NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA BẠC NITRAT (AgNO3) LÊN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA CÂY SÂM NGỌC LINH (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) NUÔI CẤY in vitro

Nghiên cứu đã khảo sát ảnh hưởng của AgNO3 ở các nồng độ khác nhau lên sự tăng sinh mô sẹo, khả năng nhân chồi và tạo rễ in vitro sâm Ngọc Linh cũng như ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

LÊN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA CÂY

SÂM NGỌC LINH (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)

NUÔI CẤY in vitro

Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện : NGUYỄN VIỆT CƯỜNG Niên khóa : 2009 – 2013

Tháng 6/2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA BẠC NITRAT (AgNO3) LÊN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA CÂY

SÂM NGỌC LINH (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)

NUÔI CẤY in vitro

PGS.TS DƯƠNG TẤN NHỰT NGUYỄN VIỆT CƯỜNG ThS NGUYỄN BÁ NAM MSSV: 09126023

Tháng 6/2013

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận này, đầu tiên, em xin bày tỏ lòng tri ân sâu sắc đến Thầy – PGS.TS Dương Tấn Nhựt, người đã hướng dẫn, tạo mọi điều kiện và tận tình giúp

đỡ em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận

Em xin gửi lời cảm ơn đến Thầy – PGS.TS Lê Đình Đôn, Trưởng Bộ Môn Công nghệ Sinh học, trường đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện và giúp

đỡ cho em hoàn thành khóa luận này

Cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em thực hiện khóa luận này

Em xin cảm ơn các Thầy, Cô thuộc bộ môn Công nghệ Sinh học, trường đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh và các Thầy, Cô khác đã chỉ dạy cho em trong suốt thời gian trên giảng đường đại học Đặc biệt, em muốn gửi lời cảm ơn đến cô – KS Tô Thị Nhã Trầm, cố vấn học tập lớp DH09SH, cô đã chỉ dạy, giúp đỡ em trong suốt thời gian

em học tập tại trường

Xin chân thành cảm ơn cô Phượng, anh Luận, chị Hiền, anh Huy, anh Chiến, chị Hương và chị Cương là cán bộ nhân viên Phòng Sinh học Phân tử và Chọn tạo Giống cây trồng đã tạo điều kiện và giúp đỡ em trong thời gian thực tập tại phòng Đặc biệt,

em xin cảm ơn anh – ThS Nguyễn Bá Nam, người đã trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ và chỉ bảo tận tình cho em trong thời gian làm khóa luận

Cảm ơn chị Linh, chị Yến, anh Cương, anh Tâm, chị Ngân, anh Tài, chị Sương, anh Tùng, anh Biên, chị Hạnh, chị Hoàng, anh Hiếu, anh Sang, chị Thủy, chị Thùy Anh và Mạnh Cường đã chia sẻ, động viên và nhiệt tình giúp đỡ Cường trong suốt thời gian qua

Cường cũng xin gửi lời cảm ơn và lời chúc thân ái nhất đến tập thể lớp DH09SH Mong rằng, mọi thành viên trong lớp mình luôn mạnh khỏe, thành công và hạnh phúc Cuối cùng, con xin dành tình cảm thiêng liêng nhất gửi tới bố mẹ – người đã cho con cuộc sống này Em cũng xin cảm ơn các anh chị cùng các cháu Gia đình mình đã luôn dõi theo, ủng hộ, giúp đỡ và động viên con trên mỗi bước con đi Gia đình mãi là chỗ dựa vững chắc và là nơi hạnh phúc nhất của con

Đà Lạt, ngày 15 tháng 6 năm 2013 Nguyễn Việt Cường

TÓM TẮT

Đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của bạc nitrat (AgNO3) lên sự sinh trưởng và phát

triển của cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) nuôi cấy in vitro” do

Nguyễn Việt Cường, trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh thực hiện tại phòng Sinh học Phân tử và Chọn tạo giống cây trồng thuộc viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên, thời gian từ tháng 12/2012 đến tháng 6/2013

Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) là một loài sâm đặc hữu của

Việt Nam Sâm Ngọc Linh có nhiều công dụng trong việc tăng cường thể lực, chống stress, trị suy nhược và chống oxi hóa Tuy nhiên, do phân bố trong tự nhiên rất hẹp và thời gian sinh trưởng dài nên việc sử dụng sâm Ngọc Linh còn hạn chế Việc nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã được nhiều tác giả nghiên cứu nhưng cũng gặp phải khó khăn do sự tích lũy ethylene trong bình nuôi cấy kín làm ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của cây Dựa trên các nghiên cứu trong và ngoài nước, AgNO3 đã được sử dụng trong nghiên cứu này nhằm hạn chế ảnh hưởng của ethylene lên sự sinh trưởng và phát triển của cây sâm Ngọc Linh

Nghiên cứu đã khảo sát ảnh hưởng của AgNO3 ở các nồng độ khác nhau lên sự

tăng sinh mô sẹo, khả năng nhân chồi và tạo rễ in vitro sâm Ngọc Linh cũng như ảnh

hưởng của điều kiện nuôi cấy thoáng khí và không thoáng khí lên khả năng nhân chồi

và tạo rễ của loài cây này

Sau thời gian thực hiện, nghiên cứu đã đạt được một số kết quả khả quan Mô sẹo tăng sinh tốt trên môi trường SH bổ sung 0,2 mg/l TDZ; 0,1 mg/l 2,4-D và 15 mg/l AgNO3 với trọng lượng tươi gấp 1,8 lần so với đối chứng (không bổ sung AgNO3) Số

chồi sâm Ngọc Linh in vitro tăng gấp đôi trong môi trường SH bổ sung 0,1 mg/l BA,

0,5 mg/l NAA; 1 mg/l than hoạt tính và 8 mg/l AgNO3 Nồng độ AgNO3 thích hợp

nhất để sâm Ngọc Linh tạo rễ in vitro là 2 mg/l trên môi trường SH bổ sung 1 mg/l

NAA và 1 g/l than hoạt tính Một điều đáng chú ý là nuôi cấy thoáng khí không thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của sâm Ngọc Linh

SUMMARY

This thesis, entitled “Effects of Silver Nitrate (AgNO3) on the Growth and

Development of Ngoc Linh Ginseng (Panax Vietnamensis Ha et Grushv.) cultured in

vitro”, is formulated by myself, Nguyen Viet Cuong, a student of Nong Lam

University, Ho Chi Minh City The related field research was conducted at Plant Molecular Biology and Plant Breeding Department, Tay Nguyen Institute for

Scientific Research

Ngoc Linh ginseng (Panax Vietnamensis Ha et Grushv.) is an endemic species of

Vietnam Ngoc Linh Ginseng has been shown to have many effects such as fitness promotion, anti-stress, anti-depressant and anti-oxidant However, due to its restricted native habitat and the considerable length of time it takes to grow, Ngoc Linh ginseng supply is limited In addition, micropropagation of this species has been widely studied, but researchers have encountered many difficulties due to the ethylene accumulation in poorly ventilated flasks, which inhibits the plant growth and development Therefore, in the present study, the use of AgNO3 was applied in order

to minimize the effect of ethylene accumulation on Ngoc Linh ginseng growth and development

Effects of various concentrations of AgNO3 and different types of ventilation of the culture vessel headspace on callus and shoot proliferation, and root formation of Ngoc Linh ginseng were investigated

After 8 weeks of culture, the best callus proliferation was achieved on SH medium supplemented with 0.2 mg/l TDZ, 0.1 mg/l 2.4-D and 15 mg/l AgNO3 The results also showed that SH medium supplemented with 1.0 mg/l BA, 0.5 mg/l NAA,

1 g/l active charcoal and 8 mg/l were suitable for shoot proliferation The most successful rooting of shoot was obtained on SH medium with 1.0 mg/l NAA, 1.0 g/l active charcoal and 2 mg/l AgNO3 Ventilation culture system proved ineffective in promoting the growth and development of Ngoc Linh ginseng

Key words: callus proliferation, development, growth, Panax Vietnamensis Ha et

Grushv., rotting, shoot proliferation, silver nitrate (AgNO3), ventilation

MỤC LỤC

Trang

Lời cảm ơn i 

Tóm tắt ii 

Summary iii 

Mục lục iv 

Danh sách các chữ viết tắt vi 

Danh sách các bảng vii 

Danh sách các hình viii 

Chương 1 MỞ ĐẦU 1 

1.1.  Đặt vấn đề 1 

1.2.  Yêu cầu 2 

1.3.  Nội dung thực hiện 2 

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 

2.1.  Sơ lược về nuôi cấy mô tế bào thực vật 3 

2.1.1. Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật 3 

2.1.2. Ưu nhược điểm của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 3 

2.1.3. Tầm quan trọng của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 4 

2.1.4. Ý nghĩa của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 5 

2.1.5. Hệ thống nuôi cấy thoáng khí 5 

2.1.6. Môi trường trong nuôi cấy mô tế bào thực vật 6 

2.1.7. Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật 8 

2.1.8. Sơ lược về vai trò của ethylene và bạc nitrat trong nuôi cấy mô thực vật 11 

2.2.  Giới thiệu cây sâm Ngọc Linh 15 

2.2.1. Phân loại 15 

2.2.2. Đặc điểm hình thái 17 

2.2.3. Đặc điểm sinh thái và sự phân bố của sâm Ngọc Linh 17 

2.2.4. Thành phần và dược tính của sâm Ngọc Linh 18 

2.2.5. Hiện trạng và tiềm năng của cây sâm Ngọc Linh 19 

2.2.6. Một số nghiên cứu có liên quan 20 

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 22 

3.1.  Thời gian và địa điểm nghiên cứu 22 

3.2.  Vật liệu và điều kiện nuôi cấy 22 

3.2.1. Nguồn mẫu 22 

3.2.2. Môi trường nuôi cấy 22 

3.2.3. Điều kiện nuôi cấy 22 

3.2.4. Trang thiết bị và dụng cụ 22 

3.3.  Phương pháp nghiên cứu 22 

3.3.1. Ảnh hưởng của AgNO3 lên sự tăng sinh mô sẹo sâm Ngọc Linh 22 

3.3.2. Ảnh hưởng của AgNO3 lên khả năng nhân chồi sâm Ngọc Linh in vitro 23 

3.3.3. Ảnh hưởng của AgNO3 lên khả năng tạo rễ ở cây sâm Ngọc Linh in vitro 24 

3.3.4. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy thoáng khí và không thoáng khí lên khả năng nhân chồi và tạo rễ ở sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro 24 

3.3.5. Phương pháp thu nhận số liệu 25 

3.4.  Xử lý số liệu 26 

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 

4.1.  Ảnh hưởng của AgNO3 lên sự tăng sinh mô sẹo sâm Ngọc Linh 27 

4.2.  Ảnh hưởng của AgNO3 lên khả năng nhân chồi sâm Ngọc Linh in vitro 29 

4.3.  Ảnh hưởng của AgNO3 lên khả năng tạo rễ ở cây sâm Ngọc Linh in vitro 33 

4.4.  Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy thoáng khí và không thoáng khí lên khả  năng nhân chồi và tạo rễ sâm Ngọc Linh in vitro 36 

4.4.1. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy thoáng khí và không thoáng khí lên khả năng nhân chồi sâm Ngọc Linh in vitro 36 

4.4.2. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy thoáng khí và không thoáng khí lên khả năng tạo rễ sâm Ngọc Linh in vitro 39 

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 43 

5.1.  Kết luận 43 

5.2.  Đề nghị 43 

TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 

PHỤ LỤC 51 

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

2,4-D : 2,4-Dichlorophenoxy acetic acid

ABA : Abscisic acid

IAA : Indole-3-acetic acid

IBA : Indole-3-butyric acid

NAA : -Naphthaleneacetic acid

PGRs : Plant Growth Regulators

RNA : Ribonucleic acid

SH : Schenk và Hildebrandt, 1972

TCL : Thin Cell Layer

TDZ : Thidiazuron

UV : Ultraviolet

         DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm tăng sinh mô sẹo sâm Ngọc Linh 23

Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm nhân chồi sâm Ngọc Linh in vitro 23

Bảng 3.3 Bố trí thí nghiệm tạo rễ ở cây sâm Ngọc Linh in vitro 24

Bảng 3.4 Bố trí thí nghiệm nhân chồi và tạo rễ sâm Ngọc Linh in vitro 25

Bảng 4.1 Ảnh hưởng của AgNO3 lên sự tăng sinh mô sẹo sâm Ngọc Linh 28

Bảng 4.2 Ảnh hưởng của AgNO3 lên khả năng nhân chồi sâm Ngọc Linh in vitro 31

Bảng 4.3 Ảnh hưởng của AgNO3 lên khả năng tạo rễ ở cây sâm Ngọc Linh in vitro 34

Bảng 4.4 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên sự nhân chồi sâm Ngọc Linh 38

Bảng 4.5 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên sự tạo rễ sâm Ngọc Linh 41

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Cây sâm Ngọc Linh ngoài tự nhiên 16

Hình 2.2 Sâm Ngọc Linh 16

Hình 4.1 Ảnh hưởng của AgNO3 lên sự tăng sinh mô sẹo sâm Ngọc Linh 28

Hình 4.2 Khí khổng ở lá của chồi sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro 31

Hình 4.3 Ảnh hưởng của AgNO3 lên khả năng nhân chồi ở sâm Ngọc Linh 32

Hình 4.4 Khí khổng ở lá cây sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro 34

Hình 4.5 Ảnh hưởng của AgNO3 lên khả năng tạo rễ ở sâm Ngọc Linh 35

Hình 4.6 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên sự nhân chồi sâm Ngọc Linh 36

Hình 4.7 Khí khổng ở lá của chồi sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro 38

Hình 4.8 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy sự tạo rễ của sâm Ngọc 40

Hình 4.9 Khí khổng ở lá cây sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro 41

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) được biết đến trên thế giới

với tên gọi Vietnamese ginseng, là một loài sâm đặc hữu của Việt Nam Sâm Ngọc Linh chứa saponin với hàm lượng cao nhất trong các loại sâm hiện nay giúp cho loài sâm này không chỉ có các tác dụng dược lý thông thường mà còn có nhiều công dụng trong việc tăng cường thể lực, chống stress, trị suy nhược và chống oxi hóa (Dong và ctv, 2007) Do đó, sâm Ngọc Linh đã trở thành một loại dược liệu quý không chỉ ở Việt Nam mà còn trên toàn thế giới Tuy nhiên, hiện nay việc sử dụng sâm Ngọc Linh vẫn còn hạn chế do loài sâm này phân bố trong tự nhiên rất hẹp và có thời gian sinh trưởng dài (5 – 7 năm) (Thanh và ctv, 2007) Đồng thời, việc khai thác quá mức đã khiến sâm Ngọc Linh được xếp vào danh sách 250 loài bị đe dọa tuyệt chủng thuộc sách Đỏ Việt Nam (Nhut và ctv, 2011) Vì vậy, việc nhân giống và bảo tồn loài sâm này là rất cần thiết

Hiện nay, sâm Ngọc Linh có thể được nhân giống bằng hạt, đầu mầm thân rễ (Triệu Văn Hùng, 2007) hay sử dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật Trong đó,

kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật là phương pháp hiệu quả nhất để nhân nhanh sâm Ngọc Linh trong thời gian ngắn mà vẫn đảm bảo chất lượng của cây giống Tuy nhiên, một trong những khó khăn của việc nhân giống cây sâm Ngọc Linh cũng như nhiều loài thực vật khác bằng kỹ thuật nuôi cấy mô là sự tích lũy ethylene trong bình nuôi cấy kín Nhiều nghiên cứu đã cho thấy ethylene tích lũy nhiều trong bình nuôi cấy gây ức chế sự hình thành mô sẹo từ rễ khoai lang (Chalutz và de Vay, 1969), ngăn cản sự hình thành chồi ở cây thuốc lá (Huxter và ctv, 1981), ức chế sự tạo rễ từ lá cây

cà chua (Coleman và ctv, 1980) và gây ra hiện tượng vàng lá ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của thực vật Do đó, các hiện tượng này cần được nghiên cứu để tìm biện pháp khắc phục

Sử dụng bạc nitrat (AgNO3) để khắc phục hiện tượng tích lũy ethylene là biện pháp đã được áp dụng nhiều và thành công nhất Thông qua sự ức chế hoạt động của ethylene, AgNO3 có thể kích thích sự tái sinh cây con ở Brassica campestris ssp

chinensis (Chi và Pua, 1989), kích thích sự hình thành phôi vô tính ở cây cà rốt

(Roustan và ctv, 1990), kích thích sự sinh trưởng của mô sẹo cây lúa (Adkins và ctv, 1993), ngăn chặn sự già hóa (Beyer và ctv, 1976a), giảm hiện tượng thủy tinh thể ở cây hướng dương (Mayor và ctv, 2003) và cây hoa đồng tiền (Nguyễn Thị Kim Yến và ctv, 2012) Tuy nhiên, AgNO3 vẫn chưa được áp dụng trên đối tượng cây sâm Ngọc Linh

Xuất phát từ những vấn đề trên, đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của bạc nitrat (AgNO3) lên sự sinh trưởng và phát triển của cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis

Ha et Grushv.) nuôi cấy in vitro” được thực hiện với mục đích nghiên cứu ảnh hưởng

của AgNO3 lên sự nhân nhanh mô sẹo, khả năng nhân chồi và tạo rễ cây sâm Ngọc

Linh in vitro

1.2 Yêu cầu

 Xác định được nồng độ AgNO3 trong môi trường nuôi cấy thích hợp nhất cho

sự tăng sinh mô sẹo sâm Ngọc Linh in vitro

 Xác định được nồng độ AgNO3 trong môi trường nuôi cấy thích hợp nhất giúp

tăng khả năng nhân chồi cây sâm Ngọc Linh in vitro

 Xác định được nồng độ AgNO3 trong môi trường nuôi cấy thích hợp nhất giúp

tăng khả năng tạo rễ ở cây sâm Ngọc Linh in vitro

 Xác định được ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy thoáng khí lên khả năng nhân

chồi và tạo rễ cây sâm Ngọc Linh in vitro

1.3 Nội dung thực hiện

 Chuẩn bị môi trường cấy chuyền mẫu sâm Ngọc Linh nhằm tạo nguồn mẫu ban đầu cho thí nghiệm

 Bố trí các thí nghiệm nhằm xác định nồng độ AgNO3 thích hợp cho sự tăng sinh

mô sẹo, khả năng nhân chồi và tạo rễ cây sâm Ngọc Linh in vitro Sau thời gian

nuôi cấy, thu thập số liệu, chụp hình và ghi nhận kết quả

 Chọn nghiệm thức tốt nhất của hai thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ AgNO3

đến khả năng nhân chồi và tạo rễ sâm Ngọc Linh in vitro để thực hiện thí

nghiệm ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy thoáng khí lên khả năng nhân chồi và

tạo rễ sâm Ngọc Linh in vitro Sau thời gian nuôi cấy, thu thập số liệu, chụp

hình kết quả

 Lựa chọn hình ảnh, xử lý số liệu, viết khóa luận tốt nghiệp

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Sơ lược về nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.1.1 Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nhân giống in vitro hay nuôi cấy mô đều là thuật ngữ mô tả các phương thức

nuôi cấy các bộ phận thực vật trong ống nghiệm có chứa môi trường xác định ở điều kiện vô trùng Môi trường có chứa các chất dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng, vitamin, các hormone tăng trưởng và đường Kỹ thuật này cho phép tái sinh chồi hoặc

cơ quan (sự phát sinh cơ quan) từ các mô như: lá, thân, hoa hoặc rễ (Dương Công Kiên, 2002)

2.1.2 Ưu nhược điểm của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.1.2.1 Ưu điểm

Phương pháp nuôi cấy mô hay nhân giống in vitro có ý nghĩa to lớn trong nghiên

cứu lý luận sinh học thực vật cơ bản, mở ra khả năng tìm hiểu sâu sắc về bản chất của

sự sống Thông qua nuôi cấy mô và tế bào, chúng ta có thể tiến hành so sánh đặc tính của cơ thể với các hợp quần của chúng khi tách ra khỏi cơ thể, từ đó rút ra quy luật về môi tương quan giữa các bộ phận trong cây Thực tế, ta đã tách và nuôi cấy được mô phân sinh (meristem), sau đó cho ra nhóm tế bào không chuyên hóa gọi là mô sẹo (callus), từ mô sẹo có thể kích thích để tái sinh cây hoàn chỉnh Trong tiến trình tạo cây từ mô sẹo, ta có thể gây ra những thay đổi có định hướng ở mức độ tế bào

Nuôi cấy mô cho phép tạo ra các bước phát sinh hình thái được phân biệt một cách rõ rệt Điều này tạo thuận lợi cho công tác nghiên cứu về các quy luật sinh trưởng, phát triển và mối quan hệ giữa chúng với môi trường bên ngoài Từ đó tìm ra các mấu chốt thúc đẩy sự phát triển của thực vật theo chiều hướng mong muốn

Bằng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào, chúng ta có thể tìm hiểu và nghiên cứu mối quan hệ giữa kí sinh và kí chủ Như vậy, nhiều vấn đề về bệnh lý sẽ được giải quyết một cách cơ bản, từ đó giúp tìm ra cơ chế miễn dịch thực vật, phục vụ tốt hơn cho công tác phòng bệnh ở thực vật Một khi con người hoàn toàn làm chủ được cơ chế này thì các biện pháp phòng chống bệnh sẽ được hoàn thiện, hiệu quả và đỡ tốn kém hơn nhiều (Nguyễn Đức Lượng, 2006)

Nhân giống in vitro cho phép tạo một quần thể lớn và đồng nhất trong một thời gian ngắn với diện tích thí nghiệm nhỏ và điều kiện hóa lý kiểm soát được; tạo được nhiều cây con từ mô và cơ quan của cây mà không thực hiện được ngoài thiên nhiên; tạo ra cây con trẻ hóa và phát triển mạnh hơn những cây được nhân giống bằng phương pháp nhân giống cổ điển; tạo dòng cây sạch bệnh bằng cách nuôi cấy mô phân sinh (meristem) hay nuôi cấy phôi tâm (nucellar embryo); bảo quản được một số lượng cây lớn trong một diện tích nhỏ, thích hợp để xây dựng ngân hàng giống và sản xuất các hợp chất thức cấp có hoạt tính sinh học ở quy mô công nghiệp

2.1.2.2 Nhược điểm

Bên cạnh những thuận lợi kể trên, phương pháp nhân giống in vitro còn có những

bất lợi như tốn thời gian và công sức mà giá thành lại cao hơn các phương pháp nhân giống cổ điển Kiểu gene thực vật không ổn định trong một số hệ thống nuôi cấy Thường xảy ra đột biến dinh dưỡng Mức độ đột biến càng cao khi số lần cấy càng nhiều, đặc biệt khi tạo chồi bằng mô sẹo (Takayama, 1991) Tiến tình nhân giống phức tạp vì bao gồm nhiều giai đoạn liên quan nhau trước khi có thể đem ra vườn ươm trồng Đối với một số mô, việc vô trùng trước khi đưa vào cấy rất khó thực hiện Hạn chế nghiêm trọng nhất trong vi nhân giống là tỷ lệ sống sót của cây thấp sau khi được

chuyển ra vườn ươm vì sự khác biệt lớn giữa điều kiện in vitro và ex vitro Tất cả

những khó khăn trên được xem như trở ngại to lớn cho việc ứng dụng rộng rãi kỹ thuật

vi nhân giống các giống thực vật có chất lượng cao

2.1.3 Tầm quan trọng của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

Phương pháp nuôi cấy mô được sử dụng để phục tráng và nhân nhanh các giống cây trồng quý, có giá trị kinh tế cao Hiện nay, phương pháp nhân giống vô tính thực

vật in vitro đã trở thành phổ biến

Phương pháp nuôi cấy mô còn có triển vọng sử dụng rộng rãi trong Công nghệ Sinh học Bằng phương pháp này chỉ sau một thời gian ngắn, chúng ta có thể tạo được một lượng sinh khối lớn, có hoạt chất sinh học như alkaloic, glycoside, các steroid (dùng trong y học), chất dính dùng trong công nghiệp thực phẩm, những chất kìm hãm

sự sinh trưởng của vi khuẩn trong công nghiệp

2.1.4 Ý nghĩa của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

Ý nghĩa thực tiễn quan trọng nhất của nuôi cấy mô tế bào thực vật là áp dụng kỹ thuật sản xuất đại trà có kiểm soát trong tạo giống và nhân giống cây trồng

Những lợi ích trong việc áp dụng nuôi cấy mô trong sản xuất nông nghiệp và lâm nghiệp gồm có kiểm soát được dịch bệnh cây trồng; kiểm soát được chất lượng giống thông qua kiểm soát kiểu gene của giống đem vào sản xuất; kiểm soát được toàn bộ kỹ thuật từ khâu nhân giống đến khâu thu hoạch; tạo ra sự đồng đều về giống, từ đó tạo ra

sự đồng nhất của sản phẩm cuối cùng Do đó, năng suất lao động tăng lên, chất lượng sản phẩm đồng nhất, thuận lợi cho việc cơ giới hóa nông nghiệp

Nuôi cấy mô tế bào thực vật đã đem lại hiệu quả to lớn trong sản xuất nông nghiệp và lâm nghiệp Đây thực sự đã và đang là cuộc cách mạng xanh trong ngành trồng trọt

2.1.5 Hệ thống nuôi cấy thoáng khí

2.1.5.1 Một số hệ thống nuôi cấy thoáng khí

Hệ thống nuôi cấy “Culture Pack”

“Culture Pack” (CP, kích thước 7,5 × 7,5 × 10,5 cm) là từ vật liệu film Neoflon PFA (dày 25 m, công ty TNHH Daikin, Nhật Bản) Sử dụng giá thể rockwool (RW,

16 lỗ cắm của công ty Grodan Rockwool Multiblock AO 18/30, Grodania A/S, Đan Mạch) Thể tích môi trường 100 – 120 ml Đây là hệ thống thoáng khí được sử dụng trên nhiều đối tượng: dâu tây, bạch đàn, chuối, lan ý, địa lan và lan hồ điệp (Nguyễn Phúc Huy, 2006)

Hệ thống nuôi cấy “Miracle Pack”

“Miracle Pack” (MP, kích thước khung 108 × 108 × 130 mm) là hệ thống nuôi cấy được cải tiến từ CP, có thể đặt đèn chiếu lên trên MP gồm film Neoflon PFA được giữ cố định bởi khung làm bằng polycarbonate Hệ thống MP RW sử dụng RW

có 25 lỗ cắm và được đậy lại bằng nắp(Nguyễn Phúc Huy, 2006)

Hệ thống nuôi cấy có lỗ thoáng khí

Hệ thống nuôi cấy thoáng khí sử dụng hộp nhựa Magenta GA 7 (Mỹ) và hộp nhựa tròn khoan 1 đến 2 lỗ đường kính 0,5 cm ở nắp hộp Dán kín các lỗ đã khoan bằng màng MillisealR (Công ty TNHH Millipore, Nhật Bản), kích thước lỗ 0,5 m, đường kính 1,8 mm(Nguyễn Quốc Thiện, 2004)

Mục đích sử dụng hệ thống nuôi cấy thoáng khí

Thông thường, đậy kín bình nuôi cấy ngăn ngừa được sự xâm nhiễm của các vi sinh vật và sự thoát hơi nước quá mức Tuy nhiên, hình dạng bình nuôi cấy kín làm ảnh hưởng đến thành phần các khí Ví dụ tích lũy nước quá mức ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của mô như sự kéo dài của chồi, sự nảy chồi, gia tăng trọng lượng tươi Sự khác

nhau về sinh trưởng của cây Chenpodium rubum in vitro trong các loại bình nuôi cấy là

do thành phần không khí khác nhau (hàm lượng CO2, ethylene) đã được chứng minh Những thông số về trao đổi khí trong bình có thể biểu diễn bằng số lần trao đổi khí trong 1 giờ (N) N trong bình nuôi cấy kín là không đổi Đối với hệ thống nuôi cấy kín sử dụng màng film polypropylene, N có thể tăng từ 3 đến 6 lần (Kozai và Sekimoto, 1988)

Sử dụng hệ thống nuôi cấy thoáng khí cải thiện được hiện tượng thủy tinh thể ở cây hoa bibi (Dillen và Buysens, 1989), cây hoa cẩm chướng (Harkkaart và Versluijs, 1983) và để nâng cao sự sinh trưởng của cây dâu tây (Kozai và Sekimoto, 1988)

Như vậy mục đích của việc sử dụng hệ thống nuôi cấy thoáng khí để tăng cường khả năng trao đổi khí trong bình nuôi cấy và môi trường ngoài nhằm tăng hàm lượng

CO2 lên mức tối ưu trong bình nuôi cấy nhằm tăng khả năng quang hợp của cây in

vitro (Tanaka, 1991), giảm nồng độ khí ethylene và các độc tố (de Proft và ctv, 1985),

giảm hàm lượng O2 trong bình nuôi cấy xuống khoảng 10% (Tanaka, 1991), giải quyết

vấn đề thủy tinh thể của cây con in vitro và hình thành hệ rễ thứ cấp trong giai đoạn in

vitro, điều này cũng góp một phần cải thiện tỷ lệ sống sót của cây khi đưa ra vườn

ươm (Nhut và ctv, 2002)

2.1.6 Môi trường trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

Một trong những yếu tố quan trọng nhất trong nuôi cấy in vitro là thành phần môi

trường nuôi cấy Tùy theo mục đích thí nghiệm thành phần môi trường sẽ thay đổi, nhưng nhìn chung đều có các thành phần sau: khoáng đa lượng, khoáng vi lượng, vitamin, đường, các chất điều hòa sinh trưởng thực vật Ngoài ra, người ta còn bổ sung các chất hữu cơ có thành phần xác định (amino acid, EDTA…) và một số chất có

thành phần không xác định như nước dừa, dịch chiết nấm men,… (Nguyễn Đức Lượng

và Lê Thị Thủy Tiên, 2006)

Khoáng đa lượng

Nhu cầu khoáng trong nuôi cấy in vitro không khác nhiều so với cây trồng trong

điều kiện tự nhiên Các nguyên tố đa lượng cần phải cung cấp là N, P, K, Ca, Mg, Fe Khoáng vi lượng

Nhu cầu khoáng vi lượng trong nuôi cấy in vitro là lĩnh vực còn ít được nghiên

cứu Có rất ít các nguyên tố vi lượng đã được chứng minh là không thể thiếu được đối

với sự phát triển của mô và tế bào như Fe, Mn, B, Zn, Cu, Co, I, Mo

Vitamin

Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau Khi tế bào

và mô được nuôi cấy in vitro thì một vài vitamin trở thành yếu tố giới hạn sự phát

triển Các vitamin thường được sử dụng trong nuôi cấy mô là thiamine (B1), acid nicotinic (PP), biotin, acid folic, acid ascorbic (C), panthothenic acid, vitamin E (tocophenol), riboflavin và p-aminobenzoic acid (B6)

Carbon và nguồn năng lượng

Trong nuôi cấy in vitro, nguồn cacbon giúp mô, tế bào thực vật tổng hợp nên các

chất hữu cơ giúp tế bào phân chia, tăng sinh khối và thường được bổ sung vào môi trường dưới dạng đường đa và đường đơn Hiện nay, người ta thường sử dụng sucrose (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2006)

Các hợp chất hữu cơ bổ sung không xác định

Bổ sung nhiều chất hữu cơ khác nhau vào trong môi trường nuôi cấy thường mang lại kết quả tốt cho sự tăng trưởng của mô Các chất bổ sung này là: dịch chiết nấm men (yeast extract), dịch chiết mầm lúa mạch (malt extract), casein hydrolysate, pepton, dịch chiết khoai tây, dịch chiết chuối

Amino acid và các nguồn cung cấp nitrogen khác

Mặc dù tế bào có khả năng tổng hợp tất cả amino acid cần thiết nhưng sự bổ sung các amino acid vào môi trường nuôi cấy là để kích thích sự tăng trưởng của tế bào – đây là nguồn nitrogen hữu cơ và được hấp thu nhanh hơn nitrogen vô cơ

Than hoạt tính

Bổ sung than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy có 3 ảnh hưởng là hút các hợp chất cản, hút các chất điều hòa sinh trưởng thực vật hoặc các chất làm đen môi trường

Yếu tố làm đặc môi trường

Agar là chất thường được sử dụng nhất để tạo môi trường đặc hay môi trường bán lỏng để nuôi cấy mô thực vật Khi agar được trộn chung với nước thì tạo ra dạng gel và tan ra ở nhiệt độ 60C đến 100C và đặc lại khi nhiệt độ giảm xuống 45C nên agar ổn định trong tất cả điều kiện nhiệt độ môi trường nuôi cấy và không bị phân hủy bởi enzym thực vật Độ cứng của agar được quyết định bởi nồng độ agar sử dụng và

độ pH (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2006)

Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật

Các hormone thực vật (phytohormones) và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật (PGRs) đóng vai trò then chốt trong kiểm soát sự sinh trưởng, biệt hóa, phát triển và sinh sản của thực vật, ảnh hưởng đến các quá trình sinh lý ở các nồng độ khác nhau

Tế bào mô trong hệ thống TCL sẽ phụ thuộc vào môi trường nhiều hơn, nhạy cảm hơn

với các PGRs bên ngoài (Dương Tấn Nhựt, 2006)

Tất cả cây trồng đều tổng hợp auxin tùy theo giai đoạn phát triển của chúng Chúng được tổng hợp từ lá non, trong các chồi đang hoạt động, ở phát hoa và ở trên các quả còn non Auxin lưu thông từ đỉnh xuống phần dưới các cơ quan với một sự phân cực rõ ràng được thấy rõ trên các thực vật còn non Nhưng trong quá trình vận

chuyển này, chúng bị oxy hóa do hoạt động của auxin – oxydases, điều này cho thấy nồng độ auxin luôn cao hơn ở những vùng tổng hợp ra chúng Như vậy, auxin hiện diện với nồng độ vừa đủ ở mức độ các điểm tăng trưởng hoặc ở phát hoa để đảm bảo cho sự nhân giống và kéo dài tế bào Đối với một số loài, auxin cần cho sự hình thành

rễ từ các đoạn cắt

2.1.7.2 Cytokinin

Các cytokinin có liên quan tới sự phát triển thực vật và điều hòa sự phân chia tế bào Cùng với auxin, các cytokinin cần cho sự phân chia và biệt hóa tế bào ở nhiều loài thực vật; người ta cũng đã chứng minh sự liên quan của chúng trong tất cả các giai đoạn của chu trình tế bào (tại các thời điểm chuyển tiếp từ G2 sang M và từ G1 sang S) Trong nuôi cấy mô, chúng cũng cảm ứng sự phát triển lục lạp và hình thành chồi Cytokinin có vai trò kiểm soát quá trình phát sinh phôi sinh dưỡng ở một số loài, làm chậm sự lão hóa mô và thúc đẩy sự hình thành cơ quan chồi, bật chồi bên, phát triển lục lạp, mở rộng lá, tạo khối u và hiện tượng mô phân sinh ngọn phát triển ngang và ức chế sự kéo dài tế bào ở thân và rễ (Dương Tấn Nhựt, 2006)

Quá trình kích thích sự hình thành và tăng nhanh chồi đã đạt được thành công bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào trên môi trường có bổ sung hàm lượng

cytokinin cao

Nhìn chung nồng độ auxin cao và cytokinin thấp thích hợp cho sự ra rễ, ngược lại auxin thấp và cytokinin cao thích hợp cho sự hình thành chồi (Heide, 1965) Các đoạn cắt khi được xử lý ở nồng độ cytokinin cao khó ra rễ hơn các đoạn được xử lý ở nồng độ cytokinin thấp (Okoro và ctv, 1978) Cytokinin tổng hợp ức chế sự hình thành

rễ của các đoạn cắt từ thân (stem cutting) (Pierik và ctv, 1975) Tuy nhiên, cytokinin ở nồng độ thấp, dùng trong giai đoạn cắt của cây đậu (mung bean) và cây thu hải đường

sẽ thúc đẩy sự hình thành rễ, trong khi ở nồng độ cao thì ức chế Sử dụng cytokinin cho các đoạn cắt của cây đậu sau giai đoạn khởi đầu hình thành rễ sẽ không gây ức chế đến sự phát triển của rễ (Bollmark và ctv, 1986)

Các đoạn cắt từ lá thể hiện mối quan hệ giữa auxin và cytokinin vì các đoạn cắt hình thành cả chồi và rễ Ở nồng độ cao (13 mg/l), cytokinin thúc đẩy sự hình thành

chồi và ức chế sự hình thành rễ của các đoạn cắt từ lá cây Begonia trong điều kiện vô

trùng Trong khi đó, auxin ở nồng độ cao có tác động ngược lại Ở nồng độ thấp (2

mg/l), auxin thúc đẩy sự hình thành chồi Ngoài ra, ở nồng độ thấp (0,8 mg/l), cytokinin kích thích sự hình thành rễ

Nồng độ cytokinin quá cao sẽ tạo ra một số lượng lớn chồi bất định nhưng giảm chất lượng của chồi mới Các kinh nghiệm trong việc nhân giống cây trồng cho thấy chất lượng chồi bất định rất quan trọng trong sự tái sinh cây mới từ các đoạn cắt

2.1.7.3 Gibberellin

Gibberellin là một nhóm lớn các hợp chất là diterpenoid có bốn vòng Ngày nay, người ta đã phát hiện hơn 60 loại Gibberellin khác nhau trong thực vật Trong số các loại Gibberellin, Gibberellin A3 (GA3) là phổ biến nhất và có hoạt tính cao nhất

Các hợp chất này có điểm giống nhau ở cấu trúc hóa học đó là sườn gibbane, được trích ra từ thực vật, vi sinh vật và được đánh số sau chữ GA Hoạt động của mỗi hợp chất phụ thuộc vào khả năng di chuyển qua mô hoặc sự biến đổi nó thành một dạng hoạt động khác Acid gibberellic (GA3) và hỗn hợp giữa GA3 và GA7 là những Gibberellin duy nhất có giá trị thương phẩm do chúng thường được sử dụng

Gibberellin có tác dụng gây phản ứng kéo dài tế bào thân cây, nhưng với mức độ sâu sắc và mạnh mẽ hơn nhiều so với auxin Phản ứng kéo dài thân chủ yếu do tăng trưởng tế bào chứ không phải phân chia tế bào Cũng như auxin, gibberellin tác động lên hầu như toàn bộ các quá trình sinh trưởng và phát triển Qua tác động của gibberellin, một lần nữa chúng ta nhận thấy trạng thái cân bằng của các hormone sinh trưởng là tính chất đặc trưng quan trọng của mối tương quan hợp lý trong sinh trưởng

và phát triển Được dẫn truyền theo cả hướng gốc và hướng ngọn theo cả phloem và xylem, gibberellin gây nên hàng loạt các phản ứng trong toàn bộ cơ thể thực vật Các tác động đặc thù của gibberellin bao gồm phá vỡ trạng thái lùn di truyền của cây do tác dụng kéo dài đốt thân, phá vỡ trạng thái ngủ của hạt ngũ cốc thông qua tác dụng kích thích sinh tổng hợp amylase, proteinase và các enzyme thủy phân để huy động các chất dinh dưỡng dự trữ trong hạt giống, kích thích ra hoa ở những cây ưa lạnh và phụ thuộc vào quang chu kỳ, kích thích đậu quả và phát triển quả, một trong số điều kiện có thể ngăn chặn sự lão hóa

Người ta chưa rõ gibberellin có ảnh hưởng trực tiếp đến tổng hợp RNA hay không, mặc dù đã phát hiện mối liên quan giữa gibberellin với tổng hợp RNA và protein trong tế bào

2.1.7.4 Abscisic Acid (ABA)

Abscisic acid (ABA) đóng vai trò như một chất kìm hãm sự tăng trưởng của thực vật, gây ra trạng thái ngủ của hạt, hóa già và rụng lá ABA còn có vai trò điều hòa sự đóng mở khí khổng, điều khiển sự hấp thu nước và các ion của rễ

Trong nuôi cấy mô, ABA đôi khi còn điều khiển sự phát sinh hình thái của mẫu cấy ABA thường kìm hãm sự tăng trưởng của mô sẹo Tuy nhiên, trong một vài thí nghiệm, người ta nhận thấy ABA lại có khả năng kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo Hàm lượng ABA tự nhiên có liên quan đến trạng thái trưởng thành của mô (Tanimoto và ctv, 1995) ABA cần thiết cho sự tăng trưởng bình thường của phôi soma và chỉ trong môi trường có ABA thì phôi soma mới phát triển và có cấu trúc tương tự như phôi hợp tử

2.1.7 Sơ lược về vai trò của ethylene và bạc nitrat trong nuôi cấy mô thực vật 2.1.8.1 Ethylene

Hầu hết các phần khác nhau của cơ thể thực vật bậc cao có thể sản sinh ra ethylene, tuy nhiên tốc độ hình thành khí đó phụ thuộc vào kiểu mô, giai đoạn phát triển của cơ thể thực vật

Ethylene gây ra sự chín trái, sự lão hóa và sự rụng lá, quả, hoa; cảm ứng sự giãn của tế bào theo hướng bên; cảm ứng ra rễ và lông hút,…

Ethylene kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo Như phôi của Ginkgo biloba sẽ

nảy mầm trên môi trường không có chất điều hòa sinh trưởng thực vật nếu như miệng ống nghiệm được đậy bằng nút bông gòn, còn nếu nuôi trong ống nghiệm có cùng loại môi trường nhưng miệng ống nghiệm được đậy bởi parafin thì sẽ có sự tạo mô sẹo vì

có thể lượng ethylene sinh ra từ phôi không thoát được ra bên ngoài nên gây sự tạo mô sẹo (Webb và ctv, 1986) Sự gia tăng lượng ethylene sinh ra do tác động của 2,4-D trong môi trường nuôi cấy, nó sẽ có tác dụng kích thích sự tăng trưởng độc lập với auxin cùng hiện diện (Mackenzie và Street, 1970) Đồng thời có một mối liên hệ giữa tốc độ sinh ra ethylene và tốc độ tăng trưởng của mô sẹo thuốc lá (Huxter và ctv, 1979), thược dược (Gavinlertvatana và ctv, 1982) và cà chua (Mukund và ctv, 1988) Tuy nhiên trong thí nghiệm nuôi cấy rễ khoai lang, Chalutz và de Vay (1969) nhận thấy ethylene có tác dụng ức chế sự hình thành mô sẹo, làm tăng sự hóa bần ở những tế bào tại vị trí vết thương và dường như nó ảnh hưởng ít nhiều đến sự phân chia liên tục của những tế bào chưa phân hóa

Ethylene ngăn cản sự hình thành chồi trong suốt năm ngày đầu tiên của quá trình khởi tạo chồi, nhưng sau đó thúc đẩy sự khởi tạo lá (Huxter và ctv, 1981)

Ethylene vừa có tác dụng kích thích vừa có tác dụng kìm hàm sự ra rễ từ mẫu cấy

in vitro Như sự tạo rễ của mẫu lá cây cà chua bị ức chế nếu có ethylene (Coleman và

ctv, 1980) Fabijan và ctv (1981) cho rằng ethylene cản sự tạo rễ trong những ngày đầu

tiên của quá trình cảm ứng ra rễ từ trụ hạ diệp Helianthus, nhưng sau đó nó lại kích

thích quá trình này

2.1.8.2 Bạc nitrat (AgNO 3 )

Bạc nitrat có tác dụng ngăn chặn hoạt động của ethylene (Beyer, 1976a) Ion bạc

có khả năng đặc biệt trong việc ngăn chặn hoạt động của ethylene ngoại sinh trong các hiện tượng sinh lý, lão hóa và chậm phát triển (Beyer, 1976b) Điều này có thể ứng dụng trong nuôi cấy mô Bổ sung AgNO3 vào môi trường nuôi cấy giúp cải thiện đáng

kể sự tái sinh mô thực vật một và hai lá mầm (Beyer, 1976b;Purnhauser và ctv, 1987; Songstad và ctv, 1988; Chi và Pua, 1989) Cơ chế chính xác của hoạt động AgNO3trên thực vật chưa rõ ràng Tuy nhiên, có một vài bằng chứng cho thấy sự can thiệp của cơ chế đó lên bộ máy thụ cảm ethylene (Beyer, 1976b) Trong những năm gần đây, AgNO3 đã được sử dụng trong nghiên cứu nuôi cấy mô để ức chế hoạt động ethylene vì khả năng hòa tan trong nước và không có độc tố ở nồng độ nhất định (Beyer, 1976a) Rất nhiều các báo cáo cho thấy ứng dụng của AgNO3 trong nuôi cấy

mô cũng như các lĩnh vực khác Sau đây là một số ứng dụng chính của AgNO3 (Kumar

và ctv, 2009)

Tác động của bạc nitrat lên sự phát sinh phôi soma

Về mặt lý thuyết, mỗi tế bào thực vật sống đều có khả năng hình thành phôi soma Phôi soma được hình thành từ tế bào sinh dưỡng thực vật Các ứng dụng của quá trình này bao gồm: nhân giống vô tính tạo cây trồng đồng nhất về mặt di truyền, loại bỏ virus, cung cấp các nguồn mô để chuyển gen, tái sinh tạo cây hoàn chỉnh từ tế bào đơn gọi là protoplasts và phát triển công nghệ hạt giống nhân tạo Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật có thể được dùng để kích thích hình thành mô sẹo và sau đó tạo ra phôi gián tiếp từ mô sẹo hoặc trực tiếp từ các mô nguyên vẹn Tỷ lệ các chất này

để tạo ra mô sẹo hoặc hình thành phôi rất khác nhau ở các loại thực vật Việc sử dụng các AgNO3 cải thiện sinh phôi ở một số loài thực vật như buffalograss (Fei và ctv,

2000), cà phê (Coffe sp.) (Fuentes và ctv, 2000), cà rốt (Nissen, 1994), vân sam trắng

(Kong và Yeung, 1994), Triticum durum (Fernandez và ctv 1999) và Zea mays L

(Vain Hort và ctv, 1989; Songstad và ctv, 1991)

Tác động của bạc nitrat lên cảm ứng tạo chồi và tái sinh chồi

Bạc nitrat có khả năng thúc đẩy nhân chồi ở các loài thực vật khác nhau Sự hình

thành chồi in vitro đã được cải thiện bằng cách bổ sung bạc nitrat trong môi trường nuôi cấy Ganesh và Sreenath (1996) nhận thấy sự nảy mầm in vitro của chồi đỉnh ở loài Coffea dưới ảnh hưởng của AgNO3 Việc bổ sung các N6-benzyladenine và AgNO3 tăng cường đáng kể tỷ lệ nảy mầm Ở nồng độ thấp, AgNO3 làm chậm sự lão

hóa dẫn đến cải thiện sự phát triển và tăng sinh ở cây cà phê vối (Coffea canephora) (Fuentes và ctv, 2000) Bạc nitrat thúc đẩy sự phát triển của chồi C arabica và C

canephora (Giridhar và ctv, 2003) Sự tái sinh chồi củ cải Trung Quốc đã được cải

thiện khi nuôi cấy trong môi trường có bổ sung 0,34 g/l AgNO3 (Pua và ctv, 1996)

Brassica đáp ứng kém với các thao tác nuôi cấy mô (Narasimhulu và Chopra, 1988)

B campestris sản xuất ethylene ở mức độ cao gây ra sự sinh trưởng phát triển bất

thường của cây trong điều kiện nuôi cấy mô (Lentini và ctv, 1988), và cũng ức chế tái sinh chồi trong ống nghiệm (Chi và ctv, 1990; Palmer, 1992; Pua và Chi, 1993) Các lá

mầm và trụ dưới lá mầm của 7 giống thuộc các chi B campestris spp chinensis, spp

pekinensis và spp parachinensis được cải thiện sự tái sinh chồi trên môi trường nuôi cấy bổ sung chất kích thích sinh trưởng và AgNO3

Tác động của các tiền chất của ethylene như 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid (ACC), silver thiosulfate và aminoethoxyvinylglycine (AVG) lên nuôi cấy tạo

chồi nách đã được thử nghiệm trên loài yellow passionfruit (Passiflora edulis) (Reis và

cvt, 2003) Sự tái sinh cơ quan được đánh giá qua số chồi hình thành trên mỗi mẫu, diện tích lá trung bình và chiều cao chồi Khi hoạt động và sự tổng hợp của ethylene bị

ức chế, số chồi và diện tích lá tăng lên rõ rệt Điều này cho thấy hiệu quả của AgNO3

trong sự phát triển in vitro của chồi bên

Sự ức chế hoạt động của ethylene của AgNO3 đã kích thích sự tái sinh chồi từ lá

mầm ở cây Helianthus annus (Chraibi và ctv, 1991) Ở nhiều loài cây, khả năng tái

sinh của tế bào và mô giảm khi số lần cấy chuyền tăng lên (Ogura và Shimada, 1978)

Hiện tượng này xuất hiện ở cây Pennisetum americanum và được Plus cũng ctv (1993)

giải quyết hiệu quả bằng cách bổ sung AgNO3 vào môi trường nuôi cấy nhằm khôi

phục khả năng tái sinh AgNO3 làm tăng tỷ lệ tái sinh chồi ở cây silk tree (Albizzia

julibrissin) và Nicotiana plumbaginifolia

Sự bổ sung putrescine và AgNO3 ảnh hưởng lên sự hình thành hình dạng của rau

diếp xoăn (Chichorium intybus) (Bais và ctv, 2000) Putrescine và AgNO3 cảm ứng

nhân chồi và ra hoa in vitro Cây rau diếp xoăn, thường ra hoa 2 năm 1 lần, có thể được kích thích để ra hoa trong thí nghiệm nghiên cứu sự thụ phấn in vitro và phát

triển của hạt (Bais và ctv, 2000)

Bạc nitrat cho thấy tác động có hiệu quả trong việc tái sinh và nhân giống vô tính một vài loài cây công nghiệp quan trọng như đậu phộng (Pestana và ctv, 1999), đậu

đũa (Brar và ctv, 1999), Brassica sp (Eapen và George, 1997), Capscicum sp (Hyde

và Philips, 1996), dưa hấu (Lim và Song, 1993), dưa leo (Mohiuddin và ctv, 1997), lựu (Naik và Chand, 2003), white marrygold (Misra và Datta, 2001), cây sắn (Zang và ctv, 2001), thuốc lá cảnh (Gavinlertvatana và ctv, 1980)

Tác động của bạc nitrat lên sự ra rễ in vitro

Decalepis hamiltonii Wight thuộc họ Asclepiadaceae, là một loại cây bụi leo bản

địa của bán đảo Deccan và các khu rừng của Western Ghats ở Ấn Độ Loài này được

sử dụng như một loại gia vị ẩm thực do rễ của nó có mùi thơm Vì vậy, tạo rễ in vitro

là một vấn đề lớn trong nuôi cấy mô ở loài cây này Ảnh hưởng của AgNO3 lên sự

hình thành rễ in vitro của Decalepis hamiltonii đã được nghiên cứu Bổ sung 6,8 mg/l

AgNO3 sẽ kích thích rễ mọc và kéo dài (Reddy và ctv, 2001)

Vani là một cây gia vị quan trọng có giá trị thương mại Ảnh hưởng của AgNO3

lên sự ra rễ và nảy chồi đã được nghiên cứu ở cây Vanilla planifolia (Giridhar và ctv,

2001) Số lượng chồi tối đa và chiều dài chồi cao nhất đã đạt được trên môi trường chứa 4,3 mg/l AgNO3 Bạc nitrat không chỉ cảm ứng nhân chồi nhưng cũng kích thích ra rễ ở mẫu vani Các cây con thu được trên môi trường chứa 6,8 mg/l AgNO3 có tỷ lệ sống sót

100% Bạc nitrat cũng kích thích ra rễ và ra hoa in vitro trên cây gỗ thuốc hiếm, Rotula

aquatica Lour Ngâm chồi trong dung dịch chứa NAA (0,45 mg/l) và AgNO3 (2 mg/l) là giải pháp để cải thiện hiệu quả sự ra rễ ở loài này (Sunandakumari và ctv, 2004)

Tác động điều chỉnh biểu hiện giới tính của bạc nitrat

Sự ức chế hoạt động ethylene của AgNO3 đã được sử dụng để ngăn chặn sự phát triển của hoa cái và tạo ra hoa đực (Beyer, 1976b; Takahashi và Jaffe, 1984) Dâu tằm

(Morus alba L.) là cây đơn tính khác gốc Hoa lưỡng tính không xuất hiện trong điều

kiện tự nhiên (Thomas, 2004) Bằng cách xử lý chồi cắt với AgNO3, hoa lưỡng tính có thể được tạo ra ở cây cái Phân tích mô học của những bông hoa lưỡng tính cho thấy cả noãn và túi phấn trong cùng một hoa (Thomas, 2004) Hoa lưỡng tính cũng đã gây ra ở dưa chuột bằng cách xử lý AgNO3 (Stankovic và Prodanovic, 2002) Ethylene và auxin thúc đẩy sự hình thành của hoa cái trong khi giberelin thúc đẩy sự hình thành của hoa đực (Mohan Ram và Jaiswal, 1970) Tăng cường đặc tính của giới cái bằng auxin có thể xảy ra thông qua sự cảm ứng sinh tổng hợp ethylene (Takahashi và Jaffe, 1984) Ethylene có liên quan với biểu hiện giới tính ở thực vật và các cây đơn tính khác gốc tạo

ra nhiều ethylene hơn các cây đơn tính cũng gốc (Rudich và ctv, 1972) Theo đó, AgNO3 có thể là hợp chất tiềm năng để điều chỉnh các biểu hiện giới tính ở thực vật Tác động của bạc nitrat lên sự chín của quả

Ethylene đóng một vai trò quan trọng trong việc khởi xướng và thúc đẩy quá trình chín Xử lý cà chua với các ion bạc đã cho thấy tác động ức chế hoạt động của ethylene và sự chín của quả (Hobson và ctv, 1984) Hơn nữa, nếu các ion bạc đã được

áp dụng ở các giai đoạn chín ngay sau giai đoạn bẻ gãy liên kết cellullar, sự chín có thể ngăn chặn (Tucker và Brady, 1987)

Tác động của bạc nitrat lên sự rụng lá

Ethylene kích thích rụng lá ở cây bông bị chặn bởi các ion bạc (Beyer, 1976b) Nếu không có AgNO3, tất cả các lá sẽ rụng vào ngày thứ 7 Cây được xử lý với nồng

độ AgNO3 ngày càng tăng và được đặt trong ethylene sẽ rụng ít lá hơn Xử lý với 25 mg/l AgNO3 giảm thời gian rụng lá 100% xuống 2 ngày Xử lý AgNO3 cũng làm chậm ảnh hưởng của ethylene Thí nghiệm tương tự khác với các cây bông trưởng thành đã chứng minh một khả năng của AgNO3 trong việc ngăn chặn hiện tượng rụng trái non

và hoa (Beyer, 1976b)

2.2 Giới thiệu cây sâm Ngọc Linh

2.2.1 Phân loại

2.2.1.1 Lịch sử phát hiện

Ngày 19 tháng 3 năm 1973, Đào Kim Long và Nguyễn Châu Giang (được biết có

cả Nguyễn Thị Lê) đã phát hiện và thu được những mẫu sâm Ngọc Linh đầu tiên ở núi Ngọc Linh, độ cao từ 1500 – 2200 m, thuộc địa phận của tỉnh Kon Tum hiện nay Hai

tác giả đặt tên cho cây thuốc này là “sâm đốt trúc” – Panax arculeatus (Đào Kim Long

và Nguyễn Châu Giang, 1991) Những tiêu bản đầu tiên này hiện đã không còn

Sau đó vào đầu năm 1979, trong một báo cáo được viết về kết quả “Điều tra phát hiện cây sâm đốt trúc ở Quảng Nam – Đà Nẵng”, Đống Việt Thắng đã thu được nhiều mẫu, mô tả khá đầy đủ các chi về đặc điểm hình thái Tác giả cũng đồng quan điểm

với Phạm Hoàng Hộ (1970) về tên khoa học là Panax schinseng Nees var japonicus

Mak và cũng từ năm 1978 tên gọi là “sâm K5” được viết trên sách báo

Đến năm 1985, trong chương trình hợp tác giữa Việt Nam và Liên Xô, cây sâm Ngọc Linh được xác định là một loài mới bởi Hà Thị Dụng và I V Grushvitzky Từ

đó Panax vietnamensis Ha et Grushv chính thức được công bố với thế giới, nhiều nhà

khoa học nước ngoài thường gọi là sâm Việt Nam (Vietnamese ginseng)

Chi : Panax (Sâm)

Tên khoa học : Panax vietnamensis Ha et Grushv

Tên tiếng Việt : Sâm Việt Nam, Sâm Ngọc Linh,

Sâm Khu Năm, Thuốc Dấu Tên tiếng Anh : Vietnamese ginseng

Hình 2.1 Cây sâm Ngọc Linh ngoài tự nhiên

(sieuthitra.net)

Hình 2.2 Sâm Ngọc Linh

(Panax vietnamensis Ha et Grushv.)

(botanyvn.com)

ở cây hoang dại, thân rễ là phần phát triển mạnh nhất chứa chất dự trữ, hoạt chất Hình dạng rễ củ rất thay đổi, rễ củ ở cây sâm hoang dại rất phát triển, có dạng con quay, hình trụ, có màu vàng nhạt mang nhiều rễ con với những vành ngang (Nguyễn Văn Trương và Trịnh Văn Thịnh, 1991)

Thân khí sinh mảnh, thẳng màu xanh hay hơi tím, mọc thẳng, mang 2 – 3 lá kép chân vịt mọc vòng Mỗi lá kép có 5 lá chét thuôn, dài 10 – 14 cm, rộng 3 – 5 cm, mép khía răng cưa, gốc nhọn, đầu vuốt nhọn, có lông ở cả hai mặt, cuống lá chét ngắn dưới

1 cm

Cụm hoa tán, mọc ở ngọn, thường có 1 tán, cá biệt có tán phụ, cuống cụm hoa dài 15 – 30 cm Hoa nhỏ, màu trắng ngà, cuống hoa 1 – 1,5 cm; đài 5, hợp ở gốc, hình tam giác; 5 cánh hoa hình tam giác rộng; nhị 5, chỉ nhị mảnh; bầu 2 ô, cá biệt 1 ô; đầu nhụy chẻ đôi

Quả hình cầu hoặc hình cầu hơi dẹt, đường kính 0,6 – 1,0 cm; khi chín màu đỏ,

có chấm đen Hạt 1 – 2, gần tròn, đường kính 2 – 3 mm, dài 3 – 4 mm; màu trắng xám (Triệu Văn Hùng, 2007)

2.2.3 Đặc điểm sinh thái và sự phân bố của sâm Ngọc Linh

2.2.3.1 Đặc điểm sinh thái

Sâm Ngọc Linh đặc biệt ưa ẩm và ưa bóng, thường mọc rải rác hoặc thành đám nhỏ dưới tán rừng kín thường xanh ẩm; độ cao 1500 – 2200 m Nhiệt độ trung bình ở vùng có sâm mọc tự nhiên từ 15 đến 18C, độ ẩm 90%, lượng mưa khoảng 3000 mm/năm; đất nhiều mùn, giàu chất dinh dưỡng Đất rừng ở đây được tạo thành do lá cây mục lâu ngày, có màu nâu đen, tơi xốp, hàm lượng mùn cao và chứa nhiều nước Hàng năm, phần thân mang lá tàn lụi vào tháng 11; đến tháng 3 năm sau mọc lên thân mới, ra hoa tháng 4 – 5; quả chín tháng 9 – 10 Tái sinh tự nhiên từ hạt hoặc từ phần đầu mầm thân rễ (Triệu Văn Hùng, 2007)

2.2.3.2 Sự phân bố của sâm Ngọc Linh

Trong số hơn mười loài và dưới loài đã biết của chi Nhân Sâm (Panax), ở Việt

Nam có ba loài mọc tự nhiên và một loài là cây nhập trồng Sâm Ngọc Linh được phát hiện sau cùng vào 1973 Đến 1985, loài sâm này mới được công bố là hoàn toàn mới đối với giới khoa học Đến nay sâm Ngọc Linh chỉ mới được phát hiện duy nhất ở vùng núi Ngọc Linh thuộc hai tỉnh Quảng Nam và Kon Tum

Ngọc Linh là dãy núi cao thứ hai của Việt Nam, có tọa độ địa lý từ 107o50’ –

108o7’ kinh tuyến Đông và từ 15o0’ – 15o10’ vĩ tuyến Bắc, đỉnh cao nhất là Ngọc Linh cao 2598 m Những điểm vốn trước đây có sâm Ngọc Linh mọc tự nhiên từ độ cao khoảng 1500 m đến 2200 m, chủ yếu tập trung ở 1800 – 2000 m, thuộc địa bàn của hai huyện Đăk Tô (tỉnh Kon Tum) và Trà My (tỉnh Quảng Nam) Về giới hạn cũng như phân bố của loài sâm này ở núi Ngọc Linh hiện nay đã có nhiều thay đổi

2.2.4 Thành phần và dược tính của sâm Ngọc Linh

2.2.4.1 Thành phần của sâm Ngọc Linh

Những nǎm 1974 – 1975, Viện Dược liệu (Bộ Y tế) nghiên cứu thấy thành phần saponin triterpenic của tam thất, nhân sâm và sâm Ngọc Linh có 9 hoặc 11 chất có Rf ngang nhau, màu giống nhau ở hai hệ dung môi khác nhau Theo Nguyễn Minh Đức (1994), từ sâm Ngọc Linh đã chiết được 50 hợp chất, xác định cấu trúc hoá học gồm 26 hợp chất có cấu trúc đã biết và 24 saponin pammaran có cấu trúc mới Sâm Ngọc Linh chứa chủ yếu các saponin triterpenic (Nguyễn Ngọc Dung, 1995) đồng thời cũng là một trong những loài sâm có hàm lượng saponin khung pammaran cao nhất (khoảng 12 –

15%) và số lượng saponin nhiều nhất so với các loài khác thuộc chi Panax trên thế giới

Ngoài ra, sâm Ngọc Linh còn chứa 11 acid béo, 16 acid amin (trong đó có 8 acid amin không thay thế được), 18 nguyên tố đa lượng, vi lượng, tinh dầu và vitamin C (Nguyễn Văn Trương và Trịnh Văn Thịnh, 1991)

2.2.4.2 Dược tính của sâm Ngọc Linh

Trước khi có những nghiên cứu kỹ lưỡng về tác dụng đối với sức khỏe của sâm Ngọc Linh, sâm đã được các dân tộc thiểu số Việt Nam, như người Xê Đăng, dùng như một loại thuốc trong những bài thuốc cổ truyền cầm máu, lành vết thương, làm thuốc bổ, thuốc chữa sốt rét, đau bụng và phù thũng

Theo tiến sĩ Nguyễn Bá Hoạt, Phó viện trưởng Viện Dược liệu Việt Nam, những kết quả nghiên cứu dược lý thực nghiệm sâm Ngọc Linh đã chứng minh tác dụng chống

stress vật lý, stress tâm lý và trầm cảm, kích thích hệ miễn dịch, chống ôxi hóa, lão hóa, phòng chống ung thư, bảo vệ tế bào gan Nghiên cứu dược lý lâm sàng của sâm Ngọc Linh cũng cho kết quả tốt: bệnh nhân ăn ngon, ngủ tốt, lên cân, tăng thị lực, hoạt động trí tuệ và thể lực cải thiện, gia tăng sức đề kháng, cải thiện các trường hợp suy nhược thần kinh và suy nhược sinh dục, nâng cao huyết áp ở người bị huyết áp thấp

Ngoài những tác dụng như tiến sĩ Nguyễn Bá Hoạt nói trên, theo dược sĩ Đào Kim Long, sâm Ngọc Linh có những tính năng tuyệt hảo như tăng lực, phục hồi sự suy giảm chức năng giúp cho tình trạng của cơ thể trở lại bình thường; kháng các độc tố gây hại tế bào, giúp kéo dài sự sống của tế bào và tăng các tế bào mới Đặc biệt, sâm Ngọc Linh có những tính năng mà sâm Triều Tiên và sâm Trung Quốc không có là tính kháng khuẩn, chống trầm cảm, giảm lo âu, chống ôxi hóa, và hiệp lực tốt với thuốc kháng sinh, thuốc trị bệnh tiểu đường (duoclieu.org)

2.2.5 Hiện trạng và tiềm năng của cây sâm Ngọc Linh

Cây có vùng phân bố rất hẹp và mọc rất rải rác Do là loài sâm quý hiếm nên số lượng cá thể giảm sút nhanh chóng, hiện đang nằm trong 250 loài quý hiếm đang có nguy cơ tuyệt chủng do bị khai thác quá mức và buôn bán bất hợp pháp, hiện sâm Ngọc Linh đã được đưa vào sách đỏ Việt Nam cần được bảo vệ

Để bảo tồn và phát triển cây dược liệu quí hiếm, hiện đã có những dự án để duy trì và bảo tồn giống tại hai tỉnh Quảng Nam và Kon Tum:

Năm 1979, Ủy Ban Nhân Dân Tỉnh Quảng Nam đã cho thành lập Trại dược liệu Trà Linh Bằng cách nhân giống hữu tính và vô tính, trại dược liệu đã có 223000 cây con Trại đã xây dựng quy trình trồng cây sâm Ngọc Linh và phổ biến cho nhân dân trong vùng thực hiện

Năm 1995, Sở Khoa học Công nghệ và Môi trường tỉnh Quảng Nam đã đầu tư nghiên cứu các biện pháp kỹ thuật nhằm bảo vệ và phát triển cây sâm Ngọc Linh Nhằm hình thành vùng nguyên liệu sâm Ngọc Linh và đưa cây sâm trở thành loại cây trồng mang lại nguồn thu nhập ổn định cho người dân trong vùng dự án, Sở đã chủ trì thực hiện dự án “Ứng dụng kỹ thuật tiến bộ xây dựng mô hình phát triển vùng nguyên liệu sâm khu Năm tại xã Trà Linh”

Viện Dược liệu Hà Nội phối hợp với Sở Khoa Học Công Nghệ và Môi Trường Kon Tum thực hiện dự án vùng trồng cây sâm Ngọc Linh vào năm 2003 Cây sâm đã được nhân giống trong năm 2003 và trồng tập trung ở xã Ngọc Lay, huyện Đắk Tô

Năng suất hàng năm ước tính khoảng 50000 cây Mục đích của dự án là quy hoạch vùng có điều kiện thích hợp cho cây sâm Ngọc Linh phát triển và tìm ra phương pháp canh tác thích hợp nhất nhằm bảo tồn loài cây đặc hữu của vùng và giúp xóa đói giảm nghèo ở Kon Tum

Sâm Ngọc Linh là một dược liệu quý và có giá trị kinh tế cao, cần thiết ứng dụng những kỹ thuật mới trong sản xuất để nâng cao giá trị thương mại, xây dựng thương hiệu sâm Ngọc Linh trên thị trường thế giới Trong đó bước đầu tiên là hiện đại hóa việc canh tác Trong nhiều biện pháp, nuôi cấy mô là một kỹ thuật tiên tiến có thể ứng dụng tốt cho sản xuất sản phẩm sâm Ngọc Linh (samngoclinh-kontum.vn)

2.2.6 Một số nghiên cứu có liên quan

Nghiên cứu tái sinh cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv) của

Nhut và ctv năm 2011 đã cho thấy môi trường tăng sinh mô sẹo tốt nhất là SH bổ sung 0,2 mg/l TDZ và 1,0 mg/l 2,4-D Môi trường SH bổ sung 1,0 mg/l BA ; 0,5 mg/l NAA

và 1 g/l than hoạt tính để nhân chồi Môi trường tạo rễ tốt nhất là SH bổ sung 1,0 mg/l NAA và 1 g/l than hoạt tính Kết quả trên được sử dụng trong nghiên cứu này

Năm 1989, Vain và ctv thấy tỷ lệ hình thành mô sẹo ở ngô (Zea mays L.) tăng từ

3 – 10 lần trên môi trường bổ sung từ 1 – 10 mg/l AgNO3

Bốn năm sau, 1993, Adkins và ctv cũng nhận thấy việc bổ sung AgNO3 với nồng

độ 8,45 mg/l giúp tăng sinh mô sẹo thêm 60% ở lúa (Oryza sativa L.) Tuy nhiên trong

điều kiện tối, AgNO3 không có ảnh hưởng đến việc hình thành hoặc tăng sinh mô sẹo Cũng với việc bổ sung AgNO3 nhưng ở nồng độ từ 5, 10 và 15 mg/l, Shuizhang

và ctv (2000) thấy rằng AgNO3 giúp kích thích tạo mô sẹo có khả năng sinh phôi ở cây buffalograss (cây cỏ trâu)

AgNO3 còn có ảnh hưởng đến sự tái sinh và tạo chồi ở cây đậu phộng ở nồng độ

2 mg/l (Elif và ctv, 2005) Điều này được tác giả giải thích là do ion Ag+ trong AgNO3

ức chế hoạt động của ethylene bằng cách giảm khả năng bám của thụ quan trên màng

tế bào với ethylene trong quá trình tác động của ethylene

Với mục đích cải thiện khả năng nhân chồi ở cây sắn (Manihot esculenta Crantz),

AgNO3 cũng đã được Peng và ctv (2001) sử dụng với nồng độ từ 4 đến 12 mg/l Kết quả tốt nhất được ghi nhận ở nồng độ 12 mg/l với tỷ lệ nhân chồi tăng từ 60 lên 90% đồng thời giảm sự hình thành mô sẹo từ 100 xuống 5 %

Một khía cạnh khác là nâng cao khả năng tạo rễ in vitro đã được Ma và ctv nghiên cứu 1998 trên cây táo Royal Gala (Malus domestica Borkh.) Rễ mọc sớm hơn,

số lượng và chiều rễ cũng tăng lên trên môi trường bổ sung từ 0,5 đến 1,7 mg/l AgNO3

là kết quả nhóm đã ghi nhận được

Bên cạnh đó, nghiên cứu của Steinitz và ctv (2010) trên cây Corymbia maculata

cho thấy tác dụng của AgNO3 lên sự hình thành rễ bất định với nồng độ từ 1 đến 4 mg/l Năm 2012, Nguyễn Thị Kim Yến và ctv đã thành công trong việc sử dụng AgNO3 để cải thiện quy trình nhân giống cây đồng tiền (Gerbera jamesonii) Kết quả

cho thấy, 2 mg/l AgNO3 là nồng độ thích hợp nhất cho giai đoạn tạo chồi in vitro và 8

mg/l AgNO3 là nồng độ thích hợp nhất cho giai đoạn tạo rễ in vitro hoa đồng tiền

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ tháng 12 năm 2012 đến tháng 6 năm 2013 tại phòng Sinh học Phân tử và Chọn tạo giống cây trồng, Viện Nghiên cứu Khoa học Tây

Nguyên, số 116 đường Xô Viết Nghệ Tĩnh, phường 7, thành phố Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng 3.2 Vật liệu và điều kiện nuôi cấy

3.2.1 Nguồn mẫu

Nguồn mẫu ban đầu gồm mô sẹo và chồi sâm Ngọc Linh in vitro đã ổn định qua

nhiều lần cấy chuyền hiện có tại phòng Sinh học Phân tử và Chọn tạo giống cây trồng thuộc Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên

3.2.2 Môi trường nuôi cấy

Môi trường sử dụng trong nghiên cứu là môi trường SH (Schenk và Hildebrandt, 1972) bổ sung 8 – 9 g/l agar, 30 g/l đường sucrose và điều chỉnh pH về 5,7 – 5,8 Tùy mục đích từng thí nghiệm mà bổ sung AgNO3, các chất điều hòa sinh trưởng (2,4-D, TDZ, NAA, BA) với các nồng độ khác nhau vào môi trường nuôi cấy Sau đó, môi trường được hấp khử trùng ở 121C, 1 atm trong 30 phút trước khi nuôi cấy

3.2.3 Điều kiện nuôi cấy

Thí nghiệm được thực hiện trong điều kiện phòng nuôi có độ ẩm 50 – 60%, nhiệt

độ 25 ± 2C, sử dụng bóng đèn huỳnh quang, thời gian chiếu sáng 12 giờ/ngày với cường độ chiếu sáng từ 40 – 45 mol.m-2.s-1

3.2.4 Trang thiết bị và dụng cụ

Trang thiết bị: tủ cấy vô trùng, nồi hấp, máy đo pH, cân điện tử, tủ sấy, máy lạnh, nhiệt kế, kệ đặt bình, đèn neon

Dụng cụ: pince, đèn cồn, dao cấy, kéo, bình tam giác, chai thủy tinh

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Ảnh hưởng của AgNO 3 lên sự tăng sinh mô sẹo sâm Ngọc Linh

Mục tiêu của thí nghiệm là xác định nồng độ AgNO3 thích hợp nhất cho sự tăng sinh mô sẹo sâm Ngọc Linh

Cách tiến hành: Mô sẹo sâm Ngọc Linh với kích thước 0,5 cm × 0,5 cm được cấy vào bình thủy tinh 250 ml chứa 40 ml môi trường SH bổ sung 1,0 mg/l 2,4-D và 0,2

mg/l TDZ AgNO3 được bổ sung vào môi trường với các nồng độ khác nhau được

trình bày trong bảng 3.1

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên 1 yếu

tố, 3 lần lặp lại Mỗi lần lặp lại cấy 10 bình/nghiệm thức, mỗi bình cấy 1 mẫu

Các chỉ tiêu theo dõi của thí nghiệm là trọng lượng tươi và trọng lượng khô của

mô sẹo (g) được thu nhận sau 8 tuần nuôi cấy

Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của AgNO3 lên sự tăng sinh mô sẹo sâm Ngọc Linh

Nghiệm thức Nồng độ AgNO3 (mg/l) S1 (Đ/C) 0 S2 5 S3 10 S4 15 S5 20

3.3.2 Ảnh hưởng của AgNO 3 lên khả năng nhân chồi sâm Ngọc Linh in vitro

Mục tiêu của thí nghiệm là xác định nồng độ AgNO3 thích hợp nhất giúp tăng

khả năng nhân chồi sâm Ngọc Linh in vitro

Cách tiến hành: Cụm chồi sâm Ngọc Linh với khoảng 2 – 3 chồi nhỏ được cấy

vào bình thủy tinh 250 ml chứa 40 ml môi trường SH bổ sung 1,0 mg/l BA, 0,5 mg/l

NAA và 1 g/l than hoạt tính AgNO3 được bổ sung vào môi trường với các nồng độ

khác nhau được trình bày trong bảng 3.2

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên 1 yếu

tố, 3 lần lặp lại Mỗi lần lặp lại cấy 10 bình/nghiệm thức, mỗi bình cấy 1 mẫu

Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của AgNO3 lên khả năng nhân chồi sâm Ngọc

Linh in vitro

Nghiệm thức Nồng độ AgNO3 (mg/l) C1 (Đ/C) 0 C2 1 C3 2 C4 4 C5 8 C6 12

Số liệu được thu nhận sau 8 tuần nuôi cấy Các chỉ tiêu theo dõi của thí nghiệm

gồm số lượng chồi (chồi/mẫu), chiều cao chồi (cm), số lượng khí khổng trung bình/900

m2 lá, độ mở khí khổng (m), trọng lượng tươi và trọng lượng khô của cụm chồi (g)

3.3.3 Ảnh hưởng của AgNO 3 lên khả năng tạo rễ ở cây sâm Ngọc Linh in vitro

Mục tiêu của thí nghiệm là xác định nồng độ AgNO3 thích hợp nhất giúp tăng

khả năng tạo rễ ở cây sâm Ngọc Linh in vitro

Cách tiến hành: Chồi sâm Ngọc Linh cao khoảng 2 – 3 cm được cấy vào bình

thủy tinh 250 ml chứa 40 ml môi trường SH bổ sung 1,0 mg/l NAA và 1,0 g/l than

hoạt tính AgNO3 được bổ sung với các nồng độ được trình bày trong bảng 3.3

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên 1 yếu

tố, 3 lần lặp lại Mỗi lần lặp lại cấy 10 bình/nghiệm thức, mỗi bình cấy 1 mẫu

Số liệu được thu nhận sau 8 tuần nuôi cấy Chỉ tiêu theo dõi của thí nghiệm gồm số

lượng rễ (rễ/mẫu), chiều dài rễ (cm), chiều cao cây (cm), số lượng khí khổng trung

bình/900 m2 lá, độ mở khí khổng (m), trọng lượng tươi và trọng lượng khô của cây (g)

Bảng 3.3 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của AgNO3 lên khả năng tạo rễ ở cây sâm

Ngọc Linh in vitro

Nghiệm thức Nồng độ AgNO3 (mg/l) R1 (Đ/C) 0 R2 1 R3 2 R4 4 R5 8 R6 12

3.3.4 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy thoáng khí và không thoáng khí lên khả 

năng nhân chồi và tạo rễ ở sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro

Mục tiêu của thí nghiệm là xác định ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy thoáng khí

và AgNO3 đối với khả năng nhân chồi và tạo rễ ở cây sâm Ngọc Linh in vitro

Cách tiến hành: Cụm chồi sâm Ngọc Linh với khoảng 2 – 3 chồi nhỏ được cấy

vào bình thủy tinh 250 ml chứa 40 ml môi trường SH bổ sung 1,0 mg/l BA; 0,5 mg/l

NAA và a mg/l AgNO3 (nghiệm thức tốt nhất của thí nghiệm 2) Chồi sâm Ngọc Linh

được cấy vào bình thủy tinh 250 ml chứa 40 ml môi trường SH bổ sung 1,0 mg/l

NAA; 1,0 g/l than hoạt tính và b mg/l AgNO3 (nghiệm thức tốt nhất của thí nghiệm 3) Các nghiệm thức đối chứng không chứa AgNO3 Các chồi và cụm chồi được nuôi cấy trong điều kiện thoáng khí và không thoáng khí như các nghiệm thức được trình bày trong bảng 3.4 Điều kiện thoáng khí được tạo ra trong bình thủy tinh có nắp đậy bằng nilon, trên nắp có lỗ (d = 1,8 mm) được dán bằng màng MillisealR (Công ty TNHH Millipore, Nhật Bản), kích thước lỗ 0,5 m Bình thủy tinh với nắp đậy bằng nilon không có lỗ tạo điều kiện nuôi cấy không thoáng khí

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên 1 yếu

tố, 3 lần lặp lại Mỗi lần lặp lại cấy 10 bình/nghiệm thức, mỗi bình cấy 1 mẫu

Số liệu được thu nhận sau 8 tuần nuôi cấy Chỉ tiêu theo dõi của thí nghiệm gồm

số lượng chồi (chồi/mẫu), chiều cao chồi (cm), số lượng rễ (rễ/mẫu), chiều dài rễ (cm), chiều cao cây (cm), số lượng khí khổng trung bình/900 m2, độ mở khí khổng (m), trọng lượng tươi và trọng lượng khô của cây và cụm chồi (g)

Bảng 3.4 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy thoáng khí và không

thoáng khí lên khả năng nhân chồi và tạo rễ sâm Ngọc Linh in vitro

Nghiệm

thức

BA (mg/l)

NAA (mg/l)

Than hoạt tính (g/l)

Nồng độ AgNO3(mg/l)

Điều kiện nuôi cấyKC1 1,0 0,5 0,0 0,0 Không thoáng khí

3.3.5 Phương pháp thu nhận số liệu

 Số lượng chồi (chồi/mẫu) là số chồi đã có đủ 2 lá trên cụm chồi Chiều cao chồi (cm) là chiều cao từ gốc đến ngọn chồi (không tính củ) Chiều cao cây (cm) là chiều cao từ đầu củ đến ngọn cây

 Số lượng khí khổng trung bình/900 m2 lá là số lượng khí khổng đếm được trên

lá sâm Ngọc Linh quan sát dưới 1 quang trường của kính hiển vi quang học ở vật kính ×40

 Độ mở khí khổng là khoảng cách lớn nhất giữa hai mép trong của khí khổng khi

mở được đo trực tiếp dưới kính hiển vi quang học ở vật kính ×40 bằng thang đo sẵn (Keynce Corporation, Japan)

 Trọng lượng tươi của mẫu là trọng lượng của mẫu khi còn tươi và được thu nhận ngay sau khi lấy ra khỏi bình nuôi cấy Trọng lượng khô của mẫu là trọng lượng không đổi của mẫu sau khi được sấy khô 3 ngày trong tủ sấy ở nhiệt độ 60C Các chỉ tiêu này được thu nhận bằng cân phân tích có giới hạn đo nhỏ nhất là 0,001 g

3.4 Xử lý số liệu

Số liệu thu nhận được xử lý trên máy tính bằng phần mềm SPSS Advanced Statistics 16.0 Đọc kết quả dựa vào bảng ANOVA, bảng trung bình và bảng trắc nghiệm phân hạng các nghiệm thức bằng phương pháp Duncan (P = 0,05)

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Ảnh hưởng của AgNO 3 lên sự tăng sinh mô sẹo sâm Ngọc Linh

Qua 8 tuần nuôi cấy, kết quả thí nghiệm đã cho thấy AgNO3 đã có ảnh hưởng rõ rệt đến sự tăng sinh mô sẹo sâm Ngọc Linh Sự tăng sinh đó thể hiện qua sự khác biệt

về trọng lượng tươi và trọng lượng khô trung bình của mô sẹo ở các nghiệm thức được

xử lý với AgNO3 ở các nồng độ khác nhau so với đối chứng (bảng 4.1, hình 4.1)

Ở nghiệm thức đối chứng (không bổ sung AgNO3), trọng lượng tươi và trọng lượng khô trung bình của mô sẹo rất thấp, lần lượt là 0,454 và 0,035 g (bảng 4.1) Khi tăng nồng độ AgNO3 trong môi trường nuôi cấy (từ 5 đến 20 mg/l), trọng lượng tươi

và trọng lượng khô trung bình của mô sẹo tăng dần và đạt cao nhất tại nghiệm thức S4 (15 mg/l AgNO3) Ở nghiệm thức này, trọng lượng tươi và trọng lượng khô trung bình của mô sẹo lần lượt đạt 0,981 g và 0,078 g gấp 2 lần so với đối chứng (bảng 4.1) Điều này cho thấy sự tích lũy của ethylene trong bình nuôi cấy đã kìm hàm sự phát triển của

mô sẹo (Adkins và ctv, 1993) và AgNO3 được bổ sung vào môi trường nuôi cấy đã kích thích sự phát triển của mô sẹo thông qua việc ức chế hoạt động của ethylene

(Shuizhang và ctv, 2000) Kết quả tương tự cũng được ghi nhận ở lúa (Oryza sativa L.) và ngô (Zea mays L.) Mô sẹo lúa tăng sinh thêm 60% trên môi trường bổ sung

8,45 mg/l AgNO3 (Adkins và ctv, 1993) trong khi tỷ lệ hình thành mô sẹo ở ngô tăng 3 – 10 lần trên môi trường bổ sung từ 1 – 10 mg/l AgNO3 (Vain và ctv, 1989)

Khi tăng nồng độ AgNO3 đến 20 mg/l (nghiệm thức S5), trọng lượng tươi và trọng lượng khô trung bình của mô sẹo lại giảm và thấp hơn so với nghiệm thức S4 Mặc dù vậy, sự khác biệt này không có ý nghĩa về mặt thống kê (bảng 4.1) Do đó, có thể bổ sung AgNO3 với nồng độ từ 15 đến 20 mg/l Tuy nhiên, 15 mg/l AgNO3 vẫn là lựa chọn có lợi về mặt kinh tế hơn trong thực tiễn

Vậy, nồng độ AgNO3 thích hợp nhất cho sự tăng trưởng của mô sẹo sâm Ngọc Linh là 15 mg/l

Bảng 4.1 Ảnh hưởng của AgNO3 lên sự tăng sinh mô sẹo sâm Ngọc Linh

Nghiệm

thức

Nồng độ AgNO3(mg/l)

Trọng lượng tươi (g)

Trọng lượng khô (g)

Hình 4.1 Ảnh hưởng của AgNO3 lên sự tăng sinh mô sẹo sâm Ngọc Linh Mô sẹo được

nuôi cấy trong 8 tuần nuôi cấy trên môi trường SH bổ sung 1,0 mg/l 2,4-D; 0,2 mg/l TDZ và AgNO 3 với nồng độ thay đổi như sau:

4.2 Ảnh hưởng của AgNO 3 lên khả năng nhân chồi sâm Ngọc Linh in vitro

Kết quả ở bảng 4.2 cho thấy các chỉ tiêu đánh giá ảnh hưởng của nồng độ AgNO3lên khả năng nhân nhanh chồi sâm Ngọc Linh sau 8 tuần nuôi cấy trên môi trường SH

bổ sung 1,0 mg/l BA; 0,5 mg/l NAA; 1 g/l than hoạt tính và AgNO3 với các nồng độ khác nhau Tùy thuộc vào nồng độ AgNO3 trong môi trường nuôi cấy, khả năng nhân chồi của sâm Ngọc Linh có sự khác biệt ở các nghiệm thức (bảng 4.2 và hình 4.3)

Từ bảng 4.2, có thể thấy số lượng chồi trung bình ở nghiệm đối chứng cao hơn so với hai nghiệm thức C2 (1 mg/l AgNO3) và C3 (2 mg/l AgNO3) Tuy nhiên, sự khác biệt này không có ý nghĩa về mặt thống kê (bảng 4.2) Do đó, có thể ghi nhận rằng khi tăng nồng độ AgNO3 trong môi trường nuôi cấy (0 – 8 mg/l), số lượng chồi trung bình của mẫu cấy tăng dần Môi trường có bổ sung 4 mg/l và 8 mg/l AgNO3 có số chồi trung bình lớn nhất và lần lượt là 18,667 và 15,000 chồi/mẫu cấy với sự khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê Từ đó cho thấy, môi trường bổ sung AgNO3 với nồng độ từ 4 – 8 mg/l cho số lượng chồi nhiều nhất Kết quả tương tự cũng được Peng

và ctv (2001) ghi nhận trên cây sắn (Manihot esculanta Crantz) với tỷ lệ nhân chồi

tăng từ 60 lên 90% khi nuôi cây trên môi trường bổ sung từ 4 đến 12 mg/l AgNO3 Một điều đáng chú ý là khi nồng độ AgNO3 trong môi trường nuôi cấy tăng lên đến 12 mg/l (nghiệm thức C6), số lượng chồi trung bình của mẫu giảm xuống còn 1/3 so với nghiệm tốt nhất và sự khác biệt này rất có ý nghĩa về mặt thống kê Như vậy, có thể

kết luận khả năng nhân chồi của sâm Ngọc Linh in vitro giảm khi nồng độ AgNO3trong môi trường nuôi cấy cao ( 12 mg/l) Vấn đề tương tự cũng xảy ra trên ba giống sắn có nguồn gốc từ Thái Lan trong nghiên cứu của Peng và ctv (2001) Theo tác giả, nồng độ AgNO3 lớn hơn 8 mg/l sẽ ức chế nhẹ khả năng hình thành chồi của lá mầm có nguồn gốc từ phôi soma ở các giống này

Đối với chỉ tiêu chiều cao chồi trung bình, sự tăng giảm cũng xảy ra tương tự với chỉ tiêu số lượng chồi trung bình Sự khác biệt ở ba nghiệm thức bổ sung 0, 1 và 2 mg/l AgNO3 không có ý nghĩa về mặt thống kê và chiều cao chồi trung bình cũng tăng dần theo nồng độ AgNO3 trong môi trường nuôi cấy (bảng 4.2) Tuy nhiên, chồi sâm Ngọc Linh có chiều cao trung bình lớn nhất (1,912 cm) lại thuộc về nghiệm thức bổ sung 8 mg/l AgNO3, khác biệt có ý nghĩa so với nghiệm thức bổ sung 4 mg/l AgNO3 Như vậy, nồng độ 8 mg/l AgNO3 có tác động tốt lên khả năng nhân nhanh chồi Ở nồng độ AgNO3 cao (12 mg/l), chiều cao chồi trung bình của cây giảm 1,7 lần so với

cây ở nồng độ 8 mg/l với sự khác biệt rất có ý nghĩa (bảng 4.2) Điều này chứng tỏ ảnh hưởng không tốt của AgNO3 ở nồng độ cao và được Elif và ctv (2005) khi nghiên cứu trên cây đậu phộng giải thích bằng giả thuyết về độc tính của ion Ag+ đã làm tăng nồng độ ethylene trong bình nuôi cấy từ đó ảnh hưởng xấu đến chiều cao chồi

Bên cạnh hai chỉ tiêu trên, trọng lượng tươi và trọng lượng khô của cụm chồi cũng là các chỉ tiêu rất quan trọng Trọng lượng tươi của cụm chồi cho biết mức độ sinh trưởng và phát triển của cụm chồi Trọng lượng khô của cụm chồi cho biết khả năng tích lũy hàm lượng các chất khô và muối khoáng, chỉ tiêu này đánh giá chính xác khả năng sinh trưởng và phát triển của cụm chồi Với 2 chỉ tiêu này, nghiệm thức C5 cho kết quả tốt nhất với trọng lượng tươi và khô trung bình của cụm chồi lần lượt đạt 2,993 g và 0,384 g (bảng 4.2) Điều này cho chúng ta thêm cơ sở để kết luận môi trường nuôi cấy bổ sung 8 mg/l AgNO3 là môi trường thích hợp nhất để nhân chồi ở cây sâm Ngọc Linh

Ngoài các chỉ tiêu trên, số lượng khí khổng trung bình và độ mở khí khổng cũng cần được quan tâm để có thể đánh giá chính xác khả năng sinh trưởng và phát triển của

cụm chồi sâm Ngọc Linh trong điều kiện in vitro Từ bảng 4.2, có thể thấy sự khác biệt

lớn về số lượng khí khổng trung bình trên diện tích 900 m2 lá giữa nghiệm thức đối chứng và nghiệm thức còn lại Lá của chồi trong môi trường nuôi cấy không bổ sung AgNO3 có số lượng khí khổng lớn (77,33) hơn so với lá của chồi khi nuôi cấy trên môi trường bổ sung AgNO3 Trong đó, môi trường bổ sung 8 mg/l AgNO3 (nghiệm thức C5) có số khí khổng thấp nhất (44,67 khí khổng) (hình 4.2) Tuy nhiên, với chỉ tiêu độ

mở khí khổng, AgNO3 dường như không có nhiều ảnh hưởng Từ bảng 4.2, có thể thấy trên môi trường bổ sung 4 mg/l AgNO3, lá cụm chồi có khí khổng mở rộng nhất 3,333

m, gấp khoảng 3 lần so với đối chứng Trong khi đó, nghiệm thức C6 (12 mg/l AgNO3) và C1 (Đ/C) có độ mở nhỏ nhất 1,167 m Như vậy, có thể thấy rằng, việc bổ sung AgNO3 có ảnh hưởng đến số lượng khí khổng trung bình trên lá cây sâm Ngọc

Linh nuôi cấy in vitro thông qua ảnh hưởng lên sự sinh trưởng của cây còn độ mở khí

khổng bị ảnh hưởng bởi các điều kiện bên ngoài như nhiệt độ, độ ẩm nhiều hơn Điều này cần được nghiên cứu thêm để có cơ sở kết luận

Tóm lại, khả năng nhân chồi của cây sâm Ngọc Linh in vitro tăng lên (số chồi

gấp 2 lần so với đối chứng) khi bổ sung 8 mg/l AgNO3 vào môi trường nuôi cấy