TIÊUCHUẨN QUỐC GIA TCVN 8775:2011 CHẤT LƯỢNG NƯỚC - XÁC ĐỊNH COLIFORM TỔNG SỐ - KỸ THUẬT MÀNG LỌC Water quality - Total coliform - Membrane-filter technique Lời nói đầu TCVN 8775:2011 hoàn toàn tương đương với METHOD 9132 Cơ quan Bảo vệ môi trường Hoa Kỳ (EPA METHOD 9132) với thay đổi biên tập cho phép TCVN 8775:2011 Ban kỹ thuật Tiêuchuẩn quốc gia TCVN/TC 147 Chất lượng nước biên soạn, Tổng Cục Tiêuchuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học Công nghệ công bố Lời giới thiệu Tiêuchuẩn xây dựng theo phương pháp tương đương có sửa đổi với METHOD 9132 Cơ quan bảo vệ Mơi trường Hoa Kỳ (EPA METHOD 9132) Trong phần nội dung tiêuchuẩn bổ sung sửa đổi sau: Bổ sung thêm tên tài liệu viện dẫn toàn nội dung tiêuchuẩn để làm rõ thêm thông tin Bổ sung thêm thích 2.2 để giải thích thêm quy trình làm giàu bước (trực tiếp) Bổ sung thêm thích 7.3.2 để cung cấp thêm thơng tin số sản phẩm có sẵn thị trường áp dụng cho tiêuchuẩn Bỏ Điều khơng có nội dung đề cập Bổ sung thêm tên Hình cho sơ đồ chuyển lên Điều theo nội dung đề cập quy trình chỉnh sửa số tham chiếu bị viện dẫn nhầm CHẤT LƯỢNG NƯỚC - XÁC ĐỊNH COLIFORM TỔNG SỐ - KỸ THUẬT MÀNG LỌC Water quality - Total coliform - Membrane-filter technique Phạm vi áp dụng 1.1 Phương pháp dùng để xác định số lượng nhóm coliform nước thải nước ngầm 1.2 Nhóm coliform phân tích qui trình bao gồm tất vi khuẩn tạo khuẩn lạc có ánh kinh vàng-xanh 24 h ni cấy Tóm tắt phương pháp 2.1 Một lượng mẫu xác định lọc qua màng lọc có khả giữ lại vi khuẩn có mẫu 2.2 Trong qui trình làm giàu hai bước, màng lọc có chứa vi khuẩn đặt lên hấp thụ bão hòa mơi trường trytose lauryl, ủ (35 ± 0,5) oC 2h Sau đó, màng lọc chuyển vào hấp thụ bão hòa mơi trường M-Endo lên đĩa chứa thạch M-Endo ủ thêm khoảng (21 ± 1)h (35 ± 0,5) oC Sau đếm khuẩn lạc thiết bị phóng đại (kính lúp kính hiển vi soi nổi) ước lượng số coliform có 100 mL mẫu ban đầu CHÚ THÍCH: Trong qui trình làm giàu bước, màng lọc chứa vi khuẩn đặt vào môi trường nuôi cấy (M-Endo thạch M-Endo) ủ (35 ± 0,5) oC (23 ± 1) h Sau đếm khuẩn lạc thiết bị phóng đại (kính lúp kính hiển vi soi nổi) ước lượng số coliform có 100 mL mẫu ban đầu 2.3 Các thao tác xử lý chi tiết phương pháp trình bày Phương pháp tiêuchuẩn để kiểm tra nước nước thải Phương pháp vi sinh để quan trắc môi trường [1] Cản trở 3.1 Clo dư halogen khác cản trở hoạt động vi khuẩn Natri thiosunfat thêm vào để ngăn ngừa tượng 3.2 Những mẫu nước có hàm lượng đồng, kẽm kim loại nặng khác cao gây độc cho vi khuẩn Chỉ nên thêm chất tạo chelat axit etylendiamintetraaxetic (EDTA) nghi ngờ có kim loại nặng mẫu 3.3 Độ đục nước tảo cản trở khác dẫn đến lọc khơng đủ lượng mẫu cần thiết kết có ý nghĩa Kết xác định số lượng coliform thấp thực tế có mặt số lượng lớn loại khơng phải coliform chất độc 3.4 Các mẫu có hàm lượng chất rắn lơ lửng cao gây cản trở đến phát triển khuẩn lạc ảnh hưởng đến việc khuẩn lạc màng lọc Trong trường hợp này, sử dụng Method 9131 Total coliform - Muiltiple tube fermentation technique (Xác định coliform tổng số - Kỹ thuật lên men nhiều ống) Thiết bị vật liệu 4.1 Chai, cốc ống dùng để pha loãng 4.1.1 Sử dụng chai, cốc ống thủy tinh trơ mặt hóa học, nên dùng thủy tinh borosilicat có nút thủy tinh nút vặn để không tạo chất độc chất ức chế vi khuẩn q trình khử khuẩn 4.1.2 Khơng sử dụng nút hay vải cotton Đánh dấu vạch định mức mặt ống chai khơng bị xóa rửa trơi q trình pha lỗng Có thể sử dụng chai nhựa làm vật liệu không độc hại có kích thước phù hợp để thay cho chai thủy tinh, khử khuẩn phù hợp 4.2 Pipet ống đong chia độ 4.2.1 Sử dụng pipet có kích thước thích hợp, miễn chúng chuyển xác nhanh thể tích mẫu theo yêu cầu Sai số hiệu chuẩn nhà sản xuất đưa phải khơng q 2,5 % Sử dụng pipet có vạch định mức đầu hút ngun vẹn Có thể sử dụng pipet chuyển vi khuẩn pipet phù hợp với tiêuchuẩn APHA nêu Các phương pháp chuẩn để kiểm tra sản phẩm từ sữa với phiên Tốt nhất, bảo vệ đầu hút tất pipet nút để loại trừ nguy hiểm nhân viên để loại bỏ khả nhiễm bẩn mẫu qua nước bọt 4.2.2 Sử dụng ống đong chia độ có vạch định mức đáp ứng tiêuchuẩn TCVN 2698:2007 (ASTM D-86), Sản phẩm dầu mỏ - Phương pháp xác định thành phần cất áp suất khí ASTM D 216, Method of Test for Distillation of Natural Gasonline (Phương pháp thử chưng cất sản phẩm dầu mỏ tự nhiên) có giới hạn độ xác theo quy định hành 4.3 Hộp chứa môi trường nuôi cấy Sử dụng bình định mức thủy tinh borosilicat vơ trùng để giảm nhiễm khuẩn Có thể sử dụng bình định mức với kích thước hình dạng, nhiên bình định mức Erlenmeyer với nắp kim loại, phủ giấy tráng kim loại, nút vặn để trộn môi trường tốt thuận tiện cho bảo quản 4.4 Đĩa nuôi cấy 4.4.1 Sử dụng đĩa Petri loại (60 x 15) mm, (50 x 12) mm, kích thước thích hợp khác Đáy đĩa phải phẳng đủ rộng cho hấp thụ môi trường nuôi cấy trải phẳng bề mặt đĩa Bọc đĩa nuôi cấy riêng số lượng thuận tiện giấy kim loại trước khử trùng nhiệt khô, bọc giấy phù hợp khử trùng nồi hấp Nếu sử dụng đĩa Petri thủy tinh, nên sử dụng borosilicat thủy tinh tương đương Vì nắp đĩa nắp lỏng, cần ý để tránh khả môi trường bay hơi, dẫn đến thay đổi nồng độ mơi trường, để trì độ ẩm mơi trường cho phát triển tối ưu khuẩn lạc 4.4.2 Có thể sử dụng đĩa nhựa dùng lần có nắp lắp đặt đáp ứng yêu cầu kỹ thuật nêu Các đĩa nhựa vơ trùng có sẵn dinh dưỡng sản phẩm thương mại thích hợp 4.5 Thiết bị lọc 4.5.1 Thiết bị lọc gồm giá màng lọc (bằng thủy tinh, nhựa, sứ, kim loại trơ với vi khuẩn) phễu lọc lắp chặt móc cài giữ chặt lực từ trường trọng lực Thiết kế phải cho màng lọc giữ an tồn giá đỡ, khơng bị gây hư hại học tất chất lỏng qua màng trình lọc 4.5.2 Bọc riêng hai phần thiết bị giấy bọc phủ để khử khuẩn nồi hấp bảo quản sử dụng Cách khác, xử lý không cần giấy bọc tia cực tím trước dùng Có thể vệ sinh dụng cụ trường cách đốt cồn metyl nhúng nước sôi Không làm cháy phận nhựa 4.5.3 Để tiến hành lọc, gắn đế đỡ màng lọc dung tích L với ống bên cạnh thiết bị phù hợp khác cho chênh lệch áp suất tác động lên màng lọc Nối bình với bơm không cần chân không, bơm lọc vận hành nhờ áp suất nước, hút tay phương tiện khác gây chênh lệch áp suất an tồn Nối thêm bình vào bình lọc nguồn chân khơng để chặn dòng nước tràn sang 4.6 Màng lọc 4.6.1 Sử dụng màng lọc có đường kính lỗ danh định giữ toàn hoàn vi khuẩn coliform màng (0,45 ± 0,02) µm Chỉ sử dụng màng lọc đảm bảo chất lượng chứng nhận nhà sản xuất giữ đầy đủ loài ni cấy, bền sử dụng, khơng có hóa chất độc hại với phát triển vi khuẩn, tốc độ lọc thích hợp, khơng ảnh hưởng đáng kể đến pH, không làm tăng số lượng khuẩn lạc Tốt sử dụng màng lọc có đánh dấu lưới ô vuông cho vi khuẩn không bị ức chế kích thích phát triển dọc theo đường lưới Lưu giữ màng lọc mơi trường bình thường khơng có nhiệt độ độ ẩm khơng q khắc nghiệt Thời gian lưu giữ không năm kể từ ngày sản xuất theo quy định nhà sản xuất 4.6.2 Nếu sử dụng màng lọc khử khuẩn, phải sử dụng màng lọc nhà sản xuất chứng nhận kỹ thuật khử khuẩn không tạo độc tố làm thay đổi đặc tính hóa học lý học màng Nếu màng lọc khử khuẩn phòng thí nghiệm, tách bỏ giấy, không tách hấp thụ, khỏi màng lọc bao gói Chia màng lọc thành tập 10 đến 12 chiếc, theo số lượng khác cho thuận tiện, đặt đĩa Petri 10 cm bọc giấy gói dày Khử khuẩn nồi hấp 10 121 oC Vào cuối giai đoạn khử khuẩn, cần phải để nước thoát nhanh để giảm thiểu nước ngưng tụ màng lọc 4.7 Tấm hấp thụ 4.7.1 Các hấp thụ đĩa giấy lọc có vật liệu khác có chất lượng cao, khơng có sunfit chất gây ức chế phát triển vi khuẩn Sử dụng hấp thụ đường kính khoảng 48 mm có bề dầy đủ để hấp thụ từ1,8 mL đến 2,2 mL môi trường nuôi cấy Tấm hấp thụ khử khuẩn hấp thụ khử khuẩn phòng thí nghiệm phải cho độ axit tổng số nhỏ mg (tính theo CaCO3) chuẩn độ NaOH 0,02 N với chất thị phenolphtalein, pH = 8,3 Nếu có dấu hiệu độ độc hấp thụ, tẩy rửa nước cất loại II 121 oC (trong nồi hấp) 15 min, gạn nước, đóng gói hấp thụ lại đặt lên đĩa Petri lớn đem khử trùng để sử dụng dần Có thể khử trùng hấp thụ đồng thời với màng lọc bao giấy gói tách riêng vật chứa thích hợp khác Sấy khơ hấp thụ cho khơng thấy ẩm trước sử dụng Xem qui trình khử khuẩn màng lọc mơ tả 4.7.2 Có thể thêm 1,5 % thạch vào môi trường nuôi cấy coliform tổng số M-Endo để thay hấp thụ bão hòa chất dinh dưỡng 4.8 Kẹp Kẹp phải có mũi tròn, khơng có gờ mặt Khử khuẩn kẹp cách nhúng vào cồn etyl 95 % cồn methyl tuyệt đối đốt thành lửa trước sử dụng 4.9 Tủ ấm (nuôi cấy) Sử dụng tủ nuôi cấy cung cấp nhiệt độ (35 ± 5) oC trì mức độ ẩm cao (khoảng 90 % độ ẩm tương đối) 4.10 Kính hiển vi nguồn sáng Đếm khuẩn lạc màng lọc kính có độ phóng đại 10 lần đến 15 lần điều chỉnh nguồn sáng cho tạo ánh rõ Tốt sử dụng kính hiển vi trường rộng hai mắt kính Tuy nhiên, sử dụng kính lúp với đèn huỳnh quang nhỏ Sử dụng ánh sáng huỳnh quang trắng-lạnh Không sử dụng loại đèn chiếu sáng cho kính hiển vi có hệ thống quang học lập ánh sáng từ nguồn nóng sáng để nhận dạng khuẩn lạc coliform môi trường Endo Thuốc thử 5.1 ASTM nước loại II (Nước cất lần đạt chuẩn chất lượng TCVN 2117 (ASTM D1193) Nước thuốc thử - Yêu cầu kỹ thuật): Nước phải giám sát độ tinh khiết 5.2 Môi trường M-Endo 5.2.1 Thành phần môi trường: Trytose polypepton 10,0 g Thiopepton Thioton 5,0 g Casiton Tryticase 5,0 g Dịch chiết men 1,5 g Lactoza Natri clorua, NaCl 12,5 g 5,0 g Dikali hydrophosphat, K2HPO4 4,375 g Kali dihydro phosphat, KH2PO4 1,375 g Natri laury sulphat 0,050 g Natri desoxycholat 0,10 g Natri sulphit, Na2SO3 2,10 g Fuchsin kiềm (thuốc nhuộm kiềm) Nước cất (Loại II) 1,05 g lít 5.2.2 Hòa 20 mL etanol 95 % vào L nước cất loại II Đun sôi bể điều nhiệt để tránh phân hủy cacbonhydrat, chuyển khỏi bể điều nhiệt làm nguội xuống 45 oC Không khử trùng nồi hấp, pH cuối phải nằm khoảng từ 7,1 đến 7,3 5.2.3 Bảo quản mơi trường hồn tất tối 20C đến 100C đổ bỏ môi trường chưa dùng sau 96 h Môi trường mẫn cảm với ánh sáng CHÚ THÍCH: Mơi trường làm đơng kết cách thêm 1,2 % đến 1,5 % thạch trước đun sôi 5.3 Môi trường trytose lauryl: xem Method 9131 Total coliform - Muiltiple tube fermentation technique (Xác định Coliform tổng số - Kỹ thuật lên men nhiều ống), 5.3 Lấy, bảo quản xử lý mẫu 6.1 Tất mẫu phải lấy theo kế hoạch lấy mẫu quy định tiêuchuẩn lấy mẫu vi sinh 6.2 Làm hoàn toàn tất dụng cụ thủy tinh chất tẩy rửa thích hợp nước nóng, súc rửa nước nóng để loại bỏ tất chất tẩy rửa dư lại, cuối cùng, súc rửa nước cất (loại II) Nếu sử dụng máy rửa, máy phải có hệ thống ống dẫn nước làm thép khơng gỉ vật liệu không độc hại với vi khuẩn Không sử dụng ống đồng để dẫn nước cất loại II Sử dụng hệ thống xả nước thép không gỉ vật liệu không độc hại 6.2.1 Khử khuẩn dụng cụ thủy tinh, ngoại trừ chứa hộp kim loại, khoảng 60 nhiệt độ 170 oC, nhiệt độ toàn đồng khử khuẩn 160 oC Sấy dụng cụ thủy tinh hộp kim loại 170 oC thời gian khơng h 6.2.2 Khử trùng chai chứa mẫu trừ chai làm nhựa, trên, nồi hấp 121 oC 15 6.2.3 Đối với chai nhựa bị méo nồi hấp, khử trùng khí etylen oxit nhiệt độ thấp Nếu chai sử dụng để đựng mẫu có chứa clo dư halogen khác, cho vào lượng Na 2S2O3 đủ để làm tới nồng độ khoảng 100 mg/L mẫu trước đem khử trùng Với chai 120 mL thêm 0,1 mL dung dịch Na2S2O3 10 % (sẽ trung hòa mẫu chứa clorua dư 15 mg/L) Vặn nắp chai vừa đủ chặt, khử trùng cách sấy khô ướt nêu 6.2.4 Nếu lấy mẫu nước có nồng độ đồng kẽm cao mẫu nước thải có nồng độ kim loại nặng cao vào chai có chứa sẵn chất tạo chelat làm giảm độ độc kim loại Việc đặc biệt có ý nghĩa thời gian vận chuyển mẫu nhiều h Sử dụng muối tetranatri axit etylendiamintetraaxetic (EDTA) có nồng độ 372 mg/L Điều chỉnh pH dung dịch EDTA 6,5 trước dùng Có thể thêm riêng biệt EDTA kết hợp EDTA với dung dịch Na 2S2O3 vào chai trước khử khuẩn (0,3 mL dung dịch 10 % EDTA cho chai dung tích 120 mL) 6.3 Khi nạp mẫu vào chai, để khoảng khơng khí chai (ít cao 2,5 cm) để thuận tiện cho việc lắc trộn mẫu trước phân tích Chú ý lấy mẫu phải đại diện cho nước thử nghiệm tránh làm nhiễm bẩn mẫu thời điểm lấy mẫu thời gian trước phân tích (thử nghiệm) 6.4 Chai đựng mẫu phải nút kín nạp mẫu Mở nút chai cẩn thận để tránh đất chất bẩn bắn vào chai Trong lấy mẫu, không cầm nắp cổ chai, bảo quản chúng cho không bị nhiễm bẩn Giữ chai gần phần đáy chai, nạp mẫu vào chai đủ lượng cần thiết mà không làm tràn ra, nắp nút chai đảm bảo phải chặt 6.5 Cần tiến hành phân tích vi khuẩn mẫu nước sau lấy để tránh thay đổi khơng dự đốn Nếu khơng thể phân tích mẫu vòng h kể từ lấy mẫu, phải bảo quản lạnh vận chuyển đến phòng thí nghiệm 6.6 Duy trì nhiệt độ tất mẫu ô nhiễm 10 oC thời gian vận chuyển tối đa h Giữ lạnh mẫu đưa đến vào phòng thí nghiệm phân tích vòng h Nếu thời gian vận chuyển cần nhiều h, nên phân tích trường thiết bị phân tích vi sinh (coliform) trường sử dụng q trình ni cấy kéo dài thời gian (tủ ấm ủ chậm) Qui trình (xem Hình 1) 7.1 Lựa chọn lượng mẫu 7.1.1 Lượng mẫu lấy phân tích phụ thuộc vào mật độ vi khuẩn dự kiến mật độ vi khuẩn mẫu bị ảnh hưởng độ đục 7.1.2 Lượng mẫu lý tưởng lượng mẫu cho khoảng 50 khuẩn lạc coliform không 200 khuẩn lạc tất vi khuẩn Với mẫu nước qua xử lý, tiến hành lọc hai lượng mẫu thử nhau, ví dụ 100 mL 500 mL lớn hơn, hai thể tích mẫu pha loãng Với loại mẫu nước khác tiến hành lọc ba (lọc mẫu) lượng mẫu thử khác tùy thuộc vào mật độ vi khuẩn dự kiến Nếu thể tích cần lọc nhỏ 20 mL (pha lỗng khơng pha lỗng), thêm lượng nhỏ nước cất vơ khuẩn vào phễu lọc trước lọc Việc tăng thể tích nước giúp cho huyền phù vi khuẩn phân tán đồng toàn bề mặt màng lọc 7.2 Lọc mẫu 7.2.1 Dùng kẹp vô khuẩn, đặt màng lọc vô khuẩn giá đỡ màng lọc phận lọc, mặt có đường lưới hướng lên Cẩn thận đặt phễu vào giá đỡ cố định khóa cài Lọc mẫu điều kiện chân khơng yếu Khi mẫu phễu vừa cạn hết, để nguyên màng lọc chỗ, tráng phễu ba lần 20 mL đến 30 mL nước pha lỗng vơ khuẩn, Mở khóa tháo phễu, dùng kẹp vơ khuẩn chuyển màng lọc đặt lên hấp thụ mặt thạch (tấm dinh dưỡng) theo cách trải thảm để tránh tạo bọt khí 7.2.2 Sử dụng thiết bị lọc vơ khuẩn bắt đầu dãy lọc để giảm thiểu nhiễm bẩn ngẫu nhiên Dãy lọc coi bị ngắt quãng thời gian dừng lần lọc mẫu lớn 30 Sau lần bị ngắt quãng thế, cần xử lý mẫu dãy lọc phải khử khuẩn tất dụng cụ sử dụng 7.2.3 Khử khuẩn dụng cụ dãy lọc nước, nước sơi, hoặc, có thể, dùng máy khử khuẩn tia cực tím Khi sử dụng qui trình khử khuẩn tia UV, thời gian phơi nhiễm với xạ UV đủ để khử 99,9 % vi khuẩn Nên bảo vệ mắt để phòng tránh lọt xạ từ buồng khử khuẩn Thiết bị UV chưa phải sản phẩm thương mại khơng u cầu bắt buộc phải sử dụng, không khuyến nghị sử dụng 7.3 Kỹ thuật làm giàu hai bước 7.3.1 Đặt hấp thụ vô khuẩn lên nắp đĩa nuôi cấy vô khuẩn dùng pipet chuyển vào vừa đủ lượng môi trường làm giàu (từ 1,8 mL đến 2,0 mL mơi trường lauryl trytose đến bão hòa) Cẩn thận loại bỏ lượng dung dịch thừa Khử khuẩn nơi đặt màng lọc mà qua mẫu chuyển vào hấp thụ Ủ màng lọc, mà không đảo đĩa thời gian 1,5 đến 2h (35 ± 0,5) oC, độ ẩm tương đối tối thiểu 90 % 7.3.2 Chuyển đĩa nuôi cấy làm giàu khỏi tủ ấm, nhấc màng lọc khỏi hấp thụ đặt lên bề mặt thạch Nếu thấy có bọt khí màng lọc, cẩn thận đặt lại màng lọc lên bề mặt thạch Trong trường hợp sử dụng mơi trường lỏng, chuẩn bị q trình ni cấy cách lấy đĩa nuôi cấy làm giàu khỏi tủ ấm tách đĩa làm hai nửa Đặt hấp thụ vô khuẩn vào nửa đáy hộp lồng bão hòa hấp thụ từ 1,8 mL đến 2,0 mL mơi trường M-Endo Chuyển màng lọc có mẫu cẩn thận lên hấp thụ Loại bỏ miếng đệm dùng Đảo đĩa chứa thạch môi trường lỏng ủ khoảng 20 h đến 22 h (35 ± 0,5) oC CHÚ THÍCH: Hiện nay, thị trường có sẵn sản phẩm dinh dưỡng (tấm hấp thụ có chất dinh dưỡng đựng hợp lồng vô khuẩn, sử dụng cần thêm nước cất theo lượng nhà sản xuất quy định Sử dụng dinh dưỡng có sẵn theo hướng dẫn nhà sản xuất, phù hợp 7.4 Đếm 7.4.1 Khuẩn lạc coliform đặc trưng có màu hồng đến đỏ thẫm với bề mặt ánh kim Vùng ánh kim có kích thước thay đổi từ chấm nhỏ đến phủ toàn bề mặt khuẩn lạc Quan sát đếm khuẩn lạc kính hiển vi soi trường rộng hai mắt độ phóng đại thấp (10 lần đến 15 lần) thiết bị quang học tương tự với nguồn ánh sáng huỳnh quang trắng nêu chiếu vng góc với mặt phẳng màng lọc tốt Tổng số khuẩn lạc đếm (coliform coliform) môi trường M-Endo khơng có mối liên quan với tổng số vi khuẩn có mẫu gốc, biết khơng thể suy luận mối tương quan với chất lượng mẫu nước 7.5 Tính tốn mật độ coliform 7.5.1 Báo cáo mật độ coliform tính theo số coliform (tổng số)/100 mL Tính số vi khuẩn coliform màng lọc có 20 khuẩn lạc coliform đến 80 khuẩn lạc coliform không 200 khuẩn lạc tất vi khuẩn theo công thức sau: (Tổng số) = Vi khuẩn coliform/100 mL 7.5.2 Nước có chất lượng nước uống 7.5.2.1 Đối với nước có chất lượng tốt, số lượng khuẩn lạc coliform nhỏ 20 màng lọc Trong trường hợp này, đếm tất khuẩn lạc coliform sử dụng công thức nêu để tính mật độ coliform 7.5.2.2 Nếu xảy tượng phát triển chập nhau, khuẩn lạc phát triển chồng lên phần toàn màng lọc báo cáo kết "phát triển chập nhau" Nếu tổng số lượng khuẩn lạc coliform coliform coliform lớn 200 màng lọc, số khuẩn lạc nhiều khơng thể đếm xác, báo cáo kết "quá nhiều không đếm được" Trong hai trường hợp phải yêu cầu lấy mẫu chọn thể tích thích hợp để lọc, cần lưu ý thể tích mẫu thử tiêuchuẩn cho nước uống 100 mL Vì thế, thay cho 100 mL lọc màng lọc cách lọc với hai màng lọc, màng lọc 50 mL, lọc với bốn màng lọc, màng lọc 25 mL, v.v … Đếm coliform tổng số quan sát màng lọc báo cáo theo số lượng 100 mL 7.5.3 Nước có chất lượng khác chất lượng nước uống 7.5.3.1 Tương tự với mẫu nước uống được, khơng có màng lọc có số lượng coliform đếm nằm khoảng lý tưởng, báo cáo số lượng coliform theo tổng số khuẩn lạc đếm tất màng lọc cho 100 mL mẫu Ví dụ, hai phần mẫu, phần 50 mL lọc hai màng lọc tương ứng cónăm ba khuẩn lạc coliform, báo cáo kết tám khuẩn lạc coliform 100 mL nghĩa là: ( + 3) × 100 ( 50 + 50 ) 7.5.3.2 Tương tự, phần mẫu 50 mL, 25 mL 10 mL đem lọc tương ứng có số khuẩn lạc coliform 15, 1, báo cáo kết số khuẩn lạc 25/100 mL, nghĩa là: (15 + ) × 100 ( 50 + 25 + 10) 7.5.3.3 Mặt khác, phần mẫu 10 mL, 1,0 mL 0,1 mL lọc tương ứng có số khuẩn lạc coliform 40,9 1, chọn phần mẫu 10 mL để tính mật độ coliform màng lọc có số lượng khuẩn lạc coliform nằm khoảng lý tưởng Kết 400/100 mL, nghĩa là: ( 40 × 100 ) 10 Trong ví dụ cuối này, màng lọc có 40 khuẩn lạc coliform có tổng số khuẩn lạc vi khuẩn lớn 200, báo cáo kết số khuẩn lạc coliform 400/100 mL 7.5.3.4 Báo cáo có "phát triển chập nhau" màng lọc có nhiều khuẩn lạc đếm được" nêu 7.5.2 Yêu cầu mẫu chọn thể tích thích hợp để lọc 7.5.4 Mức độ tin cậy theo thống kê kết sử dụng kỹ thuật màng lọc Mặc dù mức độ tin cậy kỹ thuật màng lọc theo thống kê lớn mức độ tin cậy kỹ thuật MPN, số đếm màng lọc số tuyệt đối Bảng minh họa số mức tin cậy 95 % Bảng - Mức tin cậy 95 % kết màng lọc sử dụng lượng mẫu 100 mL Số lượng khuẩn lạc coliform đếm Mức tin cậy 95 % Dưới Trên 0,05 3,0 0,35 4,7 0,81 6,3 1,4 7,7 2,0 9,2 Hình - Quy trình xác định coliform tổng số theo kỹ thuật màng lọc Kiểm soát chất lượng 8.1 Qui trình kiểm sốt chất lượng chung nêu Phần IV U.S EPA 1978 [2] Những qui trình phải thực thời điểm 8.2 Mẫu phải trì giống điều kiện ban đầu tốt cách bảo quản xử lý cẩn thận Vị trí tần suất lấy mẫu phải đại diện cho đặc tính tính thay đổi chất lượng nước vị trí Các mẫu phải phân tích Nếu khơng thể phân tích ngay, mẫu phải bảo quản lạnh nhiệt độ từ oC đến oC phân tích vòng h kể từ lấy mẫu 8.3 Kiểm sốt chất lượng mơi trường ni cấy có tính định tới độ kết phân tích vi sinh Một số yếu tố quan trọng cần ý tổng hợp 8.3.1 Môi trường dùng năm: ln sử dụng dung dịch mua trước Duy trì bảng kê tất môi trường mua, kể kết kiểm tra quan sát 8.3.2 Lưu giữ mơi trường ngun gói khơng q hai năm Các gói mơi trường mở phải loại bỏ sau sáu tháng 8.3.3 Khi chuẩn bị môi trường, để thời gian mở gói chứa mơi trường ngắn tốt Chuẩn bị môi trường nước loại ion nước cất (loại II) có chất lượng chứng nhận Kiểm tra pH môi trường sau pha thành dung dịch khử khuẩn; pH phải khoảng 0,2 đơn vị so với giá trị quy định Nếu không đạt, phải loại bỏ làm lại 8.3.4 Thời gian tối thiểu khử khuẩn nồi hấp nhà sản xuất qui định, nguy làm hư hỏng môi trường tăng cao tiếp xúc nhiều với nhiệt Lấy môi trường khử khuẩn khỏi nồi hấp áp suất không Hiệu việc khử khuẩn phải kiểm tra tuần, sử dụng strip ampuls Bacillus stearothemophelus 8.3.5 Phải để đĩa thạch mở khoảng 15 sau rót chuyển khỏi tủ lạnh để làm bay ấm Các đĩa thạch phải có bề mặt phẳng, khơng bị vón cục có bọt khí chúng làm giảm tiếp xúc thạch với môi trường 8.3.6 Kiểm tra chất lượng môi trường chuẩn bị bao gồm việc ủ % mẻ môi trường hai ngày 35 oC để giám sát phát triển khuẩn lạc kiểm tra âm tính/dương tính với mơi trường ni cấy ngun chất 8.4 Qui trình kiểm sốt chất lượng phân tích phải bao gồm 8.4.1 Phân tích lặp 10 % tất mẫu dương tính biết 8.4.2 Phân tích mẫu kiểm tra dương tính cho tháng với thơng số thử nghiệm 8.4.3 Phân tích mẫu kiểm tra âm tính cho loạt mẫu phân tích sử dụng nước đệm mẻ mơi trường đem sử dụng thời điểm bắt đầu loạt phép thử sau mười mẫu Khi mẫu kiểm tra cho thấy có nhiễm bẩn, phải tẩy phân tích mẫu 8.4.4 Sử dụng nước cất loại II để kiểm tra định kỳ nhiễm bẩn 8.5 Các qui định kiểm soát chất lượng màng lọc 8.5.1 Có thể mua lọc màng vơ khuẩn đóng gói để khử khuẩn Màng lọc khử khuẩn nồi hấp, dùng etylen oxit, chiếu xạ Nhà sản xuất màng lọc phải chứng nhận màng lọc họ đáp ứng qui định tính vơ khuẩn, độ bám, độ thu hồi, cỡ lỗ, tốc độ dòng, pH, độ axit tổng, hàm lượng phosphat, quy định khác 8.5.2 Tính màng lọc phải thử để đảm bảo kết phù hợp Phải kiểm tra phù hợp lô hàng hình dạng, đường kẻ lưới, khả khuếch tán phát triển khuẩn lạc Cần phải xem xét màng lọc khơng có khuẩn lạc phát triển vùng có diện tích lớn THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Standard methods for Examination of Water and Wastewater, 15 th ed [2] Bordner, R H., et al., Microbiological Methods for Monitoring the Environment, Environmental Monitoring and Support Laboratory, U.S EPA, Cincinnati, OH, EPA-600/8-78-017, 1978 ... độ coliform 7.5.1 Báo cáo mật độ coliform tính theo số coliform (tổng số)/100 mL Tính số vi khuẩn coliform màng lọc có 20 khuẩn lạc coliform đến 80 khuẩn lạc coliform không 200 khuẩn lạc tất... số hiệu chuẩn nhà sản xuất đưa phải không 2,5 % Sử dụng pipet có vạch định mức đầu hút ngun vẹn Có thể sử dụng pipet chuyển vi khuẩn pipet phù hợp với tiêu chuẩn APHA nêu Các phương pháp chuẩn. .. mật độ coliform 7.5.2.2 Nếu xảy tượng phát triển chập nhau, khuẩn lạc phát triển chồng lên phần tồn màng lọc báo cáo kết "phát triển chập nhau" Nếu tổng số lượng khuẩn lạc coliform coliform coliform