THIẾT LẬP KỸ THUẬT CHẨN ĐOÁN BỆNH LOẠN DƯỠNG CƠ DUCHENNE DỰA TRÊN PHẢN ỨNG PCR

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP THIẾT LẬP KỸ THUẬT CHẨN ĐOÁN BỆNH LOẠN DƯỠNG CƠ DUCHENNE DỰA TRÊN PHẢN ỨNG PCR Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : PHẠM NGỌC KHƠI Niên khố : 2005 – 2009 Tháng 8/2009 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP THIẾT LẬP KỸ THUẬT CHẨN ĐOÁN BỆNH LOẠN DƯỠNG CƠ DUCHENNE DỰA TRÊN PHẢN ỨNG PCR Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực Th.S NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN PHẠM NGỌC KHÔI PGS.TS TRẦN THỊ DÂN Tháng 8/2009 LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành gửi lời cám ơn đến: Ban Giám Hiệu, Ban Chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học với Thầy Cô trực tiếp giảng dạy suốt bốn năm học vừa qua Trường Ban Chủ nhiệm Phòng Di truyền – Bệnh viện Từ Dũ TP.HCM tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành Khóa luận tốt nghiệp Th.S Nguyễn Khắc Hân Hoan PGS.TS Trần Thị Dân tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức quý giá chân thành động viên tơi khoảng thời gian thực Khóa luận tốt nghiệp Tập thể Y – Bác sĩ, Thầy Cô Anh Chị – Phòng Di truyền tận tâm bảo, đóng góp nhiều ý kiến quý báu, hết lòng hỗ trợ cầm tay việc cho tơi suốt khoảng thời gian thực Khóa luận Phòng Di truyền TS Trần Vân Khánh (Labo Trung tâm Y Sinh học – Đại học Y Hà Nội), Th.S Nguyễn Thị Băng Sương (Bộ mơn Hóa sinh – Đại học Y khoa Huế), Th.S Ngô Diễm Ngọc (Bệnh viện Nhi Trung ương), KS Nguyễn Thị Phương Mai (Bệnh viện Nhi Trung ương), Th.S Thái Hạnh Quyên (Công ty TNHH BCE Việt Nam) Ông Robert Schuit (MRC – Holland, Amsterdam, Hà Lan) nhiệt tình góp ý, truyền đạt kinh nghiệm q giá để tơi hồn thành tốt Khóa luận tốt nghiệp CN Phan Thị Thùy Ngân, BS Nguyễn Minh Đức Anh Chị Trung tâm Y khoa Phước An (HEPA) hỗ trợ giúp đỡ vào thời điểm cuối Khóa luận Tập thể lớp DH05SH với người bạn thân tôi, người bạn gắn bó, chia sẻ tơi buồn vui suốt q trình học tập tơi hết lịng hỗ trợ, giúp đỡ tơi thời gian thực Khóa luận Và tất lời ghi ơn sâu sắc xin dành cho Ba Mẹ sinh thành, dưỡng dục, dạy dỗ để có ngày hơm nay, với tất kính trọng, niềm tự hào lịng biết ơn chân thành TP.HCM, ngày 25 tháng 08 năm 2009 Phạm Ngọc Khơi iii TĨM TẮT Loạn dưỡng Duchenne (Duchenne muscular dystrophy, DMD) bệnh thần kinh – di truyền phổ biến với tỷ lệ mắc 1/3500 trẻ trai đẻ sống Bệnh DMD có chất đột biến gen dystrophin nhiễm sắc thể giới tính X Hơn 65% trường hợp đột biến lặp đoạn gen Kỹ thuật MLPA gần cho chẩn đoán đoạn gen hiệu Mục tiêu: Sử dụng phương pháp multiplex PCR để xác định giới tính trước chẩn đốn đột biến DMD đánh giá hiệu kỹ thuật MLPA phát đột biến đoạn gen DMD Đối tượng phương pháp nghiên cứu: Hai mươi mẫu DNA bệnh nhân dùng để xác định giới tính hai mươi mẫu DNA bệnh nhân chẩn đoán lâm sàng bệnh DMD/BMD phát đột biến đoạn gen multiplex PCR Bảy mươi chín exon gen khảo sát kit SALSA® MLPA® P034 – A2 P035 – A2, điện di mao quản CEQTM 8000 phân tích tự động phần mềm Gene Marker Kết quả: Đã hoàn thiện kỹ thuật multiplex PCR để xác định giới tính phương pháp MLPA cho phép xác định xác kích thước đoạn DNA bị đột biến, kỹ thuật phân tích dễ dàng, trực quan, nhanh có độ lặp lại cao Tất exon gen DMD bị khẳng định biểu đồ kết Bộ ba multiplex PCR chẩn đốn trước khảo sát hai mươi lăm exon có exon không phát so với MLPA Kết luận: Kỹ thuật multiplex PCR dùng để xác định giới tính xác, đặc hiệu; phương pháp MLPA giúp phát nhanh chóng, tồn diện đột biến đoạn gen DMD ưu điểm vượt trội so với kỹ thuật multiplex PCR iv SUMMARY Duchenne muscular dystrophy (DMD) is one of the most common genetic neuromuscular disorders affecting 1/3500 live man births DMD is caused by mutation in the X – linked dystrophin gene More than 65% of cases are deletion or duplication mutation Recently, MLPA is described as an effective method to detect these mutations Objective: To set up multiplex PCR that determines the sex and evaluate the effectiveness of MLPA in detecting DMD gene deletion mutations Method: Twenty DNA samples of patient that were used to determine the sex and twenty DNA samples of patient having clinical signs of DMD/BMD detected the deletion mutations by multiplex PCR, which were tested for seventy nine exons with SALSA® MLPA® P034 – A2 and P035 – A2 kit, capillary electrophoresis with CEQTM 8000 and automated analysis with Gene Marker software Results: The multiplex PCR method to determine the sex and the MLPA protocol to detect the size of DNA fragment lost were optimized The techniques are easy, visual, rapid and reproducible All deleted exons were present in electropherogram results The previous set of three multiplex PCR only detects twenty five exons and some exons can not be found by this set in comparison with MLPA Conclusion: The multiplex PCR method determined the sex exactly and specifically; and the MLPA helps to rapid detect all deletions of DMD gene and has more advantage than the multiplex PCR v MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn iii Tóm tắt iv Summary v Mục lục vi Danh sách chữ viết tắt x Danh sách hình xii Danh sách biểu đồ lưu đồ xiii Danh sách bảng xiv Chương 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Yêu cầu nghiên cứu 1.3 Nội dung nghiên cứu Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Lịch sử nghiên cứu bệnh DMD 2.2 Tổng quan bệnh DMD 2.3 Nguyên nhân gây bệnh 2.3.1 Gen dystrophin sản phẩm 2.3.2 Chức dystrophin 10 2.4 Phương pháp chẩn đoán bệnh DMD 11 2.4.1 Phương pháp chẩn đoán điện 11 2.4.1.1 Đo tốc độ dẫn truyền vận động 11 2.4.1.2 Điện 11 2.4.2 Kiểm tra creatine kinase 11 2.4.3 Sinh thiết 12 vi 2.4.4 Hóa mơ miễn dịch 12 2.4.5 Western blot 12 2.5 Chẩn đoán di truyền phân tử 13 2.5.1 Multiplex PCR 13 2.5.2 Southern blot 14 2.5.3 DGGE 14 2.5.4 MAPH 15 2.5.5 MLPA 15 2.5.6 Phân tích liên kết gen 17 2.5.6.1 RFLP 17 2.5.6.2 STR 18 2.5.7 FISH 18 2.5.8 RT – PCR 18 2.5.9 PTT 20 2.6 Chẩn đoán trước sinh 20 2.7 Điều trị 20 2.8 Tổng quan nghiên cứu bệnh DMD giới 21 2.9 Tổng quan nghiên cứu bệnh DMD Việt Nam 21 Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 26 3.2 Nội dung nghiên cứu 26 3.3 Vật liệu 26 3.3.1 Xác định giới tính multiplex PCR 26 3.3.1.1 Mẫu bệnh phẩm 26 3.3.1.2 Mồi 26 3.3.1.3 Hóa chất cho tách chiết DNA 27 3.3.1.4 Hóa chất cho phản ứng multiplex PCR 27 3.3.1.5 Hóa chất cho điện di gel agarose 27 vii 3.3.1.6 Thiết bị – Dụng cụ 28 3.3.2 Chẩn đoán đột biến đoạn gen DMD MLPA 29 3.3.2.1 Mẫu bệnh phẩm 29 3.3.2.2 SALSA® MLPA® Kit P034 – A2 / P035 – A2 DMD / Becker 29 3.3.2.3 Hóa chất cho điện di mao quản máy CEQTM 8000 30 3.3.2.4 Thiết bị – Dụng cụ 31 3.4 Phương pháp nghiên cứu 31 3.4.1 Xác định giới tính multiplex PCR 31 3.4.1.1 Phương pháp thu xử lý mẫu 31 3.4.1.2 Phương pháp tách chiết DNA 32 3.4.1.3 Phương pháp multiplex PCR 32 3.4.1.4 Đảm bảo chất lượng phản ứng 33 3.4.1.5 Phương pháp điện di gel agarose 34 3.4.2 Chẩn đoán đột biến đoạn gen DMD MLPA 34 3.4.2.1 Bảo quản mẫu 34 3.4.2.2 Phương pháp MLPA 34 3.4.2.3 Đảm bảo chất lượng phản ứng 36 3.4.2.4 Điện di MLPA hệ thống điện di mao quản CEQTM 8000 36 3.4.2.5 Phương pháp phân tích kết 37 3.4.3 Đề xuất lưu đồ tầm soát trước sinh 37 Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 4.1 Kết 38 4.1.1 Xác định giới tính multiplex PCR 38 4.1.2 Chẩn đoán đột biến đoạn gen DMD MLPA 42 4.1.3 Đề xuất lưu đồ tầm soát trước sinh 51 4.2 Thảo luận 51 4.2.1 Xác định giới tính multiplex PCR 51 4.2.2 Chẩn đoán đột biến đoạn gen DMD MLPA 52 viii 4.2.3 Đề xuất lưu đồ tầm soát trước sinh 55 Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 57 5.1 Kết luận 57 5.2 Đề nghị 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 PHỤ LỤC 62 ix DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT BMD Becker muscular dystrophy bp base pair cDNA complementary deoxyribonucleic acid CK creatine kinase DGGE Denaturing gradient gel electrophoresis DMD Duchenne muscular dystrophy DMSO dimethyl sulfoxide DNA deoxyribonucleic acid DSCP Double strand conformation polymophism dATP 2’ – deoxyadenosine – 5’ – triphosphate dCTP 2’ – deoxycytidine – 5’ – triphosphate dGTP 2’ – deoxyguanosine – 5’ – triphosphate dNTP 2’ – deoxyribonucleotide – 5’ – triphosphate dTTP 2’ – deoxythymidine – 5’ – triphosphate EDTA ethylene diamine tetraacetic acid FISH Fluorescent in situ hybridization HDA Heteroduplex analysis kb kibobase MAPH Multiplex amplifiable probe hybridisation MK marker MLPA Multiplex ligation-dependent probe amplification mRNA messenger ribonucleic acid NIL nihil (Latin), nothing hay zero NST nhiễm sắc thể nt nucleotide OD optical density PCR Polymerase chain reaction x ... HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP THIẾT LẬP KỸ THUẬT CHẨN ĐOÁN BỆNH LOẠN DƯỠNG CƠ DUCHENNE DỰA TRÊN PHẢN ỨNG PCR Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực... Từ Dũ TP.HCM từ ngày 05/02/2009 đến ngày 05/06/2009 mang tên ? ?Thiết lập kỹ thuật chẩn đoán bệnh loạn dưỡng Duchenne dựa phản ứng PCR? ?? 1.2 Yêu cầu nghiên cứu Khóa luận tiến hành với mục tiêu xây... cho phản ứng multiplex PCR xác định giới tính thai nhi Sử dụng kỹ thuật MLPA để chẩn đoán loại đột biến gen dystrophin gây nên bệnh DMD, so sánh kết chẩn đoán MLPA với kết chẩn đốn trước Bệnh