CHỌN, tạo GIỐNG THỰC vật

Mặc dù lai tạo là biện pháp thực hành đã được áp dụng từ trước khi có những ý kiến của Mendel, nhưng vai trò của đặc tính di truyền trong chọn tạo giống không dễ gì chấp nhận bởi các nhà

CHỦ ĐỀ: CHỌN, TẠO GIỐNG THỰC VẬT

- Chọn giống cây trồng là nghệ thuật và khoa học cải tiến tính di truyền của thực vật vì lợi ích của loài người (Poehlman và Sleper, 1995) Chọn giống cây trồng đồng nghĩa với cải tiến cây trồng Trong quá khứ, khi con người biết thuần hóa cây dại thành cây trồng chọn giống là nghệ thuật chọn lọc, đó là khả năng quan sát và phân biệt những cá thể phù hợp mục đích kinh tế, thẩm mỹ của mình Chọn giống mang tính khoa học diễn ra trong khoảng 200 năm trở lại đây, đặc biệt sau khi tái phát hiện các định luật di truyền của Mendel vào đầu thế kỷ 20 và chọn giống mang tính khoa học nhiều hơn tính nghệ thuật

- Cùng với sự phát hiện ra giới tính của cây trồng, phương pháp lai tạo đã bổ sung cho kĩ thuật chọn tạo giống Mặc dù lai tạo là biện pháp thực hành đã được áp dụng từ trước khi

có những ý kiến của Mendel, nhưng vai trò của đặc tính di truyền trong chọn tạo giống không dễ gì chấp nhận bởi các nhà khoa học đương thời Thực nghiệm của Mendel đã cung cấp cơ sở về cơ chế của tính di truyền tuy những năm trước đây cũng có nhiều cách giải thích về cơ chế di truyền đã được công bố

- Chọn giống cây trồng vừa có tính chất khoa học, vừa có tính chất nghệ thuật, thông qua một lịch sử lâu dài về nội dung thuần hóa các loài hoang dại trở thành loài trồng trọt

1 Phương pháp chọn giống cây tự thụ phấn: Phương pháp phả hệ

- Di tích của phương phá phả hệ được tìm thấy trong “centgener” của W.H Hay (Stoskopt và ctv 1993) Mô tả chi tiết về phương pháp phả hệ được Love (1927) trình bày nhằm quản lý các thế hệ con lai phân ly

- Phương pháp chọn giống cây trồng tự thụ phấn theo phương pháp chọn cá thể của những thế hệ phân ly theo một hệ thống được ghi chép 1 cách hệ thống, từ những thế hệ đầu tiên đến thế hệ ổn định sau cùng

- Qui trình của phương pháp phả hệ bao gồm các bước sau:

1.1 Chọn bố mẹ

- Bố mẹ phải đáp ứng: (1) mục tiêu cải tiến giống; (2) có khả năng tạo ra biến dị di truyền biểu thị sự phân ly mạnh ở quần thể F2 tạo điều kiện để chọn cá thể, bố mẹ có khoảng

cách di truyền khá xa về tính trạng mong muốn; (3) bố hoặc mẹ có khả năng tiếp hợp rộng

1.2 Chọn con lai

- Số con lai của quần thể F2 phải đáp ứng đầy đủ với mục tiêu chọn giống (1.000-2.000

cá thể/ tổ hợp lai); cá thể chọn lọc được đánh dấu bằng số

- Quần thể F2 là quần thể phản ánh thông tin di truyền tốt nhất để nhà chọn lọc giống quan sát và chọn lọc Người ta còn có thể yêu cầu qui mô của F2 và F3 dựa theo kết quả phân tích kiến trúc di truyền

- Cường độ chọn lọc được ghi nhận từ F2

1.3 Trắc nghiệm thế hệ đầu tiên

2 Chọn giống cây trồng ưu thế lai

- Việc ứng dụng có tính chất kết hợp giữa khoa học và nghệ thuật trong ngành chọn tạo giống cây trồng đã làm nên một cuộc cách mạng xanh thực sự có ý nghĩa trên thế giới vào giữa thế kỷ 20 cho đến nay, trong đó, khai thác ưu thế lai không những chỉ thành

công trên loài cây thụ phấn chéo mà còn trên loài cây tự thụ phấn như lúa (Oryza sativa

L.)

- Hầu hết các công trình nghiên cứu cơ bản cho đến sản xuất hạt thương phẩm đều dựa trên khai thác ưu thế lai cây bắp Bởi vì tiềm năng giá trị ưu thế lai của nó có thể đạt từ 150% đến 200% về năng suất hạt Tiến trình được chia ra 3 bước như sau:

- Phát triển các dòng tự phối

- Trắc nghiệm thế hệ đầu tiên

- Đánh giá các dòng tự phối

- Sản xuất hạt lai F1

3 Chọn giống cây trồng sinh sản vô tính

- Lịch sử chọn giống cây trồng vô tính có thể nói rằng rất lâu đời, nhưng người ta vẫn xem người có công trong lĩnh vực này là Thomas Knight

- Ông đã thành công trong việc phát triển có hệ thống nhân giống cây ăn trái và rau nho (nho, táo, lê, đào) trong khoảng thời gian từ 1811-1838 – thời kỳ mà người ta chưa hiểu biết nhiều về cơ sở khoa học của lai giữa hai giống khác nhau

- Ngược lại với sinh sản hữu tính, những cặp lai F1 trong cây trồng sinh sản vô tính là dị hợp tử từ những cây ưu việt được chọn lọc bởi Knight và nhân giống bằng cơ quan sinh thực (vegetative propagation) để phát triển giống cây ổn định phục vụ sản xuất, mà không

có bất cứ sự suy giảm nào do phân ly của hiện tượng tái tổ hợp gen Các bước thực hiện:

- Nhập nội giống cây trồng và thích nghi hóa về khí hậu

+ Qui trình nhập nội giống cây trồng sinh sản vô tính cũng giống như cây sinh sản hữu tính, nhưng việc lựa chọn sẽ nghiêm ngặt hơn về điều kiện môi trường đối với sự trổ bông của cây sinh sản hữu tính

+ Việt Nam đã du nhập khá nhiều giống mía đường từ Đài Loan và phát triển thành công

ở các vùng trồng mía lớn của cả nước

- Chọn lọc

+ Việc chọn lọc giống cây trồng sinh sản vô tính rất hạn chế đối với nguồn vật liệu được

du nhập từ nới khác đến; ở đó, một số lượng lớn các dòng vô tính đã được đưa vào và được đánh giá dưới điều kiện khí hậu của địa phương

+ Những chọn lọc tốt nhất là trắc nghiệm theo kiểu so sánh trên diện rộng trước khi phóng thích ra giống thương mại

- Lai

+ Nguyên tắc cơ bản của lai cây trồng sinh sản vô tính cũng giống như cây trồng khác Nhưng khó hơn ở chỗ phải kích thích sự trổ hoa để có được thụ phấn bình thường và thụ tinh bình thường trong cây bố mẹ

- Đột biến

+ Cải tiến giống cây trồng sinh sản vô tính bằng phương pháp đột biến đạt được những thuận lợi rõ ràng và những hạn chế cá biệt

+ Bất cứ một bộ phận sinh thực nào đều có thể được xử lý đột biến với những tác nhân gây đột biến (mutagens) để cải tiến dạng giống gốc Từ đó việc nhân giống sẽ diễn ra nhờ sinh sản vô tính

+ Phương pháp chọn giống bằng đột biến rất thành công trên nhiều loài cây trồng như cây

có củ, hành (bulb) và cây cắt cành thí dụ như khoai tây, khoai lang, khoai mì, cây ăn quả, giống cỏ chăn nuôi gia súc, cây cảnh; nhiều nhất vẫn là cây cảnh và cây ăn quả

4 Chọn giống cây trồng đa bội

- Thao tác nhiễm sắc thể (NST) ở mức độ đa bội là phương pháp cải tiến giống cây trồng

đã được khuyến cao cho các nhà chọn giống

- Ảnh hưởng tích cực của nó là làm thay đổi số lượng các alen đặc biệt (aneuploid) hoặc hình thành những tổ hợp mới (euploid) của các alen khác nhau trong cùng gen của genome (Sybenga, 1993)

- Chọn giống cây đa bội bao gồm các bước đi sau:

- Kích thích thể đa bội

- Phát hiện những loại hình khác nhau về đa bội

- Chọn lọc cây đa bội ổn định từ nguồn vật liệu đa dạng

5 Phương pháp gây đột biến

5.1 Định nghĩa

- Đột biến là những biến đổi bất thường trong vật chất di truyền ở cấp độ phân tử (ADN, gen) hoặc cấp độ tế bào (nhiễm sắc thể), dẫn đến sự biến đổi đột ngột của một hoặc một số tính trạng, những biến đổi này có tính chất bền vững và có thể di truyền cho các đời sau

- Tạo giống bằng phương pháp gây đột biến là phương pháp sử dụng các tác nhân vật lý hóa làm thay đổi vật liệu di truyền của sinh vật nhằm phục vụ lợi ích của con người

5.2 Các tác nhân gây đột biến

a Tác nhân vật lý:

- Tia phóng xạ: tia X, tia γ, tia β, chùm notron…

- Tia tử ngoại

b Tác nhân hóa học:

- 5-Brom uraxin (5-BU)

- Etyl metal sunfonat (EMS)

- N-Nitroso-N-methylurea (NMU).

- Acridin

- Consixin

c Sốc nhiệt: Tăng giảm nhiệt độ đột ngột làm cơ chế nội cân bằng của cơ thể không khởi động kịp gây chấn thương bộ máy di truyền

5.3 Quy trình

- Bước 1: xử lý mẫu bằng tác nhân gây đột biến

- Bước 2: chọn lựa các cá thể có kiểu hình mong muốn

- Bước 3: tạo dòng thuần chủng

5.4 Ưu và nhược điểm:

a Ưu điểm:

- Cho phép mang gen liệu pháp không hạn chế

- Có thể tạo ra những giống có đặt tính quý.

b Nhược điểm:

- Dễ bị thoái hóa giống

- Các hóa chất gây đột biến có thể gây ảnh hưởng cho người tiến hành

- Xuất hiện nhiều đột biến có hại

5.5 Thành tựu:

- Dùng hóa chất consixin tạo ra các giống đa bội chẵn hay đa bội lẻ: rau muống 4n có lá và thân to, sản lượng 30tạ/ha, dương liễu 3n lớn mạnh, cho gỗ tốt, dưa hấu, nho tam bội không hạt…

- Xử lý giống lúa Mộc Tuyền bằng tia gama tạo ra giống lúa MT1 chín sớm, cây thấp và cứng, chịu phân, chịu chua, năng suất tăng 15-25% Lai giống có chọn lọc giữa 12 dòng đột biến từ giống ngô M1 tạo thành giống ngô DT6 chín sớm, năng suất cao, hàm lượng prôtêin tăng 1,5%, tinh bột giảm 4%

- Táo gia lộc xử lí NMU cho ra giống táo má hồng cho năng suất cao

III PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN.

1 Định nghĩa

- Chuyển gen ở thực vật là khái niệm dùng để mô tả quá trình chuyển 1 hoặc 1 số gen ngoại lai vào trong tế bào thực vật nhằm tạo ra 1 hoặc 1 số tính trạng mới mà trước đó

cơ thể thực vật chưa có

2 Quy trình chuyển gen

- Xác định gen liên quan đến tính trạng cần quan tâm

- Phân lập gen (PCR, cDNA, genomis DNA)

- Gắn gen vào vecto để biến nạp

- Biến nạp vào E.coli

- Tách chiết DNA plasmid

- Biến nạp vào mô, tế bào thực vật

- Chọn lọc các thể biến nạp trên môi trường chọn lọc

- Tái sinh cây biến nạp

- Phân tích để xác nhận cá thể chuyển gen và mức độ biểu hiện của gen đó

3 Ưu và nhược điểm:

a Ưu điểm:

- Bằng việc biến nạp một hoặc một số gen có thể thu được cây mang một đặc tính mới xác định

- Rào cản về loài không còn có tác dụng, vì không chỉ các gen từ thực vật mà còn từ vi khuẩn, nấm, động vật hoặc con người được chuyển thành công vào thực vật

- Có thể loại bỏ những đặc điểm không mong muốn của thực vật Chẳng hạn, sự tổng hợp các chất độc hoặc chất gây dị ứng có thể được loại trừ bằng công nghệ gen

b Nhược điểm:

- Thiết bị máy móc mắc tiền, quy trình thực hiện đòi hỏi trình độ cao

- Áp dụng hạn chế, chỉ được tiến hành trên 1 số loại thực vật được quy định, cho phép

4 Thành tựu:

- Cây đậu tương chuyển gen:

+ Kháng sâu bệnh

+ Thay đổi thành phần acid béo

+ Thay đổi thành phần và giá trị dinh dưỡng

- Cây ngô chuyển gen:

+ Kháng sâu bệnh

+ Kháng thuốc diệt cỏ

+ Kháng mọt sau thu hoạch

+ Chín sớm

- Cà chua chuyển gen:

+ Kéo dài thời gian chin, làm chậm quá trình nhũn quả, kéo dài thời gian bảo quãn

+ Kháng virus CMV

- Giống lúa được chuyển gen tổng hợp β-caroten.

IV TẠO GIỐNG CÂY SẠCH VIRUS

1 Tầm quan trọng

- Hầu hết các cây trồng đều bị nhiễm các hệ thống gây bệnh như nấm, virus, vi khuẩn, mycoplasma và nematodes Đối với bệnh về virus ở cây, người ta chưa thể sản xuất ra các hợp chất thương mại diệt virus.

- Phương pháp hiệu quả nhất hiện nay là tạo ra các vật liệu nhân giống sạch bệnh virus qua nuôi cấy đỉnh chồi, đỉnh sinh trưởng hoặc kết hợp với xử lý hoá chất, nhiệt độ Những phương pháp này đã giúp loại trừ các bệnh virus khác nhau khỏi

vật liệu nhân giống và tạo giống sạch bệnh ở một loạt cây trồng, chủ yếu là khoai tây, khoai lang, sắn, tỏi, cây ăn quả có múi, chuối, nho, mơ, mận, cây hoa như cúc, cẩm chướng

2. Cơ sở khoa học

- Làm sạch virus là việc phải giải phóng các thực vật bị nhiễm virus khỏi virus.

3 Tạo giống cây sạch virus

3.1 Các phương pháp tạo cây sạch virus

Theo Pierik (1987) có 5 phương pháp tạo cây sạch virus:

- Xử lý nhiệt

- Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (ĐST)

- Xử lý nhiệt sau đó nuôi ĐST

- Tạo chồi bất định kết hợp với nuôi cấy ĐST

- Ghép ĐST lên cây sạch virus

Khi nghi ngờ cây bị nhiễm virus cần thực hiện các bước sau:

- Xác định virus

- Thực hiện các biện pháp loại trừ virus

- Tiến hành thí nghiệm xác định cây nghi ngờ có nhiễm virus hay không

- Ngăn chặn bất kì sự tái nhiễm nào

a Xử lí nhiệt

Xử lí nhiệt là một cách hiệu quả nhằm bất hoạt một số virus Đôi khi xử lí nhiệt không hiệu quả do cây quá mẫn cảm với nhiệt độ hay virus không bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ với lí do chưa được xác định Cần xét đến nhiệt độ và thời gian xử lí, đảm bảo cây (chồi, cảnh) sống sót trong khi virus bị bất hoạt

Phương pháp này được áp dụng và mang lại kết quả tốt chống lại virus và mycoplasma hiệu quả ở cây ăn quả, mía, sắn dây và khoai mì

Ở cây thân gỗ, chỉ xử lí nhiệt chồi bên rồi ghép với cây con (cây từ hạt được vô mẫu) Thời gian xử lí nhiệt dao động từ 20 – 40 ngày với nhiệt độ cố định hay thay đổi từ 37 – 380C

Quá trình sinh trưởng của thực vật trong khi xử lí nhiệt cũng bị ức chế nhưng ít hơn vì thế những bộ phận vừa được sinh trưởng thường sạch hoặc nghèo virus Thực vật có thể được bảo tồn ở trạng thái tối thích trong một thời gian dài ở nhiệt

độ cao Tốt nhất là nên xử lí với chu kỳ quang 16 giờ/ngày Nhiệt độ phải được kiểm tra liên tục bằng máy ghi tự động để đảm bảo cung cấp lượng nhiệt năng cần thiết, độ ẩm tương đối phải đạt trung bình là 50% Để đảm bảo sự phân bố nhiệt

độ đồng đều trong phòng cần phải có quạt gió

Mỗi một loài cây hoa thường mẫn cảm rất khác nhau đối với nhiệt độ cao trong khi xử lí, ví dụ: hoa cúc có khả năng chịu đựng nhiệt rất lớn: 38oC trong thời gian nửa năm tiếp theo là hoa anh túc Hoa thủy tiên thì chịu được nhiệt độ 34 oC trong thời gian từ 4-6 tuần

Trong một số trường hợp, người ta phải phối hợp xử lí nhiệt với nuôi cấy đỉnh sinh trưởng hoặc vi ghép để loại trừ bệnh virus (Walkey, 1980; Kartha, 1986; Brown và cs, 1988) Ưu thế của kỹ thuật này là sau khi cây đã qua xử lý nhiệt, mẫu nuôi cấy (hoặc vi ghép) thường có kích thước lớn hơn Green và Lo (1989)

đã tạo giống khoai lang sạch bệnh virus (bệnh vàng lụi) bằng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng kích thước nhỏ (0,3 mm) hoặc nuôi cấy đỉnh chồi kích thước lớn hơn (1,0 -2,5 cm) sau khi xử lí cây mẹ ở 370C trong một đến hai tháng Kết quả tương tự cũng nhận được ở cây sắn (Kartha và Gambong, 1975)

Cây mẹ hoặc một phần cây mẹ được xử lí ở nhiệt độ cao bằng cách tăng nhiệt một cách từ từ cho đến khi đạt nhiệt độ tới hạn Nhiệt độ này có thể ức chế hoặc loại trừ virus khỏi vùng sinh trưởng mạnh nhưng không ảnh hưởng đến sinh trưởng của cây Cây được lưu giữ ở nhiệt độ tới hạn trong khoảng thời gian xác định, sau đó tách và nuôi cấy chồi đỉnh hoặc sử dụng trong vi ghép

b Nuôi cấy mô phân sinh đỉnh (MPS đỉnh)

Ở thực vật, sự hình thành các cơ quan bắt đầu trong các MPS đỉnh, các mô này phân hóa ngay từ những giai đoạn phát triển đầu của phôi và giữ lại trong suốt đời sống của cây Mô phân sinh có thể tích tương đối ổn định, nên các tế bào sinh ra

từ tế bào khởi sinh sau một vài lần phân chia sẽ rời khỏi mô phân sinh

Hình: Cấu tạo cơ bản của ĐST

Mô đỉnh sinh trưởng là mô duy nhất sạch virus Do đó đây là một vật liệu nuôi cây

mô tế bào được sử dụng trong tạo giống cây sạch bệnh Do kích thước quá nhỏ

nên kỹ thuật nuôi cấy mô đỉnh sinh trưởng thường được tiến hành dưới kính lúp hay bao gồm cả chồi đỉnh Virus phân bố không đồng nhất trên cây và thường không thấy chúng ở vùng đỉnh sinh trưởng

Môi trường agar thường không thích hợp cho cây sinh trưởng khi nuôi cấy, chỉ có các “cầu giấy lọc” (filter paper bridge) với phần chân được nhúng trong môi trường lỏng chứa trong ống nghiệm nuôi cấy là thích hợp hơn cả Chỉ trên các cầu giấy lọc như thế rễ mới phát triển tốt, và cây có thể sẵn sàng để đưa ra đất Rất nhiều loại môi trường đã được dùng trong nuôi cấy đỉnh phân sinh nhưng không

có một môi trường chung thích hợp cho mọi loài Môi trường chứa các nguyên tố

đa lượng và vi lượng của Knop và Berthlot (không có beryllium và titanium), glucose 40 g/L, thiamine 10-5g/L và myo-inositol 10-3 g/L ở pH 5,5 có thể được dùng cho nhiều loài NAA ở nồng độ 10-3 mg/L cần thiết cho sự hình thành các rễ ban đầu, nhưng sau đó phải cấy chuyển sang môi trường không có NAA

Có rất ít số liệu về điều kiện chiếu sáng và nhiệt độ lý tưởng, mặc dù trước đây Hollings (1968) đã đưa ra nhiệt độ nuôi là 20 oC dưới ánh sáng đèn huỳnh quang với thời gian chiếu sáng 22 giờ/ngày Thời gian để đỉnh phân sinh tạo chồi và rễ là

từ vài tuần đến vài tháng tùy loài

c Xử lí nhiệt kết hợp nuôi cấy ĐST

Để làm tăng cơ hội thu được cây sạch bệnh trong những trường hợp khó khăn (cây

bị nhiễm bới nhiều loại virus) thì nên xử lí nhiệt trước khi thu ĐST để nuôi cấy Thời gian xử lí nhiệt thay đổi từ 5 – 10 tuần với nhiệt độ 35 – 38oC Phương pháp này đã được sử dụng thành công trên cây khoai tây, cúc, cẩm chướng và dâu tây Phương pháp này có thể loại bỏ virus, vi khuẩn, nấm nhưng không thể loại bỏ được viriod – là RNA trần không có vỏ protein

Hình: Quy trình tạo cây sạch bệnh bằng phương pháp xử lí nhiệt kết hợp với nuôi cấy ĐST

d Tạo chồi bất định kết hợp với nuôi cấy ĐST

Brierley mô tả sự tạo căn hành bất định in vitro từ vảy của Lilium longiflorum Phôi soma hình thánh từ phôi tâm Citrus khi tái sinh thường tạo ra những cây

sạch bệnh Việc tạo cây sạch bệnh từ phương pháp tạo chồi bất định đã được tiến hành thành công ở Lyly và cây dạ lan hương Các mẫu cấy Lyly bị nhiễm virus

được kích thích để tạo thành củ bị cất định in vitro, khi kích thước ĐST của các

chồi mọc từ củ tăng đến 1mm thì được chuyển sang môi trường nuôi cấy khác để ĐST tiếp tục phát triển

Phương pháp tạo chồi bất định được thực hiện theo một hướng khác để thu được cây sạch bệnh ở một số loài như: thuốc lá, bắp cải Ở những cây này, trên lá có những vùng đặc biệt không bị nhiễm virus trong khi toàn cây đã bị nhiễm Những vùng này được cô lập và kích thích để tạo chồi bất định thì sẽ tạo được những cây sạch bệnh

e Vi ghép

Nếu như không cảm ứng được sự tăng trưởng của ĐST hoặc thu hút được chồi từ

nuôi cấy ĐST thì có thể ghép ĐST vào cây con in vitro để nó có thể tăng trưởng.

Phương pháp này rất có ý nghĩ đối với những cây thân gỗ không thể tiến hành nuôi cấy ĐST Phương pháp này lần đầu tiên được tiến hành trên cây thược dược bởi

Morel và Martin Sau đó, được thực hiện thành công trên cây Citrus bởi