CƠ SỞ DI TRUYỀN CHỌN GIỐNG THỰC VẬT part 9 pps

Vùng B có liên quan đến sự tái sinh Vùng C có liên quan đến sự tiếp hợp Vùng D là vùng độc có chứa các gene vir, giữ vai trò quan trọng trong việc chuyển T-DNA vào hệ gene nhân của tế b

Phần lớn các loại Ti-plasmid gồm 4 vùng A, B, C, D

Vùng A luôn luôn được truyền sang tế bào thực vật nên được gọi là

T-DNA (Transferred T-DNA), có chứa 2 hệ gene: Hệ gene gây khối u onc

(oncogeneic), chứa ít nhất 3 gene chịu trách nhiệm tổng hợp các hormone auxin và cytokinin và do đó có liên quan đến việc sản sinh ra và duy trì sự phân chia tế bào liên tục Thứ hai là hệ gene mã hoá cho một số enzyme điều khiển quá trình tổng hợp các dẫn xuất của các acid amine hay đường

gọi là opine Hai loại enzyme đã được nghiên cứu kỹ nhất là octopine

synthetase và nopaline synthetase

Vùng B có liên quan đến sự tái sinh

Vùng C có liên quan đến sự tiếp hợp

Vùng D là vùng độc có chứa các gene vir, giữ vai trò quan trọng trong

việc chuyển T-DNA vào hệ gene nhân của tế bào thực vật

Ngoài ra mỗi Ti-plasmid còn chứa các gene nằm ngoài vùng T-DNA

mã hoá cho các enzyme phân giải ocpine để làm nguồn dinh dưỡng cacbon và nitrogen cho vi khuẩn

2.1.1.2 T-DNA và các trật tự biên 25 bp

Vùng T-DNA có kích thước từ 10 kb đến 20 kb, nằm kẹp giữ hai trật

tự 25 bp lặp lại không hoàn chỉnh gọi là biên trái (left border – LB) và biên phải (right border – RB) Toàn bộ phần giới hạn giữa hai đoạn biên này đều được chuyển sang tế bào thực vật LB và RB là những yếu tố cần thiết để định hướng cho sự chuyển DNA Việc mất đi 6 bp đầu tiên hoặc

10 bp cuối cùng trong số 25 bp đều ngăn cản sự chuyển của T-DNA Quá trình chuyển của T-DNA được bắt đầu từ vị trí RB và kết thúc ở vị trí LB

Sự định hướng này là rất quan trọng nếu không việc chuyển sẽ kém hiệu quả Trong các gene được mã hoá ở vùng T-DNA có 3 gene rất quan trọng trong việc phát triển khối u: một gene mã hoá cho việc chuyển enzyme AMP-isopentonyl transferase và 2 gene mã hoá cho enzyme tham gia vào sinh tổng hợp auxin (tryptophane-2 mono oxygenase và acetamid hydrolase) Sự hoạt động của các gene này tạo điều kiện cho sự phát triển của tế bào thực vật có sự phụ thuộc vào auxin và cytokinin Đặc điểm này được sử dụng để chọn lọc các tế bào được biến nạp từ trong phần lớn các

tế bào không được biến nạp

2.1.1.3 Vùng vir

Chính hoạt động của vùng vir đóng vai trò quan trọng cho việc chuyển

T-DNA sang tế bào thực vật Nó có kích thước khoảng 40 kb và gồm 6 operon: virA, B, D và G là toàn toàn cần thiết cho việc tạo ra độc tính, còn virC và E có liên quan với việc hình thành khối u Trừ virG và A, các operon khác đều là đa cistron Nói chung gene virA biểu hiện ở mọi điều kiện, gene virC biểu hiện thấp ở các tế bào sinh dưỡng nhưng thể hiện rất mạnh ở các dịch chiết từ các mô bị tổn thương Hoạt động của các operon này có liên quan chặt chẽ với sự có mặt của các hợp chất phenol được tiết

ra từ vết thương của cây Từ vết thương của cây thuốc lá người ta đã tinh chiết và xác định được các hợp chất này là acetosyringon và alpha hydroxyacetosyringon

2.1.1.4 Quá trình chuyển T-DNA

Đoạn T-DNA muốn được chuyển, trước tiên nó cần phải được hoạt hoá nhờ hoạt động của các gene vir Hoạt động này xảy ra khi

Agrobacterium bắt đầu tiếp xúc với hợp chất chứa phenol được chiết ra từ

vết thương của cây hoặc từ các tế bào nuôi cấy hoặc protoplast

Đầu tiên là sự hoạt động của các sản phẩm được tạo ra từ gene virA

(protein virA) Protein này nằm ở màng trong của tế bào Agrobacterium,

đóng vai trò như là một chất thụ cảm đối với acetosyringon có trong môi trường Tín hiệu này sẽ được truyền dẫn qua sự hoạt hoá (có lẽ bằng việc phosphoryl hoá) gene virG Protein virG sau đó lại gắn vào gene chỉ huy nằm sát gene khởi động thuộc các gene vir khác Bằng cách như vậy, protein của gene virG đã được hoạt hoá làm tăng quá trình phiên mã của chính nó, đồng thời làm giảm quá trình này của các operon B, C, D và E Trong tiến trình chuyển T-DNA, ở giai đoạn đầu xuất hiện các vết cắt Ti-plasmid tại hai trật tự biên 25 bp, ở vị trí base thứ ba và thứ tư của mạch đơn phía dưới mới được tổng hợp Từ đó, một mạch T-DNA được giải phóng ra khỏi Ti-plasmid và thay vào đó là một mạch đơn mới được tổng hợp theo hướng 5’-3’, bắt đầu từ chỗ đứt của trật tự biên phải Điều này giải thích tại sao trật tự biên phải lại cần thiết cho sự chuyển T-DNA Operon D chủ yếu mã hoá cho một loại endonuclease tạo ra các vết cắt nói trên tại hai trật tự biên Sự hình thành mạch đơn T-DNA được tăng cường nhờ sự tương tác giữa protein virD2 với một hoặc hai protein do gene virC

mã hoá Protein gene vir E2 gắn vào mạch đơn T-DNA sau khi được cắt ra làm cho nó ổn định trong quá trình chuyển vào nhân tế bào thực vật Phức hợp protein-mạch đơn T-DNA là cấu trúc cần thiết cho việc chuyển T-

DNA sang tế bào thực vật và nó phải được sản sinh ra từ Agrobacterium

Gene virB mã hoá cho ít nhất 11 protein để hình thành nên một cầu nối,

cho phức hợp trên chuyển từ Agrobacterium sang tế bào thực vật

Tế bào thực vật bị thương tổn là nơi chuyển gene T-DNA Trong các

mô được sử dung để chuyển gene, lá là nguồn tốt nhất cho tái sinh (Hình 9.4) Những tế bào ở mép lá bắt đầu tái sinh và khi những đĩa lá này được

nuôi cấy trên môi trường chứa Agrobacterium, những tế bào này rất hiệu

quả cho tác nhân chuyển gene Kỹ thuật đĩa lá được sử dụng hiệu quả cho

chuyển gene vào thực vật nhờ sử dụng Ti-plasmid của Agrobacterium

2.1.2 Chuyển nạp gene trực tiếp vào protoplast

Hầu hết các tế bào thực vật được bao bọc bởi thành cellulose nên khó

để hấp thụ các phân tử DNA ngoài vào tế bào Tuy nhiên thành tế bào có thể làm tan nhờ xử lý tế bào với enzyme cellulase (Hình 9.5) Kết quả thu được các protoplast chỉ còn màng sinh chất rất thuận lợi cho các thao tác

thí nghiệm Protoplast có thể hấp thụ các đại phân tử như DNA và chúng

có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh thông qua sự tạo thành callus

Hình 9.4 Tái sinh cây từ đĩa lá nhiễm Agrobacterium

Mặc dầu protoplast đã được sử dụng thành công cho nhiều loài, tuy nhiên hầu hết các cây nông nghiệp quan trọng như ngũ cốc là rất khó tái sinh từ protoplast

Gần đây đã thu được một vài thành công trong sinh trưởng ở lúa và ngô từ protoplast của nuôi cấy tế bào phát sinh phôi Phôi thực vật sinh

trưởng in vitro là nguồn tế bào quan trọng cho nuôi cấy Các cây lúa và

ngô hữu thụ được tạo thành từ những tế bào được thao tác di truyền thu được từ nuôi cấy dịch huyền phù phát sinh phôi

2.1.2 Chuyển nạp DNA ngoại lai vào tế bào bằng xung điện

Tế bào được đặt ở trong một thiết bị có hiệu điện thế cao, xung điện

tạo các lỗ tạm thời (cỡ 30 nm) ở trên màng tế bào và DNA có thể xâm nhập vào chất nguyên sinh Bên cạnh những phương pháp biến nạp, người

ta còn sử dụng các phương pháp vật lý để đưa DNA vào trong tế bào 2.1.3 Chuyển gene bằng phương pháp bắn gene

Hinh 9.5 Tái sinh cây từ protoplast

Đây là phương pháp hiện đang được sử dụng phổ biến tại các phòng thí nghiệm công nghệ sinh học thực vật ở trong nước và trên thế giới Phương pháp này được Sanford (Cornell University, USA) đề xuất lần đầu tiên vào năm 1987 Nguyên tắc của phương pháp này là sử dụng viên đạn

có kích thước hiển vi, tỷ trọng cao đạt gia tốc cao xuyên qua vỏ và màng

tế bào, đưa lớp DNA bọc ngoài tiếp cận với bộ máy di truyền của tế bào

1-1,5 μm được dùng làm vi đạn (microprojectile) Vi đạn được trộn với DNA theo một tỷ lệ thích hợp cùng với các chất phụ gia và sau khi kết tủa DNA bao quang vi đạn, hỗn hợp được làm khô trên một đĩa kim loại mỏng kích thước 0,5-0,8 cm Đĩa kim loại được gắn vào đầu một viên đạn lớn (macroprojectile) vừa khít với nòng súng Thường đạn lớn làm bằng nhựa hoặc bông nén hay các vật liệu nhẹ Khi bắn, áp suất hơi đẩy viên đạn lớn đi với tốc độ cao Ra khỏi đầu nòng, một lưới thép mịn cản viên đạn lớn lại, nhưng các vi đạn vẫn tiếp tục quỹ đạo với gia tốc lớn đến đích và xuyên vào tế bào Một tỷ lệ nhất định DNA ngoại lai hội nhập với DNA tế bào và biểu hiện, thực hiện quá trình biến nạp gene (Hình 9.6)

Hình 9.6 Sơ đồ súng bắn gene 2.1.4 Chuyển nạp DNA ngoại lai vào tế bào bằng kỹ thuật vi tiêm (microinjection)

ông ở khá nhiều đối tượng thực vật (Hình 9.7) Tuy nhiên, kỹ thuật này hiện nay ít được các phòng thí nghiệm sử dụng, vì thao tác vi tiêm dưới kính hiển vi đòi hỏi thiết bị vi thao tác (micromanipulator) cực nhạy, thiết bị kéo và mài kim tiêm từ các ống thủy tinh (puller) rất đắt tiền Ngoài ra, nó còn đòi hỏi kỹ năng thao tác và sự kiên nhẫn cao của kỹ thuật viên

2.2 Biến nạp toàn bộ cơ thể

Ở động vật và thực vật sản phẩm cuối cùng thường không phải là tế bào biến nạp, mà là một cơ thể biến nạp hoàn toàn Phần lớn thực vật được tái sinh dễ dàng bằng nuôi cấy mô tế bào Tuy nhiên có vấn đề với phương pháp tái sinh cây một lá mầm như ngũ cốc và các loại cỏ khác Từ một tế bào biến nạp duy nhất người ta có thể tạo ra một cây chuyển gene, trong

đó mỗi tế bào của nó mang DNA tạo dòng và tiếp tục chuyển cho thế hệ sau, sau khi nở hoa và tạo hạt Tế bào động vật không thể tái sinh từ tế bào nuôi cấy, vì vậy người ta cần một phương pháp khác cho biến nạp động vật Phương pháp tiêu chuẩn ở động vật có vú (ví dụ như chuột) là những trứng đã được thụ tinh được lấy ra từ ống dẫn trứng, DNA được đưa vào bằng phương pháp vi tiêm và tế bào biến nạp sau đó được nuôi cấy trở lại trong bộ phận sinh sản của cơ thể mẹ

2.3 Một số thành tựu của việc tạo các cây trồng biến đổi gene trên thế giới

và ở Việt nam

2.3.1 Một số loài cây trồng chính đã được biến nạp gene thành công Nói chung, hầu hết các loài thực vật đều có thể biến nạp được gene Bảng 9.1 trình bày các loài cây trồng chính đã được biến nạp gene thành công Thông thường hiệu quả biến nạp gene khác nhau tuỳ thuộc vào thừng loại cây trồng và quá trình biến nạp gene vẫn còn bị hạn chế ở nhiều loài Ở đây chỉ minh hoạ các kết quả biến nạp gene thành công ở các giống cây trồng quan trọng

- Cây ngô:

1988) Tuy nhiên, có thể dùng phôi ngô trong nuôi cấy dịch huyền phù phát sinh phôi để tái sinh các cây hữu thụ mang gene biến nạp, sử dụng phương pháp bắn gene và chọn lọc bằng chất diệt cỏ “bialaphos” đã cho kết quả là mô callus phát sinh các phôi được biến nạp gene Các cây biến nạp gene hữu thụ đã được

tái sinh, ổn định di truyền và biểu hiện gene bar

) cùng với hoạt tính chức năng của enzyme phosphinothricin acetyltransferase quan sát được trong những thế hệ sau Hiện nay biến nạp gene ở ngô bằng phương pháp bắn gene đã được sử dụng rộng rãi Gần đây các kết quả biến nạp gene gián tiếp ở ngô nhờ

Agrobacterium cũng đã được thông báo Các thể biến nạp gene của dòng

ngô lai gần (inbredline) A188 đã được tái sinh sau khi nuôi cấy chung (cocultivation) giữa vector “super-binary” với phôi non Tần số được thông báo ở dòng A188 là khoảng 5-30% Các thể lai thế hệ thứ nhất giữa dòng A188 và 5 dòng lai gần khác được biến nạp với tần số khoảng 0,4-5,3% (tính theo số cây biến nạp gene độc lập/phôi)

9.1

TT Loài Phương pháp biến nạp gene Thử nghiệm đồng ruộng

4 Canola Bắn gene/Agrobacterium Chống chịu chất diệt cỏ,

8 Đu đủ Bắn gene/Agrobacterium Kháng virus

9 Đậu phụng Bắn gene/Agrobacterium Kháng virus

10 Bạch dương Bắn gene/Agrobacterium Chống chịu chất diệt cỏ

11 Khoai tây Agrobacterium Kháng côn trùng, virus,

chống chịu chất diệt cỏ

12 Lúa Bắn gene/Agrobacterium Chống chịu chất diệt cỏ

13 Đậu tương Bắn gene/Agrobacterium Chống chịu chất diệt cỏ

nay, hơn 40 giống đã được biến nạp gene thành công Mẫu vật sử dụng là phôi non và các callus có nguồn gốc từ hạt trưởng thành Hygromycin B là marker chọn lọc thường dùng cho lúa Tần số biến nạp có thể cao tới 50% (tính theo số cây biến nạp gene có nguồn gốc độc lập/ số mẫu được bắn

gene) Gần đây, kỹ thuật biến nạp gene ở lúa thông qua Agrobacterium

cũng đã có những cải tiến có hiệu quả tương đương với kỹ thuật bắn gene

- Cây lúa mì: Phương pháp bắn gene cũng được sử dụng để biến nạp gene ở lúa mì DNA ngoại lai được bắn vào trong vảy nhỏ (scutellum) của phôi non của hai giống lúa mùa xuân và một giống lúa mùa đông Các callus chống chịu được chọn lọc bằng phosphinothricin hoặc các nhân tố

ức chế trao đổi chất tương tự như basta, bialaphos hoặc glufosinate ammonium Chọn lọc bằng các hợp chất như thế không hiệu quả lắm và kết quả là một số lớn cây thất thoát Phân tích di truyền và phân tử đã xác nhận sự hợp nhất ổn định của các gene biến nạp Nói chung công nghệ di truyền lúa mì vẫn còn tập trung ở một hoặc hai giống đặc trưng có khả năng tái sinh cây nhanh, thích hợp với phương pháp bắn gene

- Cây lúa mạch: Wan và Lemaux (1994), đã tái sinh một số lượng lớn các cây lúa mạch biến nạp gene độc lập, tự thụ phấn Các phôi hợp tử non, các callus mới hình thành và các phôi có nguồn gốc từ tiểu bào tử hạt phấn

đã được dùng để bắn gene với plasmid mang gene bar gus

lùn vàng ở lúa mạch Kiểm tra khả năng nảy mầm của phôi non để phân

lập các cây biểu hiện hoạt tính bar bằng môi trường chứa bialaphos, mặc

dù đây chưa phải là một chất chỉ thị tốt cho sự có mặt hoặc không của gene

- Cây đậu tương: Những cố gắng đầu tiên của cây đậu tương biến nạp tập trung ở việc tái sinh cây từ protoplast và nuôi cấy dịch huyền phù phát sinh phôi Mặc dù có những thành công ban đầu, tiến triển của công việc này vẫn còn chậm và việc phục hồi các cây biến nạp gene vẫn đang còn gặp nhiều khó khăn Công nghệ biến nạp gene ở đậu tương đã có triển vọng hơn nhờ sự phát triển và tối ưu hoá của kỹ thuật bắn gene Thực tế, đậu tương đã được dùng như một cây mô hình để phát triển kỹ thuật cho nhiều loài cây trồng khó áp dụng công nghệ di truyền Kết quả đầu tiên ở

đậu tương là phục hồi thành công cây biến nạp gene nhờ Agrobacterium

Phương thức này dựa vào sự phát sinh chồi từ lá mầm của giống Peking

chọn lọc cho tính mẫn cảm với Agrobacterium Các mẫu lá mầm được xâm nhiễm với Agrobacterium mang plasmid kháng kanamycin và có hoạt tính gusA, hoặc kháng kanamycin và chống chịu glyphosate Có thể biến

nạp gene hiệu quả vào

dụng nhưng rất khó tái sinh được cây Để biến nạp gene vào các giống đậu tương khác nhau, người ta đã phối hợp hai yếu tố: genotype đơn giản - phương thức tái sinh cây độc lập (dựa trên cơ sở sự tăng sinh c

đạn (particle) có phóng điện để phân phối DNA ngoại lai Hàng trăm cây đậu tương có nguồn gốc độc lập đã thu được và kết quả biến nạp đã cho nhiều phenotype khác nhau Nói chung ở các dòng đậu tương biến nạp gene có nhiều bản sao của các gene biến nạp (số bản sao khoảng từ 1-50 nhưng thường thay đổi từ 2-10) Phân tích DNA (southern blot) ở thế hệ sau của các bản sao gene phức cho thấy tất cả các bản sao cùng tách rời, như thế mỗi thể biến nạp sơ cấp chỉ hiện diện một kết quả biến nạp độc lập

và có thể sự tái tổ hợp thống nhất đã không xuất hiện thường xuyên

Phaseolus thành công rất ít Hai hướng được ứng dụng trong công nghệ di truyền ở đậu tây là kỹ thuật xâm nhiễm bằng Agrobacterium và bắn gene

Tuy nhiên, chỉ có kỹ thuật sau mới có khả năng phục hồi các cây biến nạp

Cây đậu tây biến nạp biểu hiện các gene gusA, bar và protein vỏ của virus

khảm màu vàng đã được phục hồi Các cây biến nạp gene qua năm thế hệ

tự thụ phấn vẫn không mất các gene biến nạp hoặc khả năng biểu hiện Kỹ

thuật bắn gene cũng được sử dụng để biến nạp gene gusA được điều khiển bằng promoter concanavalin A, hoạt tính gus đã biểu hiện trong lá mầm và

vỏ hạt của các cây biến nạp

- Cây bông: Phương thức biến nạp gián tiếp thông qua Agrobacterium tumefaciens là kỹ thuật đầu tiên được sử dụng để biến nạp gene vào cây

bông giống Coker 312 (Umbeck 1987) Cây bông biến nạp gene cũng của giống t

1990) Hầu hết các giống bông có giá trị kinh tế khác không thể tái sinh cây từ giai đoạn callus Một số ít các giống đó có thể tái sinh cây nhưng quá trình này thiên về biến dị dòng vô tính (somaclonal variation) Phương thức phân phối gene ngoại lai trực tiếp vào mô phân sinh của trụ phôi cũng đã được phát triển và đã phục hồi cây biến nạp gene

một số loài tảo lam và vi khuẩn nốt sần sống cộng sinh với các loài họ đậu

(Fabaceae) Dùng kỹ thuật tách gene nif từ các cơ thể cố định đạm chuyển

sang các cây trồng quan trong như lúa, ngô là một mô hình lý tưởng của các nhà tạo giống (Hình 9.8)

Hình 9.8 Mô hình biến nạp gene nif Quá trình cố định đạm thông qua enzyme nitrogenease phải xảy ra trong điều kiện yếm khí nghĩa là không có mặt O2 ở vùng phản ứng Điều kiện này được thực hiên ở các nốt sần của cây họ đậ

1 Đại cương về kỹ thuật RFLP

Kỹ thuật này dựa trên cơ sở đặc hiệu trong việc cắt đoạn DNA của một loại hình enzyme đặc hiệu gọi là enzyme giới hạn Khi sử dụng một hay nhiều enzyme giới hạn, chúng sẽ tìm đúng vị trí đặc hiệu để cắt và cho những đoạn DNA dài ngắn khác nhau Bất kỳ có sự biến đổi nào trong hệ gene (sự đảo gene, đột biến điểm, tăng giảm các cấu trúc lặp ) đều dẫn đến sự thay đổi các điểm cắt và do vậy, khi dùng phương pháp RFLP sẽ cho bản đồ enzyme giới hạn khác biệt Cá thể đã có sự biến đổi di truyền nhất định, hay nói cách khác đã có thể thuộc biến chủng khác

Kỹ thuật RFLP dễ làm, có độ chính xác cao và có thể thực hiện trên DNA của nhiều cá thể trong thời gian ngắn Sau khi xử lý kết quả nhiều lần bằng phương pháp RFLP, mỗi một hệ gene của mỗi cá thể thuần chủng

sẽ cho một bản đồ gene xác định và giống nhau Ngược lại khi bị biến đổi, các cá thể biến chủng sẽ cho bản đồ RFLP khác nhau Độ sai khác càng xa thì sự biến chủng càng lớn Khi độ sai khác cao hơn mức xác định, các cá