TC VIỆT NAM 6189 2 1996

TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 6189-2:1996 ISO 7899-2:1984 (E) CHẤT LƯỢNG NƯỚC – PHÁT HIỆN VÀ ĐẾM KHUẨN LIÊN CẦU PHÂN - PHẦN 2: PHƯƠNG PHÁP MÀNG LỌC Water quality – Detection and enumeration of faecal streptococci - Part 2: Method by membrane filtration Lời nói đầu TCVN 6189-2:1996 hồn toàn tương đương với ISO 7899-2:1984(E); TCVN 6189-2:1996 Ban kỹ thuật tiêu chuẩn TCVN/TC135/F9/SC1 Nước tinh lọc biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn – Đo lường – Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học, Công nghệ Môi trường ban hành Lời giới thiệu Việc liên cầu khuẩn xem thị dấu hiệu ô nhiễm phân, giới ý kiến Tiêu chuẩn mô tả phương pháp phân lập liên cầu khuẩn thuộc nhóm kháng nguyên D Đối với mục kiểm tra nước sinh vật coi thị ô nhiễm phân Tuy nhiên, cần phải nhận thức nhóm liên cầu khuẩn D tìm thấy nước có nguồn gốc từ mơi trường khác Tính chọn lọc mơi trường ni cấy sử dụng mà nhờ có số đếm đáng tin cậy liên cầu khuẩn nhỏ Như đáp ứng hầu hết mục đích thực tiễn Thuật ngữ “liên cầu phản” dùng không bao hàm khẳng định mặt huyết học Tuy nhiên, vài trường hợp đặc biệt, việc thử để nhận dạng sâu hơ nhóm huyết chủng liên cầu phân phân lập cần thiết TCVN 6189:1996 (ISO 7899) gồm phần sau đây: Phần 1: Phương pháp tăng sinh môi trường lỏng; Phần 2: Phương pháp màng lọc CHẤT LƯỢNG NƯỚC – PHÁT HIỆN VÀ ĐẾM KHUẨN LIÊN CẦU PHÂN - PHẦN 2: PHƯƠNG PHÁP MÀNG LỌC Water quality – Detection and enumeration of faecal streptococci - Part 2: Method by membrane filtration Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn qui định phương pháp để phát đếm liên cầu khuẩn phân nước cách lọc qua màng Lĩnh vực áp dụng Phương pháp áp dụng tất loại nước trừ có lượng lớn chất bị giữ lại màng lọc Tiêu chuẩn trích dẫn ISO 5667-1 Chất lượng nước – Lấy mẫu Hướng dẫn xây dựng phương án lấy mẫu; TCVN 5992:1995 (ISO 5667-2) Chất lượng nước – Lấy mẫu Hướng dẫn kỹ thuật lấy mẫu; TCVN 5993:1995 (ISO 5667-3) Chất lượng nước – Lấy mẫu Hướng dẫn bảo quản xử lý mẫu; ISO 7704 Chất lượng nước – Đánh giá màng lọc dùng để phân tích vi sinh Định nghĩa 4.1 Liên cầu phân giả định: Là vi khuẩn cho phản ứng dương tính với môi trường (6.2.1 6.2.2) qui định phần tiêu chuẩn 4.2 Liên cầu phân: Là vi khuẩn cho phản ứng dương tính với mơi trường (6.2.3) qui định phần tiêu chuẩn cho phản ứng âm tính phép thử catalaza Nguyên tắc phản ứng 5.1 Lọc, nuôi cấy đếm Đếm liên cầu phân dựa việc lọc thể tích xác định mẫu nước qua màng lọc có kích thước lỗ (0,45 µm) thích hợp để giữ lại vi khuẩn Màng lọc đặt vào môi trường đặc chọn lọc chứa natri nitrua (để ngăn sinh trưởng vi khuẩn Gram âm) 2,3,5 – triphenyltetrazoli clorua liên cầu phân khử thuốc nhuộm không màu thành formazan màu đỏ Sau nuôi cấy tất khuẩn lạc mọc cho màu đỏ, màu hạt dẻ màu hồng, khuẩn lạc từ trung tâm, suốt toàn khuẩn lạc đếm liên cầu phân giả định 5.2 Khẳng định Có thể thử khẳng định môi trường chọn lọc thấy cần Môi trường khẳng định, thạch mật asculin-nitrua, nuôi 48 nhiệt độ 44 oC Liên cầu phân phát triển môi trường thủy phân asculin, sản phẩm cuối cùng, 6,7 – dihidroxycoumarin kết hợp với ion sắt (III) cho hợp chất màu nâu vàng tới đen khuyếch tán vào mơi trường Ngồi ra, tiến hành phép thử catalaza khuẩn lạc nghi ngờ môi trường khẳng định Những khuẩn lạc cho phản ứng asculin dương tính phép thử catalaza âm tính coi liên cầu phân Môi trường nuôi cấy thuốc thử Cảnh báo: Tất mơi trường chọn lọc trình bày tiêu chuẩn chứa natri nitrua (NaN3) Do chất độc có tính gây đột biến, phải cẩn thận tiếp xúc với nó, đặc biệt tránh hít phải bụi nhỏ pha chế mơi trường hồn chỉnh khơ dạng bán sẵn Các môi trường chứa nitrua không trộn lẫn với axit vơ mạnh tạo thành chất độc hidro nitrua (HN3) Các dung dịch chứa nitrua tạo thành hợp chất gây nổ tiếp xúc với ống dẫn kim loại, thí dụ bồn rửa 6.1 Các nguyên liệu Để cho kết đồng pha chế môi trường cần sử dụng thành phần có chất lượng đồng hóa chất thuộc loại phân tích mơi trường hồn chỉnh khô Natri nitrua bị phân hủy theo thời gian mơi trường khơ có thời hạn sử dụng định Chỉ dùng nước cất nước tinh khiết có chất lượng tương đương 6.2 Mơi trường nuôi cấy 6.2.1 Thạch KF – streptococcus (Kenner) 6.2.1.1 Môi trường Proteose pepton 10,0 g Cao men 10,0 g Natri clorua (NaCl) 5,0 g Natri glycerophotphat 10,0 g Mantoza 20,0 g Lactoza 1,0 g Natri nitrua (NaN3) 0,4 g Bromocresol tía [dung dịch cồn etanol (15 g/l)] ml Thạch 12 – 20 g1) Nước 000 ml Hòa thành phần nước cách đun sơi nồi cách thủy Sau hòa tan hồn tồn, đun thêm phút Để nguội đến 50oC – 60oC 6.2.1.2 Dung dịch TTC 2,3,5 – triphenyltetrazolium clorua 1g Nước 100 ml Hòa tan thuốc nhuộm nước cách lắc Khử trùng cách lọc (màng lọc có kích thước lỗ 0,22 µm) Bảo quản dung dịch khỏi tác động ánh sáng 6.2.1.3 Dung dịch hoàn chỉnh Dung dịch (6.2.1.1) 000 ml Dung dịch TTC (6.2.1.2) 10 ml 1) Theo hướng dẫn nhà sản xuất Thêm dung dịch TTC vào dung dịch làm nguội đến 50 oC ÷ 60oC TTC bền vững với nhiệt tránh để nhiệt độ Nếu cần, điều chỉnh pH đến 7,2 dung dịch natri cacbonat khử trùng (100 g/l) Rót mơi trường vào đĩa petri để có độ dày mơi trường mm để n mặt phẳng nằm ngang, chỗ mát Các đĩa bảo quản đến 30 ngày chỗ tối 4oC ± 2oC 6.2.2 Thạch m-enterococcus (Slanetz Bartley) 6.2.2.1 Môi trường Tryptoza 20,0 g Cao men 5,0 g Glucoza 2,0 g Dikali hidrophotphat (K2HPO4) 4,0 g Natri nitrua (NaN3) 0,4 g Thạch 15,0 g Nước 000 ml Hòa tan thành phần nước cách đun nồi cách thủy Sau hòa tan hoàn toàn đun thêm phút Làm nguội đến 50oC ÷ 60oC 6.2.2.2 Dung dịch TTC Xem 6.2.1.2 6.2.2.3 Mơi trường hồn chỉnh Mơi trường (6.2.2.1) 000 ml Dung dịch TTC (6.2.2.2) 10 ml Thêm dung dịch TTC vào dung dịch làm nguội đến 50 oC ÷ 60oC Nên cần, điều chỉnh pH đến 7,2 dung dịch natri cacbonat (100 g/l) Rót 20 ml vào đĩa Petri đường kính cm (hoặc lượng tương đương vào đĩa có kích thước khác) để yên mặt phẳng nằm ngang, chỗ mát Các đĩa bảo quản đến 30 ngày chỗ tối 4oC ± 2oC 6.2.3 Thạch – Mật asculin – nitrua Trypton 17,0 g Pepton 3,0 g Cao men 5,0 g Mật bò khơ 10,0 g Natri clorua 5,0 g Asculin 1,0 g Amoni-sắt (III) xitrat 0,5 g Natri nitrua (NaN3) 0,15 g Thạch 12 – 20 g1) Nước 000 ml Hòa tan thành phần nước cách đun sôi Điều chỉnh pH cho sau khử trùng pH 7,1 ± 0,1 25oC Phân phối vào chai có dung tích 500 ml, có nút xốy, chai 250 ml Khử trùng 15 phút 121oC ± 1oC Làm nguội đến 50oC ÷ 60oC rót vào đĩa Petri cho độ dày mơi trường mm để yên mặt phẳng nằm ngang, chỗ mát 1) Theo hướng dẫn nhà sản xuất 6.3 Hidro peroxit, dung dịch 30 g/l Thiết bị Các thiết bị phòng thí nghiệm phân tích vi sinh thông thường, 7.1 Thiết bị màng lọc 7.2 Màng lọc khử trùng với kích thước lỗ danh định 0,45 µm Chất lượng màng lọc hãng lơ khác Do đó, nên kiểm tra chất lượng theo qui định ISO 7704 7.3 Tủ ấm, trì nhiệt độ 35oC ± 1oC 37oC ± 1oC 7.4 Tủ ấm, trì nhiệt độ 44 oC ± 0,5oC 7.5 Nồi hấp áp lực, trì nhiệt độ 121 oC ± 1oC Lấy mẫu Xem ISO 5667-1; TCVN 5992:1995 (ISO 5667-2) TCVN 5993:1995 (ISO 5667-3) Cách tiến hành 9.1 Xử lý mẫu Các qui trình chung việc xử lý mẫu nước chuẩn bị dung dịch pha loãng xây dựng thành tiêu chuẩn thời gian tới 9.2 Lọc nuôi cấy Các qui định chung kỹ thuật màng lọc xây dựng thành tiêu chuẩn thời gian tới Lọc thể tích nước thích hợp Đặt màng lọc lên mặt thạch – KF streptococcus (6.2.1) thạch m-enterococcus (6.2.2) Nuôi đĩa 35oC ± 1oC 37oC ± 1oC 44 ± 9.3 Đếm Sau ni, đếm tất khuẩn lạ mọc có màu nâu đỏ màu hồng từ trung tâm toàn khuẩn lạc Các khuẩn lạc coi liên cầu phân giả định Chú thích – Đơi vi khuẩn khác nhóm liên cầu khuẩn nhóm D sinh loại khuẩn lạc Việc nâng nhiệt độ ủ đến 44oC ± 0,5oC sau ủ giai đoạn đầu 37oC ± 1oC ± ngăn ngừa sinh trưởng loại vi sinh vật 9.4 Khẳng định Cấy truyền mẫu đại diện khuẩn lạc điển hình lên đĩa mơi trường thạch-mật asculin nitrua (6.2.3) Nuôi 44oC ± 0,5oC 48 Xem xét tất đĩa cho thấy khuẩn lạc có màu từ nâu đến đen và/hoặc môi trường bao quanh có màu nâu hay đen loại cho phản ứng dương tính 9.5 Phép thử catalaza Nhỏ giọt dung dịch oxi già (hidro peoxit) (6.3) lên khuẩn lạc môi trường thạch-mật asculin nitrua (6.2.3) Sự xuất bọt nhỏ oxy chứng tỏ sinh vật catalaza dương tính Chỉ có khuẩn lạc catalaza âm tính coi liên cầu phân Chú thích – Để loại trừ sai lầm phản ứng catalaza âm tính giả xảy mơi trường thạch-mật asculin nitrua, phép thử lặp lại mẫu cấy truyền lên môi trường không chọn lọc khác 10 Biểu thị kết Qui định chung biểu thị kết tính số vi khuẩn có mẫu xây dựng thành tiêu chuẩn thời gian tới 11 Báo cáo kết Báo cáo kết bao gồm thông tin sau: a) tham khảo tiêu chuẩn này; b) chi tiết cần thiết để nhận biết đầy đủ mẫu; c) môi trường chọn lọc, nhiệt độ nuôi cấy, phép thử khẳng định sử dụng; d) kết nêu điều 10 theo số liên cầu phân giả định thể tích mẫu; e) số khuẩn lạc thử số liên cầu phân khẳng định  ... Làm nguội đến 50oC ÷ 60oC 6 .2. 2 .2 Dung dịch TTC Xem 6 .2. 1 .2 6 .2. 2.3 Mơi trường hồn chỉnh Mơi trường (6 .2. 2.1) 000 ml Dung dịch TTC (6 .2. 2 .2) 10 ml Thêm dung dịch TTC vào dung dịch làm nguội đến... quản đến 30 ngày chỗ tối 4oC ± 2oC 6 .2. 2 Thạch m-enterococcus (Slanetz Bartley) 6 .2. 2.1 Môi trường Tryptoza 20 ,0 g Cao men 5,0 g Glucoza 2, 0 g Dikali hidrophotphat (K2HPO4) 4,0 g Natri nitrua (NaN3)... lỗ 0 ,22 µm) Bảo quản dung dịch khỏi tác động ánh sáng 6 .2. 1.3 Dung dịch hoàn chỉnh Dung dịch (6 .2. 1.1) 000 ml Dung dịch TTC (6 .2. 1 .2) 10 ml 1) Theo hướng dẫn nhà sản xuất Thêm dung dịch TTC vào