ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SNP (MINISEQUENCING) TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH BETATHALASSAEMIA

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SNP (MINI-SEQUENCING) TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH BETA-THALASSAEMIA Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : NGUYỄN THỊ KIM NGÂN Niên khóa : 2006 – 2010 Tháng 7/2010 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SNP (MINI-SEQUENCING) TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH BETA-THALASSAEMIA Hướng dẫn khoa học: Sinh viên thực hiện: ThS BS NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN NGUYỄN THỊ KIM NGÂN ThS BS QUÁCH THỊ HỒNG OANH Tháng 7/2010 LỜI CẢM ƠN Tơi xin chân thành cảm ơn: Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm Bộ Mơn Công Nghệ Sinh Học, tất quý Thầy - Cô truyền đạt kiến thức quý báu cho suốt thời gian học trường ThS.BS Nguyễn Khắc Hân Hoan, ThS.BS Quách Thị Hoàng Oanh tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tơi hồn thành khóa luận Xin cảm ơn thầy cô anh chị Phòng Di Truyền Bệnh viện Từ Dũ tận tình giúp đỡ tơi suốt q trình thực khóa luận Các bạn bè thân yêu lớp Công Nghệ Sinh Học khóa 32 giúp đỡ chia sẻ vui buồn suốt năm học thời gian thực tập tốt nghiệp Con xin chân thành cảm ơn Cha Mẹ theo dõi, động viên cho Chân thành cảm ơn Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2010 Sinh viên Nguyễn Thị Kim Ngân i TÓM TẮT Thalassaemia nặng cần truyền máu để trì sống nhiên truyền máu kéo dài có biến chứng ứ sắt mơ dẫn đến tổn thương quan gây tử vong cao Nước ta có tần suất bệnh β thalassaemia cao, chi phí điều trị lại lớn nước ta lại có nguồn lực thấp khơng thể kham chi phí Do đó, chẩn đốn trước sinh biện pháp phòng ngừa hiệu làm giảm gánh nặng bệnh tật lên xã hội Vì việc thành lập chương trình phát thalassaemia với kỹ thuật di truyền thích hợp Việt Nam cần thiết Vì lý trên, chúng tơi thực đề tài: “Ứng dụng kỹ thuật SNP (Mini-Sequencing) chẩn đoán bệnh β-Thalassaemia Kỹ thuật SNP nghiên cứu để ứng dụng vào chẩn đoán trước sinh cách kiểm tra DNA bố mẹ thai nhi từ máu bố mẹ (10 mẫu) nước ối thai nhi (6 mẫu) Nghiên cứu sử dụng kỹ thuật SNP xác định loại đột biến gây bệnh β thalassaemia phổ biến Việt Nam: –28 A Ỉ G, codon 17 AAG Ỉ TAG, IVS1-1 G Ỉ T, codon 41/41 –TCTT, codon 71/72 +A, codon 95 +A, IVS2-654 C Ỉ T, codon 26 GAG Ỉ AAG Trong q trình nghiên cứu tiến hành thiết lập thông số cho phản ứng PCR để xác định đột biến đoạn -619bp, phản ứng SNPlex gồm phản ứng multiplex phản ứng signleplex xác định loại đột biến : –28 A Ỉ G, codon 17 AAG Ỉ TAG, IVS1-1 G Ỉ T, codon 71/72 +A, codon 95 +A, IVS2-654 C Ỉ T, codon 26 GAG Ỉ AAG ii SUMMARY The thesis: "Technical Applications SNP (mini-sequencing) in the diagnosis of βThalassaemia”.  Children with Thalaaemia major need blood transfusing regularly for all their life – time Gradually, there is iron overload in tissue leading to damage organs in the body and causing death Vietnam has a high frequency of disease β thalassemia, treatment costs are too great, while our country has low resources that can not afford these cost Therefore, diagnosis before birth is effective measure to reduce the disease burden on society Thus the establishment of a detection program to thalassemia with appropriate genetic engineering in Vietnam is very necessary We research technical SNP to diagnose before birth by testing the DNA of parents and their prenatal child from parental blood (10 samples) and fetal amniotic fluid (6 samples) The study use a technical SNP to identify eight types of mutations causing β Thalassaemia commonly occurring in Vietnam: –28 A Ỉ G, codon 17 AAG Ỉ TAG, IVS1-1 G Ỉ T, codon 41/41 –TCTT, codon 71/72 +A, codon 95 +A, IVS2-654 C Ỉ T, codon 26 GAG Ỉ AAG In the course of study, we have conducted to establish parameters for PCR to identify mutants delete the 619bp, including two SNPlex reaction and a multiplex reaction and the reaction signleplex has identified seven types mutation: –28 A Ỉ G, codon 17 AAG Ỉ TAG, IVS1-1 G Ỉ T, codon 71/72 +A, codon 95 +A, IVS2-654 C Ỉ T, codon 26 GAG Ỉ AAG iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT .ii SUMMARY iii MỤC LỤC iv DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT .vi DANH SÁCH CÁC BẢNG vii DANH SÁCH CÁC HÌNH viii CHƯƠNG MỞ ĐẦU 1  1.1 Đặt vấn đề 1  1.2 Mục tiêu đề tài 2  1.3 Nội dung thực 2  CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3  2.1 Tổng quan bệnh thalassaemia 3  2.1.1 Lịch sử nghiên cứu bệnh thalassaemia 3  2.1.2 Cấu trúc phân tử haemoglobin gen tổng hợp globin 4  2.1.3 Phân loại bệnh thalassaemia 5  2.1.4 Sự phân bố bệnh thalassaemia 6  2.1.5 Chi phí điều trị bệnh thalassaemia 8  2.2 Bệnh học di truyền bệnh β thalassaemia 8  2.2.1 Cơ sở phân tử bệnh 8  2.2.2 Đặc điểm lâm sàng 9  2.2.3 Cơ chế bệnh học β thalassaemia 11  2.2.4 Cơ chế di truyền bệnh β thalassaemia 11  2.2.5 Điều trị bệnh β thalassaemia 11  2.2.6 Sự lưu hành gen β thalassaemia giới 12  2.3 Các phương pháp chẩn đoán bệnh β thalassaemia 14  2.3.1 Chẩn đoán lâm sàng 14  2.3.2 Chẩn đoán cận lâm sàng 14  iv 2.4 Các nghiên cứu ứng dụng chẩn đoán bệnh β thalassaemia 19  2.4.1 Trên giới 19  2.4.2 Tại Việt Nam 19  CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21  3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 21  3.2 Vật liệu 21  3.2.1 Mẫu bệnh phẩm 21  3.2.2 Hóa chất 21  3.2.3 Mồi 22  3.2.4 Thiết bị dụng cụ 23  3.2.5 Phương pháp tách chiết DNA 24  3.3 Phương pháp xét nghiệm 25  3.3.1 Phương pháp PCR xác định đột biến đoạn -619 bp 26  3.3.2 Làm sản phẩm thừa sau PCR 27  3.3.3 Phản ứng SNPlex 27  3.3.4 Tinh sau phản ứng SNPlex 29  3.3.5 Điện di mao quản máy CEQ 8000 29  CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32  4.1 Kết 32  4.1.1 Kết sàng lọc đột biến đoạn -619bp 32  4.1.2 Kết sàng lọc đột biến 34  4.2 Thảo luận 37  CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 39  5.1 Kết luận 39  5.2 Đề nghị 39  TÀI LIỆU THAM KHẢO 40  PHỤ LỤC     v DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ARMS: amplification refractory mutation system bp: base pair DNA: deoxyribonucleic acid dATP: 2’- deoxyadenosine - 5’ - triphosphate dCTP: 2’- deoxycytidine - 5’ - triphosphate dGTP: 2’- deoxyguanosin - 5’ - triphosphate dTTP: 2’- deoxythymidine - 5’ – triphosphate dNTP: 2’- deoxynucleotide – 5’ - triphosphate EDTA: ethylene diamine tetraacetid acid Hb: haemoglobin kb: kilobase MCH: mean corpuscular haemoglobin (thể tích trung bình hồng cầu) MCV: mean corpuscular volume (lượng haemoglobin trung bình hồng cầu) MK: marker (thang chuẩn) MT mutation (đột biến) NST: nhiễm sắc thể PCR: polymerase chain reaction RNA: ribonucleic acid SNP: single-nucleotide polymorphism Taq: Thermus aquaticus TE: Tris / EDTA WT: wile type vi DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1 Số liệu bệnh máu nhập viện khoa Huyết học lâm sàng, BVNĐ1 Bảng 2.2 Các đột biến β thalassaemia phổ biến số nơi giới 12 Bảng 3.1 Mồi dùng cho phản ứng PCR phát đột biến đoạn -619 bp 22 Bảng 3.2 Mồi dùng cho phản ứng SNPlex 23 Bảng 3.3 Thành phần phản ứng PCR xác định đột biến đoạn -619 bp 26 Bảng 3.4 Chu trình luân nhiệt 26 Bảng 3.5 Kích thước sản phẩm DNA sau PCR 27 Bảng 3.6 Thành phần phản ứng bất hoạt sản phẩm PCR 27 Bảng 3.7 Thành phần phản ứng SNPlex 28 Bảng 3.8 Thành phần phản ứng SNPlex 28 Bảng 3.9 Thành phần phản ứng SNPlex 28 Bảng 3.10 Chu trình luân nhiệt cho phản ứng SNPlex 29 Bảng 3.11 Thành phần phản ứng tinh sau SNPlex 29 Bảng 3.12 Thành phần điện di mao quản 29 Bảng 3.13 Thành phần điện di mao quản 30 Bảng 3.14 Kích thước sản phản phản ứng SNPlex điện di mao quản 30 Bảng 4.1 Kết sàng lọc đột biến đoạn -619 bp 33 Bảng 4.2 Kết sàng lọc đột biến 16 mẫu bệnh phẩm 36 vii DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1 Cấu trúc phân tử haemoglobin Hình 2.2 Sự tổng hợp chuỗi globin giai đoạn phát triển người Hình 2.3 Cụm gen α Hình 2.4 Cụm gen β Hình 2.5 Phân bố bệnh thalassaemia giới Hình 2.6 Bệnh nhân thalassaemia nặng phải cắt lách 10 Hình 2.7 Cơ chế di truyền bệnh thalassaemia 11 Hình 2.8 Nguyên lý hoạt động kỹ thuật ARMS-PCR 16 Hình 2.9 Phương pháp minisequencing 18 Hình 2.10 Sơ đồ phân tích gen β globin kỹ thuật multiplex minisequecing 19 Hình 3.1 Bộ kit Qiagen 21 Hình 3.2 Máy ly tâm 24 Hình 3.3 Máy ủ nhiệt 24 Hình 3.4 Máy định lượng DNA 24 Hình 3.5 Máy luân nhiệt 24 Hình 3.7 Máy chụp gel 24 Hình 3.6 Máy CEQ 8000 24 Hình 3.8 Máy trộn mẫu 24 Hình 3.9 Bể điện di 24 Hình 3.10 Các bước thực trong trình nghiên cứu 25 Hình 3.11 Nguyên tắc hoạt động kit SNP 27 Hình 4.1 A, B Kết điện di sàng lọc đột biến đoạn -619 bp 32 Hình 4.2 Kết điện di mao quản SNPlex mẫu 34 Hình 4.3 Kết điện di mao quản SNPlex mẫu 35 Hình 4.4 Kết điện di mao quản SNPlex mẫu 35 viii Bảng 4.1 Kết sàng lọc đột biến đoạn -619 bp Thứ tự mẫu Mã nhập viện 10 11 12 13 14 15 16 -28 09072A 09072B 09072C 09078A 09078B 09078C 09074B 09074C 09218B 09218C 10034A 10034B 10034C 10029A 10029B 10029C 09125C (mẫu đột biến -28) 09007A (mẫu đột biến Cd17) 09128C (mẫu đột biến Cd26) 09128B (mẫu đột biến 09035B (mẫu đột biến Cd71/72) 10001C (mẫu đột biến Cd95) 09089B (mẫu đột biến IVS1) 09221A (mẫu đột biến IVS2 10023A (mẫu bình thường) Cd17 Cd26 Cd41/42 Cd71/72 Cd95 IVS1 IVS2 WT NIL Kích thước sản phẩm điện di (bp) 1457 1457 1457 1457 1457 1457 1457 1457 1457 1457 1457 1457 1457 1457 1457 1457 1457 Đột biến đoạn -619 bp 1457 - 1457 - 1457 - 1457 - 1457 - 1457 - 1457 - 1457 - - - - Mã bệnh viện hiểu sao: hai số năm, ba số số thứ tự, chữ theo sau ký hiệu cho cha, me thai Ví dụ 10029A: vào viện năm 2010, số thứ tự 029, người chồng, 10029B: vào viện năm 2010, số thứ tự 029, người vợ, 10029C: vào viện năm 2010, số thứ tự 029, thai nhi (-): khơng có sản phẩm đột biến 33 4.1.2 Kết sàng lọc đột biến Mẫu 1: mã nhập viện 09072A Hình 4.2 Kết điện di mao quản SNPlex mẫu Đột biến IVS1 G Ỉ T điện di mao quản cho sản phẩm có kích thước khoảng 20 bp peak có màu đen peak bình thường, peak màu xanh đỏ peak đột biến Đột biến Codon95+A cho sản phẩm có kích thước khoảng 25 bp với peak màu xanh bình thường, màu đỏ đột biến Đột biến Codon26 G Ỉ A (HbE) cho sản phầm có kích thước khoảng 36 bp peak màu đen bình thường, màu xanh dương đột biến Đột biến IVS2-654 C Ỉ T cho sản phẩm có kích thước khoảng 62 bp peak màu đen bình thường màu xanh dương đột biến Kết điện di mao quản phản ứng SNPlex sàng lọc đột biến IVS1 G Ỉ T, Codon95+A, Codon26 G Ỉ A (HbE), IVS2-654 C Ỉ T mẫu xuất peak với kích thước 19,72 bp peak màu đen (dC/19,72), 20,19 bp peak màu đỏ (dA/20,19), 25,40 bp peak màu xanh (dG/25,40), 36,15 bp peak màu đen (dC/36,15), 62,91 bp peak màu đen (dC/62,91) Với kết thu được, ta kết luận mẫu bệnh phẩm mã nhập viện 09072A phát đột biến IVS1 G Ỉ T đột biến IVS1 G Ỉ T xuất peak: màu đen (peak bình thường) đỏ (peak đột biến), đột biến lại xuất peak peak peak bình thường 34 Hình 4.3 Kết điện di mao quản SNPlex mẫu Đột biến Codon17 A Ỉ T điện di mao quản cho sản phẩm có kích thước khoảng 52 bp peak có màu xanh dương peak bình thường peak màu đỏ peak đột biến Đột biến Codon71/72+A cho sản phẩm có kích thước khoảng 55 bp peak màu xanh peak bình thường, peak màu đỏ peak đột biến Kết điện di mao quản SNPlex sàng lọc đột biến Codon17 A Ỉ T Codon71/72+A mẫu Xuất peak có kích thước 53,20 bp peak màu xanh dương (dT/53,20), 57,50 bp peak màu xanh (dG/57,50) Với kết điện di trên, ta kết luận mẫu bệnh phẩm mã nhập viện 09072A khơng phát đột biến Codon17 A Ỉ T Codon71/72+A, kết điện di thu peak bình thường đột biến Codon17 A Ỉ T Codon71/72+A Hình 4.4 Kết điện di mao quản SNPlex mẫu 35 Đột biến -28 A Ỉ G điện di mao quản cho sản phẩm có kích thước khoảng 43 bp peak có màu xanh dương peak bình thường peak màu đen peak đột biến Kết điện di mao quản SNPlex sàng lọc đột biến -28 A Ỉ G Xuất peak có kích thước 43,73bp màu xanh dương (dT/43,73) Với kết điện di trên, ta kết luận mẫu bệnh phẩm số mã nhập viện 09072A khơng tìm thấy đột biến -28 A Ỉ G, kết điện di thu peak bình thường đột biến -28 A Ỉ G Kết luận: Trong sàng lọc đột biến IVS1-1 G Ỉ T, Codon95+A, Codon26 G Ỉ A (HbE), IVS2-654 C Ỉ T, Codon17 A Ỉ T, Codon71/72+A, -28 A Ỉ G mẫu (Mã nhập viện 09072A) phát đột biến IVS1-1 G Ỉ T thể dị hợp tử Mẫu (09072A), mẫu (09072B), mẫu (09072C) gia đình, qua kết sàng lọc, kết phát gen bệnh có người cha mẹ, thai lại khơng có mang gen bệnh Bảng 4.2 Kết sàng lọc đột biến 16 mẫu bệnh phẩm Mẫu bệnh phẩm Mã nhập viện Đột biến Đột biến 09072A IVS1-1 G Ỉ T - 09072B Codon95+A - 09072C - - 09078A Codon95+A Codon26 G>A 09078B Codon17 A>T - 09078C Codon95+A - 09074B IVS2-654 C>T -28 A>G 09074C IVS2-654 C>T - 09218B Codon17 A>T -28 A>G 10 09218C -28 A>G - 11 10034A Codon17 A>T - 12 10034B Codon17 A>T - 13 10034C Codon17 A>T đồng hợp - 14 10029A Codon71/72+A - 15 10029B IVS2-654 C>T - 16 10029C Codon71/72+A - (-): khơng có đột biến 36 4.2 Thảo luận Với việc sử dụng kit Qiagen cho kỹ thuật ly trích DNA trở nên nhanh chóng, đơn giản độc hại phương pháp truyền thống sử dụng phenolcloroform nhiều: lượng máu cần cho ly trích DNA ít: 0,2ml thay 2-4ml Thời gian ly trích cần khoảng 30 phút, nhiều so với ngày phải ủ qua đêm phương pháp truyền thống Như vậy, việc sử dụng kit tiết kiệm nhiều thời gian công sức lao động Chất lượng DNA sau ly trích kiểm tra máy Thermo Spectronic cho thấy nồng độ DNA mẫu từ 20ng/µl trở lên độ tinh OD260/OD280 ≥ 1,8 Đồng thời, chất lượng DNA kiểm chứng qua hoạt động phản ứng PCR bước Tồn q trình ly trích DNA thực phòng riêng biệt với phòng chạy PCR, giải trình tự DNA phân tích sau PCR, với dụng cụ riêng nên đảm bảo mẫu DNA không bị ngoại nhiễm sản phẩm PCR sau PCR từ bước kỹ thuật khác Mặt khác, mẫu DNA không bị ngoại nhiễm hay nhiễm chéo từ mẫu sang mẫu khác trình thao tác Điều thể qua kết phát allen đột biến phù hợp nhóm bệnh nhân gia đình khác bệnh nhân khác huyết thống Phản ứng PCR phát đột biến đoạn -619 bp, chứng không DNA (nil) phản ứng PCR phát đột biến đoạn -619 bp không cho tín hiệu chứng tỏ phản ứng khơng bị ngoại nhiễm Mẫu bệnh số 13 điện di gel mờ cho kết điện di mao quản rõ, khơng có band phụ, chứng tỏ thơng số thiết lập cho phản ứng PCR khuếch đại β globin tìm đột biến đoạn -619 bp xác khuếch đại đoạn gen mong muốn Quá trình tinh sạch, phản ứng SNPlex, làm sau SNPlex, ba trình kiểm tra qua trình điện di mao quản CEQ 8000 cho kết tốt Chứng tỏ thông số thiết lập từ trình tinh phản ứng SNPlex, trình làm sau SNPlex hoạt động tốt Chỉ phản ứng SNPlex sàng lọc đột biến -28 điện di mao quản cho kết peak thấp, phải điện di với thành phần hóa chất nhiệt độ khác kết đẹp cho peak cao không bị peak phụ 37 Tất trường hợp kiểm tra DNA bệnh nhân phù hợp với đặc điểm lâm sàng huyết học Các đột biến phát gia đình phù hợp với đặc điểm di truyền cha mẹ Phương pháp SNPlex có độ nhạy cao, kỹ thuật đơn giản, dễ thực để phát đột biến điểm đột biến đoạn nhỏ, chi phí thấp nên áp dụng phổ biến để chẩn đoán xác định đột biến β thalassaemia Trên giới có nơi sử dụng kỹ thuật Multiplex minisequencing phát đột biến β thalassaemia, nghiên cứu dựa phương pháp nói Tuy nhiên có thay đổi thơng số kỹ thuật cho giai đoạn để đạt kết tốt nhất, trường hợp đột biến -28 A>G Đối với đột biến codon 41/41 –TCTT thực phần thiết lập thông số phát đột biến có trùng lấp kết đột biến codon 41/41 –TCTT với đột biến codon95 +A kết điện di sàng lọc đột biến codon 41/41 –TCTT cho peak màu xanh kích thước giống với peak xanh WT đột biến codon95 +A (mẫu lại mẫu đột biến codon 41/41 –TCTT) Chúng nghi ngờ mồi phát đột biến codon 41/41 –TCTT (Cd41/42-F trình tự (a)14 CCTTGGACCCAGAGGTT) bị nhầm với mồi phát đột biến codon95 +A đặt lại mồi Cd41/42-F trình tự (a)14 CCTTGGACCCAGAGGTT, kết giống kết ban đầu, chúng tơi nghi ngờ trình tự đoạn mồi Cd41/42-F trình tự (a)14 CCTTGGACCCAGAGGTT có nhiều poly (a) nên bị xoắn lại nên lúc điện di mao quản kết cho kích thước sản phẩm khoảng 25 bp ngắn bình thường 30 – 31 bp 38 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Kỹ thuật SNP (minisequencing) để sàng lọc lúc nhiều đột biến hiệu giúp tiết kiệm thời gian nguyên liệu trình xác định đột biến Đã thiết lập thông số tối ưu cho phản ứng PCR nhân đoạn gen β globin đồng thời xác định đột biến đoạn -619 bp, phản ứng SNPlex, phản ứng tinh sản phẩm sau PCR SNPlex, thông số cho trình điện di mao quản Và sử dụng phương pháp SNP (mini-sequencing) để sàng lọc chẩn đoán xác định loại đột biến β thalassaemia phổ biến Việt Nam 5.2 Đề nghị Xem lại thành phần phản ứng SNPlex sàng lọc đột biến -28, xem nồng độ thể tích thành phần chưa phù hợp, mồi phát đột biến -28 bị thoái hóa, hóa chất bị hỏng Thực sàng lọc tiếp đột biến codon 41/41 –TCTT thay đổi thành phần hóa chất điện di mao quản đột biến IVS1-1 G>T, Codon95+A, Codon26 G>A (HbE), IVS2-654 C>T, Codon17 A>T, Codon71/72+A theo thông số điện di mao quản đột biến -28 A>G xem kết thời gian thực ngắn nên làm hai mẫu xem kết quả, chưa thực số lượng mẫu nhiều Nếu thành cơng tiết kiệm hóa chất (SS-80) Và đưa thơng số tối ưu để đưa phương pháp vào áp dụng sàng lọc trước sinh 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO   Tài liệu tiếng Việt Mã Phương Hạnh, Lâm Thị Mỹ, số - 2009 Đặc điểm bệnh nhân thalassaemia thể nặng có ứ sắt bệnh viện nhi đồng Tạp chí y học Vol 13: 167 – 171 Nguyễn Khắc Hân Hoan 2006 Mơ hình sàng lọc chẩn đoán sớm trước sinh bệnh β thalassaemia Bệnh viện Từ Dũ Lâm Thị Mỹ, Lê Bích Liên, Bùi Mai Phương, Nguyễn Minh Tuấn 2003 Tình hình chẩn đoán điều trị bệnh β thalassaemia bệnh viện nhi đồng Y học TP Ho Chi Minh vol 7: 38 – 43 Trần Nguyễn An Phú 2007 Chẩn đoán đột biến beta thalassaemia phương pháp AMRS-PCR, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Phạm Hùng Vân 2009 PCR real-time PCR: Các vấn đề áp dụng thường gặp Nhà Xuất Bản Y Học Tài liệu tiếng Anh Androulla Eleftheriou 2003 About thalassemia Thalassemia international federation 1: 14 – 20 Deborah Rund, M.D., and Eliezer Rachmilewitz, M.D 2005 β thalassaemia The new england journal of medicine 353:1135-46 John Old, Joanne Traeger-Synodinos, Renzo Galanello, Mary Petrou & Michael Angastiniotis 2005 Prevention of thalassemias and other haemoglobin disorders Thalassemia International federation vol 2: 85 – 150 M.L Saovaros Svasti, Tran Minh Hieu, Thongperm Munkongdee, Pranee Winichagoon,Tran Van Be, Tran Van Binh, and Suthat Fucharoen 2002 Molecular Analysis of β-Thalassemia in South Vietnam American Journal of Hematology vol 71:85–88 10 Wang, W., Kham, S K., Yeo, G H., Quah, T C & Chong, S S 2003 Multiplex minisequencing screen for common Southeast Asian and Indian beta-thalassemia mutations Clin Chem, 49(2), 209-218 Tài liệu Internet 11 www.molehr.oxfordjournals.org 12 http://www.cooleysanemia.org/ 13 http://www.beckmancoulter.co.jp/product/product01/SNPs.html 14 http://www.genetics.com.au/ 15 http://www.ncbi.nlm.gov/ 16 http://www.globin.cse.edu/globin/html/huisman 17 http://www.thalassemia.org/ 18 http://www.umass.edu/molvis/tutorials/hemoglobin/index.htm 19 www.bestofsicily.com/mag/art133.html  40 PHỤ LỤC   Bảng Số liệu thống kê kích thước peak điện di mao quản STT MHV IVS1 Cd95 09072A dC/1 dG/ 9,72 25,40 dA/2 0,19 09072B dC/ dG/ 19,79 25,44 dA/ 25,39 09072C dC/ dG/ 19,74 25,36 09078A dC/ dG/ 19,70 25,61 dA/ 25,53 09078B dC/ dG/ 19,72 25,31 09078C dC/ 19,91 09074B dC/ 19,63 09074C dC/ 19,85 09218B dC/ 1976 10 09218C dC/ 19,79 Cd26 IVS2 Cd17 Cd71 -28 KQĐB dC/ dC/ dT/ dG/ dT/ IVS1 36,15 62,91 53,20 57,50 43,73 dC/ dC/ dT/ dG/ dT/ Cd95 36,09 63,01 53,13 57,65 43,77 dC/ 36,26 dC/ 36,48 dT/ 36,36 dC/ 36,08 dC/ 62,90 dC/ 63,07 dT/ 53,20 dT/ 53,09 dC/ dT/ 62,87 51,00 dA/ 52,39 dG/ dC/ dC/ dT/5 24,30 35,17 62,63 3,08 dA/ 24,40 dG/2 dC/ dC/ dT/ 5,48 36,00 62,80 52,23 dT/ 62,94 dG/ dC/ dC/ dT/ 24,96 35,76 62,75 52,78 dT/ 62,88 dG/ dC/ dC/ dT/ 25,85 36,50 63,13 51,93 dA/ 53,13 dG/ dC/ dC/ dT/ 25,63 36,32 63,10 52,86 dG/ 57,50 dG/ 57,56 dT/ Không 43,77 dT/ Cd95 43,85 Cd26 dG/ dT/ Cd17 56,36 43,78 dG/ dT/ Cd95 57,53 43,84 dG/ dT/ IVS2 56,49 43,77 -28 dC/4 3,91 dG/ dT/ IVS2 57,22 43,84 dG/ dT/ Cd17 57,31 43,80 -28 dC/ 43,99 dG/ dT/ -28 57,30 43,85 dC/ 43,90 Bảng (tt) Số liệu thống kê kích thước peak điện di mao quản STT MHV IVS1 Cd95 Cd26 IVS2 Cd17 Cd71 11 10034A dC/ dG/ dC/ dC/ dT/ dG/ 19,72 25,27 36,13 62,91 52,83 57,27 dA/ 52,92 12 10034B dC/ dG/ dC/ dC/ dT/ dG/ 19,57 25,19 36,05 62,82 53,20 57,61 dA/ 53,41 13 10034C dC/ dG/ dC/ dC/ dA/5 dG/ 19,83 24,96 35,75 62,74 3,19 56,98 14 15 16 -28 KQĐB dT/ Cd17 43,84 dT/ Cd17 44,12 dT/ Cd17 43,75 đồng hợp 10029A dC/1 dG/ dC/ dC/ dT/ dG/ dT/ Cd71 9,82 25,47 36,40 63,21 52,81 57,14 43,33 dA/ 57,21 10029B dC/ dG/ dC/ dC/ dT/ dG/ dT/ IVS2 19,93 25,18 35,93 63,02 52,94 57,18 43,48 dT/ 63,09 10029C dC/ dG/ dC/ dC/ dT/ dG/ dT/ Cd71 19,58 24,75 36,65 62,74 52,70 57,10 43,49 dA/ 57,11 SST: số thứ tự, MNV: mã nhập viện, KQĐB: kết đột biến Hình Gen β globin nhiễm sắc thể 11 Hình Trình tự gen β globin nhiễm sắc thể 11 Hình Sơ đồ khối máy điện di mao quản Hình Kết điện di mao quản chứng dương đột biến -28 Hình Kết điện di mao quản chứng dương đột biến codon 26 Hình Kết điện di mao quản chứng dương đột biến codon 17 Hình Kết điện di mao quản chứng dương đột biến codon 71 Hình Kết điện di mao quản chứng dương đột biến codon 95 Hình Kết điện di mao quản chứng dương đột biến IVS1 Hình 10 Kết điện di mao quản chứng dương đột biến IVS2 ... Thalassaemia tên chung cho nhóm bệnh thi u máu, di truyền lặn nhiễm sắc thể thường Bệnh thalassaemia gây giảm tạo haemoglobin tăng phá hủy hồng cầu Kết hồng cầu giảm số lượng (thi u máu) chất lượng (hồng... thalassaemia Thalassemia bệnh thi u máu di truyền lặn nhiễm sắc thể thường phổ biến giới Bệnh nhà khoa học quan tâm nghiên cứu từ đầu kỷ 20 Vào năm 1904, Jame B Herrick lần phát bệnh thi u máu hồng cầu... thường hóa học X-quang, biểu thi u máu gan, lách to, da vàng, xương mặt xương hộp sọ to biến dạng trẻ em Italia Năm 1936, Whipple Bradford mô tả trường hợp bệnh nhân thi u máu giống bệnh nhân Cooley