các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzym

̶ TTHĐ là một phần nhỏ trong phân tử enzym, tham gia trực tiếp liên kết với cơ chất và chuyển đổi nó thành sản phẩm của phản ứng.. ̶ Tiếp xúc với cơ chất→ biến đổi hình dạng của E → Các

HÓA SINH HỌC

Thời lượng: 45 tiết

ThS Huỳnh Thị Thu Hương

NỘI DUNG HỌC

2 Chuyển hóa các chất, Oxy hóa sinh học, chu trình

acid acid citric

3 Hóa học và chuyển hóa glucid

KIỂM TRA GIỮA KỲ

4 Hóa học và chuyển hóa lipid

5 Hóa học và chuyển hóa acid amin, protein

6 Hóa học và chuyển hóa acid nucleic

7 Hóa học và chuyển hóa hemoglobin

8 Vitamin

Tài liệu tham khảo

Sinh Học – Phần 1: Hóa Sinh

Cấu Trúc”, Nhà xuất bản giáo

dục Việt Nam

Sinh Học – Phần 2: Chuyển

hóa các chất và hóa sinh một

số cơ quan”, Nhà xuất bản

giáo dục Việt Nam

(2011), “Text book biochemistry for medical students”, Jaypee brothers medical

John Wiley & Sons

5 Dr (Brig) MN Chatterjea, Rana Shinde (2012), “Textbook

of Medical Biochemistry”, Jaypee brothers medical

6 David L Nelson, Michael M Cox (2008), “Principles of

biochemstry”, W H Freeman and Company

HÓA SINH VÀ Y DƯỢC

KHÁI NIỆM

Hóa sinh học làm sáng tỏ nhiều khía cạnh về sức khỏe và

bệnh tật

Nghiên cứu về các khía cạnh của sức khỏe và bệnh tật

mở ra thêm nhiều lĩnh vực mới của hóa sinh

MỐI QUAN HỆ TƯƠNG HỖ GIỮA HÓA SINH VÀ Y DƯỢC

Lipid

BỆNH XƠ VỮA ĐỘNG MẠCH

Hydrat carbon

ĐÁI THÁO ĐƯỜNG TỤY

• Cơ chế điều hòa sự

chuyển hóa trong tế

bào

Mục tiêu cụ thể

• Vận dụng được kiến thức phục vụ cho những môn nghiệp vụ

• Dễ dàng tiếp cận môi trường xét nghiệm lâm sàng

• Thực hiện những

nghiên cứu khoa học

acids

ENZYM

1 Đại cương về enzym

1.1 Khái niệm

̶ Là chất xúc tác sinh học , có bản chất là protein

không thay đổi tiến trình của phản ứng

tương đối nhẹ nhàng

̶ Có tính đặc hiệu cao với cơ chất

Năng lượng hoạt hóa

̶ Là sự sai khác giữa mức năng lƣợng của trạng thái cơ bản

và trạng thái chuyển tiếp Kí hiệu: ΔG*

̶ Là năng lƣợng cần cung cấp trong giai đoạn ban đầu để cho phản ứng xảy ra

̶ ΔG* càng cao → Tốc độ phản ứng sẽ xảy ra chậm

̶ Enzym làm giảm năng lƣợng hoạt hóa của phản ứng

Ví dụ: Phản ứng thủy phân đường saccarose

Phản ứng Saccarose + H 2 O → Glucose + Fructose

Không xúc tác ΔG* = 32.000 calo/mol

Xúc tác vô cơ ΔG* = 25.000 calo/mol

Enzym (saccarase) ΔG* = 9.400 calo/mol

1.2 Cân bằng hóa học

thái cân bằng động học khi những phân tử mới của

cơ chất và của sản phẩm liên tục chuyển hóa và sản

̶ Hằng số cân bằng K:

 Nồng độ của B gấp 100 lần A (dù có hay không có enzym)

̶ Để đạt đến trạng thái cân bằng:

+ Phản ứng không có enzym: cần khoảng 1 giờ

+ Phản ứng có enzym: trong vòng 1 giây

 Enzym không làm thay đổi trạng thái cân bằng nhƣng thúc

đẩy phản ứng nhanh chóng đạt trạng thái cân bằng

̶ TTHĐ là một phần nhỏ trong

phân tử enzym, tham gia trực tiếp

liên kết với cơ chất và chuyển đổi

nó thành sản phẩm của phản ứng

̶ Các acid amin của TTHĐ thường

là Serin , Histidin, Tryptophan,

Cystein , Lysin, Arginin,

Glutamat

1.3 Trung tâm hoạt động

 Cơ chế xúc tác của enzym

S : cơ chất

ES : phức trung gian

E : enzyme

P : sản phẩm

E : enzyme

Thuyết của Fisher (“chìa khóa với ổ khóa”) (1894)

̶ Cấu dạng của cơ chất và TTHĐ của enzym giống nhƣ là chìa khóa và ổ khóa

̶ Hai dạng này đƣợc xem nhƣ không thay đổi, cố định và

hoàn toàn ăn khớp với nhau

→ Thuyết này đã giải thích đƣợc tính đặc hiệu của enzym

 Thuyết Koshland (“tiếp xúc cảm ứng”) (1958)

̶ TTHĐ rất mềm dẻo và linh hoạt, các nhóm chức năng TTHĐ của E chưa ở tư thế sẵn sàng hoạt động

̶ Tiếp xúc với cơ chất→ biến đổi hình dạng của E → Các nhóm chức năng của E di chuyển và định hướng một cách thích hợp

và chính xác → Khớp với cơ chất

→ TTHĐ chỉ thực sự được hình thành trong quá trình tiếp xúc giữa

E và S

1.4 Tính đặc hiệu của enzym

Gồm 2 loại:

+ Đặc hiệu phản ứng: Chỉ xúc tác một kiểu phản

ứng hoá học nhất định

nhất định hoặc chỉ một cơ chất duy nhất

 Tính đặc hiệu phản ứng

Các phản ứng của acid amin

 Phản ứng khử carboxyl nhờ decarboxylase

 Phản ứng khử amin nhờ amino acid oxydase

 Phản ứng chuyển nhóm amin nhờ amino transferase

cơ chất có cấu trúc hoàn toàn khác nhau

o Hoạt hóa acid amin

o Chuyển gốc acid amin đã đƣợc hoạt hóa

cho ARNt → phức hợp acid amin-ARNt

AMINO ACID

AMP-Amino acid

Aminoacyl-tRNA

2.1 Danh pháp

 Tên thông dụng : pepsin, trypsin, bromelin, amylase…→Không nói lên bản chất xúc tác

 Tên hệ thống : Hội nghị hóa sinh quốc tế quy định

VD: Pyruvat-decarboxylase (khử CO2 của acid pyruvic)

A-B + H 2 O  A-H + B-OH

Phân cắt liên kết C-C, C-O, C-N và các liên kết khác để thành lập thường là một liên kết đôi

X Y  

A-B  A=B + X-Y

Chuyển đổi các nhóm chức nội phân tử (chuyển đồng phân)

X Y Y X     A-B  A-B

Xúc tác các phản ứng tổng hợp có kết hợp với sự thủy giải của ATP

A + B → A-B

Alcol dehydrogensase Hexokinase

Trypsin

Pyruvat decarboxylase

Maleat isomerase

Pyruvat carboxylase

PỨ 1:

PỨ 2:

PỨ 3:

độ của enzym

̶ Liên quan đến giá trị của vận tốc khởi đầu, ở thời điểm zero (ký hiệu Vo, mol/phút)

̶ Tại thời điểm zero:

đi qua tọa độ góc

Sự liên quan giữa việc tạo thành sản phẩm theo thời gian

trong phản ứng xúc tác bởi enzyme

Độ dốc

Đơn vị hoạt độ enzyme:

 Đƣợc biểu thị bằng vận tốc ban đầu (Vo, mol/phút) của phản ứng đƣợc xúc tác (mol cơ chất đƣợc chuyển hóa trong thời gian 1 phút)

 2 đơn vị tiêu chuẩn khác cho hoạt độ của enzyme là đơn vị enzyme (U) và katal (kat):

− U: Lƣợng enzyme cần thiết để xúc tác việc chuyển 1 µnol

của enzyme này

− Katal: Tác động xúc tác làm tăng tốc độ phản ứng của một mol/giây trong một hệ thống đặc hiệu

Sự chuyển đổi giữa những đơn vị:

Đo trực tiếp:

 Sự thay đổi nồng độ cơ chất hoặc sản phẩm theo thời gian

Đo gián tiếp:

 Thông qua đo sự thay đổi nồng độ của một cơ chất hoặc sản

phẩm của một phản ứng enzym đi kèm theo thời gian

3.2 Định lượng enzym

 Điều kiện: Cơ chất (hay sản phẩm) hấp thụ ánh sáng ở một

bước sóng nhất định

→ Nồng độ của chúng được đo bằng cách khảo sát sự biến thiên của độ hấp thụ ở bước sóng đó

 Mật độ quang học tỷ lệ với nồng độ; tốc độ biến thiên của

độ hấp thụ tỷ lệ với tốc độ phản ứng enzyme biểu thị bằng

số mol cơ chất được tiêu thụ (hay số mol sản phẩm được

tạo thành) trong một đơn vị thời gian

 NADH và NADPH: hấp thụ ở bước sóng 340 nm→ Đo sự thay đổi độ hấp thụ  Định lượng hoạt độ enzyme

Đo trực tiếp:

VD: Enzym lactat dehydrogenase

CH3-CH(OH)-COO - + NAD + CH3-CO- COO - + NADH + H +

Đo gián tiếp:

Định lượng kết hợp enzyme glucose oxydase và peroxydase được sử

dụng để đo nồng độ glucose trong máu

3.3 Nồng độ cơ chất

̶ [S] thấp: khi tăng gấp đôi cơ chất → Vo tăng gấp đôi

̶ [S] cao: E đã bị bảo hòa→ sự tăng [S] thêm→ tăng rất ít Vo

→Biểu đồ biểu thị mối liên quan giữa Vo theo [S] là một đồ thị dạng hyperpol

???

Rate of reaction

Enzyme concentration [unlimited substrate]

3.4 Nồng độ enzym

• Trong điều kiện nồng độ cơ

chất bảo hòa , [E] tăng

→ vận tốc ban đầu Vo tăng

→Đồ thị biểu diễn sự thay đổi

Vo theo nồng độ E là một

đường thẳng

• Tăng nhiệt độ

→Tăng năng lƣợng nhiệt cung cấp

cho các phân tử cơ chất

→Gia tăng vận tốc của phản ứng →

đến khi Vo = Vmax thì tại nhiệt độ

đó gọi là nhiệt độ tối ưu (to opt)

3.5 Nhiệt độ

Functional protein

Denatured protein

• Nhiệt độ > t o

opt → Tăng nguy cơ phá vỡ các liên kết yếu không đồng hóa trị→ Làm giảm hoạt tính E→ Biến tính E→ Vận tốc phản ứng sẽ gần bằng 0

3.6 pH

• Mỗi enzym có 1 giá trị pH tối ưu để hoạt động

• Thông thường pH opt khoảng 6-8

• Hoạt tính xúc tác của enzym rất nhạy khi thay đổi pH → Trong mọi nghiên cứu, enzym cần được giữ vững bằng

dung dịch đệm thích hợp.

Enzyme Nguồn gốc pHopt

3.7 Cofactor

• Cofactor (chất cộng tác): là những phần không có bản chất protein khi gắn với protein thì tạo nên một phức hợp có hoạt tính xúc tác

• Cofactor:

 Ion vô cơ: Zn 2+ , Fe 2+ ,…

Coenzym: Một phức hợp các phân tử hữu cơ

• Apoenzym là phần protein của enzym không có cofactor

COFACTOR + APOENZYM  HOLOENZYM

• Holoenzym là dạng có hoạt tính xúc tác hoàn chỉnh của một enzym

Cofactor Tiền chất Bệnh do thiếu

vitamin

b Coenzym

Coenzym A Acid pantothenic (Vit B5) Viêm da, thiếu máu FAD, FMN Riboflavine (Vit B2) Chậm lớn, viêm da NAD + , NADP + Niacine (Vit B3) Pellagra_viêm da nhạy

cảm với ánh sáng Thiamine pyrophosphat Thiamine (Vit B1) Beriberi_Tê phù

Scorbut

• NAD + (Nicotinamide adenin dinucleotid)

• NADP + (Nicotinamide adenin dinucleotid phosphat)

→Hoạt động nhƣ chất vận chuyển điện tử, tham gia vào các

phản ứng oxy hóa khử

Cấu trúc của coenzyme NAD + và NADP +

N

CONH2

OH HO

CH2O

• FMN (flavin mononucleotid): Tạo bởi một đơn vị flavin mononucleotid

• FAD (flavin adenin dinucleotid): Ngoài flavin mononucleotid chứa thêm 1 nhóm bổ sung glucid (ribose), và Adenin

→ FAD và FMN tác động với 2 proton và 2 điện tử để chuyển

luân phiên từ trạng thái khử sang trạng thái oxy hóa

• Những dạng khác nhau của một enzym xúc tác cùng một phản ứng được gọi là các isoenzym

• Chúng có những tính chất động học và vật lý khác nhau Ví dụ: điểm đẳng điện, pH tối ưu, ái lực đối với cơ chất hay đối với những tác động của các chất ức chế

• Những isoenzym khác nhau của một enzym nhất định được tổng hợp do những gen khác nhau và thường tác động trong những mô khác nhau của cơ thể

3.8 Các isoenzym

Cấu tạo bởi 4 tiểu đơn vị từ 2 loại tiểu đơn vị khác nhau gọi là H và M

Có 5 isoenym: H4, H3M, H2M2, HM3, M4

Các isoenzym H4 và H3M có nhiều trong tim và hồng cầu; H2M2 trong não và thận, trong khi đó HM3 và M4 có nhiều trong gan và cơ xương

Mỗi isoenzym đặc trưng cho một mô đặc hiệu

Ý nghĩa to lớn trong y học → chuẩn đoán bệnh

Mô hình Michaelis-Menten tóm tắc khái niệm sau đây về sự xúc tác của một phản ứng bởi enzym

Nghiên cứu động học của một số enzym:

 [S] thấp →Vận tốc ban đầu (Vo) tỷ lệ trực tiếp với [S]

 [S] cao →Vận tốc có xu hướng đạt đến giá trị tối đa và không phụ thuộc vào [S]  Vận tốc tối đa này được gọi là

- Hằng số Km (hằng số Michaelis) với đơn vị là M (mol)

K m = k 2 + k 3

k 1

- Km bằng tổng vận tốc của sự phân rã ES chia vận tốc của

sự tạo thành ES → Dùng để đo độ bền của phức hợp

 Đối với một số các enzym k 2 >> k 3 → K m → Một hằng số

đo ái lực của enzym đối với cơ chất bởi vì giá trị của nó lúc này phụ thuộc vào giá trị tương đối của k1 và k2, hằng

số vận tốc tương ứng với sự thành lập và phân ly ES

Ý nghĩa:

 K m lớn → Enzym có ái lực yếu đối với cơ chất (k 2 >> k 1 )

 K m thấp → Enzym có ái lực mạnh đối với cơ chất (k 1 >>k 2 )

→ Xác định dạng cơ chất tốt nhất cho enzym

k3

k2

k1

 Xác định Km bằng thực nghiệm dựa vào phương trình Michaelis và Menten: Gía trị của nó chính là nồng độ cơ

 Không thể đánh giá được Vmax (và cả của Km) từ đồ thị hyperbol

 Nghịch đảo 2 vế của phương trình Michaelis và Menten như sau:

1

Vo

1 Vmax

Km Vmax

1 [S]

x +

=

→ Đồ thị Lineweaver-Burk cho phép tìm Km và Vmax một

cách dễ dàng và chính xác

→ Đồ thị này cắt trục tung tại 1/Vmax và cắt trục hoành tại

-1/Km Độ dốc của đường thẳng này là Km/Vmax

4.2 Đồ thị Lineweaver – Burk

y = ax + b

Chú ý:

 Mô hình của Michaelis và Menten đƣợc xem nhƣ là một

mô hình rất tốt liên quan đến hầu hết các số liệu thực nghiệm của phần lớn các enzym

 Vẫn còn một số các enzym không phù hợp với động học của Michaelis và Menten: Aspartat transcarbamoylase (ATCase) đƣợc gọi là các enzym dị lập thể (enzym

allosteric)

 Các chất ức chế: tác động trực tiếp trên enzym làm giảm vận tốc xúc tác của enzym

 Một số chất ức chế enzym:

+ Các sản phẩm chuyển hóa của tế bào bình thường

+ Những tác nhân lạ bên ngoài như các loại ma túy, độc tố,…

 Hai cách ức chế enzym:

- Ức chế thuận nghịch: Được đảo ngược lại bằng cách loại bỏ chất ức chế, gồm: ức chế cạnh tranh và không cạnh tranh

- Ức chế không thuận nghịch: Không thể đảo ngược

4.3 Ức chế enzym

 Iodoacetamid làm thay đổi gốc Cys và có thể đƣợc sử dụng nhƣ là một tác nhân chẩn đoán trong việc xác định số gốc Cys cần thiết cho tác động của enzym

Enzym-CH2SH + IC H 2 C N H 2

O

+ HI Enzym-CH2  S  CH2  C  NH2

O

 Kháng sinh Penicilline ức chế một cách không thuận nghịch enzym glycopeptid transpeptidase (có vai trò xúc tác việc thành lập những liên kết chéo trong thành tế bào vi khuẩn) bằng các liên kết cộng hóa trị với gốc Serin trong trung tâm hoạt động của enzym

 Cyanide liên kết cộng hóa trị với enzym cytochrome oxidase → Ức chế phản ứng liên quan đến sự vận chuyển điện tử

→Chất ức chế không thuận nghịch thường được xem như là

chất độc và không thích hợp cho mục đích điều trị

Ý nghĩa:

Ứng dụng để nhận biết các nhóm chức trong TTHĐ của E

Ức chế thuận nghịch

Đặc điểm:

 Một chất ức chế cạnh tranh có cấu trúc gần giống cơ chất cạnh tranh với cơ chất Liên kết với trung tâm hoạt động của enzym

 Enzym có thể liên kết với cơ chất hoặc chất ức chế

 Tốc độ phản ứng enzym tùy thuộc vào nồng độ tương đối của chất ức chế và cơ chất [S] >> [I] → Khắc phục được hiện tượng ức chế

S

I E

EI

1/Vo

1/[S]

1/Vmax

-1/Km

Đồ thị Lineweaver-Burk cho thấy ảnh hưởng của chất ức chế

cạnh tranh trên Km và Vmax

• Nghiên cứu TTHĐ, cơ chế xúc tác của E, con đường trao đổi chất

• Sử dụng trong điều trị bệnh

VD:

Krebs đã sử dụng chất ức chế cạnh tranh của succinate dehydrogenase

để nghiên cứu chu trình acid tricarboxylic

Sulphanilamide là chất ức chế cạnh tranh của E vi khuẩn tham gia trong quá trình sinh tổng hợp CoE tetrahydrofolate từ p-aminobenzoic → Được sử dụng để hạn chế sự sinh trưởng của vi khuẩn và ít độc hại đối với cơ thể

Ức chế thuận nghịch

Đặc điểm:

 Chất ức chế không cạnh tranh liên kết với một trung tâm khác với trung tâm hoạt động cấu trúc không gian của enzym thay đổi Giảm hoạt tính của enzym

 Enzym có thể liên kết với chất ức chế, với cơ chất hoặc

Đồ thị Lineweaver-Burk cho thấy ảnh hưởng của chất

ức chế không cạnh tranh trên Km và Vmax

 Nghiên cứu cơ chế tương tác của enzym với cơ chất

 Vai trò điều hòa hoạt động enzym

 Thiết kế “Thuốc” để ức chế phản ứng sinh hóa không mong muốn,

 Tìm hiểu vai trò của các độc tố sinh học, ví dụ:

+ Những hợp chất tương tự acid amin, được dùng như chất diệt cỏ

ví dụ như chất „Roundup‟_Glyphosate

5 Kiểm soát hoạt động của enzym

5.1 Điều hòa bởi cơ chế feed-back

• E tham gia đầu tiên được ức

• Các sản phẩm cuối cùng của chuyển hóa thường ít khi tương đồng với hợp chất ban đầu về mặt cấu trúc → Chúng sẽ liên kết với E ở một vị trí khác ngoài TTHĐ của E

→Những E loại này là E dị lập thể

VD: Aspartat transcarbamoylase (ATCase) là E cho tổng hợp

pyrimidine

5.2 Sự thay đổi các liên kết cộng hóa trị thuận nghịch

• Nhóm phosphat →Tác động đến hoạt độ của E

• Sự phosphoryl hóa là sự thêm nhóm phosphat được xúc tác bởi

protein kinase có sử dụng ATP

• Sự dephosphoryl hóa là sự lấy đi nhóm phosphate được xúc tác bởi protein phosphatase

→Sự phosphoryl hóa/dephosphoryl hóa như một rờle nhanh và thuận nghịch → để định hướng một con đường chuyển hóa tuân theo hoặc không tuân theo nhu cầu của tế bào