Sử dụng 4 cặp mồi khác nhau ta có thể nhân bản 35 đoạn gen có chứa vùng NBS – LRR của 35 giống lúa khác nhau từ ADN tổng số bởi phơng pháp PCR.
Với 2 cặp mồi F11&R16 (ảnh 2) và F11&R18 (ảnh 3), xuất hiện một băng chính có kích thớc khoảng 200 bp và vài băng mờ xấp xỉ khoảng 400- 2500 bp có thể quan sát đợc. Với hai cặp mồi khác là F11&R11 (ảnh 4) và LM637 & LM638 (ảnh 5) cho kết quả trên băng chính cỡ 500 bp. Trong cặp mồi F11&R11 có một băng chính khác cỡ 1000 bp cũng đợc nhân bản (ảnh 4).
Với những băng có kích thớc xấp xỉ 500 bp thì trình tự của chúng tơng đồng với trình tự của các gen N của cây thuốc lá (Nicotin), L6 của cây lanh (Flax) và RPS2 của cây Arabidopsis. Tất cả chúng đều chứa vị trí liên kết nucleotit và các vùng giàu leucin (NBS - LRR). Dựa trên kết quả đó chúng tôi nhận thấy rằng, với hai cặp mồi F11&R11 và LM637 & LM638, chúng mang các băng chính có kích thớc từ 502-517 bp sau phản ứng PCR, chính vì vậy mà các băng này sẽ đợc sử dụng để tách dòng và đọc trình tự.
Tuy nhiên, với hai cặp mồi F11&R16 và LM637 & LM638, cặp mồi F11&R16 không tơng đồng với trình tự NBS- LRR sau khi đọc trình tự và đem so sánh trên BLAST. Trình tự của chúng giả thiết nh là trình tự mã hoá protein hoặc không phải protein. Chỉ duy nhất đoạn băng có trọng lợng phân tử 500 bp của cặp mồi LM637 & LM638 xuất hiện trình tự tơng đồng với trình tự NBS- LRR, vì vậy mà nó đợc sử dụng để nghiên cứu trong đề tài này.
ảnh2. Sản phẩm PCR của 35 giống lúa với cặp mồi F11&R16
M (100 bp ladder); 1 (Nếp cái mùa); 2 (Xuân Dài Tám Thơm); 3 (Dự đột biến); 4 (CL9); 5 (AC); 6 (R527); 7 (DT15); 8 (DT10); 9 (DT11); 10 (DT12); 11 (DT13); 12 (DT14); 13 (DT15); 14 (DT17); 15 (A20); 16 (Dự); 17 (DT23-Nếp); 18 (Sóc Trăng); 19 (CR203); 20 (Tám Thơm đột biến); 21 (ST4); 22 (C71); 23 (Nàng thơm); 24 (DV2); 25 (DT25); 26 (375); 27 (Chân Hải Phòng); 28 (Soan Hà Bắc); 29 (Q5); 30 (Khang Dân); 32 (DT22); 32 (346); 33 (Nếp HoaVàng); 34 (CL8); 35 (DT2001).
ảnh 3. Sản phẩm PCR của 35 giống lúa với cặp mồi F11&R18 M (100 bp ladder); 1 (Nếp cái mùa); 2 (Xuân Dài Tám Thơm); 3 (Dự đột biến); 4 (CL9); 5 (AC); 6 (R527); 7 (DT15); 8 (DT10); 9 (DT11); 10 (DT12); 11 (DT13); 12 (DT14); 13 (DT15); 14 (DT17); 15 (A20); 16 (Dự); 17 (DT23- Nếp); 18 (Sóc Trăng); 19 (CR203); 20 (Tám Thơm đột biến); 21 (ST4); 22 (C71); 23 (Nàng thơm); 24 (DV2); 25 (DT25); 26 (375); 27 (Chân Hải Phòng); 28 (Soan Hà Bắc); 29 (Q5); 30 (Khang Dân); 32 (DT22); 32 (346); 33 (Nếp HoaVàng); 34 (CL8); 35 (DT2001).
ảnh 4. Sản phẩm PCR của 35 giống lúa với cặp mồi F11&R11
M (100 bp ladder); 1 (Nếp cái mùa); 2 (Xuân Dài Tám Thơm); 3 (Dự đột biến); 4 (CL9); 5 (AC); 6 (R527); 7 (DT15); 8 (DT10); 9 (DT11); 10 (DT12); 11 (DT13); 12 (DT14); 13 (DT15); 14 (DT17); 15 (A20); 16 (Dự); 17 (DT23-Nếp); 18 (Sóc Trăng); 19 (CR203); 20 (Tám Thơm đột biến); 21 (ST4); 22 (C71); 23 (Nàng thơm); 24 (DV2); 25 (DT25); 26 (375); 27 (Chân Hải Phòng); 28 (Soan Hà Bắc); 29 (Q5); 30 (Khang Dân); 32 (DT22); 32 (346); 33 (Nếp HoaVàng); 34 (CL8); 35 (DT2001).
ảnh 5. Sản phẩm PCR của 35 giống lúa với cặp mồi LM637 & LM638 M (100 bp ladder); 1 (Nếp cái mùa); 2 (Xuân Dài Tám Thơm); 3 (Dự đột biến); 4 (CL9); 5 (AC); 6 (R527); 7 (DT15); 8 (DT10); 9 (DT11); 10 (DT12); 11 (DT13); 12 (DT14); 13 (DT15); 14 (DT17); 15 (A20); 16 (Dự); 17 (DT23-Nếp); 18 (Sóc Trăng); 19 (CR203); 20 (Tám Thơm đột biến); 21 (ST4); 22 (C71); 23 (Nàng thơm); 24 (DV2); 25 (DT25); 26 (375); 27 (Chân Hải Phòng); 28 (Soan Hà Bắc); 29 (Q5); 30 (Khang Dân); 32 (DT22); 32 (346); 33 (Nếp HoaVàng); 34 (CL8); 35 (DT2001).
Sequences producing significant alignments: Score Value (bits)
gi|7248825|gb|AAF43678.1| NBS-LRR-like protein [Oryza sativ... 342 2e-93 gi| 7489508|pir||T02224 NBS-LRR type resistance protein - ri... 337 6e-92 gi| 21635120|gb|AAM69498.1| NBS-LRR-like resistance protein ... 333 7e-91 gi| 21635148|gb|AAM69504.1| NBS-LRR-like resistance protein ... 333 9e-91 gi| 21635156|gb|AAM69507.1| NBS-LRR-like resistance protein ... 323 5e-88 gi| 21635150|gb|AAM69505.1| NBS-LRR-like resistance protein ... 279 9e-86 gi| 21635144|gb|AAM69503.1| NBS-LRR-like resistance protein ... 270 2e-85 gi| 21635169|gb|AAM69510.1| NBS-LRR-like resistance protein ... 291 1e-80 gi| 21635112|gb|AAM69496.1| NBS-LRR-like resistance protein ... 275 2e-73 gi| 21635117|gb|AAM69497.1| NBS-LRR-like resistance protein ... 241 3e-70 gi| 29837761|gb|AAP05797.1| putative disease resistance comp... 189 1e-47 gi| 7489510|pir||T02227 NBS-LRR type resistance protein - ri... 139 2e-32 gi| 7489511|pir||T02228 NBS-LRR type resistance protein - ri... 137 6e-32 gi| 20146399|dbj|BAB89180.1| disease resistance protein -lik... 125 4e-28 gi| 28371840|gb|AAO38218.1| RCa7 [Manihot esculenta] 122 2e-27 gi| 7248755|gb|AAF43652.1| NBS-LRR-like protein [Oryza sativ... 120 1e-26 gi| 22947589|gb|AAN08158.1| putative citrus disease resistan... 119 2e-26 gi| 7248746|gb|AAF43648.1| NBS-LRR-like protein [Oryza sativ... 119 3e-26 gi| 30408013|gb|AAP30051.1| RCa6.1 NBS type resistance prote... 119 3e-26 gi| 22652524|gb|AAN03738.1|AF456243_1 NBS-LRR-like protein [... 119 3e-26 gi| 15487848|gb|AAL00974.1|AF402698_1 NBS/LRR resistance pro... 119 3e-26 gi| 28371838|gb|AAO38217.1| RCa6 [Manihot esculenta]… 118 3e-26 gi| 15487967|gb|AAL01029.1|AF402762_1 NBS/LRR resistance pro... 117 6e-26 gi| 7489501|pir||T02213 NBS-LRR type resistance protein - ri... 117 6e-26 gi| 15487913|gb|AAL01003.1|AF402734_1 NBS/LRR resistance pro... 117 3e-26 gi|7248773|gb|AAF43661.1| NBS-LRR-like protein [Oryza sativ... 117 e-26 gi| 15487852|gb|AAL00976.1|AF402700_1 NBS/LRR resistance pro... 117 8e-26 gi| 15487973|gb|AAL01032.1|AF402765_1 NBS/LRR resistance pro... 117 8e-26 gi| 22652532|gb|AAN03742.1|AF456247_1 NBS-LRR-like protein [... 117 8e-26 gi| 7489401|pir||T04394 NBS-LRR type resistance protein - ba... 115 2e-25 gi| 7248781|gb|AAF43665.1| NBS-LRR-like protein [Oryza sativ... 115 2e-25 gi| 27463527|gb|AAO15846.1| resistance protein KR4 [Glycine ... 115 2e-25 gi| 16933577|gb|AAL30114.1| resistance gene analog [Solanum ... 115 2e-25 gi| 28300299|gb|AAO37645.1| NBS-LRR resistance protein RGH1 ... 115 3e-25
Hình 4: Trình tự sau khi so sánh trên chơng trình BLAST