Phân tích đa dạng trình tự nucleotit các vùng tương đồng gen kháng ở một số giống lúa Việt Nam

Hiện nay, dân số trên thế giới đ• là hơn 6 tỉ người và vẫn đang tiếp tục tăng, nguồn lương thực chính được sử dụng là lúa gạo. Châu á là nơi trồng và tiêu thụ lúa gạo nhiều nhất với trên 90% tổng sản lượng, trong khi đó, diện tích đất trồng lúa vào khoảng 148 triệu heta chiếm 11% tổng diện tích đất canh tác trên thế giới. Do dân số ngày một tăng mà diện tích đất trồng trọt là có giới hạn nên muốn giải quyết được vấn đề lương thực thì không còn cách nào khác là phải tăng năng suất. Sâu bệnh là một trong những yếu tố cơ bản làm giảm năng suất cây lúa, do đó muốn tăng năng suất thì phải làm giảm sự thiệt hại do sâu bệnh gây ra. Theo ước tính, bệnh đạo ôn làm thiệt hại trên 55 triệu USD mỗi năm tại Nam á và Đông Nam á (Hert,1991), cao hơn tại vùng Đông á và các vùng ôn đới khác. Bệnh bạc lá cũng là một trong nhưng bệnh chính hại lúa ở các nước vùng nhiệt đới châu á trong 3 thập kỉ trở lại đây, ở một số nơi bệnh này làm giảm trên 50% năng suất, mức độ ảnh hưởng của bệnh phụ thuộc vào giai đoạn sinh trưởng, điều kiện thổ nhưỡng và mùa vụ (Kameswara, 2002). Việt Nam nằm ở một vùng được ưu đ•i về địa lý và có một nền nông nghiệp trồng lúa nước truyền thống được phát triển từ lâu đời. Nước ta đang là nước xuất khẩu gạo đứng thứ hai trên thế giới sau Thái Lan với hơn 80% dân số làm nghề nông. Để ngành nông nghiệp đặc biệt là trồng lúa phát triển hơn nữa, Nhà nước ta đ• có nhiều sự đầu tư cho nghiên cứu và áp dụng công nghệ sinh học phục vụ cho nông nghiệp. Đối với lúa ở nước ta bệnh bạc lá và đạo ôn cũng là những bệnh chính gây nhiều thiệt hại. Thiệt hại do bệnh đạo ôn gây ra đối với lúa tại Việt Nam là 15-30% (Vien, 1992). Cho tới nay đ• có biện pháp phòng trừ khá hiệu quả là dùng thuốc trừ sâu hoá học nhưng biện pháp này có nhiều tác động xấu đến con người, hệ vi sinh vật và môi trường. Do đó, việc tìm ra và phát triển những giống lúa có khả năng kháng những bệnh này là mục tiêu của các nhà chọn giống, biện pháp này tỏ ra có hiệu quả kinh tế, không gây ảnh hưởng xấu đến con ngừơi, vi sinh vật có lợi và môi trường.

Mở đầu Hiện nay, dân số trên thế giới đã là hơn 6 tỉ ngời và vẫn đang tiếp tục tăng, nguồn lơng thực chính đợc sử dụng là lúa gạo. Châu á là nơi trồng và tiêu thụ lúa gạo nhiều nhất với trên 90% tổng sản lợng, trong khi đó, diện tích đất trồng lúa vào khoảng 148 triệu heta chiếm 11% tổng diện tích đất canh tác trên thế giới. Do dân số ngày một tăng mà diện tích đất trồng trọt là có giới hạn nên muốn giải quyết đợc vấn đề lơng thực thì không còn cách nào khác là phải tăng năng suất. Sâu bệnh là một trong những yếu tố cơ bản làm giảm năng suất cây lúa, do đó muốn tăng năng suất thì phải làm giảm sự thiệt hại do sâu bệnh gây ra. Theo ớc tính, bệnh đạo ôn làm thiệt hại trên 55 triệu USD mỗi năm tại Nam á và Đông Nam á (Hert,1991), cao hơn tại vùng Đông á và các vùng ôn đới khác. Bệnh bạc lá cũng là một trong nhng bệnh chính hại lúa ở các nớc vùng nhiệt đới châu á trong 3 thập kỉ trở lại đây, ở một số nơi bệnh này làm giảm trên 50% năng suất, mức độ ảnh hởng của bệnh phụ thuộc vào giai đoạn sinh tr- ởng, điều kiện thổ nhỡng và mùa vụ (Kameswara, 2002). Việt Nam nằm ở một vùng đợc u đãi về địa lý và có một nền nông nghiệp trồng lúa nớc truyền thống đợc phát triển từ lâu đời. Nớc ta đang là nớc xuất khẩu gạo đứng thứ hai trên thế giới sau Thái Lan với hơn 80% dân số làm nghề nông. Để ngành nông nghiệp đặc biệt là trồng lúa phát triển hơn nữa, Nhà nớc ta đã có nhiều sự đầu t cho nghiên cứu và áp dụng công nghệ sinh học phục vụ cho nông nghiệp. Đối với lúa ở nớc ta bệnh bạc lá và đạo ôn cũng là những bệnh chính gây nhiều thiệt hại. Thiệt hại do bệnh đạo ôn gây ra đối với lúa tại Việt Nam là 15-30% (Vien, 1992). Cho tới nay đã có biện pháp phòng trừ khá hiệu quả là dùng thuốc trừ sâu hoá học nhng biện pháp này có nhiều tác động xấu đến con ngời, hệ vi sinh vật và môi trờng. Do đó, việc tìm ra và phát triển những giống lúa có khả năng kháng những bệnh này là mục tiêu của các nhà 1 chọn giống, biện pháp này tỏ ra có hiệu quả kinh tế, không gây ảnh hởng xấu đến con ngừơi, vi sinh vật có lợi và môi trờng. Ngời ta đã sử dụng các chỉ thị phân tử để chọn tạo các giống lúa có khả năng kháng một số bệnh trên. Việc sử dụng các chỉ thị phân tử trong công tác chọn tạo ra các giống kháng bệnh đã và đang phất triển ngày càng có hiệu quả lớn. Chính vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài: Phân tích đa dạng trình tự nucleotit các vùng tơng đồng gen kháng ở một số giống lúa Việt Nam nhằm góp một phần vào công tác chọn tao giống lúa ở nớc ta hiện nay. 2 Chơng I : tổng quan tài liệu 1. Sự đa dạng ADN Trên trái đất của chúng ta có rất nhiều sinh vật, chúng tạo nên sự đa dạng và phong phú rất cao. Chính vì sự đa dạng đó mà ngời ta đã xếp sinh vật vào các bậc phân loại khác nhau. ở mức vĩ mô ngời ta chia làm 3 nhánh chính: Động vật, thực vật và vi sinh vật. Trong mỗi nhánh ngời ta lại phân loại theo thang bậc gồm 6 lớp: ngành, lớp, bộ, họ, chi, loài. Thang phân loại này dựa theo tiêu chẩn hình thái, vì vậy nó vẫn cha mô tả đợc hết sự phong phú của thế giới sinh vật nên ngời ta lại phải sử dụng đến các tiêu chuẩn bổ sung để phân loại sinh vật chi tiết hơn nữa nh dới chi, loài .Vì hệ thống phân loại nói trên dựa vào kết quả quan sát đặc điểm hình thái, chính vì vậy mà đã gặp rất nhiều khó khăn khi tiến hành phân loại sâu hơn, trong khi đó sự phân loại dới loài lại đóng vai trò rất quan trọng. Để khắc phục tình trạng này ngời ta phải sử dụng chỉ thị phi hình thái ở dạng phân tử mà một trong số đó là chỉ thị ADN. Khi nói đến sự đa dạng ADN , nghĩa là sự khác nhau ở mức độ phân tử ADN giữa các cá thể trong cùng một loài sống ở trong một vùng địa lý nhất định. Nghiên cứu đa dạng ADN thực chất cũng là phân loại nhng ở mức độ ADN để xác định sự khác biệt hay giống nhau giữa hai cá thể cùng loài, chẳng hạn nh sự giống hay khác nhau giữa các giống lúa trong cùng một loài phụ mà không thể phân biệt đợc qua chỉ thị hình thái (Lã Tuấn Nghĩa, 2004). Nghiên cứu đa dạng ADN đóng vai trò rất quan trọng, thông qua phân tích tính đa dạng ta có thể chọn đợc những cặp bố mẹ lai thích hợp trong chọn tạo giống cây trồng. Chẳng hạn, khi tiến hành chọn cặp lai hoặc chọn dòng ở cây trồng, quan sát đặc điểm hình thái cho thấy chúng rất giống nhau, vì vậy rất khó chọn lọc. Tuy nhiên nếu dùng chỉ thị ADN sẽ giúp chúng ta dễ dàng chọn lọc đợc những cặp lai thích ứng hoặc những dòng mong muốn. Chỉ thị ADN đặc 3 biệt có lợi khi sử dụng để chọn lọc cây trồng có đặc tính khó hoặc không thể quan sát bằng mắt thờng nh khả năng chịu bệnh, chịu rét, chịu mặn, năng suất . 2. Các chỉ thị sinh học và ứng dụng của nó trong nghiên cứu đa dạng di truyền và chọn tạo giống 2.1. Chỉ thị hình thái. Một tính trạng đợc coi là một chỉ thị di truyền nếu nó đợc kiểm soát bởi một locus xác định và không bị ảnh hởng bởi các yếu tố bên ngoài của môi tr- ờng, mặc dù chỉ thị hình thái thờng đợc sử dụng là một chỉ thị trội hoặc đồng trội, song trong nhiều trờng hợp chúng vẫn bị ảnh hởng của các yếu tố khác nh tơng tác gen, nhân tố gen nhẩy và các nhân tố môi trờng . Trong các giai đoạn khác nhau của sự phát triển của cây các đặc điểm hình thái cũng khác nhau nên chúng không đợc xem là đặc trng. Hơn nữa các đặc điểm hình thái cũng không nhiều ở mỗi sinh vật, do đó khả năng ứng dụng của chúng còn nhiều hạn chế. 2.2. Chỉ thị sinh hoá Chỉ thị sinh hoá thờng là loại chỉ thị có bản chất là Protein. Do các gen trong cơ thể qui định cấu trúc của Protein nên nếu ta biết đợc cấu trúc của phân tử Protein thì sẽ suy ra đợc cấu trúc của gen. Các phân tử izozym có trọng lợng phân tử khác nhau sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau trong gel khi điện di. Sau khi nhuộm bằng các thuốc nhuộm đặc trng và quan sát kết quả điện di trên bản gel ta có thể đánh giá đợc sự đa dạng di truyền của sinh vật. Tuy nhiên số lợng kiểu hình isozyme trong thực tế là không nhiều, không phân bố trên toàn bộ gen mà thờng xuyên bị ảnh hởng của yếu tố môi trờng Hơn nữa, isozyme chỉ thể hiện ở một giai đoạn nhất định của quá trình phát triển cơ thể (P. Samee, 1996). 2.3.Chỉ thị phân tử ADN. 4 Hạn chế của việc sử dụng chỉ thị hình thái , chị thị protein là chúng chỉ dùng để nghiên cứu gián tiếp hệ gen của vi sinh vật, do đó ngời ta đã phát triển nhng kĩ thuật dùng ngay ADN làm chỉ thị phân tử . Chỉ thị phân tử bao gồm RFLP, PCR . dùng để phát hiện, phân tích và tổng hợp ra những đoạn ADN (hoặc ARN) đợc sử dụng để lai với ADN của hệ gen cần phân tích .Việc sử dụng chỉ thị ADN đã tạo điều kiện cho các nhà khoa học có thể nghiên cứu trực tiếp hệ gen của sinh vật. Chỉ thị ADN rất phong phú và có tính ổn định cao, hơn nữa chúng ta có thể nghiên cú ở bất kì giai đoạn nào của cá thể. Chỉ thị ADN rất thích hợp cho việc nghiên cứu đa dạng sinh học, lập bản đồ di truyền và chọn tạo giống cây trồng. 2.3.1. Chỉ thị RFLP (Bostein, 1980) RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) nghĩa là đa hình độ dài các mảnh giới hạn. RFLP là một kỹ thuật nhận dạng ADN bằng cách lai axitnucleic. Nguyên tắc của kỹ thuật này là dựa trên sự phân cắt ADN bằng enzym giới hạn và sự lai (liên kết) giữa các bazơ bổ sung trên hai sợi đơn axit nucleic (sợi ADN hoặc mARN). Khi xử lý ADN bằng các enzym giới hạn sẽ thu đợc những mảnh ADN nhỏ hơn có kích thớc khác nhau, những mảnh này sau đó đợc điện di trên gel agaroza 0.8%. Tiếp theo ngời ta chuyển các mảnh ADN lên một màng lai theo nguyên tắc thẩm thấu giữ nguyên vị trí (Southen Bloting), sau đó ngời ta cho mẫu dò có trình tự nucleotit đã biết trớc và đợc đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ hoặc bằng chất hoá học lai với ADN cố định trên màng lai, nếu chúng bổ sung với nhau thì sẽ cho phản ứng lai. Kết quả của phản ứng lai sẽ đợc phát hiện bằng cách nhuộm màu hoặc dùng phóng xạ qua phim X-quang. Dựa vào những băng ADN chúng ta có thể xác định đợc sự đa hình giữa các mẫu ADN khác nhau (Bùi Chí Bửu, 1999). Chỉ thị RFLP đợc ứng dụng để nghiên cứu sự đa dạng di truyền, sự phân hoá trong di truyền huyết thống và lập bản đồ gen: lập bản đồ di truyền trên cây lúa (Mc.Couch và cs, 1988), lập bản đồ gen cho bệnh đạo ôn (Yu và cs, 1991), 5 bệnh bạc lá (Ogawa, 1987; Kinoshita, 1991), bệnh rầy nâu (Lang và cs, 1999), bệnh sâu đục thân (Tan và cs, 1993). 2.3.2. Chỉ thị PCR 1. Khái niệm: PCR (Polimerase Chain Reaction) hay phản ứng chuỗi polimeraza là một quá trình cho phép nhân nhanh các đoạn ADN trong một khoảng thời gian ngắn .Kỹ thuật này do Kary Mullis phát minh năm 1985. Nguyên tắc: Nhờ enzym ADN polymeraza xúc tác, trên các mạch khuôn ADN tổng hợp nên các mạch đơn mới, các mạch đơn vừa đợc tổng hợp lại đợc sử dụng làm khuôn cho quá trình tổng hợp mach mới của chu kì tiếp theo. Sự tổng hợp mạch ADN mới cần có sự tham gia của các đoạn ADN mồi làm xuất hiên những nhóm 3OH tự do,các nucleotit đợc gắn ở vị trí nhóm OH kéo dài tạo thành mạch đơn mới, chiều tông hợp là chiều 5-3. 2. Các bớc tiến hành. Kỹ thuật PCR gồm 3 bớc: a) Giai đoạn biến tính: Giữ nhiệt độ khoảng 94-95 0 C trong 30 đến 1 phút để phá vỡ các liên kết hydro giữa 2 mạch ADN để tạo thành sợi đơn. Nếu đoạn khuôn có tỉ lệ G-C cao, chuỗi G, C liền nhau càng dài thì nhiệt độ biến tính sẽ cao hơn do đó cần tính toán để có nhiệt độ và thời gian phù hợp. b) Giai đoạn gắn mồi: Hạ nhiệt độ xuống khoảng 30- 60 0 C trong 30 đến 1 phút , các mồi sẽ bắt cặp với khuôn . c) Giai đoạn tổng hợp: Giữ nhiệt độ ở 72 0 C là nhiệt độ thích hợp nhất với sự hoạt động của enzym polymeraza, ADN mới sẽ đợc tổng hợp theo chiều 5- 3 bắt đầu từ vị trí gắn mồi. Sau mỗi chu kì, một đoạn ADN đợc nhân lên thành 2, các ADN đợc nhân lên lại đợc sử dụng làm khuôn cho quá trình sau, sau n chu kỳ ta có 2 n đoạn ADN. 6 3. Thành phần phản ứng. a) Khuôn: Khuôn có thể là ADN mạch đơn hoặc mạch kép thậm chí cả ARN. Khuôn đòi hỏi phải có độ tinh sạch cao, nồng độ thích hợp khoảng 50- 100 ng, nếu ít quá thì phản ứng sẽ không thể xảy ra, nếu cao quá thì sẽ hình thành sản phẩm phụ không mong muốn và làm giảm độ nét của các băng ADN. b) Mồi: Là những đoạn oligonucleotit dài khoảng 6-10 nucleotit (mồi ngẫu nhiên) hoặc từ 18-24 nucleoitit (mồi đặc trng). Nồng độ thích hợp là từ 100-500 nM. Nồng độ thấp sẽ không đủ cho phản ứng do đó sẽ không tạo băng ADN hoặc nếu có băng thì nồng độ ADN sẽ rất thấp, ngoài ra cần phải chọn các mồi sao cho không có sự bắt cặp giữa chúng làm giảm hiệu quả phản ứng. c) Enzym Taq: Đợc tách chiết từ vi khuẩn Themus aquticus hay sống ở suối nớc nóng có khả năng chịu nhiệt cao đợc dùng thay cho enzym Klenow tách chiết từ VK E.Coli không chịu đợc nhiệt. Enzym Taq có trọng lợng phân tử (TLPT) 94 kD và nhiệt độ hoạt động tối u là 72 0 C, nếu tăng nhiệt độ lên 95 0 C trong 20 để biến tính ADN sợi kép thành sợi đơn thì hoạt tính enzym còn lại 65% sau 50 chu kì phản ứng. Nồng độ thích hợp là 0,5-2,5 đơn vị. c) MgCl 2 : Ion Mg 2+ có ảnh hởng quan trọng đến phản ứng vì nó ảnh hởng đến sự hoạt động của enzym polymeraza, tạo phức chất tan với dNTP, nồng độ Mg 2+ phụ thuộc vào nồng độ dNTP, pyrophosphat tự do (PPi) và EDTA là những hợp chất liên kết với những ion có trong dung dịch. Nồng độ thích hợp cho phản ứng là từ 0.5-5mM. d) dNTP (deoxynito triphosphat) Gồm 4 loại là: dATP, dCTP, dGTP, dTTP. Nó chính là nguyên liệu để tổng hợp nên các đoạn ADN mới, nồng độ dNTP thờng sử dụng cho mỗi phản ứng là 200àM. Khi tăng nồng độ dNTP lên cao thì nó sẽ liên kết với Mg 2+ ảnh 7 hởng tới phản ứng tổng hợp. Ngoài ra nó còn có tính không bền nhiệt và dễ bị chuyển hoá thành dNDP và dNMP. e) Dung dịch đệm PCR (PCR buffer): Thờng là hỗn hợp của KCl, Tris-HCl và gelatin. Muối KCl góp phần làm tăng hiệu quả phản ứng, Tris-HCl giữ cho pH ổn định, sự thay đổi nhiều nồng độ Tris không ảnh hởng nhiều đến phản ứng PCR. 4.Sơ đồ kỹ thuật PCR: 8 2.3.3. Kü thuËt ®iÖn di a) Nguyªn t¾c: 9 5’ 3’ ( 94 o C- 95 o C ) BiÕn tÝnh ADN 5’ 3’ 3’ 5’ 30 o C- 65 o C G¾n måi vµo sîi ®¬n 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 72 o C Tæng hîp ADN 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ ở pH trung tính, axit nucliec mang điện tích âm nhờ nhóm phophoit nằm trên phosphodieste của các sợi axit nucleic. Do đó chúng sẽ di chuyển về phía điện cực dơng khi đặt chúng vào điện trờng. b) Quá trình điện di: Các mẫu a.nucleic đợc đặt vào gel và đặt trong một điện áp nào đó sau khi đợc nhuộm bằng chất nhuộm. Dựa vào sự di chuyển của chất nhuộm này để dừng quá trình chạy gel. Kết quả đợc nhìn thấy khi soi bản gel dới đèn tử ngoại (UV), các băng ADN màu da cam hiện lên có thể nhìn thấy bằng mắt thờng. Có hai loại gel cơ bản thờng dùng là: Gel agaroza: Là một polysacarit đợc tách chiết từ tảo biển, thờng ở dạng bột, bị nóng chảy khi đun nóng, để nguội sẽ đông lại thành khối. Nó thờng đợc dùng để điện di những mẫu ADN với nồng độ từ 0,5% tới 3%. Gel polyacrylamit: Đợc làm từ polyme hữu cơ, có các lỗ có kích thớc cực nhỏ có khả năng phân giải cao (ở nồng độ 5-6% có thể phân tách đợc những đoạn ADN chỉ hơn kém nhau 1 nucleotit). Do vậy nó có độ phân giải cao hơn gel agaroza. 2.3.4. Các kỹ thuật dựa trên phản ứng chuỗi: a) Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA) Kỹ thuật này đợc William và cs xây dựng năm 1990. Đây là kỹ thuật dựa trên cơ sở của PCR với việc sử dụng các mồi ngẫu nhiên (Random Primer) dài khoảng 10 bp. Trong phản ứng các mồi RAPD gắn ngẫu nhiên vào ADN khuôn ở bất kì vị trí nào mà có trình tự bổ sung với nó. Sản phẩm PCR đợc điện di trong gel agaroza và phát hiện bằng cách nhuộm với dung dịch ethidium bromide, kích thớc sản phẩm có chiều dài 200bp đến 2000 bp (Trần Duy Dơng, 1999). Chỉ thị RAPD thuộc loại chỉ thị di truyền trội. Ngời ta có thể phân biệt hai cá thể thông qua sự có hay vắng mặt của những băng RAPD đặc trng. Phơng 10