguồn cung lƣơng thực ngày vô lớn Việc phát triển nguồn giống cho suất cao, chất lƣợng tốt yếu tố quan trọng, cấp bách có ý nghĩa cho an toàn lƣơng thực, đảm bảo sản lƣợng lúa, tăng thu nhập cho ngƣời dân Phƣơng pháp chọn giống nhờ thị phân tử (MAS-Marker assisted selection) lai trở lại (MABC – Marker Asissted Backcrossing) đƣợc ứng dụng rộng rãi thành công nhiều nƣớc Thế giới Trong đó, Viện Nghiên cứu lúa Quốc tế (IRRI) thành công việc quy tụ QLT/gen chịu ngập chịu mặn vào số giống lúa trồng phổ biến nƣớc Đông Nam châu Á nhƣ: Ấn Độ, In-đô-nê-xi-a, Băng-la-đét Phƣơng pháp chọn giống nhờ thị phân tử phƣơng pháp thiết thực, hiệu việc quy tụ locus gen quy định tính trạng di truyền số lƣợng (QTL) hay gen vào giống cho phép rút ngắn trình chọn lọc, chọn lọc đƣợc tính trạng khó hay nhiều gen lúc Chọn giống phƣơng pháp MAS, MABC giảm đƣợc giá thành, thời gian cho hiệu cao so với phƣơng pháp chọn giống truyền thống Phƣơng pháp cho phép chọn lọc trực tiếp hệ gen cá thể quần thể Việc ứng dụng thị phân tử kết hợp lai trở lại từ đến hệ thu đƣợc lai mang gen quan tâm Các dòng tự thụ, thu hạt để thử nghiệm phát triển đồng ruộng Xuất phát từ vấn đề nêu kết hợp phƣơng pháp chọn giống nhờ thị phân tử chọn giống truyền thống để tạo dòng/giống lúa có suất cao, tiến hành thực đề tài:“Ứng dụng thị phân tử chọn lọc cá thể BC3F1 tổ hợp lai KD18 x KC25 mang QTL/gen tăng số hạt bông” Mục đích nghiên cứu Sử dụng thị phân tử để xác định có mặt QTL/gen tăng số hạt cá thể quần thể BC3F1 tổ hợp lai KD18 x KC25 Phạm vi nghiên cứu - Nghiên cứu chủ yếu tập trung vào việc ứng dụng phƣơng pháp MABC chọn lọc cá thể BC3F1 mang QTL/gen tăng số hạt phục vụ cho công tác chọn tạo giống lúa cao sản - Thời gian thực đề tài thực hiện: tháng 6/2015 đến tháng 05/2016 Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn - Ý nghĩa khoa học Ứng dụng thị phân tử kết hợp phƣơng pháp lai trở lại để chọn lọc nhanh xác cá thể mang QTL/gen tăng số hạt bông, nhằm rút ngắn thời gian, công sức chọn lọc đồng ruộng, giảm số lƣợng lớn cá thể gieo trồng hàng vụ khắc phục đƣợc số hạn chế phƣơng pháp truyền thống - Ý nghĩa thực tiễn Những thành công bƣớc đầu lai chuyển QTL/gen tăng số hạt nhờ sử dụng thị phân tử lúa mở khả ứng dụng rộng rãi công tác chọn giống nói chung, không tính trạng suất mà với nhiều đặc tính nông học quan trọng khác đáp ứng nhu cầu lƣơng thực cho ngƣời Những cá thể quần thể BC3F1 triển vọng đƣợc chọn lọc đề tài đƣợc trồng thử nghiệm tiếp tục đánh giá, chọn tạo dòng/giống lúa có tiềm năng suất cao, phục vụ cho nghiên cứu PCR plate 96 giếng Thành phần, hàm lƣợng chất phản ứng nhƣ bảng 2.2 Bảng 2.2 Thành phần chất dùng cho phản ứng PCR với mồi SSR STT Thành phần Thể tích (l) H2O cất khử trùng 8.95 Buffer 10X 1,5 MgCl2 (50mM) 0,45 dNTP (1mM) 1,0 Taq ADN polymeraza (5U) 0,1 Primer forward 5M 0,5 Primer Revert 5M 0,5 ADN (35ng/ l) 2,0 Tổng thể tích: 15 Sau có đủ thành phần, hàm lƣợng chất cần thiết, tiến hành đặt chƣơng trình chạy cho máy Chu trình nhiệt máy PCR nhƣ sau: Bảng 2.3 Chƣơng trình chạy phản ứng PCR Bƣớc Nhiệt độ (oC) Thời gian Số chu kỳ 94 phút 94 30giây 55 30 giây 72 45 giây 72 phút 10 ∞ 35 (*): Nhiệt độ gắn mồi - thay đổi tùy theo cặp mồi SSR cụ thể 27 2.3.2.3 Phương pháp điện di gel agarose 0,8% Các bước tiến hành: - Cân 0.8g agarose, đong 100ml TBE 0,5X (5,4g Tris base; 2,76g axit boric; 2ml 0,5M EDTA, pH = 8,0) cho vào bình tam giác - Đun lò vi sóng tạo thành dung dịch đồng - Để nguội đến khoảng 50 - 600C, thêm 5l ethidium bromide (10 mg/ml) lắc - Chuẩn bị khay lƣợc Đổ dung dịch agarose vào khay cho bọt khí Chờ khoảng 45 - 60 phút gel đông - Rút lƣợc, đặt gel vào bể điện di Đổ 0,5X TBE ngập mặt gel khoảng 2mm - Tra sản phẩm PCR đƣợc trộn với Xylen cyanol vào giếng tỷ lệ 5l Xylen cyanol /15l mẫu Thời gian điện sử dụng để điện di dài hay ngắn phụ thuộc vào kích thƣớc cặp mồi SSR cần kiểm tra Các mẫu chạy với ladder 25 bp - Soi gel máy soi cực tím, đọc ghi nhận kết 2.3.2.4 Phương pháp điện di gel agarose 3% Các bước tiến hành: Giống nhƣ điện di gel agarose 0,8% khác cân lấy 3g agarose 2.3.2.5 Phương pháp điện di gel polyacrylamide 4,5% Chuẩn bị dung dịch 4,5%,acrylamide từ dung dịch gốc 40% acrylamide (19:1 = acrylamide 380g; bisacrylamide 20g lít dung dịch) Chuẩn bị kính: - Lau kỹ bề mặt hai kính lần nƣớc cất, sau lau lại lần ethanol 95%, để khô sau lần lau - Lau kính dài với giấy lụa tẩm Rain-X Để phút cho khô dung dịch 28 Chú ý Tránh làm dính dung dịch lên kính ngắn - Lau kính ngắn với dung dịch dính (Binding solution) đƣợc tạo thành cách thêm 2l Bind Silane vào 1ml chứa 95% ethanol 5% glacial acetic acid - Để cho kính khô, lau tiếp ethanol 95% lần - Lắp ghép kính lại với nhau, sử dụng nẹp Sigma 0,4mm Chuẩn bị gel polyacrylamide: Chuẩn bị dung dịch 4,5% acrylamide từ dung dịch gốc 40% acrylamide (19:1 = acrylamide 380g; bisacrylamide 20g pha lít nƣớc) - Đổ 60ml dung dịch 4,5% acrylamide (25,2 Urea: 6ml TBE 10X: 6,75ml acrylamide/bis-acrylamide 40% (19:1) vào cốc đong 100ml Thêm 300l 10% APS (ammonium persulfate) 60l TEMED (N,N,N’,N’Tetraethyl - ethylendiamine), trộn - Bơm dung dịch gel vào hai kính cho bọt khí - Cài lƣợc vào hai kính (răng lƣợc hƣớng phía ngoài) Dùng kẹp cố định lƣợc - Để gel polyme hóa - Điện di: - Tháo lƣợc loại bỏ hết mảnh gel thừa bám mặt kính - Lắp ráp điện di Cho lít đệm TBE 1X vào buồng đệm dƣới - Dùng xylanh đuổi hết bọt khí bề mặt phía khuôn gel - Chạy tiền điện di (prerun) với cƣờng độ dòng điện 50 - 60A, công suất 92 - 100W - Biến tính sản phẩm PCR 950C phút, đặt vào đá phủ đá lên phút Sản phẩm PCR lúc đƣợc trộn với 4l Sequencing Stop solution (10mM NaOH: 95% formamid: 0,05% bromphenol; 0,05% xylene cyanol) 29 - Tra vào giếng 5l sản phẩm PCR đƣợc làm biến tính, mẫu chạy với ladder 50 bp Thời gian tra mẫu không kéo dài dài để gel không bị nguội nhiều - Tiến hành điện di với công suất 60W 500C, thời gian chạy ngắn hay dài tùy kích thƣớc mồi sử dụng Phương pháp nhuộm bạc: + Chuẩn bị dung dịch - Dung dịch cố định/dừng phản ứng (Fix/Stop solution): gồm có 100ml glacial acetic acid 900ml nƣớc cất - Dung dịch nhuộm (Staining solution) đƣợc tạo thành cách hòa tan 1g bạc nitrat (AgNO3) vào lít nƣớc cất, sau bổ sung thêm 1,5ml formaldehyd (H2CO) 37% - Dung dịch (Developing solution): Hòa tan 30g natri cacbonat (Na2CO3) lít nƣớc cất làm lạnh -200C Chú ý: (Trƣớc sử dụng thêm 1,5ml formaldehyd (H2CO) 37% 200l natri thiosulfat 10% (Na2S2O.5H2O) + Tiến hành nhuộm Sau chạy điện đi, tháo gỡ kính bám gel tiến hành bƣớc sau: - Cố định gel: Đặt kính vào khay cho mặt bám gel hƣớng lên trên, đổ dung dịch cố định/dừng phản ứng để khoảng 30 phút Sau lấy gel khỏi dung dịch Chú ý: Giữ lại dung dịch để dùng cho bƣớc sau - Rửa gel nƣớc cất lần lần phút Cho gel vào dung dịch nhuộm, lắc nhẹ 30 phút Thêm formaldehyd sodium thiolsufat vào dung dịch Lấy gel khỏi dung dịch nhuộm, rửa lại nƣớc cất - 10 giây 30 - Đƣa gel vào dung dịch lắc nhẹ đến băng xuất Cho gel vào dung dịch cố định/dừng phản ứng - phút Rửa lại gel nƣớc cất Để gel khô tự nhiên sau ghi nhận kết 2.3.3 Phương pháp xử lí số liệu Số liệu đƣợc ghi nhận chƣơng trình,IRRISTAT, Excel xử lí chƣơng trình Graphical Genotyper (GGT2) ( Van Borloo, 2008) nhƣ sau ghi nhận liệu thị SSR alen đồng hợp tử giống nhận nhận gen “A”, đồng hợp tử giống cho gen “B” dị hợp tử “H”, số phần trăm alen nhận gen “R” 2.4 Cách bố trí thí nghiệm - Trong nhà lƣới: theo dõi đƣợc trồng xô nhựa theo Phạm Chí Thành (1976) [10] - Trên ruộng thí nghiệm: bố trí treo kiểu ngẫu nhiên hoàn chỉnh - Diện tích ô thí nghiệm: 1,5m x 2m = 3m2 ; khoảng cách đƣờng công tác 30cm; cấy cách 12 cm hàng cách hàng 18 cm 2.5 Địa điểm nghiên cứu Phòng thí nghiệm Bộ môn Kỹ thuật Di truyền Viện di truyền nông nghiệp Việt Nam, khu triển khai thí nghiệm đồng ruộng xóm Đại Yên, huyện Hoài Đức, Hà Nội 31 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Kết 3.1.1 Khảo sát đa hình hai giống bố mẹ Để khảo sát đa hình hai giống lúa bố mẹ KD18 KC25 sử dụng thị RM400, RM500 RM21615 (3 thị đa hình vị trí QTL/gen tăng số hạt bông) đƣợc thể qua hình ảnh sau: Hình 3.1 Kết chạy điện di gel Agarose 3% L.Ladder 50bp chuẩn; BT7; KD18 ; 3.KC25 Qua hình 3.1 ta thấy đa hình hai giống bố mẹ đƣợc phát chiều dài khác đoạn lặp lại đƣợc khuếch đại phản ứng PCR sử dụng cặp mồi SSR 3.1.2 Kết tách chiết tinh ADN Trong khuôn khổ nghiên cứu nhờ kế thừa vật liệu Viện Di truyền Nông nghiệp, có cá thể BC2F1 mang QTL/gen tăng số hạt có di truyền cao nhất, tiến hành ngâm ủ, gieo trồng chăm sóc khu thí nghiệm Viện Di truyền Nông nghiệp Sau tiến hành khử đực cho lai trở lại với KD18 thu đƣợc 100 hạt lai BC3F1 Toàn hạt lai đem gieo trồng, sau lúa đƣợc khoảng 15 ngày tuổi tiến hành thu mẫu, tách chiết ADN, kiểm tra chất lƣợng tách chiết Vì ADN tinh điều kiện thuận lợi cho nghiên cứu phân tử Do đó, tách chiết tinh ADN tổng số bƣớc quan trọng Có nhiều phƣơng pháp tách chiết tinh ADN, tùy theo loại đối tƣợng trồng 32 mục đích thí nghiệm mà có phƣơng pháp tách chiết ADN phù hợp Trong đề tài này, sử dụng phƣơng pháp tách chiết ADN theo phƣơng pháp CTAB cải tiến (phòng thí nghiệm trƣờng đại học Ghent, vƣơng quốc Bỉ) Lá non sau 15 ngày cấy đƣợc thu để tách chiết ADN, nồng độ độ tinh ADN đƣợc kiểm tra cách điện di gel agarose 0,8% với ADN chuẩn, nhuộm gel dung dịch ethidum bromide thu nhận kết máy soi cực tím Kết kiểm tra độ tinh nồng độ ADN đƣợc thể hình 3.2 Hình 3.2 Kết điện di gel agarose 0,8% Ghi chú: 1-9 mẫu ADN cá thể lai BC3F1 (tổ hợp KD18/KC25); λ: nồng độ ADN chuẩn 200 ng/µl; Kết thể hình 3.1 cho thấy, tất số mẫu ADN không bị đứt gãy, băng điện di gọn rõ ràng Toàn mẫu ADN đƣợc sử dụng cho thí nghiệm 3.1.3 Sử dụng thị phân tử đa hình chọn lọc cá thể quần thể BC3F1 Sau tiến hành tách chiết tinh ADN,mẫu ADN đủ tiêu chuẩn đƣợcsàng lọc với ba thị liên kết chặt với QTL/gen yld7 tăng số hạt lần lƣợt RM445, RM500 RM21615 với mục đích chọn lọc đƣợc cá thểBC3F1 mang QTL/gen dị hợp tử mang băng nhận gen cho gen Kết điện di sản phẩm PCR quần BC3F1 (cá thể C1-7461/ Khang dân18) với thị RM445 đƣợc thể hình 3.3 33 Hình 3.3 Hình ảnh điện di Polyacrylamide 4,5%BC3F1 với thị RM445 Ghi chú: 1-97: Mẫu ADN cá thể BC3F1, M: Khang dân 18; B: KC25;L: Ladder 50bp Kết thể hình 3.2 cho thấy, cá thể lai BC3F1 mang kiểu gen đồng hợp tử giống mẹ kiểu gen dị hợp Kết xác định đƣợc 50 cá thể mang kiểu gen dị hợp tử đƣợc lựa chọn gồm cá thể số: 1, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 19, 21, 22, 24, 25, 28, 29, 30, 34, 35, 37, 38, 41, 43, 46, 48, 51, 53, 57, 59, 61, 67, 69, 70, 73, 74, 76, 77, 79, 82, 85, 87, 90, 92, 93, 94, 95 Năm mƣơi cá thể BC3F1 dị hợp tử vị trí thị RM445 tiếp tục đƣợc sàng lọc thị RM500 RM21615 Hai thị nằm chặn hai đầu QTL/gen yd7 quy định tính trạng tăng số hạt Kết kiểm tra cá thể lai BC3F1 thị RM21615 đƣợc thể hình 3.4 34 Hình 3.4 Kết chạy điện di gel Polyacrylamide 4,5% với thị RM21615 Ghi chú: 1-97: Mẫu ADN cá thể BC3F1, M: Khang dân 18; B: KC25; L: Ladder 50bp Qua hình 3.4 cho thấy, có 13/97 kiểu gen dị hợp bao gồm số thứ tự là: 4, 11, 16, 24, 43, 51, 57, 59, 69, 73, 76, 82, 94 Các cá thể mang kiểu gen đồng hợp giống mẹ gồm cá thể có số thứ tự là: 1, 3, 5, 6, 7, 9, 10, 13, 14, 15, 19, 21, 22, 25, 28, 29, 30, 34, 35, 37, 38, 41, 46, 48, 53, 61, 67, 70, 74, 77, 79, 85, 87, 90, 95 Có 2/97 cá thể mang kiểu gen đồng hợp với bố có số thứ tự là: 92 93 Tiếp tục kiểm tra sản phẩm PCR với mồi RM500 gel polyacrylamide 4,5%, kết đƣợc thể hình 3.5 Hình 3.5 Kết chạy điện di gel Polyacrylamide 4,5% với thị RM500 35 Ghi chú: 1-97: Mẫu ADN cá thể BC3F1, M: Khang dân 18; B: KC25; L: Ladder 50bp Kết thể hình 3.4 cho thấy, có 13/50 cá thể có kiểu gen dị hợp có số thứ tự lần lƣợt là: 3, 15, 34, 35, 41, 43, 53, 76,77, 85, 87, 90, 94 Các cá thể có kiểu gen đồng hợp giống Khang dân 18 36/50 cá thể, bao gồm: 1, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 14, 16, 19, 21, 22, 24, 25, 28, 29, 30, 37, 38, 46, 48, 51, 57, 59, 61, 67, 69, 70, 73, 74, 79, 82, 92, 93, 95 Nhƣ vậy, sử dụng thị RM21615 RM500 việc xác định cá thể lai BC3F1 chọn đƣợc 24 cá thể mang QTL/gen yd7 quy định tính trạng tăng số hạt bông, bao gồm cá thể: 1, 5, 6, 7, 9, 10, 14, 19, 21, 22, 25, 28, 29, 30, 37, 38, 46, 48, 61, 67, 70, 74, 79, 95 tƣơng ứng với cá thể số: C1-42-1, C1-42-5, C1-42-6, C1-42-7, C1-42-9, C1-42-10, C1-42-14, C1-4219, C1-42-21, C1-42-22, C1-42-25, C1-42-28, C1-42-29, C1-42-30, C1-42-37, C1-42-38, C1-42-46, C1-42-48, C1-42-61, C1-42-67, C1-42-70, C1-42-74, C142-79, C1-42-95 3.2 Thảo luận Hiện nhờ phƣơng pháp chọn giống thị kết hợp lai trở lại giới hệ BC3F1 cho tự thụ tạo thành BC3F2 nhờ ứng dụng thị phân tử Thomson cs 2010 nghiên cứu thành công chọn tạo giống lúa chịu mặn mang gen chịu mặn đƣợc phóng thích mang đến, đƣợc phát triển diện rộng Trong khuôn khổ nghiên cứu nhờ kế thừa vật liệu Viện Di truyền Nông nghiệp, có hạt lai BC2F1 với cá thể mang gen phát triển thành quần thể BC3F1 thu đƣợc 100 lai, 100 lai thu đƣợc 24 cá thể mang gen, cho cá thể tự thụ tiếp tục phát triển diện rộng cho suất cao, thí nghiệm đánh giá kiểu hình đồng ruộng 36 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Trong khuôn khổ đề tài đƣợc số kêt sau: - Sử dụng thị phân tử RM445, RM500 RM21615 sàng lọc đƣợc 24/373 cá thể BC3F1 tổ hợp Khang dân 18 KC25 mang QTL/gen quy định tính trạng tăng số hạt gồm cá thể mang số thứ tự: 1, 5, 6, 7, 9, 10, 14, 19, 21, 22, 25, 28, 29, 30, 37, 38, 46, 48, 61, 67, 70, 74, 79, 95 tƣơng ứng với cá thể số: C1-42-1, C1-42-5, C1-42-6, C1-42-7, C1-42-9, C1-4210, C1-42-14, C1-42-19, C1-42-21, C1-42-22, C1-42-25, C1-42-28, C1-42-29, C1-42-30, C1-42-37, C1-42-38, C1-42-46, C1-42-48, C1-42-61, C1-42-67, C142-70, C1-42-74, C1-42-79, C1-42-95 4.2 Kiến nghị Tiếp tục lai tạo cá thể C1-42-14 cho tự thụ tạo thành BC3F2 , chọn cá thể đồng hợp tử chọ lọc kiểu hình đẹp để vụ phát triển giống 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Nguyễn Duy Bảy, Nguyễn H.T., Bùi Chí Bửu Bùi Bá Bổng (2001), Chọn giống nhờ Marker Phân tích QTL, Viện lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long, tr 44 - 58 Bộ Nông nghiệp PTNN (2014), Báo cáo kết thực kế hoạch tháng 12 năm 2014 ngành nông nghiệp phát triển nông thôn, tr 1-11 Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang (1999), Ứng dụng DNA marker đánh giá quỹ gen lúa, Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc, Hà Nội Tr 1216-1273 L M Cúc (2009), Sử dụng thị vi vệ tinh SSR lập đồ gen kháng bệnh đốm muộn lạc phục vụ công tác chọn tạo giống, Luận án tiến sĩ nông nghiệp, Hà Nội Lê Huy Hàm (2015),Ứng dụng thị phân tử công chọn tạo giống lúa, Nxb Nông nghiệp, tr 3-26 Lê Thị Ánh Hồng (2002), Bệnh học phân tử thực vật, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội Nguyễn Thị Lẫm (1999), Giáo trình lúa, Nxb Nông Nghiệp Hà Nội, tr 23-25 Sasato (1968) Nghiên cứu tổng hợp lúa – Tập II, Nxb Khoa học, tr 14-19 Lê Duy Thành (2000), Cơ sở di truyền chọn tạo giống thực vật, Nxb ĐHQG Hà Nội 10 Phạm Chí Thành (1976), Phương pháp thí nghiệm đồng ruộng Giáo trình giảng dạy Đại học, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội Tài liệu tiếng Anh 11 Brondani C, Rangel PHN, Brondani RPV, Ferreira ME (2002), QTL mapping and introgression of yield-related traits from Oryza glumaepatula to 38 cultivated rice (Oryza sativa) using microsatellite markers Theor Appl Genet 104:1192–2030 12.Hua J, Xing Y, Xu C, Sun X, Yu S, Zhang Q (2002), Genetic dissection of an elite rice hybrid revealed that heterozygotes are not always advantageous for performance Genetics 162:1885–95 13.Moncada P, Martinez CP, Borrero J, Chatel M, Gauch H, Guimaraes E, Tohme J,and McCouch SR (2001), Quantitative trait loci for yield anh yield components in an Oryza sativa X Oryza rufipogon BC2F2 population evaluated in an upland environment Theor Appl Genet 14.Thomson MJ, Marjorie DO, James E, Rahman MA, Sajise AG, Adorada AL, Raiz ET, Blumwald E, Seraj ZI, Singh RK, Gregorio GB & Ismail MA (2010), Characterizing the Saltol Quantitative Trait Locus for Salinity Tolerance in Rice Rice DOI 10.1007/s12284-010-9053-8 15 Wang Z., Second G and Tanksley S.D (1992), Polymorphism and phylogenetic relationship among species in the Genus Oryza as determined by analysis of nuclear RFLPs Theor Appl Genet 83, 565 - 581 16 Williams J.G (1990), DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic marker, Nucleic Acid Research, 18, 6531-6535 17 Xiao J, J Li, S Grandillo, SN Ahn, L Yuan, SD Tanksley, SR McCouch SR (1998), Identification of trait-improving quantitative trait loci alleles from a wild rice relative,Oryza rufipogon Genetics 150:899-909 18 Zhao, C.Z., Qi, X.F and Yang, C.D 1993 Chinese J Rice Sci 7(2): 120-122 19 Zhuang JY, Fan YY, Wu JL, Xia YW, Zheng KL (2001), Comparison of the detection of QTL for yield traits in different generations of a rice cross using two mapping approaches Acta Genet Sin 28:458–64 20 Xu YB, Beachell H, McCouch SR (2004), A marker–based approach to broadening the genetic base of rice in the USA Crop Sci 44:1947–1959 39 PHỤ LỤC DANH MỤC HÓA CHẤT SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU H a chất TT Bis – acylamide Acrylamide Silver Nitrate Formaldehyde Ammonium persulfate (APS) Bind Silane Sodium thiosulfates Glacial acetic acid Sodium carbonate 10 N,N,N’,N’-Tetraethyl - ethylendiamine (TEMED) 11 Urea 12 Agarose 13 Ethydium bromide 14 Bromphenol Blue 15 Xylene cyanol 16 Isoamyl alcohol 17 Isopropanol alcohol 18 Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB) 19 Boric acid 20 Ethylenediaminetetra Acetic Acid (EDTA) 21 Chloroform 22 Ethanol 40 23 NaCl 5M 24 NaOH 25 RNase (10mg/ml) 26 Sodium dedoxyl sulfat (SDS) 27 Tris base 1M; pH = 8.0 28 Tris HCl 1M; pH = 8.0 29 +  - Mercaptol ethanol 41 ... tài: Ứng dụng thị phân tử chọn lọc cá thể BC3F1 tổ hợp lai KD18 x KC25 mang QTL/ gen tăng số hạt bông Mục đích nghiên cứu Sử dụng thị phân tử để x c định có mặt QTL/ gen tăng số hạt cá thể quần thể. .. Lai tạo quần thể BC3F1 tổ hợp lai KD18 x KC25 - Sử dụng thị phân tử đa hình vị trí QTL/ gen quy định tính trạng tăng số hạt để x c định cá thể quần thể BC3F1 mang QTL/ gen tăng số hạt 2.3 Phƣơng... học Ứng dụng thị phân tử kết hợp phƣơng pháp lai trở lại để chọn lọc nhanh x c cá thể mang QTL/ gen tăng số hạt bông, nhằm rút ngắn thời gian, công sức chọn lọc đồng ruộng, giảm số lƣợng lớn cá thể