NGHIÊN CỨU TÁCH ACID URSOLIC TỪ VỎ QUẢ TÁO VÀ TỔNG HỢP 1 SỐ DẪN XUẤT

Trong đó phải kể đến họ terpennoid mà điển hình là acid ursolic với khả năng đặc trị hữu hiệu với những bệnh khó chữa như ung thư, viêm, tiểu đường,… Bởi vì vai trò quan trọng như vậy nê

ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ HÓA HỌC

…………o0o…………

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

NGHIÊN CỨU TÁCH ACID URSOLIC TỪ VỎ QUẢ

TÁO VÀ TỔNG HỢP 1 SỐ DẪN XUẤT

SVTH: VÕ TUẤN HÙNG MSSV: 09139069

GVHD: TS TỐNG THANH DANH

TP.HỒ CHÍ MINH, THÁNG 8 NĂM 2013

NGHIÊN CỨU TÁCH ACID URSOLIC TỪ VỎ QUẢ TÁO

LỜI CẢM ƠN

Hoàn thành luận văn tốt nghiệp là một dấu mốc quan trọng trong cuộc đời tôi, kết thúc thời sinh viên và đi làm Bây giờ tôi xin dành những dòng sau đây để cảm ơn những người đã giúp đỡ, đã bên cạnh tôi trong cả thời gian hơn bốn năm đại học cũng như trong giai đoạn làm luận văn tốt nghiệp

Trước tiên, lời cảm ơn xin gửi đến ba mẹ, người đã sinh thành và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho con Ba mẹ còn là một người bạn luôn bên cạnh động viên, giúp đỡ con trong bất kỳ hoàn cảnh nào

Em xin chân thành cảm ơn Thầy TS.Tống Thanh Danh, thầy đã tận tâm hướng dẫn, giúp đỡ và giảng dạy trong quá trình thực hiện đề tài Em cũng xin cảm ơn thầy vì những lời khuyên bổ ích không chỉ trong học thuật mà cả trong cuộc sống

Em xin cám ơn quý thầy cô Bộ môn Công Nghệ Hóa Học, trường Đại Học Nông Lâm TPHCM đã tận tình truyền đạt kiến thức, nhiệt tình giúp đỡ và hỗ trợ cho

em trong quá trình học tập và thực hiện đề tài

Em cũng xin cảm ơn các anh chị cao học, chị Mỹ Tiên, anh Ngọc Vỹ đã giúp đỡ tận tình trong thời gian làm luận văn

Cuối cùng xin cảm ơn tất cả các bạn, những người đã đồng hành cùng tôi trong hơn bốn năm trên giảng đường

Kính chúc mọi người sức khỏe và thành công !

ABSTRACT

Acid ursolic are triterpene pentacyclic triterpenoid compound which occurs widely in plants all over the world Acid ursolic are relatively non-toxic and have many the pharmacologicals Example anti-tumor, anti-inflamatory, antibacterial and more

In this project, acid ursolic was extracted from apple peel The process was optimized by the extracting use two solvents ( ethyl acetate and 2-propanol) In addition, it’s iterative process Acid ursolic after isolation was reacted for synthesizing some derivates Their structures were confirmed using Thin Layer Chromatography, Column Chromatography and 1H-NMR All of compounds will evaluate Biological activity assays

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN iii

ABSTRACT iv

MỤC LỤC v

DANH SÁCH BẢNG viii

DANH SÁCH HÌNH ix

DANH SÁCH SƠ ĐỒ X DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT Xi LỜI MỞ ĐẦU Xii PHẦN 1 TỔNG QUAN 1

1.1 TỔNG QUAN VỀ TÁO 2

1.1.1 Đặc điểm thực vật 2

1.1.2 Phân loại 2

1.1.3 Giá trị dinh dưỡng 2

1.2 TỔNG QUAN VỀ ACID URSOLIC 3

1.2.1 Sơ lược về acid ursolic 3

1.2.2 Nguồn gốc của acid ursolic 4

1.2.3 Tính chất hóa lý[20] 5

1.2.4 Những ứng dụng quan trọng của acid ursolic 6

1.2.4.1 Tác nhân chống lão hóa 6

1.2.4.2 Tác nhân kích thích tóc tăng trưởng 6

1.2.4.3 Hoạt tính kháng khuẩn 6

1.2.4.4 Hoạt tính kháng viêm 7

1.2.4.5 Hoạt tính ức chế khối u 7

PHẦN 2: THỰC NGHIỆM 9

2.1 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 10

2.2 SƠ ĐỒ TIẾN TRÌNH THỰC NGHIỆM 10

2.3 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HỢP CHẤT 11

2.3.1 Khối phổ (MS) 11

2.3.2 Phổ hồng ngoại (IR) 11

2.3.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 11

2.4 HÓA CHẤT VÀ DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM 11

2.4.1 Hóa chất 12

2.4.2 Dụng cụ thí nghiệm 13

2.5 NỘI DUNG THÍ NGHIỆM 13

2.51 khảo sát tách acid ursolic trên táo xanh Việt Nam nếu có 13

2.5.1.1 Nguyên liệu 13

2.5.1.2 Quy trình chiết với dung môi ethyl acetate 15

2.5.1 Tách acid ursolic từ vỏ táo xanh Fuji Úc 16

2.5.2.1 Nguyên liệu 16

2.5.2.2 QUY TRÌNH CHIẾT VỚI DUNG MÔI 2-PROPANOL 18

2.5.1.2 QUY TRÌNH CHIẾT VỚI DUNG MÔI ETHYLACETATE 21

2.5.2 Tổng hợp dẫn xuất của acid ursolic 25

2.5.2.1 Phản ứng ester hóa Ursolic acid 25

PHẦN 3 : KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 27

3.1 QUY TRÌNH TÁCH ACID URSOLIC TỪ VỎ TÁO 28

3.1.1 Chiết acid ursolic từ vỏ táo sử dụng dung môi 2-propanol 28

3.1.2 Chiết acid ursolic từ vỏ táo sử dụng dung môi Ethyl Acetate 30

3.1.3 So sánh hiệu quả chiết với hai loại dung môi 32

3.1.4 phân tích cấu trúc hợp chất Ursolic acid 34

3.2 TỔNG HỢP VÀ PHÂN TÍCH CẤU TRÚC HỢP CHẤT TRONG PHẢN ỨNG ESTER HÓA URSOLIC ACID 37

3.2.1 phản ứng ester hóa Ursolic acid 37

3.2.2 Phân tích cấu trúc hợp chất ester hóa Ursolic acid 39

PHẦN 4 KẾT LUẬN 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO 44

PHỤ LỤC 49

Phụ lục 1a 49

Phụ lục 1b 53

Phụ lục 2a 56

Phụ lục 2b 57

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1.1: Giá trị dinh dưỡng trong 100g Táo ( Táo đỏ, xanh, vàng, Fuji tươi, gồm vỏ)

3

Bảng 1.2: Một số loại thảo dược chứa acid ursolic 4

Bảng 2.1: Các loại hóa chất sử dụng 12

Bảng 2.2: Hệ thống thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 13

Bảng 3.1: So sánh hai phương pháp chiết ứng với hai loại dung môi 32

Bảng 3.2: Phân tích phổ 1H-NMR của Ursolic acid 34

Bảng 3.2: Phân tích phổ 13C-NMR của Ursolic acid 35

Bảng 3.3: Phân tích phổ 1H-NMR của sản phẩm ester hóa ursolic acid 39

Bảng 3.3: Phân tích phổ 13C-NMR của sản phẩm ester hóa ursolic acid 40

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1.1: Một số hình ảnh về táo xanh Fuji 2

Hình 1.2: Acid ursolic và Acid oleanoic 4

Hình 1.3: Rau Oregano Hình 1.4: Hạt Bilberry 5

Hình 2.1 : Táo xanh Việt Nam 13

Hình 2.2: Chạy sắc kí bảng mỏng 16

Hình 2.3 : Táo xanh Fuji Úc 16

Hình 2.4: Sắc ký cột của Ursolic Acid ngâm bằng 2-propanol 20

Hình 2.5 Cột sắc kí sau khi nhồi silicagel 24

Hình 2.6 : Phản ứng ester hóa Ursolic acid 25

Hình 2.7 : Vỏ táo được ngâm bằng 2-propanol 28

Hình 2.8: Kết quả trên bản mỏng của dịch chiết lần 1,2 và 3 với hệ hexan : etylacetate = 70% : 30% 29

Hình 2.9: Dịch chiết trước và sau khi được cao bằng hệ thống cô quay chân không 29

Hình 3.0: Kết quả trên bản mỏng của acid ursolic sau khi sắc ký cột 30

Hình 3.5 phản ứng ester hóa Ursolic acid 37

Hình 3.6 sắc kí bảng mỏng phản ứng ester hóa Ursolic acid với hệ dung môi Hexan:Ethyl acetate = 70:30 38

Hình 3.7 sản phẩm thu được sau khi cô quay chân không 38

DANH SÁCH SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1: Tiến trình thực nghiệm 10

Sơ đồ 2.2: Chuẩn bị nguyên liệu bột vỏ táo 14

Sơ đồ 2.3 quy trình chiết với dung môi Ethyl acetate 15

Sơ đồ 2.4: Chuẩn bị nguyên liệu bột vỏ táo 17

Sơ đồ 2.5: Quy trình chiết với dung môi 2 propanol 18

Sơ đồ 2.6: Quy trình tách acid ursolic với dung môi Ethyl Acetate 22

HPLC: Sắc ký lỏng hiệu năng cao

IR: phổ hồng ngoại (infrared spectroscopy)

IUPAC: International Union of Pure Applied Chemistry

MeOH: methanol

MS: khối phổ (infrared spectroscopy)

m-CPBA: meta-Chloroperoxybenzoic acid

NMR: phổ cộng hưởng từ hạt nhân (nuclear magnetic resonance spectroscopy)

TCL: sắc ký bản mỏng (thin layer chromatography)

MTT: 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide

THF: tetrahydrofuran

LỜI MỞ ĐẦU

Ngày nay, cùng với việc môi trường sống ngày càng suy giảm, bệnh tật ngày càng nhiều Nhu cầu nghiên cứu những loại thuốc mới thay thế những thuốc cũ đã giảm dược tính và để điều trị những bệnh mới ngày càng tăng Do đó, vai trò của ngành công nghệ hóa dược ngày càng quan trọng Với mong muốn hạn chế ảnh hưởng tới môi trường, người ta thường tìm tới nguồn nguyên liệu từ thiên nhiên và thực tế đã tìm

ra nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học mong muốn Trong đó phải kể đến họ

terpennoid mà điển hình là acid ursolic với khả năng đặc trị hữu hiệu với những bệnh khó chữa như ung thư, viêm, tiểu đường,…

Bởi vì vai trò quan trọng như vậy nên acid ursolic và dẫn xuất đã không ngừng được nghiên cứu, tổng hợp nhằm mục đích tìm kiếm những hợp chất có hoạt tính tốt hơn và khả năng điều trị được những bệnh mới Đó cũng chính là lý do đề tài này được triển

khai: Nghiên cứu tách acid ursolic từ vỏ quả táo và tổng hợp một số dẫn xuất

Những mục tiêu cần thực hiện của đề tài:

» Đưa ra quy trình hoàn thiện tách acid ursolic từ vỏ quả táo

» Thực hiện quy trình tổng hợp một số dẫn xuất: các thông số hóa lý, các điều kiện để phản ứng xảy ra, những lưu ý cụ thể,…

» Khảo sát tính chất hóa lý, dược tính của các dẫn xuất tổng hợp được

PHẦN 1 TỔNG QUAN

1.1 TỔNG QUAN VỀ TÁO

1.1.1 Đặc điểm thực vật

Táo (Malus domestica ) là một loại trái cây thuộc chi Malus (khoảng 25 loài)

họ Rosaceae Đây là loại cây ăn quả được trồng rộng rãi nhất Táo là một trong những

trái cây thịt, phần bầu và mô đều trở thành thịt và ăn được Hoa táo của hầu hết các giống đều đòi hỏi thụ phấn chéo để thụ tinh Kích thước quả táo, hình dạng, màu sắc, phụ thuộc vào giống và môi trường Tuy nhiên quả thường tròn, đường kính khoảng 50-100mm [1]

Táo được sử dụng trong đề tài là Táo xanh Fuji , xuất xứ từ Úc Vỏ táo có màu

đỏ xanh la cây, hơi sần sùi Mỗi quả táo nặng tầm 250 g - 300g Quả có ít hạt, phần thịt màu xanh lá cây, giòn, vị chua Táo xanh cũng có thể tìm thấy dễ dàng tại Việt Nam

1.1.2 Phân loại

Táo có hơn 7500 giống cây trồng [2] Mỗi

giống cây khác nhau về năng suất, kích thước cây,

hình dạng và màu sắc của quả, vùng khí hậu,… Hầu

hết các táo được trồng để ăn tươi, và sản suất rượu [3]

Hình 1.1: Một số hình ảnh về táo xanh Fuji

1.1.3 Giá trị dinh dưỡng

Bảng 1.1: Giá trị dinh dưỡng trong 100g Táo ( Táo đỏ, xanh, vàng, Fuji tươi, gồm vỏ)

Chất dinh dưỡng Đơn vị Giá trị các

chất có trong táo

Chất dinh dưỡng

Đơn vị Giá trị các

chất có trong táo

Vitamin B12

1.2 TỔNG QUAN VỀ ACID URSOLIC

1.2.1 Sơ lược về acid ursolic

Acid ursolic (3β-hydroxy-urs-12-en-28-oic acid) cũng được gọi là urson, prunol, micromerol, và malol, là một hợp chất triterpenoid pentacyclic tồn tại trong nhiều loại cây, thảo dược, và các loài thực vật khác [5-15] Triterpenoid pentacyclic hiện diện phổ biến trong tự nhiên và có nhiều ứng dụng rộng rãi trong dược phẩm, thực phẩm và mỹ phẩm Những ứng dụng quan trọng của triterpenoid pentacyclic là

về khả năng chống ung thư, kháng viêm, tác dụng tích cực trong bảo vệ da, tóc, ức chế các loại virus, vi khuẩn và điều trị các loại bệnh Đặc biệt ứng dụng trong mỹ phẩm của acid ursolic cho thấy có nhiều mặt tích cực vì độc tính thấp Do đó, hiện nay nhiều công trình nghiên cứu đã được công bố với các hướng đi riêng biệt [6, 10, 16-18]

Acid ursolic hiếm khi tồn tại mà không có đồng phân của nó là acid oleanolic [(3b)-3-Hydroxyolean-12-en-28-oic acid]

Acid ursolic có công thức C30H48O3 và có cấu tạo cụ thể như sau:

Hình 1.2: Acid ursolic và acid oleanoic

1.2.2 Nguồn gốc của acid ursolic

Acid ursolic được tìm thấy rộng rãi trong tự nhiên trong các loại thảo dược, các loại thực phẩm và một số cây khác Một số loại cây thường biết đến có chứa acid ursolic cho ở bảng sau

Bảng 1.2: Một số loại thảo dược chứa acid ursolic [19]

Holy Basil (Tulsi) Ocimum sanctum L Lamiaceae

Bilberry Vaccinium myrtillus L Vacciniaceae

procumbens DC

Pedaliaceae

Elder Flowers (European

Variety)

Peppermint leaves Mentha piperita L Lamiaceae

Lavender Lavandula augustifolia

Mill

Lamiaceae

Hawthorn Crataegus laevigata (Poir)

DC

Rosaceae

Cherry laurel leaves Prunus laurocerasus L Rosaceae

Hình 1.3: Rau Oregano Hình 1.4: Hạt Bilberry

2,3,4,5,6,6a,7,8,8a,10,11,12,13,14b-tetradecahydro-1H-picene-4a- Tên khác: Prunol, Malol, beta-Ursolic acid, NSC4060, CCRIS 7123, TOS-BB-0966, 3-beta-hydroxyurs-12-en-28-oic acid

Công thức hóa học: C30H48O3

1.2.4 Những ứng dụng quan trọng của acid ursolic

Trước khi biết được thành phần và tác dụng của acid ursolic trong các cây thuốc thì y học dân gian đã sử dụng điều trị nhiều chứng bệnh Những nghiên cứu sau này đã tách acid ursolic và dẫn xuất đồng thời làm rõ tác dụng dược lý như kháng viêm, ức chế sự phát triển của khối u, kháng khuẩn, kháng virus… Acid ursolic cũng

có hiệu quả trong việc bảo vệ chống lại tổn thương hóa học cho gan ở động vật thí nghiệm.invitro Acid uroslic không độc, được sử dụng nhiều trong mỹ phẩm và sản phẩm chăm sóc sức khỏe [21]

1.2.4.1 Tác nhân chống lão hóa

Acid ursolic có tác dụng tích cực trong việc bảo vệ da và tóc vì cơ chế giống như tạo lớp phủ trên bề mặt Ngoài ra, nó còn có tác dụng ngăn cản tạo thành nếp nhăn

và sự xuất hiện đồi mồi trên da bằng cách tác động lên collagen [22]

1.2.4.2 Tác nhân kích thích tóc tăng trưởng

Acid ursolic và acid oleanolic được sử dụng để tăng cường sự phát triển tóc và ngăn kích ứng da đầu Chúng tác động đến sự vận chuyển máu và tế bào gốc trên da đầu [23]

1.2.4.3 Hoạt tính kháng khuẩn

Acid ursolic có khả năng ngăn ngừa một số chủng loại vi khuẩn Acid ursolic trích từ cây họ bạc hà thường có tác dụng kháng và ức chế một số loại vi khuẩn và nấm mốc [24] Acid ursolic thể hiện hoạt tính còn tùy theo nồng độ mà tại đó khả năng gây ức chế cao nhất

Trong một nghiên cứu, tác giả Suzuki và cộng sự đã đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của acid ursolic trong bệnh sâu răng Hai loại vi khuẩn được sử dụng để khảo sát hoạt tính Streptococci, Actinomyces trong các lỗ sâu răng Thí nghiệm đã xác nhận được acid ursolic có hoạt tính đối với hai loại vi khuẩn trên với lượng tối thiểu mà acid ursolic có hoạt tính lần lượt là 7,5–15 mg/ml và 15–30 mg/ml [25]

1.2.4.4 Hoạt tính kháng viêm

Hoạt tính kháng viêm là một tính chất chung của triterpenoid Acid ursolic có hoạt tính kháng viêm mạnh Tác dụng kháng viêm dựa vào khả năng gây ức chế một

số enzym hoặc ức chế khả năng sản sinh ra những chất gây viêm nhiễm

Tác giả Kotha Subbaramaiah và cộng sự cũng đã nghiên cứu về hoạt tính của acid ursolic trên tế bào biểu mô ở vú người và đã có những kết quả khả quan Đồng thời, những dữ liệu đó đóng góp quan trọng trong việc tìm hiểu hoạt tính chống ung thư của acid ursolic [26]

Tác giả Kosuge cũng đã nghiên cứu hoạt tính của acid ursolic tách từ cây

Pyiola rotundifolia L trong hoạt tính ngăn ngừa carrageen trong chứng phù nề của

chân chuột [27]

1.2.4.5 Hoạt tính ức chế khối u

Acid ursolic (AU ) và acid oleanolic (AO) cô lập từ Glechoma hederacea , ức

chế hoạt động của virus Epstein -Barr gây ra bởi 12 -O- tetradecanoylphorbol 13- acetate (TPA ) trong da chuột Tác dụng ức chế đã được đánh giá trong 20 tuần Cả hai

AU và AO đều thể hiện tác dụng ức chế sự phát triển khối u một cách rõ rệt so với các chất ức chế khối u được biết đến là acid retinoic (AR) So với AR hoặc AO, acid ursolic ức chế khối u hiệu quả hơn Tác dụng ức chế khối u bằng AU khác với AR hoặc AO Do đó nên tiền xử lý của da trước với AU để đạt hiệu quả cao [28]

Tác giả Hee-Jae Cha và cộng sự đã đánh giá về hoạt tính chống lan rộng của acid ursolic trên sợi tế bào có khối u ác tính di căn HT1080 ở người Bước đầu đã đã đánh giá được khả năng của acid ursolic trong việc làm chậm sự phát triển tế bào khối u HT1080 thông qua việc tái tạo một màng nền [29]

PHẦN 2: THỰC NGHIỆM

2.1 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Nghiên cứuhoàn thiện quy trình phân lập ursolic acid từ vỏ táo

Tổng hợp một số dẫn xuất của acid ursolic với cấu trúc sản phẩm tạo thành được phân tích bởi phương pháp phổ

Thử hoạt tính sinh học của các sản phẩm tổng hợp được nếu điều kiện cho phép

2.2 SƠ ĐỒ TIẾN TRÌNH THỰC NGHIỆM

Sơ đồ 2.1:Sơ đồ tiến trình thực nghiệm

Thuyết minh:

Quá trình thực nghiệm như đã nêu có ba nhiệm vụ lớn, đó là khảo sát hàm lượng acid ursolic nếu có trong táo xanh Việt Nam, tách acid ursolic từ vỏ táo xanh Fuji Úc và tổng hợp dẫn xuất của acid ursolic Acid ursolic tách ra được đem phân tích cấu trúc bằng phổ 1H-NMR, Khi kết quả phân tích phù hợp sẽ thực hiện phản ứng điều chế dẫn xuất Dẫn xuất tổng hợp được tinh chế bằng sắc ký cột và phân tích cấu trúc bằng phổ 1H-NMR Sản phẩm tinh khi vệt hiện tròn trong các hệ dung môi khác nhau với tỷ lệ khác nhau

2.4.HÓA CHẤT VÀ DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM

2.4.1 Hóa chất

Bảng 2.1: Các loại hóa chất sử dụng

Tên hóa chất CTPT Độ tinh khiết Xuất xứ

Ethyl acetate CH3COOCH2CH3 99,9% Trung Quốc

2.5 NỘI DUNG THÍ NGHIỆM

2.51 khảo sát tách acid ursolic trên táo xanh Việt Nam

2.5.1.1 Nguyên liệu

Hình 2.1 : táo xanh Việt Nam

Táo xanh Việt Nam được chuẩn bị sơ đồ như bên dưới

Sơ đồ 2.2: Chuẩn bị nguyên liệu bột vỏ táo Thuyết minh:

Táo xanh Việt Nam mua về được rửa sạch, gọt lấy phần vỏ và đem xay nhỏ Có nhiều phương pháp làm nhỏ vỏ táo, có thể dùng máy xay sinh tố hoặc băm nhỏ bằng dao Mục đích của quá trình xay nhỏ vỏ táo là phá vỡ màng tế bào để dung môi chiết

Táo xanh Việt Nam

Rửa sạch, gọt lấy vỏ

Cân khối lượng

có thể ngấm sâu để lôi kéo các chất cần chiết Tuy nhiên cũng không nên xay quá nhỏ

vì sẽ khó khăn trong quá trình lọc lấy dịch chiết sau này

2.5.1.2 Quy trình chiết với dung môi ethyl acetate

Sơ đồ 2.3 quy trình chiết với dung môi Ethyl acetate

Thuyết minh:

Chiết với Ethyl Acetate

Vỏ táo sau khi được xay nhỏ có khối lượng 153 (g), sấy trong 4h ở nhiệt độ

60-o

C, khối lượng vỏ sau khi sấy 140 (g), độ ẩm 37,71% , sau đó ngâm với 300ml Hexan ở nhiệt độ phòng trong vòng 1 ngày trong bình tam giác 1000ml ,sau đó lọc cô quay thu hồi Hexan Mục đích ngâm với dung môi n-Hexan nhằm loại bỏ những tạp chất không phân cực có trong vỏ táo, sau đó ta ngâm lại với 400ml Ethyl Acetate ở nhiệt độ phòng trong 2 ngày, rồi lọc mẫu chạy thử sắc kí bảng mỏng so sánh với mẫu Ursolic Acid chuẩn nếu có thì ta sẽ cô quay và ngâm lại, chạy sắc kí cột để tách sản phẩm nếu không thì đưa ra kết luận rằng trong táo xanh Việt Nam không có Ursolic Acid

n-Nhiệt độ phòng

1 ngày

Nhiệt độ phòng

Lọc, cô quay thu, thử sắc kí bảng mỏng

Hình 2.2: chạy sắc kí bảng mỏng dịch chiết hệ dung môi hexan:ethyl acetate 7:3 Nhìn vào hình ta có thể thấy rằng tại vệt Ursolic Acid trên bảng mỏng màu hồng, bên kia táo xanh không có, nên ta có thể kết luận rằng trong táo xanh việt nam không có chứa Ursolic Acid

2.5.1 Tách acid ursolic từ vỏ táo xanh Fuji Úc

2.5.1.1 Nguyên liệu

Nguyên liệu táo xanh được chuẩn bị như sơ đồ bên dưới

Hình 2.3 : Táo xanh Fuji Úc

Sơ đồ 2.4: Chuẩn bị nguyên liệu bột vỏ táo

tố hoặc băm nhỏ bằng dao Mục đích của quá trình xay nhỏ vỏ táo là phá vỡ màng tế bào để dung môi chiết có thể ngấm sâu để lôi kéo các chất cần chiết Tuy nhiên cũng không nên xay quá nhỏ vì sẽ khó khăn trong quá trình lọc lấy

dịch chiết sau này

2.5.1.2 Quy trình chiết với dung môi 2-propanol

Sơ đồ 2.5: Quy trình chiết với dung môi 2 propanol

Thuyết minh: Chiết với 2-propanol

Vỏ táo sau khi được say nhỏ có khối lượng 92g, độ ẩm 66,37% ( khối lượng có thể thay đổi vì phần thịt lẫn vào), màu xanh nâu Phần vỏ được đem sấy 4h tại nhiệt độ

60oC ở tủ sấy.Vỏ táo sau khi sấy được chiết với 300 ml n-Hexan trong thời gian 1 ngày, dùng bình lọc hút để phân lập n-Hexan và phần bã, phần dung môi đem đi cô quay thu hồi.phần bã sau quá trình lọc đem đi ngâm với 500ml 2-propanol 2 ngày ở nhiệt độ phòng,sau đó dùng bình lọc hút để phân lập 2-propanol được dịch chiết lần 1 (màu xanh lá cây đậm) Phần bã sau quá trình trích ly với 2-propanol được chiết tiếp với 400ml 2-propanol trong thời gian 3 ngày, lọc hút được dịch chiết 2 (màu xanh nhạt) Tiếp tục chiết phần bã với 300ml 2-propanol trong 4 ngày tất cả đều ở nhiệt độ phòng, lọc hút được dịch chiết 3 (màu xanh nhạt)

Cả ba phần dịch chiết được gộp chung lại và đem đi cô quay chân không đến khi thành cao thô dạng sệt để loại bỏ dung môi ( khi không còn dòng chảy ở bình hứng của máy cô quay) Tắt máy, tháo bình cô quay và thêm 10g silicagel vào phần cao thu được của dịch chiết Cô quay tiếp khoảng 30p thu được dạng cao khô màu xanh lá cây, chuẩn bị cho quá trình chạy cột lần 1

Sắc ký cột

Chuẩn bị cột sắc ký silicagel (loại cột lớn cho lần đầu chạy sắc ký cột, đường kính 4cm, chiều cao 40cm) Nhồi cột bằng silicagel làm pha tĩnh Chiều cao silicagel được nhồi gấp 3 chiều cao của cao thô trên cột Cho cao vào cột và thêm lớp bông gòn trên cùng để ổn định bề mặt

Chạy sắc ký cột như sau:

Hình 2.4: Sắc ký cột của Ursolic Acid ngâm bằng 2-propanol

Cột sau khi đã nhồi xong ta cho phần cao khô thu được từ dịch chiết rồi thêm vào 1 miêng bông gòn để ổn định bề mặt, sau đó ta cho dung môi Hexan-EthylAcetate (7:3) vào cột 1 cách từ từ và ta chạy liên tục với hệ dung môi này và ta bắt đầu thử sắc

kí bảng mỏng với từng lọ bi chứa phần sau khi đã chạy cột cho tới khi nào hết Ursolic Acid

2.5.1.2 Quy trình chiết với dung môi ethylacetate

Sơ đồ 2.6: Quy trình tách acid ursolic với dung môi Ethyl Acetate

Chiết với Ethyl Acetate

Vỏ táo sau khi được say nhỏ có khối lượng 114g, độ ẩm 66,37% ( khối lượng có thể thay đổi vì phần thịt lẫn vào), màu xanh nâu Phần vỏ được đem sấy 4h tại nhiệt độ

độ phòng, lọc hút được dịch chiết 3 (màu vàng nhạt)

Cả ba phần dịch chiết được gộp chung lại và đem đi cô quay chân không đến khi thành cao thô dạng sệt để loại bỏ dung môi ( khi không còn dòng chảy ở bình hứng của máy cô quay) Tắt máy, tháo bình cô quay Vì chạy cột khô nên ta thêm 10g silicagel vào phần cao thu được của dịch chiết Cô quay tiếp khoảng 30p thu được dạng cao khô màu xanh lá cây, chuẩn bị cho quá trình chạy cột lần 1

Sắc ký cột

Chuẩn bị cột sắc ký silicagel (loại cột lớn cho lần đầu chạy sắc ký cột, đường kính 4cm, chiều cao 40cm) Nhồi cột bằng silicagel làm pha tĩnh Chiều cao silicagel được nhồi gấp 3 chiều cao của cao thô trên cột Cho cao vào cột và thêm lớp bông gòn trên cùng để ổn định bề mặt

Hình 2.5 Cột sắc kí sau khi nhồi silicagel Chạy sắc ký cột như sau:

Cột sau khi đã nhồi xong ta cho phần cao khô thu được từ dịch chiết rồi thêm vào 1 miêng bông gòn để ổn định bề mặt, sau đó ta cho dung môi Hexan-EthylAcetate (7:3) vào cột 1 cách từ từ và ta chạy liên tục với hệ dung môi này và ta bắt đầu thử sắc

kí bảng mỏng với từng lọ bi chứa phần sau khi đã chạy cột cho tới khi nào hết Ursolic Acid