PHÂN LẬP ĐỊNH DANH Chlorella vulgaris NUÔI SINH KHỐI LY TRÍCH DẦU

Chọn được dòng Chlorella vulgaris nuôi cấy ở điều kiện nuôi cấy chọn lọc được bố trí trong nghiên cứu của đề tài để có hàm lượng dầu cao là  15% trọng lượng khô.. Bước đầu tiến hành n

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

  

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP ĐỊNH DANH Chlorella vulgaris

NUÔI SINH KHỐI LY TRÍCH DẦU

Sinh viên thực hiện: NGUYỄN NGỌC LỢI

Niên khoá: 2005 – 2009

Tháng 09/2009

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

  

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP ĐỊNH DANH Chlorella vulgaris

NUÔI SINH KHỐI LY TRÍCH DẦU

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

TS TRƯƠNG VĨNH NGUYỄN NGỌC LỢI

Tháng 09/2009

LỜI CẢM ƠN

Xin chân thành cảm ơn:

Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trường

Các thầy cô trong Bộ môn Công nghệ sinh học cùng các thầy cô trực tiếp giảng dạy luôn tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt bốn năm qua

TS Trương Vĩnh đã dành nhiều thời gian và công sức để truyền đạt cho em những kiến thức quí báu, lắng nghe và động viên em, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành khóa luận này

KS Nguyễn Văn Lẫm phụ trách phòng thí nghiệm I5 Thầy đã nhiệt tình giúp đỡ tôi vượt qua giai đoạn đầu của quá trình thực hiện đề tài và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong suốt thời gian làm đề tài

Các thầy cô phụ trách phòng thí nghiệm I4, bộ môn Công Nghệ Hóa Học Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM đã tận tình giúp đỡ tôi và tạo mọi điều kiện trong suốt thời gian làm đề tài

Các anh chị ở Viện Công Nghệ Sinh Học - Môi Trường, Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm đề tài

Toàn thể các bạn cùng làm đề tài ở phòng thí nghiệm I5, I4 và trung tâm phân tích khu Cẩm Tú đã giúp đỡ và tạo niềm hứng khởi cho tôi khi làm đề tài

Toàn thể lớp CNSH K31 đã giúp đỡ, chia sẽ và động viên tôi trong suốt thời gian làm đề tài

Thành kính ghi ơn bố mẹ đã nuôi nấng, dạy bảo điều hay lẽ phải cho con cũng như đã động viên, hỗ trợ con về tinh thần, vật chất để con có thể hoàn thành tốt khóa luận này Ba mẹ là nguồn động viên là người tạo thêm sức mạnh để con vượt qua mọi khó khăn trở ngại trong cuộc sống

Tp Hồ Chí Minh, ngày 22 tháng 07 năm 2009

Nguyễn Ngọc Lợi

TÓM TẮT

Tảo đã được sử dụng trong nhiều ngành công nghiệp và các ứng dụng, và nhiều ứng dụng mới được phát hiện như biodiesel từ tảo Như một loạt các nghiên cứu gần đây cho phép các công ty sử dụng để sản xuất cả nhiên liệu và sản phẩm phi nhiên liệu từ từ các nguyên liệu từ cùng một loại tảo Tảo là những nguyên liệu duy nhất có khả năng thay thế hoàn toàn nhiên liệu cho ngành giao thông vận tải trên toàn thế giới Nhiên liệu từ tảo đại diện cho một thị trường mà giá trị hàng trăm

tỷ đô la Từ nhu cầu phát triển nguồn nhiên liệu sinh học thay thế cho dầu diesel, tôi tiến

hành thực hiện đề tài: “ Phân lập, định danh Chlorella vulgaris nuôi sinh khối ly

trích dầu ”

Đề tài được thực hiện qua 2 giai đoạn: Phân lập và định danh Chlorella

vulgaris từ giống tảo Chlorella sp được cung cấp từ Khoa Thủy Sản, Trường Đại

Học Cần Thơ ; Nuôi cấy Chlorella vulgaris và ly trích dầu trong tảo

Qua thực nghiệm, chúng tôi thu được một số kết quả sau:

Môi trường thích hợp nhất cho nuôi cấy để phân lập Chlorella vulgaris môi trường BG-11 có bổ sung 10 ppm NAA Định danh được 4 dòng Chlorella vulgaris

nuôi cấy trên môi trường BG-11 bao gồm: CV1, CV2, CV3 và CV4

Nuôi cấy 4 dòng Chlorella vulgaris và Chlorella sp.(đối chứng) trên môi

trường đạm thấp trong chai thủy tinh 500 ml Với kết quả thu được chúng tôi quyết định chọn CV2 vì dòng này phát triển tốt hơn so với các dòng khác cùng nuôi cấy

và cả với mẫu đối chứng Nuôi cấy 60 lít dòng CV2 trên môi trường nitơ cải tiến có

bổ sung 0,87 mM axít citric để thu sinh khối nhằm phân tích hàm lượng dầu tổng Kết quả hàm lượng dầu tổng thu được là 17,25 % khi ly trích sử dụng dung môi là n-hexan

SUMMARY

Algae are already being used in a wide variety of industries and applications, and many newer applications are being discovered such as biodiesel from algae Such a wide range of end-uses enable companies to produce both fuels and non-fuel products from the same algae feedstock Algae are the only feedstock that have the potential to completely replace world's consumption of transportation fuels Fuel from algae represents a market that is worth hundreds of billions of dollars The

thesis entiled: “Isolation and identification of Chlorella vulgaris for biomass culture

and lipid extraction from this algae ”

The topic consists of two stages: Isolation and identification of Chlorella

vulgaris from Chlorella sp supplied by Faculty of Fisheries, Can Tho Universit ; Chlorella vulgaris has been cultured and extracted lipids

 Results:

BG-11 medium containing 10 mg/L NAA is suitable for development of

Chlorella vulgaris Four types of Chlorella vulgaris were identified : CV1, CV2,

CV3 and CV4

Four types of Chlorella vulgaris and Chlorella sp.(control) are cultured in

modified low nitrogen medium using 500 ml beaker The CV2 was found to be the

best among others A 60 L of type CV2 has been cultured in modified low nitrogen

medium with addition of 0.87 mM citric acid during culture The total lipids of 17.25 % extracted from CV2 was obtained using n-hexan

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN iii

TÓM TẮT iv

SUMMARY v

MỤC LỤC vi

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii

DANH SÁCH CÁC BẢNG ix

DANH SÁCH CÁC HÌNH x

Chương1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.3 Nội dung nghiên cứu 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Tổng quan về Chlorella sp 3

2.1.1 Giới thiệu về Chlorella sp 3

2.1.2 Đặc điểm sinh lý 4

2.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy tảo Chlorella 4

2.1.3.1 Ảnh hưởng của ánh sáng 5

2.1.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ 5

2.1.3.3 Ảnh hưởng của pH môi trường 5

2.1.3.4 Ảnh hưởng của sự khuấy trộn môi trường 5

2.1.3.5 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng nuôi cấy 6

2.1.4 Các thành phần dinh dưỡng có trong tảo Chlorella 8

2.2 Tổng quan về biodiesel 10

2.3 Tổng quan về axít citric 11

2.4 Tổng quan về Chlorella vulgaris 14

2.5 Những cách phân lập tảo thông dụng 16

2.6 Mối quan hệ giữa các chất hóa học trong trao đổi năng lượng ở sinh vật 18

2.7 Những thành tựu nghiên cứu về Chlorella để phân tích hàm lượng dầu 20

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

3.1 Địa điểm và thời gian tiến hành đề tài 24

3.2 Vật liệu 24

3.2.1 Nguồn tảo giống 24

3.2.2 Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm 24

3.2.3 Hoá chất thí nghiệm 24

3.3 Phương pháp nghiên cứu 25

3.3.1 Phương pháp phân lập tảo Chlorella vulgaris 25

3.3.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm 26

3.3.2.1 Thí nghiệm 1: Nuôi sinh khối 4 dòng CV và đối chứng 26

3.3.2.2 Thí nghiệm 2: Chọn dòng CV2 nuôi tăng sinh khối 28

3.3.2.3 Thí nghiệm 3: Ly trích lấy dầu trong dung môi n-hexan 29

3.3.3 Phương pháp theo dõi chỉ tiêu chất lượng môi trường 30

3.3.4 Phương pháp xử lý số liệu 30

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

4.1 Phân lập và định danh tảo 31

4.2 Nuôi sinh khối tảo 37

4.2.1 Thí nghiệm 1: Nuôi sinh khối 4 dòng CV và đối chứng 37

4.2.2 Thí nghiệm 2 : Chọn dòng CV2 nuôi tăng sinh khối tảo .39

4.2.3 Thí nghiệm 3: Ly trích lấy dầu trong dung môi n-hexan 41

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 44

5.1 Kết luận 44

5.2 Đề nghị 44

Tài liệu tham khảo 45 Phụ lục

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ATP: Adenosin Tri Phosphate

CAUP: Culture Colllection of Algae of Charles University in Prague

CV: Chlorella vulgaris

Ch sp/NK: Chlorella sp nuôi trong môi trường nitơ thấp cải tiến không bổ sung

axít citric

CV2/NK: Chlorella vulgaris dòng 2 nuôi trong môi trường nitơ thấp cải tiến

không bổ sung axít citric

CV2/NC: Chlorella vulgaris dòng 2 nuôi trong môi trường nitơ thấp cải tiến có

bổ sung axít citric

NAA: Naphtalen acetic axít

Tb: Tế bào

TL Trọng lượng

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Những thành phần có trong 100g trọng lượng khô của Chlorella sp .9

Bảng 2.2 Một số loài tảo nuôi sinh khối để ứng dụng sản xuất biodiesel .20

Bảng 4.1 Mối tương quan giữa mật độ tế bào và kết quả đo OD (A) 10ml 32

Bảng 4.2 Mối tương quan giữa mật độ và kết quả đo OD (A) ở 0 giờ và 97 giờ 33

Bảng 4.3 Mối tương quan giữa mật độ và kết quả đo OD (A) 14 ngày 34

Bảng 4.4 Tỷ lệ Chlorella vulgaris trong CV1, CV2, CV3, CV4 36

Bảng 4.5 So sánh mật độ đỉnh, trọng lương khô thu được của 5 nghiệm thức 38

Bảng 4.6 Gia tăng mật độ (triệu tb/ml) trong 96 giờ (F2) 40

Bảng 4.7 Gia tăng mật độ (triệu tb/ml) trong 96 giờ (F3) 40

Bảng 4.8 Gia tăng mật độ (triệu tb/ml) trong 96 giờ ( F4) 40

Bảng 4.9 Gia tăng mật độ (triệu tb/ml) trong 96 giờ (F4’) 41

Bảng 4.10 Kết quả tính toán hàm lượng lipid (%) ở Chlorella .41

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Những hóa thạch Chlorella ở tiền Kỷ Cambri .3

Hình 2.2 Những tế bào Chlorella sp .4

Hình 2.3 Chu trình Kreb’s 12

Hình 2.4 Tế bào Chlorella vulgaris 13

Hình 2.5 Tổng hợp lipid từ nguyên liệu là acetyl-CoA trong ty thể 14

Hình 2.6 Sáu dòng tảo thuộc loài Chlorella vulgaris 15

Hình 2.7 Sơ đồ sản xuất dùng cho nuôi tảo theo từng mẻ (Lee và Tamaru, 1993) 16

Hình 2.8 Thiết bị chuyên dùng để phân lập các loại tảo 16

Hình 2.9 Phương pháp tạo khuẩn lạc đơn trên đĩa Petri 17

Hình 2.10 Phương pháp pha loãng mẫu 18

Hình 2.11 Ảnh hưởng của các nồng độ Fe3+ thêm vào ngày thứ 7 21

Hình 2.12 Hàm lượng dầu được tích lũy trong tảo (%) 22

Hình 2.13 Sự gia tăng mật độ tế bào khi nuôi trong môi trường đạm thấp 23

Hình 3.1 Hình dạng ngoài của buồng đếm hồng cầu 27

Hình 3.2 Kích thước các ô trong buồng đếm 27

Hình 4.1 Ống tảo thu được qua quá trình lọc với mật độ 8 triệu tb/ml 31

Hình 4.2 Đường chuẩn độ của mẫu tảo trong ống nghiệm 32

Hình 4.3 Phân lập tảo theo phương pháp pha loãng 32

Hình 4.4 Đường chuẩn độ của mẫu tảo trong chai thủy tinh 100ml ở 0 giờ 32

Hình 4.5 Bốn dòng CV phân lập được sau 14 ngày nuôi cấy chai 100 ml 33

Hình 4.6 Trước khi phân lập và định danh Chlorella vulgaris ở 100X ………… 34

Hình 4.7 Sau khi phân lập và định danh Chlorella vulgaris ở 100X 34

Hình 4.8 Các dòng Chlorella vulgaris phân lập được sau nuôi cấy 35

Hình 4.9 Bốn dòng CV phân lập được nuôi cấy trong chai thủy tinh 500 ml 36

Hình 4.10 Thí nghiệm bố trí nuôi cấy tảo trong chai thủy tinh 500 ml 36

Hình 4.11 Quá trình sinh trưởng của 5 nghiệm thức theo dõi trong 8 ngày 37

Hình 4.12 Kết quả ly trích dầu bằng n-hexan 41

sử dụng không phải để ăn, mà để làm nhiên liệu sinh học gây sức ép đối với nguồn cung cấp lương thực trên toàn thế giới Nhu cầu năng lượng ngày càng cao trong khi nguồn năng lượng hóa thạch ngày càng cạn kiệt Vì năng lượng sinh học là nguồn tạo năng lượng nhanh và hiệu quả trong qui trình xử lí công nghiệp Năng lượng sinh học từ tinh bột chuyển hóa thành ethanol chạy máy là rất tốt tuy nhiên vấn đề

là sử dụng và sản xuất là vô cùng lớn Tại Hoa Kỳ để thay thế 10% xăng thì phải sử dụng 150 triệu tấn tinh bột bắp với số lượng tinh bột này đủ cung cấp lương thực cho 650 triệu dân trong 1 năm Việc dùng nhiên liệu sinh học thay thế một phần xăng dầu do Mỹ và châu Âu xúc tiến đã khiến giá nông sản tăng đáng kể trong năm ngoái Riêng trong năm 2007, 1/4 lượng ngô sản xuất tại Mỹ được dùng làm nhiên liệu Được biết, lượng gạo dự trữ của toàn thế giới năm 2007 - 2008 thấp hơn năm

1983 - 1984 và chỉ bằng 50% năm 2000 - 2001

Ý tưởng sản xuất biodisel từ vi tảo có từ lâu (Chisti Y, 1980) Việc sản xuất biodiesel từ tảo không cạnh tranh với đất trồng cho thực phẩm và góp phần giảm thiểu khí nhà kính làm sạch môi trường Đặc biệt, tảo có sự phát triển nhanh, vòng đời ngắn và có thể tồn tại ở bất cứ nơi nào có đủ ánh sáng, kể cả vùng hoang hoá, nước mặn, nước thải, lại có khả năng làm sạch môi trường nước thải Để nuôi tảo, chỉ cần ánh sáng, CO2, nước và dinh dưỡng có thể là phân hoá học hoặc phân chuồng Tảo giống thường nuôi trong phòng thí nghiệm, về sau có thể chuyển qua

bể hoặc ao So sánh với cây cọ dầu tuy là loại cây cho năng suất dầu cao, khoảng 5 tấn dầu/ha/năm nhưng loại cây này chiếm khá nhiều diện tích đất nông nghiệp Nếu tảo có chứa hàm lượng dầu khoảng 30% thì cho tới 45 tấn/ha/năm, cao gấp 9 lần so

với cọ dầu Và trên thế giới có nhiều loại tảo có hàm lượng dầu tới 70% và cho 120 tấn/ha/năm Tuy nhiên, nếu hàm lượng dầu trong tảo đạt khoảng 57% thì giá thành sản xuất dầu biodiesel sẽ bằng giá dầu diesel 11.500 VND/lít

Chlorella là một ngành tảo vi mô xanh lục tế bào đơn cực nhỏ (2 - 10 µm)

tồn tại trên Trái đất khoảng 2,5 tỉ năm Ngành vi tảo này có những 2 đặc tính khác thường trong nó: thành tế bào duy nhất và khả năng sinh sản khác thường tới mức ngạc nhiên

Từ nhu cầu thực tế phát triển nguồn năng lượng thay thế đồng thời đảm bảo

an ninh lương thực Chúng tôi thực hiện nghiên cứu đề tài: "Phân lập, định danh

Chlorella vulgaris nuôi sinh khối ly trích dầu "

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Tiến hành phân lập dòng tảo Chlorella vulgaris và các yếu tố giúp cho tảo

tổng hợp được nhiều dầu Từ đó làm cơ sở để tối ưu hóa quá trình nhân sinh khối

tảo Chlorella vulgaris ở quy mô lớn để sản xuất biodiesel Chọn được dòng

Chlorella vulgaris nuôi cấy ở điều kiện nuôi cấy chọn lọc được bố trí trong nghiên

cứu của đề tài để có hàm lượng dầu cao là  15% trọng lượng khô

1.3 Nội dung nghiên cứu

Phân lập và tách đơn bào tử dòng tảo Chlorella vulgaris trong môi trường

BG-11

Nuôi cấy các dòng tảo Chlorella vulgaris trong môi trường nitơ thấp cải tiến

và định lượng dầutổng bằng soxhlet

Bước đầu tiến hành nuôi cấy dòng tảo Chlorella vulgaris có bổ xung thêm

acid citric vào trong môi trường nitơ thấp cải tiến để cải thiện khả năng tổng hợp và tích lũy lipid của tảo lên 15% trọng lượng khô

Nuôi cấy tảo ở thể tích 5 - 6 lít để đánh giá khả năng phát triển của tảo và cải thiện điều kiện nuôi cấy nhằm có mật độ tảo cao

Chương 2:

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về Chlorella sp

2.1.1 Giới thiệu về Chlorella sp

Chlorella thuộc ngành tảo lục (Chlorophyta) Chlorella là một ngành tảo vi

mô xanh lục tế bào đơn cực nhỏ (từ 2 đến 10 µm) tồn tại trên trái đất khoảng 2,5 tỉ năm Ngành tảo vi mô này có những 2 đặc tính khác thường trong nó: thành tế bào duy nhất và khả năng sinh sản khác thường tới mức ngạc nhiên của nó

Hình 2.1 Những hóa thạch Chlorella ở tiền Kỷ Cambri

(http://www.naturalways.com/chlorella.html)

Đầu những năm 1900, người ta biết rằng cơ thể Chlorella bao gồm 60%

protein và sinh sản rất nhanh, các nhà khoa học ở các quốc gia khác nhau, đặc biệt

là ở Đức bắt đầu nghiên cứu ý tưởng làm thực phẩm từ Chlorella

Mặc dù việc nghiên cứu bị gián đoạn bởi chiến tranh thế giới thứ II ở châu Âu,

niềm đam mê trong việc nghiên cứu Chlorella vẫn được tiếp tục Năm 1948, một

nhà nghiên cứu tại viện nghiên cứu Stanford đã thành công trong việc phát triển

Chlorella Tuy nhiên, việc nghiên cứu bị dừng lại vì vấn đề tài chính Vào năm

1950, viện Carnegie đảm nhận việc nghiên cứu và họ kết luận rằng Chlorella có thể

phát triển cho việc thương mại và sẽ là một giải pháp để cải thiện nạn đói trên thế

giới Lợi ích ban đầu của Chlorella là làm nguồn thực phẩm

Hình 2.2 Những tế bào Chlorella sp

(http://www.naturalways.com/chlorella.html)

2.1.2 Đặc điểm sinh lý

Chlorella là hình thức tế bào đầu tiên của sự sống có nhân thật Phát triển

trong điều kiện có nhiều ánh sáng và chất dinh dưỡng, Chlorella tái sản xuất bằng

cách phân chia tế bào với tốc độ 4 tế bào trong mỗi 17 - 24 giờ Tảo thường chứa chất diệp lục và tảo lục là cơ thể sống màu xanh đơn giản nhất

Giống như chất diệp lục khác được chứa trong thực vật, tảo biến đổi những những chất vô cơ thành những chất hữu cơ bằng cách sử dụng năng lượng ánh sáng và quang hợp Chúng tạo nên mắt xích đầu tiên trong chuỗi thức ăn của trái đất Thành tế bào làm nhiệm vụ nhốt và bảo vệ tế bào bên trong, làm cho

Chlorella có thể chống chịu được những thay đổi môi trường, cũng như sự tấn

công của các vi sinh vật khác

2.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy tảo Chlorella

2.1.3 1 Ảnh hưởng của ánh sáng

Đối với Chlorella, ánh sáng có ý nghĩa rất lớn Cường độ ánh sáng càng cao,

khả năng phát triển của tảo càng mạnh Shigetoh miyachi (1983) cho rằng cường độ

ánh sáng thích hợp cho sự phát triển của tảo Chlorella nằm trong khoảng 500 –

10000 lux (Trích dẫn bởi Nguyễn Đức Lượng, 2006) Robert (1971) cho rằng có thể

là ánh sáng tự nhiên hoặc ánh sáng của đèn huỳnh quang, chu kỳ chiếu sáng tối thiểu là 18 giờ/ngày, tối đa là 24 giờ/ngày tùy vào thể tích Tuy nhiên không phải tất

cả các phiêu sinh vật đều chịu được ánh sáng liên tục nhưng phần lớn các giống tảo làm thức ăn đều chịu được ánh sáng liên tục (Trích dẫn bởi Đậu Thị Như Quỳnh, 2001) Điều này hạn chế một phần phiêu diêu sinh vật hiện diện trong quá trình nuôi cấy tảo và làm tăng khả năng đề kháng cho tảo

2.1.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Mỗi loài tảo thích hợp với nhiệt độ tối ưu và biên độ nhiệt khác nhau tùy theo loài (Trịnh Trường Giang, 1997) Nhiệt độ đóng vai trò quan trọng trong phát triển và sinh sản của tảo Chính vì vậy, việc chọn các chủng loại tảo có khả năng chịu nhiệt thì ý nghĩa lớn đến năng suất tảo Mặt khác, nhiệt độ thấp cũng ảnh

hưởng xấu đến sinh trưởng của tảo Tảo Chlorella phát triển tốt ở khoảng nhiệt độ

25 – 35oC Tuy nhiên, khoảng nhiệt độ tối ưu cho tảo Chlorella phát triển còn phụ

thuộc rất nhiều ở cường độ chiếu sáng, khoảng thời gian chiếu sáng và thành phần dinh dưỡng có trong môi trường nuôi cấy (Nguyễn Đức Lượng, 2006)

2.1.3.3 Ảnh hưởng của pH môi trường

Một thông số quan trọng của môi trường là pH vì pH xác định độ hòa tan của

CO2 và muối khoáng ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất ở tảo Thông số này lại phụ thuộc vào thành phần khả năng đệm của môi trường, nhiệt độ có vai trò trong

hoạt hóa khả năng trao đổi chất của tế bào tảo Tảo Chlorella phát triển tốt ở pH

axít yếu đến pH trung tính (pH = 5,5 – 7) Tuy nhiên loại này cũng có khoảng thích nghi ở vùng pH = 3 – 8,5 (Nguyễn Đức Lượng, 2006)

2.1.3 4 Ảnh hưởng của sự khuấy trộn môi trường

Khuấy trộn môi trường trong nuôi cấy tảo là điều kiện bắt buộc Mục đích của khuấy đảo: Tăng khả năng tiếp xúc của tế bào tảo với chất dinh dưỡng, làm tăng quá trình trao đổi chất, tăng khả năng thoát chất khí trong quá trình hô hấp của tảo, hạn chế vi sinh vật yếm khí có trong môi trường, đảm bảo chu kỳ sáng tối cho tảo trong quá trình quang hợp (Nguyễn Đức Lượng, 2006)

Như vậy, kỹ thuật khuấy sục là vấn đề rất cần được quan tâm nhằm mục tiêu tăng năng suất tảo mà không làm ảnh hưởng tới trạng thái tế bào Về mặt kinh tế, chọn giải pháp khuấy sục sao cho chi phí thấp nhất là yêu cầu đầu tiên (Đặng Đình Kim và Đặng Hoàng Phước Hiền, 1999)

Trong quá trình nuôi tảo, người ta lắp những thiết bị khuấy hoặc sục khí có công suất nhỏ mà ít sử dụng loại công suất lớn (Nguyễn Đức Lượng, 2006) Vì không phải tất cả các loài tảo đều có thể chịu đựng được với chế độ sục khuấy mạnh (Đặng Đình Kim và Đặng Hoàng Phước Hiền, 1999)

2.1.3.5 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng nuôi cấy

Các dưỡng chất : trong môi trường nước Chlorella cần đủ nguồn dinh dưỡng

carbon, nitơ, các chất khoáng đa lượng và vi lượng Ngoài ra chúng còn cảm ứng với một số chất như là chất ức chế hoặc chất kích thích sinh trưởng

Khảo cứu môi trường tự nhiên của Chlorella sinh sống, đến pha chế các môi

trường nhân tạo, hoặc nửa nhân tạo bằng bổ sung các chất vào nguồn tài nguyên thiên nhiên : nước biển, nước suối khoáng, nước khoáng ngầm, giếng khoan,…

Dinh dưỡng carbon : Tảo Chlorella đồng hoá carbon chủ yếu ở dạng vô cơ,

tốt nhất là carbonat (CO32-), thông qua quá trình quang hợp Shigetoh miyachi (1983) cho rằng carbon dạng khí CO2 cũng có thể được sử dụng nhưng phải đảm

bảo cho môi trường ở vùng pH axít thích hợp Nguồn carbon để nuôi Chlorella ở

khoảng 2 - 8 g NaHCO3/lít (Trích dẫn bởi Nguyễn Đức Lượng, 2006)

Dinh dưỡng nitơ : Theo Lê Đình Lăng (1999) tảo Chlorella và nhiều vi sinh

vật cố định nitơ, đồng hoá nitơ theo phản ứng khử nhờ enzyme nitrogenase xúc tác khi có ATP Kết quả nitơ được tổng hợp thành protein của chúng Khả năng cố định

đạm của Chlorella rất cao, cho hàm lượng nitơ  10% trọng lượng khô, hay thường

trên 50% protein Nhưng Chlorella không có khả năng sử dụng nitơ dạng khí N2 mà

sử dụng dưới dạng nitrat (NO3-) Ngoài ra có thể dùng nguồn nitơ khác : nitơ amon : (NH4)2SO4 (Amonisulphat - AS), (NH4)2HPO4 (Diamoniphotphat - DAP) là các loại phân bón hay dùng trong nông nghiệp, hoặc urê (NH2)2CO Vậy nguồn thức ăn cho

Chlorella có thể chuyển đổi theo cách :

Urê (NH2CONH2) Amoniac (NH3) Amonium (NH4+) Nitrat (NO3-)

Phốt pho vô cơ dưới dạng muối natri, kaliphotphat hoà tan 90 – 180 mg/lít Phốt pho tham gia hợp chất cao năng ATP, axít nucleotit, hợp chất của màng tế

bào Nếu môi trường nuôi cấy thiếu phốt pho, Chlorella biến đổi màu rất nhanh, các

quá trình trao đổi chất giảm mạnh (Nguyễn Đức Lượng, 2006)



Kali K+ và Na+ : dưới dạng muối cloride hoặc vài dạng kết hợp với nguồn

nitơ, phốt pho Tảo Chlorella rất ưa muối, trong môi trường ưu trương nhất chứa

kali tới 5 g/lít và natri tới 25 g/lít Trong thực nghiệm một số ý kiến cho rằng tỷ lệ

K+/Na+ nên nhỏ hơn 5, lớn hơn tảo sẽ chậm phát triển, hoặc xấu hơn nữa gây rối loạn tế bào, phá vỡ cất trúc tế bào tảo (Lê Đình Lăng, 1999)

Magie (Mg+2) : đóng vai trò tương tự như phốt pho, trong tổng hợp các hạt polyphotphate Magie rất quan trọng đối với tảo vì nó là nhân của clorophin ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình quang hợp của tảo (Lê Đình Lăng, 1999)

Sắt: là những dưỡng chất thiết yếu, ảnh hưởng trực tiếp tới sinh trưởng và hàm lượng của protein Sắt thường dùng ở dạng muối FeSO4 (0,01 g/lít) Có thể dùng sắt dạng phức EDTA (Etylen Diamin Tetra Acetic Axít), phức này hoà tan bền hơn trong kiềm so với dạng vô cơ Nồng độ Fe3+ trong môi trường rất rộng từ 0,56 –

56 mg/lít môi trường Nồng độ Fe3+ trong môi trường để thu được lượng dầu cao

khoảng 56,6% trọng lượng khô đối với Chlorella vulgaris là trong khoảng 1 - 1,32

mg/lít (Zhi-Yaun Liu và ctv, 2007)

Các khoáng vi lượng khác : Bo (B3+), kẽm (Zn2+), Mangan (Mn2+), đồng (Cu2+), Coban (Co2+) là các vi lượng được dùng, nhưng ảnh hưởng không rõ đến sinh khối protein, nhưng lại có ảnh hưởng tới một số thành phần khác như vitamin: thiamin – B1, riboflavin – B2, pyridoxine – B6, cyanocobalamin – B12, biotin, pyridoxine… (Thinh và ctv, 1999)

Chlorella có thể bị tác động bởi các kích thích tố (hormon), giúp tảo tăng

trưởng nhanh hơn như indol axetic axít (AIA), gibberelic axít (GA3), naphtalen

acetic axít (NAA) Một số công trình nghiên cứu chứng tỏ Chlorella có sản sinh các

hormon tăng trưởng hoạt tính kiểu AIA, GA3 và NAA Các hormon nội sinh này kích thích nâng cao sinh khối và tăng tốc sinh sản của tảo (Lê Đình Lăng, 1999)

2.1.4 Các thành phần dinh dưỡng có trong tảo Chlorella

Chlorella chứa hơn 19 loại amino axít, bao gồm tất cả những loại thiết yếu

Thành phần chính: protein, carbohydrate, lipid và rất giàu vitamin B12 Nó cung

cấp gấp 50 lần chất diệp lục trong cỏ linh lăng, 2 lần protein so với đậu nành và nhiều B12 so với gan bò, Vitamin A gấp 5,8 lần cà rốt, B1 gấp 1,3 lần men vô

cơ, B2 gấp 35 lần sữa, sắt gấp 13 lần gan lợn và 45 lần nho, chất xơ gấp 1,5 lần khoai lang, canxi gấp 1,6 lần sữa

Giá trị dinh dưỡng của tảo có thể thay đổi rất lớn ở các pha phát triển và dưới các điều kiện nuôi khác nhau (Enright và ctv, 1986; Brown và ctv, 1997) Kết quả nghiên cứu của Thinh và ctv (1999) chỉ ra rằng tảo phát triển đến cuối pha logarit thường chứa 30 - 40% protein, 10 - 20% lipid và 5 - 15% carbohydrate Khi tảo được nuôi qua pha cân bằng thì hàm lượng này bị thay đổi rất lớn, ví dụ như: khi nitrat giảm thì hàm lượng carbohydrate có thể tăng gấp 2 lần hàm lượng protein

Mối liên quan giữa giá trị dinh dưỡng của tảo với hàm lượng lipid tổng, carbohydrat, và protein không được thể hiện rõ Tuy nhiên, lipid rất quan trọng trong việc dự trữ năng lượng cho ấu trùng khi sống trong điều kiện thiếu thức ăn, tảo có hàm lượng carbonhydrat cao cho sự phát triển tốt nhất của hàu giống và ấu trùng điệp (Whyte và ctv 1989)

Các axít béo không no (PUFA) có trong tảo, ví dụ như: docosahexaenoic axít (DHA), eicosapentaenoic axít (EPA), arachidonic axít (AA) rất cần thiết đối với động vật nuôi thủy sản (Brown và ctv, 1997) Hầu hết các loài tảo đều chứa loại axít béo không no EPA ở mức độ từ trung bình tới cao (7 – 34 %)

Vi tảo được coi là có giá trị dinh dưỡng tốt cho các đối tượng nuôi nếu hàm lượng PUFA (DHA, EPA) dao động từ 1 – 20 mg/ml tế bào (Thinh và ctv, 1999) Ngoài ra, các khoáng chất và sắc tố trong tảo cũng đóng góp một vai trò quan trọng trong việc xây dựng nên giá trị dinh dưỡng của một loài tảo (Fabregas và Herrero, 1986) Thành phần chủ yếu của sắc tố là chlorophyll và các loại carotenoid chiếm 0,5 - 5 % trọng lượng khô Ngoài ra còn có phycoerythin và phycocyanin nhưng chỉ chiếm một lượng nhỏ khoảng 1% khối lượng khô ß-carotene (tiền vitamin A) được xem là rất quan trọng trong chuỗi thức ăn của giáp xác

Nghiên cứu của Ronnestad, Helland và Lie (1998) đã phát hiện ra rằng sắc tố lutein và astaxanthin (có nhiều trong tảo xanh) có khả năng chuyển đổi thành vitamin A trong chuỗi mắt xích thức ăn của động vật nuôi thủy sản Vi tảo là nguồn cung cấp vitamin quan trọng cho các đối tượng nuôi thuỷ sản Theo Brown (2002), hàm lượng acid ascorbic (vitamin C) trong vi tảo 51 mg/g trọng lượng khô ở tảo

Chorella sp Còn lại các vitamin khác (B1, B2, B6, B12, biotin, pyridoxine…) là

cao hơn so với các giống tảo khác

Bảng 2.1 Những thành phần có trong 100 g trọng lượng khô của Chlorella sp

(http://www.aquasonic.com.au)

2.2 Tổng quan về biodiesel

Biodiesel là tên gọi cho một loạt các ester dựa vào nhiên liệu từ axít béo thường được định nghĩa như monoalkyl ester dầu từ rau quả, chẳng hạn như dầu đậu nành, cải dầu hoặc cây gai dầu, hoặc đôi khi từ mỡ động vật thông qua một quá trình chuyển hóa đơn giản Đây là nguồn nhiên liệu tái tạo và có hiệu quả như xăng, dầu diesel trong động cơ diesel

Loại nhiên liệu này có nhiều ưu điểm nổi bật so với các loại nhiên liệu truyền thống (dầu khí, than đá )

Tính chất thân thiện với môi trường: chúng sinh ra ít hàm lượng khí gây hiệu ứng nhà kính (một hiệu ứng vật lý khiến Trái Đất nóng lên) và ít gây ô nhiễm môi trường hơn các loại nhiên liệu truyền thống

Nguồn nhiên liệu tái sinh: các nhiên liệu này lấy từ hoạt động sản xuất nông nghiệp và có thể tái sinh Chúng giúp giảm sự lệ thuộc vào nguồn tài nguyên nhiên liệu không tái sinh truyền thống

Để sản xuất diesel sinh học người ta pha khoảng 10% mêtanol vào dầu thực vật và dùng nhiều chất xúc tác khác nhau (đặc biệt là KOH, NaOH) Ở áp suất thông thường và nhiệt độ vào khoảng 60°C liên kết este của glyxêrin trong dầu thực vật bị phá hủy và các axít béo sẽ được este hóa với methanol Chất glyxêrin hình thành phải được tách ra khỏi dầu diesel sinh học Siêu âm làm tăng tốc độ phản ứng hóa học và hiệu suất của quá trình chuyển hóa dầu thực vật và mỡ động vật thành biodiesel Siêu âm có thể đạt được sản lượng biodiesel hơn 99% Siêu âm làm giảm thời gian tiến hành và thời gian phân tách

Điều này cho phép chuyển quy trình sản xuất từng bước theo mẻ phản ứng sang quá trình “dòng chảy liên tục”, và nó làm giảm đầu tư và chi phí thực hiện Sản xuất biodiesel từ dầu thực vật hay mỡ động vật, bao hàm cả việc chuyển hóa axít béo, dựa vào chất xúc tác phản ứng với methanol hay ethanol để có được este methyl hay este ethyl Thông qua việc chuyển đổi este này dầu diesel sinh học có độ nhớt ít hơn dầu thực vật rất nhiều và có thể được dùng làm nhiên liệu thay thế cho dầu diesel mà không cần phải cải biến động cơ để phù hợp

(http://en.wikipedia.org/wiki/Biodiesel)

2.3 Tổng quan về axít citric

Axít citric là một axít hữu cơ thuộc loại yếu và nó thường được tìm thấy trong các loại trái cây thuộc họ cam quít Nó là chất bảo quản thực phẩm tự nhiên

và thường được thêm vào thức ăn và đồ uống để làm vị chua Ở lĩnh vực hóa sinh thì axít citric đóng một vai trò trung gian vô cùng quan trọng trong chu trình axít citric của quá trình trao đổi chất xảy ra trong tất cả các vật thể sống

Ngoài ra axít citric còn đóng vai trò như là một chất tẩy rửa, an toàn đối với môi trường và đồng thời là tác nhân chống oxy hóa Axít citric có mặt trong nhiều loại trái cây và rau quả nhưng trong trái chanh thì hàm lượng của nó được tìm thấy nhiều nhất, theo ước tính axít citric chiếm khoảng 8% khối lượng khô của trái

Với vai trò là một chất phụ gia thực phẩm, axít citric được dùng làm gia vị, chất bảo quản thực phẩm và đồ uống, đặc biệt là nước giải khát, nó mang mã số E330 Muối citrat của nhiều kim loại được dùng để vận chuyển các khoáng chất trong các thành phần của chất ăn kiêng vào cơ thể Tính chất đệm của các phức citrat được dùng để hiệu chỉnh độ pH của chất tẩy rửa và dược phẩm

Axít citric được dùng trong công nghệ sinh học và công nghiệp dược phẩm

để làm sạch ống dẫn thay vì phải dùng axít nitric Axít citric cũng được cho vào thành phần của kem để giữ các giọt chất béo tách biệt Ngoài ra nó cũng được thêm vào nước ép chanh tươi.( Thái Phú Khánh Hòa Axít Citric 2006

http//:www.hoahocvietnam.com/Home/Moi-tuan-mot-hoa-chat/Axit-Citric.html)

Chu trình Kreb’s ( chu trình axít citric) là quá trình nhằm oxi hóa acetyl-CoA thành CO2, H2O, và giải phóng triệt để năng lượng Là con đường cuối cùng chung cho sự oxi hóa glucid, lipid, protein bởi vì glucose, axít béo, amino axít thoái biến

ra acetyl-CoA Glucose được biến đổi theo tiến trình đường phân EM Mayehoff), sản phẩm không dừng lại ở pyruvate mà bị carboxylase tạo acetyl-CoA

(Embden-để đi vào chu trình Kreb’s Axít béo qua quá trình  oxi hóa trong ti thể sẽ được phân cắt thành các đơn vị 2C là acetyl-CoA Amino axít qua quá trình khử nhóm amin sẽ tạo thành các keto axít và sẽ được đưa vào chu trình Kreb’s (Nguyễn Phước Nhuận và ctv, 2003)

Các enzyme của chu trình Kreb’s định vị trong phần khuôn ty lạp thể và các đương lượng khử giải phóng được chuyển vào chuỗi hô hấp nhờ các hạt đính ở phần màng trong ty thể Năng lượng giải phóng qua môt vòng chu trình Kreb’s có

ba phân tử NADPH+H+ và một phân tử FADH2 được thành lập do sự thoái biến của một phân tử aceyl-CoA, có tất cả mười hai phân tử ATP được tạo ra qua một vòng chu trình Kreb’s

Axít citric đóng có vai trò trong sự tổng hợp lipid bên trong ty thể của tế bào Lipid được tạo thành trước hết là tổng hợp axít béo Tổng hợp axít béo no bắt đầu từ acetyl-CoA và diễn ra carboxyl hóa bằng ATP để chuyển hóa thành malonyl-CoA Malonyl-CoA tiếp tục phản ứng với acetyl-CoA để tạo thành axít béo có mạch carbon dài thêm 2C Quá trình này cần có NADPH tham gia và thải ra CO2 Carboxyl hóa acetyl- CoA là bước tốc độ xác định của tổng hợp axít béo Thay đổi bước này dẫn đến làm thay đổi tốc độ tổng hợp axít béo Axít citric và isocitric có tác dụng hoạt hóa acetyl-CoA-carboxylase (Nguyễn Quốc Khang, 2002)

Nghiên cứu ghép gen cho nhiều dầu cũng cho kết quả khả quan Enzyme Acetyl-CoA carboxylase (ACC) chi phối số lượng lipids tích trữ trong cơ thể vi-tảo,

và gen chi phối ACC đã được đánh dấu và ghép vào bộ máy di truyền của tảo Chìa

khóa cho công nghệ sản xuất dầu từ tảo nhằm tăng nhanh sản lượng biodiesel và hạ

thấp giá thành sản phẩm đủ sức cạnh tranh với nhiên liệu dầu mỏ là nâng cao hàm lượng chất béo từ 15 - 30% trong điều kiện tự nhiên lên 75 - 85% trọng lượng khô của tảo thông qua hoạt động của enzyme chuyển hóa acetyl - CoA carboxylase

Hình 2.3 Chu trình Kreb’s

(http://www.uic.edu/classes/bios/bios100/summer2003/krebsfull.html)

Khi tổng hợp axit béo ngoài ty thể đòi hỏi ATP và khung carbon Khung carbon có thể do acetyl-CoA hay citrat cung cấp Do tính chất bán thấm của màng

mà liên kết thioester của acetyl-CoA không thể thấm trực tiếp qua màng mà phải chuyển hóa thành acetylcarnitin giàu năng lượng Phản ứng này được sự xúc tác của enzyme chuyển nhóm acetylcarnitin là acetylcarnitintranferase và có thể không tiêu hao năng lượng Trong tế bào chất acetyl-CoA không thể lọt qua màng ty thể để vào bên trong ty thể vì thế trong tế bào tự có cơ chế trao đổi qua lại giữa vài hệ thống vận chuyển với nhau Tính chất màng ty thể không cho acetyl-CoA thấm qua, nhưng lại cho acetyl-carnitin thấm qua Cho nên phải có biến đổi qua lại giữa hai dạng acetyl này với nhau nhờ acetycarnitintransferase Nhờ cơ chế biến đổi này mà các axít béo chuỗi dài cũng có thể đi vào được ty thể Carnitin có vai trò quan trọng đối với sự xuất hiện của axít béo trong ty thể (Nguyễn Quốc Khang, 2002)

Acetyl-CoA là nguyên liệu chính cho chu trình Kreb’s tạo ra năng lượng cho

sự sống, phát triển, và phân chia của tế bào (Nguyễn Phước Nhuận và ctv, 2003) Các nhân tố làm giảm hoạt động của citratsynthetase xúc tác cho acetyl-CoA-carboxylase : các axít béo có mạch carbon dài được tổng hợp nhiều, thiếu axít citric Điều này gây ứ đọng acetyl-CoA Tế bào sử dụng acetyl-CoA ứ đọng để tổng hợp acetoacetic và tác động đến axít béo để phân giải tạo ATP cho tế bào sử dụng, ức chế tổng hợp axít citric trong ty thể dẫn đến thiếu axít citric và ức chế luôn quá trình chuyển hóa acetyl-carnitin thành acetyl-CoA (Nguyễn Quốc Khang, 2002)

Hình 2.4: Tổng hợp lipid từ nguyên liệu là acetyl-CoA trong ty thể

(http://www.uic.edu/classes/bios/bios100/summer2003/acetylcoal.html)

2.4 Tổng quan về Chlorella vulgaris

Loài: Chlorella vulgaris

Chlorella vulgaris Beijerinck (1890), tế bào hình cầu, thể màu hình chén

chiếm gần 2/3 thể tích tế bào, chứa một hạt tạo tinh bột lớn dễ nhìn thấy, có một nhân màu sáng Kích thước 2-10µm (Dương Đức Tiến và Võ Hành, 1997)

Chúng hiện diện khắp nơi trên bề mặt trái đất như: sông suối, ao hồ, và ở

biển Chlorella vulgaris là dòng tảo có khả năng thích nghi cao trong tự nhiên và có

sức chống chịu điều kiện bất lợi tốt Phạm Hữu Giục (1991) cho rằng nếu trong môi trường nuôi cấy hoàn toàn không có nguồn nitơ, tế bào không chết mà tồn tại ở

trạng thái tiềm sinh Chlorella sẽ nhanh chóng phục hồi lại trạng thái sinh lý bình

thường khi bổ sung nitơ vào môi trường (Trích dẫn bởi Nguyễn Đức Lượng, 2006)

Hình 2.5 Tế bào Chlorella vulgaris

(http://botany.natur.cuni.cz/algo/determin.html)

Chlorella vulgaris var f viridis Chlorella vulgaris var vulgaris f vulgaris

Hình 2.6 Sáu dòng tảo thuộc loài Chlorella vulgaris

(http//:www.botany.natur.cuni.cz/algo/CAUP/H1955Chlorella vulgaris.html)

Hình 2.7 Sơ đồ sản xuất dùng cho nuôi tảo theo từng mẻ Lee và Tamaru (1993)

2.5 Những cách phân lập tảo thông dụng

Theo Đặng Đình Kim và Đặng Hoàng Phước Hiền (1999), có một số kỹ thuật phân lập tảo như : dùng micropipette thu một tế bào tảo hay một sợi tảo khi soi qua kính hiển vi; phun tảo lên bề mặt thạch nghiêng hay hòa dòng tảo với thạch mỏng rồi trải lên bề mặt thạch cứng dùng ánh sáng là dòng điện hay chất kích thích

để tăng sự phát triển của tảo Tuy nhiên, kỹ thuật này đòi hỏi thiết bị chuyên dụng

và tay nghề kỹ thuật cao

Hình 2.8 Thiết bị chuyên dùng để phân lập các loại tảo

(http//:www.marine.csiro.au/microalgae/methods/isolation techniques.html)

Cấy trên đĩa Petri, dàn lớp mỏng để tách riêng từng tế bào Sau đó, tuyển chọn một vùng đem soi kính hiển vi và tìm xác xuất loại tảo mà ta cần tìm Cách này cần môi trường đặc biệt và thời gian ủ lâu từ 10 - 15 ngày (vì thời gian nhân đôi của tảo từ 17 - 24 giờ/1 lần 4 tế bào)

Đĩa Petri được đánh dấu bằng các đường tròn ở mặt sau có đường kính 0.5

cm, trung bình từ 50 - 100 đường tròn/1 đĩa, mỗi 1 μl dung dịch chứa 10 tế bào nhỏ vào một đường tròn Sau khi ủ 2 - 4 ngày thì số lượng tế bào trong mỗi đường tròn được đếm Từng tế bào trong mỗi đường tròn khi phát triển được cấy truyền sang môi trường mới và sẽ thu được dòng thuần Phương pháp này đòi hỏi cần nhiều thời gian thực hiện

Hình 2.9 Phương pháp tạo khuẩn lạc đơn trên đĩa Petri

(http//:www.marine.csiro.au/microalgae/methods/isolation techniques.html)

Vũ Thị Tám (1989) đã phân lập tảo bằng phương pháp dùng micropippette phân lập tảo và cấy trên thạch Tuy nhiên, hai phương pháp trên đòi hỏi kỹ thuật cao hơn so với pha loãng và khi các mẫu này chuyển sang môi trường lỏng, các tế bào tảo cần nhiều thời gian hơn để thích nghi (15 ngày/chu kỳ) Theo lí thuyết kiểu phân lập pha loãng, mẫu tảo được pha loãng trong các ống nghiệm với dung tích 10 ml, nhưng tiến hành nhân sinh khối thì tảo không phát triển mà có khuynh hướng suy tàn dần Vì vậy, đề nghị phương pháp phân lập là pha loãng với thể tích 50 ml trong các bình tam giác hay chai thủy tinh có thể tích từ 100 - 250 ml

Hình 2.10 Phương pháp pha loãng mẫu

(http//:www.marine.csiro.au/microalgae/methods/isolation techniques.html)

2.6 Mối quan hệ giữa các nhóm chất hóa học trong trao đổi năng lượng

Trong cơ thể mọi quá trình biến đổi các chất không xảy ra riêng rẽ mà có

mối quan hệ qua lại rất chặt chẽ Mối quan hệ thể hiện cả trong quá trình biến đổi

của một nhóm chất lẫn trong mối quan hệ của quá trình biến đổi các nhóm chất

khác nhau (Irina A và ctv, 2006)

Trong cùng một nhóm chất mối quan hệ thể hiện qua quá trình đồng hóa và

dị hóa Mối quan hệ tương hỗ của sự đồng hóa và dị hóa thể hiện cả hai quá trình

xảy ra đều có các chất trung gian chung Ví dụ phosphoglyceric aldehyde vừa là sản

phẩm trung gian trong quá trình phân giải (dị hóa) vừa là sản phẩm trung gian của

quá trình tổng hợp (đồng hóa) saccharose (Irina A và ctv, 2006)

Giữa các nhóm chất mối quan hệ diễn ra phức tạp hơn, nhiều hình thức hơn

Trước hết mối quan hệ được thể hiện qua các chất trung gian Một chất là sản phẩm

phân giải của nhóm chất này lại là nguyên liệu để tổng hợp cho nhóm chất khác Ví

dụ: Acetyl-CoA là sản phẩm của quá trình phân giải glucose đồng thời nó là nguyên

liệu để tổng hợp axít béo (Ngô Xuân Mạnh, 2006)

Mối liên quan tương hỗ giữa các quá trình trao đổi saccharide, lipid, protein, nucleic axít có ý nghĩa quan trọng trong sự sống của sinh vật Việc chuyển hóa tinh bột thành đường sau đó tạo các chất béo trong những tháng mùa đông ở thực vật cũng như ở động vật, có ý nghĩa quan trọng trong việc tăng khả năng chịu rét của chúng Việc chuyển biến lipid thành saccharide khi hạt nảy mầm sẽ đảm bảo năng lượng cho phôi (Irina A và ctv, 2006)

Trong quá trình hoạt động sống của cơ thể, saccharide là chất dự trữ quan trọng; khi cơ thể cần sẽ phân giải thành phosphoglyceric axít rồi thành pyruvic axít làm nguyên liệu cho sự tổng hợp amino axít, axít béo và các chất khác Lipid dự trữ cũng có vai trò tương tự, khi phân giải lipid tạo nên acetyl-CoA để từ đó lại tổng hợp amino axít, saccharide… Khi trong cơ thể hết nguồn dự trữ saccharide và lipid thì protein sẽ bị phân giải tạo ra các sản phẩm để từ đó có thể tổng hợp lipid, saccharide Hàm lượng dầu trong thực vật thay đổi nhiều theo giống, cách chăm bón và thời gian thu hoạch (Irina A và ctv, 2006)

Tổng hợp và phân giải lipid là một trong những quá trình chuyển hóa năng lượng rất đặc trưng của tế bào Nó là nguồn cung cấp và dự trữ năng lượng chủ yếu của tế bào Phân giải lipid bao gồm 2 phần: là phân giải phần glixerin hay sphingozin và phần axít béo Từng phần riêng cũng có những vấn đề rất phức tạp như phân giải axít béo no, axít béo không no, axít béo có số cacbon chẵn, axít béo

có số carbon lẻ, axít béo đơn giản, axít béo phức tạp… giữa chúng ít nhiều khác nhau trong cách phân giải Trên cơ sở nghiên cứu sự phân giải và tổng hợp lipid chúng ta đã hiểu sâu hơn bản chất nguồn gốc năng lượng của tế bào Nguồn năng lượng mà tế bào đảm bảo cho mọi hoạt động sống (Ngô Xuân Mạnh, 2006)

2.7 Những thành tựu nghiên cứu về nuôi sinh khối Chlorella để phân tích hàm

lượng dầu

Tảo được biết là nguồn protein đơn bào dồi dào trong tự nhiên Tảo là loài sinh vật có khả năng quang hợp tạo sinh khối chính nhờ khả năng này đã thúc đẩy các nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu ứng dụng tảo để phục vụ đời sống của loài người Thay đổi điều kiện môi trường sống của tảo đã làm thay đổi thành phần dinh dưỡng tổng hợp trong tảo

Việc phân lập và định danh các loài tảo giúp xác định tốt hơn thành phần dinh dưỡng trong tảo để từ đó có những hướng ứng dụng phù hợp với mục đích

nuôi sinh khối thu sản phẩm tảo trong điều kiện nuôi cấy thích hợp với mục đích

của chúng ta Nuôi sinh khối tảo nhằm có hàm lượng lipid cao ban đầu được ứng

dụng trong thủy sản nhằm sản xuất tôm, cá giống vì tảo có chứa nhiều dầu thì khả

năng sống xót của tôm, cá bột càng cao (năng lượng giải phóng ra lớn) và lipid rất

quan trọng trong việc dự trữ năng lượng cho ấu trùng khi sống trong điều kiện thiếu

thức ăn Tăng hàm lượng dầu tổng số thì đồng thời làm gia tăng thêm hàm lượng

các axít béo không no (PUFA) là nguồn đinh dưỡng cho ấu trùng phát triển tốt

Ngày nay, theo tính toán của các nhà khoa học thì nguồn dự trữ dầu mỏ và

than đá trên toàn thế giới chỉ đủ dùng đến năm 2050 Nguồn nguyên liệu cho ngành

năng lượng thay thế đang là xu thế tất yếu của các quốc gia trên thế giới Tùy theo

tiềm lực ở mỗi vùng mà mỗi quốc gia có chiến lược phát triển nguồn năng lượng

cho chính nước mình Phát triển biodiesel từ tảo là một trong những hướng phát

triển nguồn năng lượng sạch cho tương lai nhằm đa dạng nguồn thu năng lượng và

phù hợp với lợi thế của mỗi vùng lãnh thổ, đảm bảo nhu cầu năng lượng tại chỗ

Bảng 2.2 Một số loài tảo đã nghiên cứu để so sánh hàm lượng dầu sản xuất

biodiesel

Tên loài tảo Nơi lấy mẫu Thuộc

ngành tảo

% Lipid

Chlamidomonas reinhardti Nước sông, hồ Lục 21,0

Nannochloropsis oculata Nước sông, hồ Lục 21,0

Dunaliela salina Nước biển Lục 15,0

Tetraselmis chui Nước biển Lục 45,7

Isochrysis galbana Nước biển Nâu 7,0

Pleurochrysis carterae Nước biển Nâu 21,9

Chlorella pyrenoidosa Nước biển Lục 2,0

Chlorella minutissima Nước biển Lục 44,0

Chlorella protothecoides Nước biển Lục 14,0 (http://www.biodieselnow.com/forums/t/18566.aspx)

Nghiên cứu về ảnh hưởng của nồng độ Fe3+ lên sự tích lũy dầu trong tảo

Chlorella vulgaris của nhóm tác giả Zhi-Yuan Liu, Guang-Ce Wang, Bai-Cheng

Zhou ở Trung Quốc Giống tảo là Chlorella vulgaris C7 được cung cấp từ Viện

nghiên cứu biển, Trung Quốc Môi trường nuôi cấy là F/2-Si được nghiên cứu bởi Guillard và Ryther (1962) Điều kiện nuôi cấy ánh sáng 100 μmol m-2s-1 (14:10 sáng – tối), nhiệt độ 20 ± 2 oC

Việc nghiên cứu cung cấp thêm Fe3+ thì không thể thay đổi pha tích lũy dầu trong tảo nhưng qua nghiên cứu đã cải thiện được hàm lượng dầu trong tảo Điều này có lợi cho ứng dụng trong sản xuất dầu sinh học làm gia tăng giá trị trong tương lai

Theo nghiên cứu của nhóm tác giả thì bổ sung thêm Fe3+ vào ngày thứ 7 là hiệu quả nhất và chỉ bổ sung một lần Việc bổ sung thêm lần 2 vào ngày 17 thì hiệu quả tăng sinh khối giảm xuống cụ thể là mật độ ngày thứ 25 giữa hai thí nghiệm bổ sung Fe3+ 1lần và 2 lần (1 lần: 17,25 triệu tb/ml, 2 lần: 13,85 triệu tb/ml)

Hình 2.11 Ảnh hưởng của các nồng độ Fe3+ thêm vào ngày thứ 7 làm gia tăng mật độ tế bào (Zhi-Yuan Liu và ctv, 2007)

Hình 2.12 Hàm lượng dầu được tích lũy trong tảo(%)(Zhi-Yuan Liu và ctv, 2007) (Màu đen ly trích bằng phương pháp Soxhlet và không màu được phân tích bằng phương pháp so màu với chất phát huỳnh quang là Nile red

Nghiên cứu sự gia tăng giá trị năng lượng của các dòng tảo khi nuôi cấy trên môi trường đạm thấp của nhóm tác giả A.M Illman, A.H Scragg, S.W Shales, thuộc Phòng khoa học môi trường, Viện nghiên cứu khoa học Miền Tây nước Anh

Kết quả thu được ở nghiên cứu này là trọng lượng khô thu được của Chlorella

vulgaris là cao nhất 406 mg/lít đối với môi trường Watanabe và 392 mg/lít đối với

môi trường đạm thấp tương ứng với mật độ tế bào khi kết thúc nuôi cấy là cao hơn hẳn so với các loài khác (6,15 triệu tb/ml) (Phụ lục 1, môi trường nitơ thấp cải tiến hàm lượng đạm giảm ½ là môi trường đạm thấp)

So sánh hàm lượng (%) protein, carbohydrat, lipid của tảo Chlorella vulgairis thay đổi giữa hai môi trường Watanabe và đạm thấp: protein tương ứng

29 : 7, carbohydrat 51 : 55, lipid tương ứng 18 : 40 ( A.M Illman và ctv, 2000)

Xét trên khía cạnh sản xuất biodesel từ tảo Chlorella vulgaris thì sử dụng môi

trường đạm thấp là hiệu quả hơn làm tăng khả năng tổng hợp và tích lũy lipid trong tảo cao (40%) Bên cạnh đó trọng lượng khô khi nuôi trong môi trường đạm thấp là

406 mg/lít cao hơn môi trường Watanabe 392mg/lít, và tốn ít chi phí cho các thành phần dinh dưỡng nuôi tảo hơn do hạn chế về lượng đạm cung cấp khi nuôi cấy

Hình 2.13 Sự gia tăng mật độ tế bào khi nuôi trong môi trường đạm thấp

(A.M Illman và ctv, 2000) ( C vulgaris; (*) C minutissima;  C emersonii; x C sorokiniana;  C protothecoides)

Qua hình trên chúng ta dễ dàng nhận thấy mức độ thích nghi của

Chlorella vulgaris là cao hơn các loài khác trong cùng giống Chlorella Thích

hợp cho nuôi cấy lâu dài để thu hàm lượng dầu Khả năng thích nghi tốt thuận lợi cho bảo quản giống lâu hơn, ít bị suy giảm khả năng sinh trưởng trong điều kiện bảo quản ở nhiệt độ phòng

Qua thí nghiệm nuôi tảo trong môi trường thiếu đạm mà Chlorella vulgaris

vẫn phát triển tốt Khả năng thích nghi trong điều kiện môi trường đạm thấp này được giải thích nhờ tác động của môi trường lên gene (gene NR) cố định đạm của

tảo Chlorella Chlorella vulgaris có mức độ đáp ứng tốt hơn so với các loài khác

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Địa điểm và thời gian tiến hành đề tài

Địa điểm: Phòng thí nghiệm I4, I5 khu Hoàng Anh, Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM và phòng Công nghệ sinh học Thực Vật, Viện nghiên cứu Công Nghệ Sinh Học - Môi Trường, trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

Thời gian tiến hành đề tài : từ 01/03/2009 đến 30/07/2009

3.2 Vật liệu

3.2.1 Nguồn tảo giống

Tảo giống Chlorella sử dụng để bố trí thí nghiệm được cung cấp Khoa

Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ

Các dụng cụ cơ bản cho thí nghiệm trong phòng hóa sinh và hóa lý

Các dụng cụ cơ bản cho thí nghiệm trong phòng vi sinh