ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SNP (MINISEQUENCING) TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH BETATHALASSAEMIA

Tuy nhiên, phương pháp này chỉ phát hiện được những đột biến đã biết trước, những mẫu không phát hiện được đột biến thì phải đem đi giải trình tự, và cho đến nay Việt Nam vẫn chưa có phư

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SNP (MINI-SEQUENCING) TRONG

CHẨN ĐOÁN BỆNH BETA-THALASSAEMIA

Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện : NGUYỄN THỊ KIM NGÂN Niên khóa : 2006 – 2010

Tháng 7/2010

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SNP (MINI-SEQUENCING) TRONG

CHẨN ĐOÁN BỆNH BETA-THALASSAEMIA

Hướng dẫn khoa học: Sinh viên thực hiện:

ThS BS NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN NGUYỄN THỊ KIM NGÂN ThS BS QUÁCH THỊ HOÀNG OANH

Tháng 7/2010

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn:

Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm

Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý Thầy - Cô đã truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong suốt thời gian học tại trường

ThS.BS Nguyễn Khắc Hân Hoan, ThS.BS Quách Thị Hoàng Oanh đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận

Xin cảm ơn thầy cô và các anh chị tại Phòng Di Truyền Bệnh viện Từ Dũ đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận

Các bạn bè thân yêu lớp Công Nghệ Sinh Học khóa 32 đã giúp đỡ và chia sẻ cùng tôi những vui buồn trong suốt những năm học cũng như thời gian thực tập tốt nghiệp

Con xin chân thành cảm ơn Cha Mẹ đã luôn theo dõi, động viên cho con

Chân thành cảm ơn

Tp Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2010

Sinh viên Nguyễn Thị Kim Ngân

TÓM TẮT

Thalassaemia nặng cần truyền máu để duy trì sự sống tuy nhiên truyền máu kéo dài sẽ có biến chứng ứ sắt ở mô dẫn đến tổn thương các cơ quan gây tử vong cao Nước ta có tần suất bệnh β thalassaemia cao, chi phí điều trị lại quá lớn trong khi nước

ta lại có nguồn lực thấp không thể kham nổi chi phí này Do đó, chẩn đoán trước sinh

là biện pháp phòng ngừa hiệu quả làm giảm gánh nặng bệnh tật lên xã hội Vì thế việc thành lập một chương trình phát hiện thalassaemia với những kỹ thuật di truyền thích hợp tại Việt Nam là hết sức cần thiết Vì những lý do trên, chúng tôi thực hiện đề tài:

“Ứng dụng kỹ thuật SNP (Mini-Sequencing) trong chẩn đoán bệnh β-Thalassaemia

Kỹ thuật SNP được chúng tôi nghiên cứu để ứng dụng vào chẩn đoán trước sinh bằng cách kiểm tra DNA của bố mẹ và thai nhi từ máu bố mẹ (10 mẫu) và nước ối thai nhi (6 mẫu) Nghiên cứu sử dụng kỹ thuật SNP xác định 8 loại đột biến gây bệnh β thalassaemia phổ biến tại Việt Nam: –28 A Æ G, codon 17 AAG Æ TAG, IVS1-1 G

Æ T, codon 41/41 –TCTT, codon 71/72 +A, codon 95 +A, IVS2-654 C Æ T, codon

26 GAG Æ AAG Trong quá trình nghiên cứu chúng tôi đã tiến hành thiết lập những thông số cho các phản ứng PCR để xác định đột biến mất đoạn -619bp, phản ứng SNPlex gồm 2 phản ứng multiplex và 1 phản ứng signleplex và đã xác định được 7 loại đột biến : –28 A Æ G, codon 17 AAG Æ TAG, IVS1-1 G Æ T, codon 71/72 +A, codon 95 +A, IVS2-654 C Æ T, codon 26 GAG Æ AAG

SUMMARY

The thesis: "Technical Applications SNP (mini-sequencing) in the diagnosis of

β-Thalassaemia”. 

Children with Thalaaemia major need blood transfusing regularly for all their

life – time Gradually, there is iron overload in tissue leading to damage organs in the

body and causing death Vietnam has a high frequency of disease β thalassemia,

treatment costs are too great, while our country has low resources that can not afford

these cost Therefore, diagnosis before birth is effective measure to reduce the disease

burden on society Thus the establishment of a detection program to thalassemia with

appropriate genetic engineering in Vietnam is very necessary

We research technical SNP to diagnose before birth by testing the DNA of

parents and their prenatal child from parental blood (10 samples) and fetal amniotic

fluid (6 samples) The study use a technical SNP to identify eight types of mutations

causing β Thalassaemia commonly occurring in Vietnam: –28 A Æ G, codon 17 AAG Æ TAG, IVS1-1 G Æ T, codon 41/41 –TCTT, codon 71/72 +A,

codon 95 +A, IVS2-654 C Æ T, codon 26 GAG Æ AAG In the course of study,

we have conducted to establish parameters for PCR to identify mutants delete the

-619bp, including two SNPlex reaction and a multiplex reaction and the reaction

signleplex has identified seven types mutation: –28 A Æ G, codon 17 AAG Æ TAG, IVS1-1 G Æ T, codon 71/72 +A, codon 95 +A,

IVS2-654 C Æ T, codon 26 GAG Æ AAG

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT ii

SUMMARY iii

MỤC LỤC iv

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT vi

DANH SÁCH CÁC BẢNG vii

DANH SÁCH CÁC HÌNH viii

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1 

1.1 Đặt vấn đề 1 

1.2 Mục tiêu của đề tài 2 

1.3 Nội dung thực hiện 2 

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 

2.1 Tổng quan về bệnh thalassaemia 3 

2.1.1 Lịch sử nghiên cứu bệnh thalassaemia 3 

2.1.2 Cấu trúc phân tử haemoglobin và gen tổng hợp globin 4 

2.1.3 Phân loại bệnh thalassaemia 5 

2.1.4 Sự phân bố của bệnh thalassaemia 6 

2.1.5 Chi phí điều trị bệnh thalassaemia 8 

2.2 Bệnh học và di truyền bệnh β thalassaemia 8 

2.2.1 Cơ sở phân tử của bệnh 8 

2.2.2 Đặc điểm lâm sàng 9 

2.2.3 Cơ chế bệnh học của β thalassaemia 11 

2.2.4 Cơ chế di truyền bệnh β thalassaemia 11 

2.2.5 Điều trị bệnh β thalassaemia 11 

2.2.6 Sự lưu hành của gen β thalassaemia trên thế giới 12 

2.3 Các phương pháp chẩn đoán bệnh β thalassaemia 14 

2.3.1 Chẩn đoán lâm sàng 14 

2.3.2 Chẩn đoán cận lâm sàng 14 

2.4 Các nghiên cứu ứng dụng trong chẩn đoán bệnh β thalassaemia 19 

2.4.1 Trên thế giới 19 

2.4.2 Tại Việt Nam 19 

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 21 

3.2 Vật liệu 21 

3.2.1 Mẫu bệnh phẩm 21 

3.2.2 Hóa chất 21 

3.2.3 Mồi 22 

3.2.4 Thiết bị và dụng cụ 23 

3.2.5 Phương pháp tách chiết DNA 24 

3.3 Phương pháp xét nghiệm 25 

3.3.1 Phương pháp PCR xác định đột biến mất đoạn -619 bp 26 

3.3.2 Làm sạch sản phẩm thừa sau PCR 27 

3.3.3 Phản ứng SNPlex 27 

3.3.4 Tinh sạch sau phản ứng SNPlex 29 

3.3.5 Điện di mao quản bằng máy CEQ 8000 29 

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 

4.1 Kết quả 32 

4.1.1 Kết quả sàng lọc đột biến mất đoạn -619bp 32 

4.1.2 Kết quả sàng lọc 7 đột biến 34 

4.2 Thảo luận 37 

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 39 

5.1 Kết luận 39 

5.2 Đề nghị 39 

TÀI LIỆU THAM KHẢO 40  PHỤ LỤC

 

 

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ARMS: amplification refractory mutation system

DNA: deoxyribonucleic acid

dATP: 2’- deoxyadenosine - 5’ - triphosphate

(lượng haemoglobin trung bình trong một hồng cầu)

MK: marker (thang chuẩn)

MT mutation (đột biến)

NST: nhiễm sắc thể

PCR: polymerase chain reaction

RNA: ribonucleic acid

SNP: single-nucleotide polymorphism

Taq: Thermus aquaticus

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Số liệu bệnh máu nhập viện tại khoa Huyết học lâm sàng, BVNĐ1 7

Bảng 2.2 Các đột biến β thalassaemia phổ biến ở một số nơi trên thế giới 12

Bảng 3.1 Mồi dùng cho phản ứng PCR phát hiện đột biến mất đoạn -619 bp 22

Bảng 3.2 Mồi dùng cho phản ứng SNPlex 23

Bảng 3.3 Thành phần phản ứng PCR xác định đột biến mất đoạn -619 bp 26

Bảng 3.4 Chu trình luân nhiệt 26

Bảng 3.5 Kích thước các sản phẩm DNA sau PCR 27

Bảng 3.6 Thành phần phản ứng bất hoạt sản phẩm PCR 27

Bảng 3.7 Thành phần của phản ứng SNPlex 1 28

Bảng 3.8 Thành phần phản ứng SNPlex 2 28

Bảng 3.9 Thành phần phản ứng SNPlex 3 28

Bảng 3.10 Chu trình luân nhiệt cho phản ứng SNPlex 29

Bảng 3.11 Thành phần phản ứng tinh sạch sau SNPlex 29

Bảng 3.12 Thành phần điện di mao quản 1 29

Bảng 3.13 Thành phần điện di mao quản 2 30

Bảng 3.14 Kích thước sản phản phản ứng SNPlex điện di mao quản 30

Bảng 4.1 Kết quả sàng lọc đột biến mất đoạn -619 bp 33

Bảng 4.2 Kết quả sàng lọc 7 đột biến của 16 mẫu bệnh phẩm 36

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Cấu trúc phân tử haemoglobin 4

Hình 2.2 Sự tổng hợp chuỗi globin trong các giai đoạn phát triển ở người 4

Hình 2.3 Cụm gen α 5

Hình 2.4 Cụm gen β 5

Hình 2.5 Phân bố bệnh thalassaemia trên thế giới 6

Hình 2.6 Bệnh nhân thalassaemia nặng phải cắt lách 10

Hình 2.7 Cơ chế di truyền bệnh thalassaemia 11

Hình 2.8 Nguyên lý hoạt động của kỹ thuật ARMS-PCR 16

Hình 2.9 Phương pháp minisequencing 18

Hình 2.10 Sơ đồ phân tích gen β globin bằng kỹ thuật multiplex minisequecing 19 Hình 3.1 Bộ kit của Qiagen 21

Hình 3.2 Máy ly tâm 24

Hình 3.3 Máy ủ nhiệt 24

Hình 3.4 Máy định lượng DNA 24

Hình 3.5 Máy luân nhiệt 24

Hình 3.7 Máy chụp gel 24

Hình 3.6 Máy CEQ 8000 24

Hình 3.8 Máy trộn mẫu 24

Hình 3.9 Bể điện di 24

Hình 3.10 Các bước thực hiện trong trong quá trình nghiên cứu 25

Hình 3.11 Nguyên tắc hoạt động của kit SNP 27

Hình 4.1 A, B Kết quả điện di sàng lọc đột biến mất đoạn -619 bp 32

Hình 4.2 Kết quả điện di mao quản SNPlex 1 của mẫu 1 34

Hình 4.3 Kết quả điện di mao quản SNPlex 2 của mẫu 1 35

Hình 4.4 Kết quả điện di mao quản SNPlex 3 của mẫu 1 35

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Thalassaemia là tên chung cho một nhóm bệnh thiếu máu, di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường Bệnh thalassaemia gây ra giảm tạo haemoglobin và tăng phá hủy hồng cầu Kết quả là hồng cầu giảm về số lượng (thiếu máu) và chất lượng (hồng cầu nhỏ, nhược sắc)

Mỗi năm, trên thế giới có khoảng 100000 em bé sinh ra mắc phải loại bệnh trầm trọng của nhóm bệnh trên - phần lớn là người Ý, Hy Lạp, Trung Đông, Đông Nam Á và Châu Phi Và hiện bệnh đang hiện diện khắp nơi do tình trạng di dân

Thalassaemialà bệnh di truyền rất phổ biến ở Đông Nam Á, Trung Quốc, Ấn

Độ, Châu Phi và Địa Trung Hải Cứ 10 người thì có 1 người mang gen bệnh Hiện thế giới có khoảng 269 triệu người mang một gen đột biến Riêng Việt Nam thống kê di truyền quần thể cho thấy có 5,1 triệu người mang gen đột biến gây bệnh thalassaemia, với 1700 trẻ sơ sinh bị bệnh sinh ra mỗi năm (Nguyễn Khắc Hân Hoan, 2009)

Bệnh thalassaemia là một gánh nặng cho xã hội nói chung và gia đình bệnh nhân nói riêng, vì bệnh nhân phải truyền máu liên tục Hiện nay nhu cầu về nguồn máu phục vụ điều trị ngày càng cao Ngoài ra, những tai biến về truyền máu cũng như hiện tượng lây nhiễm do truyền máu là điều đáng quan tâm Bệnh còn làm giảm khả năng hoạt động xã hội của bệnh nhân

Tại Việt Nam Bệnh viện Từ Dũ là bệnh viện duy nhất cả nước thực hiện được

kỹ thuật ARMS – PCR chẩn đoán trước sinh (chi phí một 1 triệu đồng/lần, sau 1-2 tuần có kết quả) để xác định thai nhi có mắc bệnh hay không (Nguyễn Khắc Hân Hoan, 2009) Tuy nhiên, phương pháp này chỉ phát hiện được những đột biến đã biết trước, những mẫu không phát hiện được đột biến thì phải đem đi giải trình tự, và cho đến nay Việt Nam vẫn chưa có phương pháp nào khác để kiểm tra lại kỹ thuật ARMS – PCR Vì thế, cần thiết thực hiện kỹ thuật SNP (minisequencing), để kiểm tra lại kỹ thuật ARMS-PCR góp phần phát hiện bệnh sớm và tư vấn cho gia đình bệnh nhân Kỹ thuật SNP là kỹ thuật phát hiện đột biến điểm mà bệnh β thalassaemia là do đột biến điểm gây ra, nên kỹ thuật này là rất phù hợp

1.2 Mục tiêu của đề tài

Kỹ thuật SNP được nghiên cứu để ứng dụng vào chẩn đoán trước sinh bằng cách xác định đột biến DNA từ máu của bố mẹ và nước ối thai nhi

1.3 Nội dung thực hiện

1.3.1 Xác định các thông số cho phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen β globin và đồng thời phát hiện đột biến mất đoạn -619bp

1.3.2 Tinh sạch sản phẩm PCR bằng enzyme ExoSap-It

1.3.3 Xác định các thông số cho phản ứng multiplex hay singleplex SNP

1.3.4 Làm sạch sau phản ứng multiplex hay singleplex SNP

1.3.5 Điện di mao quản: Mini-sequencing

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về bệnh thalassaemia

2.1.1 Lịch sử nghiên cứu bệnh thalassaemia

Thalassemia là bệnh thiếu máu di truyền lặn nhiễm sắc thể thường phổ biến trên thế giới Bệnh đã được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu từ đầu thế kỷ 20 Vào năm 1904, Jame B Herrick lần đầu tiên phát hiện bệnh thiếu máu hồng cầu hình liềm Năm 1925- 1927, Cooley và cộng sự đã mô tả những hình ảnh bất thường về hóa học

và X-quang, đó là những biểu hiện về thiếu máu gan, lách to, da vàng, xương mặt và xương hộp sọ to và biến dạng ở trẻ em Italia

Năm 1936, Whipple và Bradford mô tả những trường hợp bệnh nhân thiếu máu giống những bệnh nhân của Cooley đã từng miêu tả và lần đầu tiên dùng thuật ngữ Thalassemia vì tất cả bệnh nhân được báo cáo là người thuộc vùng Địa Trung Hải, thuật ngữ Hy Lạp của từ này có nghĩa là “biển” (thalassa) và “thiếu máu” (anaemia)

Cuối thập niên 1940 là thời kỳ tiến bộ nhanh chóng về mọi mặt của lĩnh vực haemoglobin (Hb) người Năm 1948, Haldane là nguời đầu tiên cho rằng thalassaemia xuất hiện với tần số cao trong dân cư vùng Địa Trung Hải ở thể dị hợp tử có khả năng bảo vệ cơ thể khỏi tình trạng sốt rét nặng Lĩnh vực này tiếp tục phát triển đến cuối thập niên 50

Năm 1959, Ingram và Stretton đã đưa ra mô hình lý thuyết quan trọng về cơ sở

di truyền của thalassaemia Họ cho rằng có 2 loại thalassaemia chính là α và β, và vì vậy họ cũng cho rằng 2 dạng biến thể của cấu trúc Hb là do sự bất thường của chuỗi α globin hay β globin

Thập niên 60 và 70 là giai đoạn có nhiều thành công lớn trong việc khám phá cấu trúc của cụm gen α globin trên nhiễm sắc thể (NST) 16

Cuối thập niên 70 và đầu thập niên 80, bản đồ gen của cụm gen α globin đã được thiết lập Cho đến nay đã có những hiểu biết đầy đủ hơn về cấu trúc bất thường của các Hb gây nên bệnh thalassaemia

Đến nay, các nhà khoa học đã phát hiện được một số lượng lớn các đột biến mất đoạn và không mất đoạn gây bệnh α thalassemia và hơn 200 loại đột biến khác nhau gây bệnh β thalassemia Nhờ những hiểu biết về sinh lý bệnh và bệnh học phân tử mà

người mang gen bệnh thalassaemia được phát hiện sớm một cách dễ dàng và chương trình chẩn đoán trước sinh đã được áp dụng ở rất nhiều nước trên thế giới (các nước vùng Địa Trung Hải, Ấn Độ, Thái Lan…), làm giảm tần suất trẻ mới sinh mắc bệnh thalassemia thể nặng (Trần Nguyễn An Phú, 2007)

2.1.2 Cấu trúc phân tử haemoglobin và gen tổng hợp globin

Hình 2.1 Cấu trúc phân tử haemoglobin

(Nguồn: http://www.umass.edu/molvis/tutorials/hemoglobin/index.htm)

Hb gồm 2 thành phần: phần protein là globin gồm 4 chuỗi polypeptide giống nhau từng đôi một và các chuỗi này gắn với thành phần thứ hai là hem gồm 4 nhân qua các vị trí gắn kết oxy (Trần Nguyễn An Phú, 2007)

Hình 2.2 Sự tổng hợp chuỗi globin trong các giai đoạn phát triển ở người

(Nguyễn Khắc Hân Hoan, 2006)

Ở người trưởng thành sự tổng hợp globin được điều hòa bởi 2 cụm gen α globin

và β globin nằm những vị trí riêng biệt trên NST 16 và NST 11

Cụm gen α globin nằm trên nhánh ngắn, vùng 13 và tiểu vùng 3 của NST 16 (16p13,3), trên một đoạn DNA dài 30.000 cặp base Trên mỗi NST 16 có 2 gen α Vùng mã hóa của gen được sắp xếp trong 3 exon và mã hóa cho 141 amino acid trong

đó exon 1 mã hóa cho 31 amino acid, exon 2 mã hóa cho 68 amino acid, exon 3 mã hóa cho 42 amino acid

Hình 2.3 Cụm gen α (Nguyễn Khắc Hân Hoan, 2006)

Cụm gen β nằm trên nhánh ngắn, vùng 15 và tiểu vùng 5 của NST 11 (11p15,5), trên đoạn DNA dài 73308 bp Gen β mã hóa cho 141 amino acid Exon 1

mã hóa cho amino acid từ 1-30, exon 2 mã hóa cho amino acid từ 31-104 và exon 3

mã hóa cho các amino acid từ 105-146 Các exon này tương ứng với 3 vùng cấu trúc

và chức năng của chuỗi β globin Exon 1 và exon 3 nằm phía ngoài chủ yếu là các amino acid ưa nước Exon 2 nằm bên trong phân tử tạo bởi các amino acid kỵ nước Khi đột biến gen xảy ra, trình tự về mặt chức năng bị thay đổi Các amino acid ưa nước ở bề mặt có thể bị thay thế bởi các amino acid kị nước và tạo ra các thay đổi về

lý hóa dẫn đến sự giảm đàn hồi, gây ra sự không ổn định của phân tử

Hình 2.4 Cụm gen β (Nguyễn Khắc Hân Hoan, 2006)

2.1.3 Phân loại bệnh thalassaemia

Bệnh thalassaemia được phân loại dựa vào sự không tổng hợp hoặc giảm tổng hợp chuỗi globin Bệnh được chia làm hai loại chính là α thalassaemia và β thalassaemia Trong bệnh α thalassaemia giảm tổng hợp chuỗi α globin, β thalassaemia giảm tổng hợp chuỗi β globin Ngoài ra còn có nhiều loại hiếm gặp khác như: γ thalassaemia, δ thalassaemia, εγδβ thalassaemia

3’

30kb 20kb

2.1.4 Sự phân bố của bệnh thalassaemia

2.1.4.1 Bệnh thalassaemia trên thế giới

Thalassaemia hiện diện với tần số khá cao ở vùng sốt rét do những người mang gen thalassaemia có khả năng tự bảo vệ khỏi sốt rét một cách mạnh mẽ Bệnh kéo dài

từ vùng Địa Trung Hải, qua Trung Đông, bán đảo Ấn Độ, Đông Nam Á và các quần đảo ở Thái Bình Dương Hiện nay, bệnh thalassaemia là vấn đề toàn cầu do tình trạng

di dân.Theo hiệp hội thalassemia có 1,5% dân số toàn thế giới mắc bệnh β thalassemia, với khoảng 100.000 trẻ sinh ra hàng năm mắc bệnh này tuy nhiên chỉ có 60.000 trẻ thalassemia nặng sống sót và được điều trị (Mã Phương Hạnh, 2009)

Hình 2.5 Phân bố bệnh thalassaemia trên thế giới

(Nguồn: www.bestofsicily.com/mag/art133.html)

Bệnh α thalassaemia tập trung tại Châu Phi, Trung Đông, bán đảo Ấn Độ và Đông Nam Á, Địa Trung Hải Tần suất cao ở một số đảo trên Thái Bình Dương, có thể lên tới 80% Về β thalassaemia, bệnh phổ biến ở Bắc Phi, Địa Trung Hải, một số nơi ở Trung Đông, bán đảo Ấn Độ và Đông Nam Á Tần suất ở các vùng này khoảng 1 – 20% Hb E có tần suất cao ở bán đảo Ấn Độ và là dấu hiệu đặc trưng của Đông Nam Á.Tần suất mang gen HbE ở Thái Lan, Lào và Campuchia có thể hơn 60% Bệnh cũng

có tần số cao ở một số vùng thuộc Liên Xô cũ và Trung Quốc Ở châu Phi bệnh tương đối ít gặp

Ở những vùng có tần số lưu hành bệnh cao, thường có một số đột biến mang tính phổ biến chiếm đa số bên cạnh các đột biến có tỷ lệ thấp, ít gặp hơn Các đột biến này có tính đặc trưng cho từng dân tộc, từng vùng (Nguyễn Khắc Hân Hoan, 2006)

2.1.4.2 Bệnh thalassaemia ở Việt Nam

Việt nam là một quốc gia đa dân tộc với 54 dân tộc, trong đó người Kinh là

nhóm dân tộc chính với khoảng 75 triệu dân phân bố khắp đất nước, các dân tộc thiểu

số còn lại chỉ chiếm khoảng 8,1 % dân số và đa số sống ở vùng cao nguyên Tỉ lệ

bệnh thalasseamia ở nước ta dao động vào khoảng từ 1,5 % và 25%, tỉ lệ mắc bệnh cao

nhất ở nhóm dân tộc thiểu số đặc biệt là Tầy (11 %), Mông (25 %), Pako (8,33 %),

Catu (14 %) (Saovaros Svasti và ctv, 2002)

Tần suất người mang gen trung bình của bệnh α thalassaemia, β thalassaemia và

Hb E của dân tộc Kinh lần lượt là 5,35 %, 1,5 % và 4,9 % Các dạng α thalassaemia

nghiêm trọng thường gây chết trong tử cung và không tạo gánh nặng lên sức khỏe

cộng đồng Vì thế, chính β thalassaemia và Hb E mới là thách thức chủ yếu

(Trần Nguyễn An Phú, 2007)

Ở Việt Nam, theo báo cáo Viện Nhi bệnh chiếm 49% các trường hợp thiếu máu

tán huyết Tại trung tâm truyền máu huyết học, bệnh huyết sắc tố chiếm 11,46% trong

đó β.Thalassemia chiếm 30,2% (Mã Phương Hạnh, 2009)

Bảng 2.1 Số liệu bệnh máu nhập viện tại khoa Huyết học lâm sàng, BVNĐ1

Số liệu thống kê của bệnh viện Nhi Đồng 1 (Mã Phương Hạnh, 2009)

Ước tính nước ta hiện có 5,12 triệu người mang gen β thalassaemia hoặc Hb E

Với tỉ suất sinh 19,58/1000 thì có khoảng 1,57 triệu trẻ sinh ra mỗi năm trong số đó có

100 ngàn trẻ dị hợp tử gen bệnh và 1.700 trẻ đồng hợp tử hay dị hợp tử kép gen bệnh

và biểu hiện bệnh nặng Như vậy, mỗi năm số lượng bệnh nhân sẽ tăng lên chồng chất (Nguyễn Khắc Hân Hoan, 2006)

2.1.5 Chi phí điều trị bệnh thalassaemia

Chi phí dành cho các bệnh nhân thalassaemia bao gồm truyền máu 200.000 đ/125ml/ 10 kg/lần , thuốc và các điều trị cần thiết khác bao gồm thải sắt 180.000đ/ 0,5g/ 15kg/ngày và phẫu thuật, viện phí (Lâm Thị Mỹ, 2003) Cho đến nay chưa có một tính toán cụ thể về chi phí cho điều trị bệnh thalassaemia ở Việt Nam Ở các nước có nguồn lực cao, chi phí cho điều trị và chăm sóc y tế hầu như được ngân sách chính phủ trả Tuy nhiên, các nước có nguồn lực thấp không thể kham nổi chi phí này cho tất cả bệnh nhân Vì thế bệnh nhân và gia đình phải chi trả cho việc điều trị Vấn đề này tạo gánh nặng lên gia đình bệnh nhân và xã hội

Thực tế về vấn đề nguồn máu điều trị là một vấn đề nan giải nếu một bệnh nhân được truyền máu mỗi hai hoặc ba tuần, tổng số lượng máu mỗi năm khoảng 52 đơn vị Nếu 1.700 sinh ra mắc bệnh mỗi năm được truyền máu đầy đủ thì lượng máu sử dụng

sẽ gần 1,77 triệu đơn vị Tuy nhiên thực tế cho thấy hệ thống y tế của Việt Nam đang thiếu nguồn hiến máu trong khi nhu cầu cho điều trị lại tăng lên Gánh nặng do thalassaemia gây ra chắc chắn sẽ làm tình trạng khan hiếm máu trầm trọng hơn (Nguyễn Khắc Hân Hoan, 2006)

2.2 Bệnh học và di truyền bệnh β thalassaemia

2.2.1 Cơ sở phân tử của bệnh

Hiện nay trên thế giới có hơn 200 đột biến khác nhau gây bệnh β thalassaemia

đã được mô tả Trong đó, chủ yếu là đột biến điểm, phần nhỏ là đột biến mất đoạn Các đột biến này có thể gây ra sai lệch trong quá trình phiên mã, quá trình cắt nối RNA, làm xuất hiện mã dừng hoặc làm thay đổi quá trình đọc mã (Rund và ctv, 2005), kết quả là làm giảm hay mất hoàn toàn tổng hợp chuỗi β globin Có thể xếp các đột biến thành 2 nhóm, gồm các đột biến gây mất hoàn toàn tổng hợp chuỗi β globin gọi là

β0 thalassaemia và các đột biến gây giảm tổng hợp chuỗi β globin gọi là

β+thalassaemia Các đột biến β0 thalassaemia thường gây ra các biểu hiện lâm sàng nặng hơn các đột biến β+thalassaemia Những đột biến này có thể xảy ra ở vùng exon, intron và vùng promoter, poly A (Trần Nguyễn An Phú, 2007)

2.2.1.1 Đột biến vùng promoter

Đã có 18 đột biến vùng promoter được phát hiện Các đột biến ở vùng này gây ảnh hưởng đến quá trình phiên mã do làm giảm khả năng kết hợp của enzyme RNA polymerase và gây giảm nhẹ tổng hợp số lượng chuỗi β globin với các biểu hiện lâm sàng của β+ thalassaemia Ví dụ đột biến -28 AÆG (Trần Nguyễn An Phú, 2007)

2.2.1.2 Đột biến trong quá trình cắt nối RNA

Sau quá trình phiên mã, là quá trình cắt nối mRNA để loại bỏ các intron Các sai lệch trong quá trình này có thể gây ra mất hoàn toàn quá trình cắt nối bình thường hoặc giảm một phần hoặc tạo ra vị trí cắt nối mới trên intron hoặc trên exon gây ra β+ hoặc β0 thalassaemia như các đột biến IVS1-1 G Æ T và đột biến IVS2-654 C Æ T (Trần Nguyễn An Phú, 2007)

2.2.1.3 Đột biến tạo ra các mRNA không có chức năng

Đột biến vô nghĩa: xảy ra khi thay thế 1 nucleotide này bằng 1 nucleotide khác làm xuất hiện mã dừng Các chuỗi globin không hoàn chỉnh sẽ được tạo ra và nhanh chóng bị thoái hóa Các đột biến này gây ra kiểu hình β0 thalassaemia Ví dụ đột biến codon 17 AAG Æ TAG

Đột biến dịch khung: xảy ra khi mất hoặc thêm 1 hoặc nhiều nucleotide vào vùng mã hóa của gen dẫn đến kết quả là làm thay đổi khung đọc mã bình thường bắt đầu từ vị trí thay đổi và làm mã dừng xuất hiện sớm, hậu quả là tạo ra các chuỗi β globin không hoàn chỉnh Các đột biến này gây kiểu hình β0 thalassaemia Một số đột biến thuộc loại này như đột biến codon 41/42 –TTCT, codon 71/72 +A, codon 95 +A (Trần Nguyễn An Phú, 2007)

Bệnh đặc trưng bởi thiếu máu nặng xuất hiện trong vài tháng đầu của đứa bé, thiếu máu da niêm nhợt nhạt, vàng da, gan lách to, xạm da, xương mặt và xương họp

sọ biến dạng: u trán, u chẩm, xương hàm trên dô, mũi tẹt, bụng chướng, tiêu chảy,

chậm phát triển trí não Và dẫn đến những biến chứng ảnh hưởng đến đời sống là tình trạng quá tải sắt gây rối loạn chức năng các cơ quan đặc biệt là cơ tim gây tử vong, rối loạn hệ nội tiết (Mã Phương Hạnh, 2009) Hồng cầu nhỏ, nhược sắc, hình dạng hồng cầu không đều, thể tích trung bình của hồng cầu (MCH < 27 pg) và số lượng Hb trung bình trong một hồng cầu (MCV < 78 fl) giảm (Nguyễn Khắc Hân Hoan, 2006)

Hình 2.6 Bệnh nhân thalassaemia nặng phải cắt lách (tham khảo từ Mã Phương Hạnh, 2009)

2.2.2.2 β thalassaemia vừa (β + / β + )

Thể bệnh này thường là kết quả của sự kết hợp giữa 2 đột biến β+ hoặc giữa một đột biến β+ và một đột biến β0 Bệnh nhân bị thiếu máu, lách to vừa phải, nhu cầu truyền máu thấp, sống trưởng thành được β thalassaemia / Hb E được coi là thalassaemia trung gian Tuy nhiên mức độ biểu hiện của bệnh rất thay đổi Một nghiên cứu trên 378 trường hợp cho thấy một nửa trong số này có biểu hiện nhẹ nhưng một nửa có biểu hiện nặng

2.2.3 Cơ chế bệnh học của β thalassaemia

Sau khi sinh, HbA tăng dần và chiếm chủ yếu HbA gồm 2 chuỗi α và 2 chuỗi

β Các đột biến gen β globin gây mất hay giảm số lượng chuỗi β globin làm cho chuỗi

α bị dư thừa Các chuỗi này tạo thành các hạt không hòa tan, lắng xuống màng hồng cầu trong máu ngoại biên làm hồng cầu bị phá hủy sớm gây tan máu, lắng vào hồng cầu non ở tủy xương làm hồng cầu non chết trước khi trưởng thành nên sự tạo hồng cầu không hiệu quả làm cho quá trình tạo hồng cầu lại càng tăng lên Khi chuỗi β giảm, các chuỗi γ và δ tăng để bù trừ làm tăng HbF (α2γ2) và HbA2 (α2δ2) Khi sự tổng hợp chuỗi β globin giảm thì tổng hợp Hb cũng bị giảm gây biểu hiện hồng cầu nhược sắc trong máu ngoại vi và tăng tạo hồng cầu trong tủy xương Sự tăng hoạt động của tủy xương làm cho xương bị biến dạng tạo ra vẻ mặt đặc biệt của bệnh nhân thalassaemia Tóm lại, sự thiếu hụt chuỗi β globin là điểm khởi phát trong cơ chế sinh bệnh β thalassaemia (Androulla Eleftheriou, 2003)

2.2.4 Cơ chế di truyền bệnh β thalassaemia

β thalassemia là bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường theo qui luật của Mendel Trong gia đình nếu chỉ có cha hoặc mẹ mang gen bệnh thể dị hợp tử thì con sinh ra có 50% khả năng mang gen bệnh, nếu cả cha và mẹ đều mang gen bệnh thì con sinh ra có 50% khả năng mang gen bệnh và 25% khả năng con bị bệnh thể nặng

Hình 2.7 Cơ chế di truyền bệnh thalassaemia

(Nguồn: http://www.genetics.com.au/)

2.2.5 Điều trị bệnh β thalassaemia

Bệnh nhân thalassaemia thể vừa và nhẹ không cần điều trị, chỉ cần bổ sung sắt khi cần thiết Đối với thai phụ cần bổ sung thêm acid folic định kỳ

Đối với bệnh nhân thiếu máu nặng cần truyền máu: truyền hồng cầu lắng mỗi

4 – 6 lần / tuần tùy theo mức độ huyết tán Truyền máu sẽ duy trì lượng Hb bình

thường nên ngăn ngừa sự biến dạng mặt của trẻ, giúp trẻ phát triển bình thường, ngăn

ngừa lách to và cải thiện tình trạng suy tim

Thải sắt theo chỉ định là khi lượng sắt trong cơ thể vượt quá 1000 ng/ml máu,

bệnh nhân phải trên 3 tuổi, và khi bệnh nhân thalassaemia thể nặng có biểu hiện cường

lách (số lượng hồng cầu lắng truyền trong một năm trên 250 ml/kg) Những điều trị

trên cũng để lại một số di chứng: lây những bệnh truyền nhiễm như HIV, giang mai,

sốt rét… hay nhiễm trùng do cắt lách (Mã Phương Hạnh, 2009)

Ngoài ra việc ghép tủy cũng là một phương án điều trị bệnh Chi phí cho ghép

tủy rất tốn kém, không phải phù hợp với tất cả các bệnh nhân mà còn phụ thuộc vào

tuổi tác, tình trạng sức khỏe của bệnh nhân

2.2.6 Sự lưu hành của gen β thalassaemia trên thế giới

Bảng 2.2 Các đột biến β thalassaemia phổ biến ở một số nơi trên thế giới

Người Việt

-28 AÆG codon 17 AAGÆTAG codon 26 GAGÆAAG codon 41/42 –TTCT codon 71/72 +A IVS 2-654 CÆT codon 95 +A

codon 41/42 –TTCT IVS 2-654 CÆT

Bảng 2.2 (tt) Các đột biến β thalassaemia phổ biến ở một số nơi trên thế giới

Người Trung Quốc

-28 AÆG codon 17 AAGÆTAG codon 26 GAGÆAAG codon 41/42 –TTCT codon 71/72 +A IVS 2-654 CÆT

2.3 Các phương pháp chẩn đoán bệnh β thalassaemia

2.3.1 Chẩn đoán lâm sàng

Bệnh β thalassaemia thể nặng thường gặp ở trẻ dưới 5 tuổi với triệu chứng thiếu máu huyết tán mãn: da niêm nhợt nhạt, vàng da, gan lách to, xạm da Biến dạng xương sọ: u trán, u chẩm, xương hàm trên dô, mũi tẹt Chậm phát triển thể chất và tinh thần

Đối với β thalassaemia thể vừa và nhẹ, có thiếu máu với mức độ thay đổi Hầu hết, người mang gen thể dị hợp tử không có triệu chứng và thường được phát hiện qua xét nghiệm huyết học hay trong gia đình có người bị thalassaemia thể nặng Cơ thể phát triển bình thường chỉ một tỉ lệ nhỏ thalassaemia thể dị hợp tử có thiếu máu mạn

25 – 300 ng/ml và nữ 16 – 160 ng/ml (Lâm Thị Mỹ, 2003)

2.3.2.2 Chẩn đoán di truyền phân tử

Một số kỹ thuật phát hiện đột biến dựa trên phương pháp PCR Về nguyên tắc, PCR một chu kỳ nhiệt độ sẽ bao gồm 3 giai đoạn nhiệt độ:

Bước 1: nhiệt độ sẽ được đưa lên 94OC, ở nhiệt độ này các liên kết hydro của mạch đôi DNA sẽ bị mất đi, nhờ vậy DNA đích bị biến tính thành các mạch đơn; giai đoạn này gọi là giai đoạn biến tính

Bước 2: nhiệt độ sẽ được hạ đến 55OC – 65OC là nhiệt độ thích hợp để các đoạn mồi tìm đến bắt cặp bổ sung vào hai đầu của đoạn DNA đích, giai đoạn này gọi là giai đoạn bắt cặp

Bước 3: nhiệt độ được đưa lên 72OC là nhiệt độ thích hợp cho hoạt tính enzyme

Tap polymerase để kéo các dNTP lại đầu 3’ của đoạn mồi đang bắt cặp trên đầu 5’ của

sợi DNA đích, bắt nguồn cho sự tổng hợp nên mạch bổ sung (Phạm Hùng Vân, 2009)

1 Kỹ thuật lai bằng các đầu dò đặc hiệu

Kỹ thuật lai bằng đầu dò đặc hiệu (Alelle Specific Oligonucleotide dot blot) Bước 1: Đoạn DNA đích sẽ được khuếch đại bằng kỹ thuật PCR

Bước 2: Sản phẩm DNA được đem đi biến tính rồi nhỏ lên một màng nylon, trên màng nylon đã gắn sẵn 2 loại đầu dò là 2 đoạn DNA ngắn, một đoạn sẽ bắt cặp với đoạn DNA đột biến, một đoạn sẽ bắt cặp với đoạn DNA bình thường Các đầu dò này đã được đánh dấu trước bằng biotin hoặc horseradish ở đầu tận cùng 5’

Bước 3: Sau khi lai và rửa ở nhiệt độ thích hợp, các dấu hiệu sẽ được phát hiện Kiểu gen của mẫu DNA được chẩn đoán nhờ quan sát sự hiện diện hay không hiện diện của sản phẩm PCR trên các giếng gắn đầu dò bình thường hay đột biến

Ưu điểm của phương pháp này là có thể phát hiện nhiều đột biến cùng lúc Nhược điểm chi phát cao, phương pháp đồi hỏi kỹ thuật cao trong bước lai và rửa (John Old và ctv, 2005)

2 Kỹ thuật Reverse Dot – blot

Phương pháp này được Saiki và cộng sự đưa ra vào năm 1989 Kỹ thuật nhằm xác định các đột biến đã biết

Bước 1: Các cặp đoạn dò oligonucleotide đặc hiệu bình thường và đột biến được cố định trên màng nylon

Bước 2: Màng nylon được lai với các đoạn DNA là sản phẩm của phản ứng PCR mà mồi được đánh dấu ở đầu 5’ bằng biotin để sàng lọc các đột biến

Đây là phương pháp có độ nhậy cao, nhưng có thể có dương tính giả, đòi hỏi tỉ

mĩ nên cần kỹ thuật viên có nhiều kinh nghiệm (John Old và ctv, 2005)

3 Kỹ thuật dùng hệ thống khuếch đại có tính chất trơ (ARMS)

Kỹ thuật ARMS được Newton và cộng sự đưa ra vào năm 1989 Kỹ thuật dựa trên PCR cho phép phát hiện các đột biến điểm và các đột biến thêm đoạn hay mất đoạn nhỏ bằng cách khuếch đại các allele đặc hiệu Đây là phương pháp cho phép nhanh chóng phát hiện đột biến sau khi điện di trên thạch agarose hay thạch polyacrylamide và có thể phân biệt được các trường hợp đồng hợp tử và dị hợp tử

Đoạn nucleotide có sự bổ sung không tương hổ ở đầu 3’ sẽ ngăn chặn sự kéo dài của đoạn mồi trong phản ứng PCR

Mồi bình thường Mồi đột biến

DNA bình

thường

DNA đột biến

Hình 2.8 Nguyên lý hoạt động của kỹ thuật ARMS-PCR

Phương pháp ARMS – PCR thiết lập cùng lúc 2 phản ứng đối với một mẫu bệnh phẩm, một phản ứng với mồi đặc hiệu cho DNA bình thường và một phản ứng với mồi đặc hiệu cho DNA đột biến Sau phản ứng khuếch đại, nếu sản phẩm xuất hiện chỉ ở phản ứng với mồi bình thường chứng tỏ DNA bình thường, nếu sản phẩm chỉ xuất hiện ở phản ứng với mồi đột biến chứng tỏ mẫu mang đồng hợp tử về đột biến, còn nếu sản phẩm xuất hiện ở cả hai phản ứng thì mẫu ở dạng dị hợp tử một đột biến (Trần Nguyễn An Phú, 2007)

4 Kỹ thuật Gap-PCR

Được sử dụng để phát hiện những đột biến mất đoạn: đột biến -619 bp hay gặp

ở người Ấn Độ Đây là phương pháp PCR sử dụng 2 đoạn mồi bổ xung cho cả chuỗi bình thường và chuỗi đột biến ở vùng DNA gần chỗ đột biến mất đoạn Với những đột biến mất đoạn nhỏ hơn 1 kilobase, cặp mồi sẽ tạo ra 2 sản phẩm PCR khác nhau, sản phẩm nhỏ hơn là của allele đột biến Với những mất đoạn lớn, khoảng cách giữa 2 mồi

ở allele bình thường là quá xa để khuếch đại và chỉ có sản phẩm PCR của allele đột biến Trong trường hợp này, allele bình thường được phát hiện bằng cách khuếch đại đoạn DNA qua vùng mất đoạn, sử dụng 1 đoạn mồi bổ xung với trình tự đoạn bị mất

và mồi kia thì bổ xung vùng DNA gần chỗ đột biến (John Old và ctv, 2005)

5 Kỹ thuật dùng enzym cắt (Restriction Enzyme)

Bước 1: Kỹ thuật dùng enzyme cắt giới hạn đòi hỏi khuếch đại đoạn DNA đích bằng kỹ thuật PCR

Bước 2: Enzyme cắt giới hạn sẽ được thêm vào sản phẩm DNA được khuếch đại để cắt các sản phẩm này Những vị trí cắt trên DNA có thể thay đổi tùy theo sự

hiện diện hay không hiện diện của đột biến, kết quả dẫn đến việc tạo ra các đoạn có kích thước khác nhau

Bước 3: Dùng kỹ thuật điện di trên gel agarose hay gel polyacrylamide để phát hiện các đoạn khác nhau này Hơn 40 đột biến β thalassaemia có thể tạo ra hay làm mất đi vị trí cắt của enzyme, nhờ đó có thể phát hiện ra các đột biến này nhờ các enzyme cắt thích hợp

Ưu điểm của phương pháp này là thực hiện nhanh ít tốn kém, nhược điểm nếu cho lượng enzyme quá nhiều sẽ cắt nát đoạn DNA đích dẫn đến kết quả không chính xác (John Old và ctv, 2005)

6 Kỹ thuật điện di trên gel biến tính tuyến tính

Kỹ thuật điện di trên gel biến tính tuyến tính (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis - DDGE) được Myers và cộng sự mô tả lần đầu vào năm 1987 khi điện

di phân tử DNA mạch đôi trên gel polyacrylamide có chứa các chất biến tính như formamide và urea với nồng độ tăng dần Nguyên tắc của kỹ thuật này là sự phân tách của đoạn DNA dựa trên cách thức nóng chảy của phân tử Nhiệt độ mà đoạn DNA biến tính gọi là nhiệt độ nóng chảy phụ thuộc vào trình tự của chuỗi DNA Tại điểm phân tử DNA biến tính một phần thì sự di chuyển của nó trên gel rất chậm Nhờ đó mà

2 đoạn DNA mạch đôi khác nhau chỉ một nucleotide có thể được phân biệt do sự di chuyển khác nhau giữa các đoạn này trên gel Kỹ thuật này có thể cho phép khảo sát đoạn DNA từ 50 - 1000 bp với thời gian chạy điện di từ 7,5 - 10 giờ Sau khi nhuộm ethidium bromide và phát hiện bất thường thì tiến hành các phân tích tiếp theo bằng các kỹ thuật khác để xác định bản chất của đột biến Nhược điểm của phương pháp này là tốn kém, đòi hỏi máy móc chuyên dùng (John Old và ctv, 2005)

7 Kỹ thuật giải trình tự đoạn gen (Sequencing)

Giải trình tự gen (sequencing) nhằm xác định đột biến, bản chất đột biến sau khi đã sàng lọc bằng các kỹ thuật như SSCP, DDGE

Năm 1977 Maxam và Gilbert đã phát minh ra phương pháp hóa học giải trình

tự DNA, phương pháp giải trình tự của Maxam và Gilbert trên thực tế không phải dễ thực hiện vì nó phải xác định nhiều thông số tối ưu cho thí nghiệm Cùng năm Sanger

và cộng sự đã phát minh ra phương pháp enzyme giải trình tự DNA Hiện nay các phòng thí nghiệm trên thế giới giải trình tự bằng phương pháp enzyme giải trình tự,

nhưng khi làm giải trình tự thì dùng các máy tự động (Automated sequencer) mà không dùng kỹ thuật xạ ký như trước đây (Phạm Hùng Vân, 2009)

8 Minisequencing

Nguyên tắc của kỹ thuật này là dựa trên sự kéo dài đầu 3’ của mồi bởi một nucleotide được đánh dấu Mồi được thiết kế sao cho lai với DNA ngay kế vị trí nucleotide đột biến và chỉ kéo dài chuỗi bởi một ddNTP phù hợp với nucleotide tại điểm đột biến Vì thế nên hỗn hợp cho phản ứng không có dNTP và phản ứng chỉ xảy

ra tại một vị trí đơn Kết thúc quá trình này sẽ tạo ra đoạn DNA có đánh dấu huỳnh quang để phân tích ddNTP được quy định đánh dấu bởi các màu khác nhau: xanh lá/A, đen/C, xanh dương/G, đỏ/T

Với việc sử dụng điện di mao quản trong phương pháp multiplex minisequecing đánh dấu huỳnh quang cho phép tầm soát cùng lúc nhiều đột biến điểm ở các vị trí khác nhau Để tránh nhẫm lẫn các sản phẩm cuối cùng khi phân tích thì độ dài của mồi phải khác nhau từ 4-6 nucleotide Độ dài của mồi có thể được gắn thêm các đuôi polynucleotide không đồng nhất (non- homologous polynucleotides) vào đầu 5’: poly (dT), poly (dA), poly (dC), poly (dGACT)

Hình 2.9 Phương pháp minisequencing

(Nguồn: www.molehr.oxfordjournals.org)

dd G