Lên men Acid citric

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HỒ CHÍ MINH KHOA CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM MƠN HỌC: VI SINH VẬT HỌC THỰC PHẨM GVHD: Liêu Mỹ Đơng Đề tài: Cơng nghệ lên men Acid Citric Nhóm: 5 Nguyễn Đình Trung Hiếu Huỳnh Tấn Thành Lâm Thục Trinh Đặng Thị Kim Ngân Nguyễn Thị Thanh Trúc I Acid Citric Giới thiệu  Axít citric axít hữu thuộc loại yếu thường tìm thấy loại trái thuộc họ cam qt Nó chất bảo quản thực phẩm tự nhiên thường thêm vào thức ăn đồ uống để làm vị chua Ở lĩnh vực hóa sinh axít citric đóng vai trò trung gian vơ quan trọng chu trình axít citric q trình trao đổi chất xảy tất vật thể sống  Ngoài axít citric đóng vai trò chất tẩy rửa, an tồn mơi trường đồng thời tác nhân chống oxy hóa  Axít citric có mặt nhiều loại trái rau trái chanh hàm lượng tìm thấy nhiều nhất, theo ước tính axít citric chiếm khoảng 8% khối lượng khô trái chanh Tổng quát - Tên theo IUPAC: Axit 2-hydroxypropan-1,2,3-tricacboxylic - Tên thông thường: Axit chanh - Công thức phân tử: C6H8O7 - Khối lượng phân tử: 192.13 g/mol - Có dạng: tinh thể màu trắng - Nhiệt độ nóng chảy: 153oC -Nhiệt độ sơi: 175oC (phân hủy) Tính chất  Tính axít axit citric ảnh hưởng nhóm carboxyl -COOH, nhóm carboxyl cho proton để tạo thành ion citrat Các muối citrat dùng làm dung dịch đệm tốt để hạn chế thay đổi pH dung dịch axít  Các ion citrat kết hợp với ion kim loại để tạo thành muối, phổ biến muối canxi citrat dùng làm chất bảo quản giữ vị cho thực phẩm Bên cạnh ion citrat kết hợp với ion kim loại tạo thành phức dùng làm chất bảo quản làm mềm nước  Ở nhiệt độ phòng axít citric tồn dạng tinh thể màu trắng dạng bột dạng khan dạng monohydrat có chứa phân tử nước phân tử axít citric Dạng khan thu axít citric kết tinh nước nóng, trái lại dạng monohydrat lại kết tinh nước lạnh Ở nhiệt độ 74oC dạng monohydrat chuyển sang dạng khan  Về mặt hóa học axít citric có tính chất tương tự axít carboxylic khác Khi nhiệt độ 175oC phân hủy tạo thành CO2 nước Yêu cầu nguyên liệu lên men acid citric: + Nguyên liệu phải đảm bảo đủ lượng đường cho vi sinh vật phát triển + Giống vi sinh vật dùng sản xuất acid citric phải đảm bảo yêu cầu sau: - Có khả tạo acid mạnh - Có khả chịu môi trường acid lượng acid citric tăng cao - Ít tạo acid hữu khác như: acid oxalic, acid gluconic, acid fumaric Một số nguyên liệu gluxit a) Mật rỉ - Mật rỉ phụ phẩm ngành sản xuất đường, sản phẩm cuối trình sản xuất đường mà từ đường khơng kết tinh cách kinh tế công nghệ thông thường Thành phần mật rỉ đường, chủ yếu sucroza với glucoza fructoza - Mật rỉ thành phần hóa học chủ yếu đường vi sinh vật trực tiếp sử dụng đường để tạo thành acid citric, mặt khác mật rỉ nguyên liệu rẻ tiền dễ kiếm mật rỉ nguyên liệu sử dụng nhiều việc sản xuất acid citric, nhiên cần xử lí mật rỉ trước sử dụng mật rỉ chứa chất màu, hệ keo, đặc biệt kim loại nặng ảnh hưởng đến trình lên men, ức chế vi sinh vật phát triển b) Tinh bột Sản xuất acid citric nguồn chất tinh bột ngơ, lúa mì, khoai tây,… tương đối phổ biến Nguồn chất có độ tinh khiết phương thức thủy giải phù hợp cho việc sản xuất acid citric II Aspergillus niger  Aspergillus niger loại nấm sợi loài phổ biến chi Aspergillus có nhiều ứng dụng cơng nghệ sinh học, nhiệt độ tối ưu 35-37 ° C, pH từ 1,4 đến 9,8 Nó gây bệnh gọi nấm mốc đen số loại trái rau nho, hành tây, đậu phộng, chất gây ô nhiễm phổ biến thực phẩm  A.niger vi sinh vật hiếu khí phát triển chất hữu cơ, tìm thấy gần khắp nơi mơi trường có chứa đất III IV Ngồi ra, tìm thấy chất thải, ngun liệu thực vật phân hủy phân hữu môi trường ngồi trời Mơi trường ẩm nhà tạo môi trường sống tốt cho phát triển nấm mốc Chẳng hạn lĩnh vực hộ gia đình thơng thường, tường phòng tắm khu vực khác có mositure Các yếu tố ảnh hưởng Môi trường dinh dưỡng pH môi trường Sự thống khí Nhiệt độ Các phương pháp lên men acid citric Phương pháp lên men bề mặt (lên men nổi) Phương pháp lên men bề mặt ứng dụng nhiều vào năm đầu kỷ XX, theo vi sinh vật phát triển hẳn bề mặt mơi trường nằm pha rắn pha khí nằm pha lỏng pha khí Như vậy, phương pháp lên men bề mặt sử dụng hai loại môi trường: môi trường bán rắn (môi trường xốp) môi trường lỏng a) Lên men bề mặt với mơi trường bán rắn Phương pháp áp dụng hiệu suất thu khơng cao phức tạp khâu chiết, tách acid citric Trước người ta dùng mơi trường cám mì, cám gạo có trộn khoảng 15 – 25% trấu để tăng độ xốp mơi trường Ngồi ra, số sở người ta dùng mơi trường khác từ sắn, khoai tây, bắp,… Môi trường làm nguyên liệu phải nghiền nhỏ đến kích thước vừa phải Sau nghiền xong mơi trường phải làm ấm đến độ ẩm khoảng 60 – 65% đem hấp trùng nóng Môi trường làm xong phải làm nguội chuẩn bị cho q trình ni cấy Trước ta phải chuẩn bị giống Q trình gọi giai đoạn thu nhận bào tử giống Phương pháp thu nhận bào tử giống: Có phương pháp thu nhận:  Phương pháp thứ nhất: Chuẩn bị – bình tam giác dung tích 150 ml, cho vào khoảng 50g cám để có độ ẩm 60% Hấp trùng để nguội Từ ống giống Aspergillus niger gốc, ta chuyển toàn khuẩn lạc cách cho vào ống nghiệm 10ml nước vô trùng, khuấy cho bào tử giống ống nghiệm hòa trộn nước Bằng phương pháp vơ trùng chuyển tồn sang bình tam giác chuẩn bị môi trường sẵn Lắc cho môi trường trộn bào tử Nuôi chúng tủ ấm có nhiệt độ 30 - 37C Ni thời gian ngày Khi thấy bình tam giác toàn bào tử màu đen kết thúc giai đoạn ni cấy Tiếp đó, mơi trường chuẩn bị vào khai nhôm inox Tải cho 10% mơi trường giống từ bình tam giác nuôi vào Chiều dày khối trộn khoản từ – 5cm Để phòng có nhiệt độ ổn định 32C Nuôi khoảng – ngày bào tử màu đen xuất kín bề mặt môi trường, đem sấy nhiệt độ < 40C ta thu giống bào tử sẵn sàng cho trình sản xuất đại trà  Phương pháp thứ hai: Người ta nuôi môi trường lỏng giống Aspergillus niger Mơi trường để thu nhận bào tử có thành phần sau: Dung dịch nước malt có nồng độ chất khô – 5% NH4Cl: 0,25g KH2PO4: 1,25g MgSO4: 0.25g FeSO4: 0,0125g Môi trường chuẩn bị xong đưa vào bình có dung tích – lít với chiều cao dung dịch bình 1cm, đem hấp trùng 1at 30 phút Sau chuyển giống từ ống nghiệm giống vào Tiến hành nuôi nhiệt độ 32C thời gian ngày lâu bề mặt xuất váng nấm sợi, lúc đầu màu trắng sau đen chứa tồn bào tử Người ta thu bào tử đem sấy nhiệt độ < 40C dùng bào tử giống cấp Để sản xuất bào tử giống cấp 2, 3, người ta thực q trình ni nấm sợi khay trình bày Cách thực trình lên men bề mặt: Trộn cám với nước theo tỉ lệ 1:1 Hấp trùng 1at 30 phút tãi khay, sau làm nguội trộn giống với tỉ lệ 0,3 – 0,5% Chiều dày khối cám cộng bào tử giống khoảng – 5cm Tiến hành nuôi nhiệt độ ổn định 30 - 32C – ngày Thời gian lên men kết thúc bào tử nấm sợi bắt đầu xuất nhiều chưa hoàn tồn chuyển qua màu đen Phương pháp ni cấy bề mặt để thu nhận acid citric môi trường basb rắn khơng áp dụng nước châu Âu Tuy nhiên, nhiều nước phương pháp áp dụng thay cám bột khoai mì Cứ – 4kg bột khoai mì người ta thu 1kg acid citric b) Lên men bề mặt với môi trường lỏng: Thông thường người ta thay đường saccharose mật rỉ Mật rỉ xử lí trước làm mơi trường Xử lí mật rỉ gồm vấn đề cần giải quyết: - Xử lí màu - Xử lí hệ keo có mật rỉ - Xử lí sắt mật rỉ chứa sắt Mật rỉ đường cần phải xử lí màu hệ keo cách cho dịch qua than hoạt tính để hấp phụ pha loãng để điều chỉnh hệ keo dịch mật rỉ Nếu mật rỉ có Fe3+người ta cho vào mật rỉ sau pha loãng K4(Fe(CN)6) Tiếp theo ta hiệu chỉnh hàm lượng đường pH để thuận lợi cho trình lên men Hàm lượng đường đưỡ hiệu chỉnh hàm lượng từ 14 – 15% khối lượng Ngồi để q trình lên men thuận lợi cho vi sinh vật người ta bổ sung MgSO4, NH4NO3, KH2PO4 điều chỉnh pH từ 2,2 – tùy thuộc vào thành phần chất bổ sung mà điều chỉnh pH cho hợp lí Q trình chuẩn bị giống trình bày mục Mơi trường lên men phải lọc kỹ trùng, làm nguội, phân phối vào khay, nuôi nhiệt độ 28- 32C thời gian từ 48 – 72h Quá trình lên men bề mặt dịch lỏng nhờ lớp váng dày khuẩn lạc nấm Aspergillus niger Acid citric thẩm thấu qua màng tế bào vào môi trường Kết thúc trình lên men, người ta lấy phần dịch lên men đem lọc để thu acid citric tiếp tục lên men mẻ Phương pháp lên men chìm Phương pháp dùng cho vi sinh vật kỵ khí hiếu khí Đối với ni vi sinh vật kị khí ni khơng cần sục khí khuấy trộn với vi sinh vật hiếu khí phải sục khí liên tục Ni cấy chìm hay nuôi cấy bề sâu dùng môi trường dinh dưỡng lỏng (dịch thể) Chủng vi sinh vật gieo cấy vào môi trường phân tán khắp điểm chung quanh bề mặt tế bào tiếp xúc với dịch dinh dưỡng  Đòi hỏi suốt q trình ni cấy phải khuấy cung cấp oxy cách sục khí liên tục Ni cấy chìm dùng phổ biến cơng nghệ vi sinh để sản xuất men bánh mì, protein đơn bào từ nấm men, phế phẩm vi sinh làm phân bón cố định đạm, làm thuốc trừ sâu, enzyme, acid amin, vitamin, chất kháng sinh, chất kích thích sinh học v.v… Do hệ thống khuấy trộn tốt nên tồn mơi trường ni cấy hệ thống Phương pháp ni cấy chìm có số ưu điểm:  Tốn mặt xây dựng lắp đặt dây chuyền  Chi phí điện năng, nhân lực khoảng phụ cho đơn vị sản phẩm thấp  Dễ tổ chức xí nghiệp có sản lượng lớn  Các thiết bị lên men chìm dễ khí hóa, tự động hóa cho tồn q trình Song phương pháp chìm có số nhược điểm sau:  Đòi hỏi trang thiết bị cao, dễ bị nhiễm trùng toàn  Thiết bị lên men chìm cần phải chế tạo đặc biệt cẩn thận, chịu áp lực cao, đòi hỏi kín làm việc với điều kiện vơ trùng tuyệt đối (trong ni cấy bề mặt loại bỏ phần nhiễm trùng, phần khác dùng được)  Trong lên men chìm cần phải khuấy sục khí liên tục VSV sử dụng oxy hòa tan mơi trường ni cấy Khí nén qua hệ thống lọc tạp trùng, hệ thống tương đối phức tạp dễ gây nhiễm cho môi trường nuôi cấy So với phương pháp lên men bề mặt lên men chìm có nhiều ưu điểm là: chốn bề mặt (khơng nhiều diện tích), dễ giới hóa tự động hóa trình theo dõi Tuy nhiên phương pháp lên men chìm đòi hỏi đầu tư nhiều kinh phí cho trang thiết bị Ngoài ra, mẻ lên men, lý bị xử lý xử lý cục được, đa phần phải hủy bỏ trình lên men, gây tốn lớn Phế liệu trình lên men thải phải kèm theo công nghệ xử lý chống ô nhiễm mơi trường QUY TRÌNH SẢN XUẤT ACID CITRIC THEO PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN CHÌM Chuẩn bị dịch lên men: - Cơ chất sử dụng là: rỉ đường siro glucose - Rỉ đường 40 Brix với 52-57% đường, nguồn cacbon rẻ tiền, sử dụng phổ biến công nghệ vi sinh Cần phải xử lý rỉ đường trước sử dụng Có thể xử lý sau:  Xử lý acid H2SO4  pH (10% dung dịch đường) chỉnh cách cho acid H2SO4 0,1N vào  Để 1,5 tới cho ly tâm với dung dịch 3000 vòng/15 phút  Thu hồi dịch sử dụng  Xử lý dung dịch Ca3(PO4)2:  pH (10% dung dịch đường) chỉnh tới việc cho dung dịch NaOH 0,1N vào  Sau đó, cho Ca3(PO4)2 theo tỉ lệ 2% (w/v) đun 105 phút  Hỗn hợp làm lạnh ly tâm 3000 vòng/15 phút  Thu hồi sử dụng dịch - Trước hết phải sử dụng cao áp để tiệt trùng thiết bị đường ống - Rỉ đường pha thành loại nồng độ: nồng độ 3-4% để nuôi cấy nấm mốc giống lên men ban đầu Nồng độ 25-28% để bổ sung trình lên men - Để pha chế dịch lên men, dùng nước vô trùng trộn với dung dịch muối dinh dưỡng rỉ đường khuấy - Môi trường 3-4% pha chế thiết bị nuôi cấy - Môi trường tiệt trùng theo mẻ 121C 15-30 phút Nuôi cấy nấm mốc (nuôi cấy phòng thí nghiệm nhân giống sản xuất): - Việc tiếp giống thông thường thực điều kiện vô trùng cách chuyển bào từ từ giống gốc sang môi trường agar (trong khay suông: 75mm, đĩa petri, ống nghiệm) - Sau 3-6 ngày nuôi cấy 30C bào tử thu hoạch nuôi cấy môi trường tinh bột để tạo khoảng 1011 bào tử cho cm3 môi trường - Sinh khối truyền trực tiếp vào nồi lên men dung tích 10 - 20 m để tạo giống hạt chứa - 5.105 hạt cho lít mơi trường Mỗi hạt có đường kính 0,1-0,2mm - Giống tiếp sang môi trường lên men công nghiệp với nồng độ 510% (v/v) - Sau đó, mở cánh khuấy cung cấp khí vơ trùng (nạp khí đảo trộn suốt trình nhân giống) Lên men: - Trong trình lên men, lượng đường giảm nhanh để bù lại dùng dung dịch rỉ có nồng độ: 25-28% để bổ sung gián đoạn vào thiết bị lên men - Quá trình lên men sản sinh nhiệt cần thiết phải đảm bảo nhiệt độ lên men 28-35C thiết bị làm lạnh Nếu hệ số truyền nhiệt chung vào khoảng 500kJ/m2/h chênh lệch nhiệt độ thực tế dịch lên men dung dịch làm lạnh 5C, diện tích trao đổi nhiệt cần để đảm bảo ổn định nhiệt độ 3,2 m2 cho 1m3 dịch lên men không 1m - Cung cấp oxi cách bơm 0,1-0,4 thể tích hỗn hợp khí cho đơn vị thể tích dịch phút (v.v-1min-1) - Điều chỉnh pH áp suất phù hợp - Quá trình tạo bọt khống chế cách bổ sung chất phá bọt phù hợp - Gián đoạn thời việc cung cấp khơng khí khơng ảnh hưởng nhiều tới q trình nồng độ O hòa tan lớn 20% nồng độ bão hòa Nếu lượng oxi hòa tan dừng mức gần 85 phút, sau việc cấp khí khơi phục lại bình thường, sinh trưởng tổng hợp acid citric khơng mà hẳn, nhiên sản lượng acid citric đạt giảm 20% - Thời gian lên men kéo dài từ 5-10 ngày tùy vào hoạt lực nấm - Nếu kiểm tra mẫu cách 4-6 mà độ acid coi kết thúc trình lên men Thu hồi tinh chế acid ctric: - Có phương pháp thu hồi acid citric:  Kết tinh trực tiếp cô đặc dịch lọc  Kết tủa dạng tetrahydrate citrat canxi  Phương pháp chiết pha lỏng Tuy nhiên, phổ biến kết tủa citric Tách nấm mốc: - Khi kết thúc q trình lên men đun nóng dịch lên men 60-65C chuyển vào thùng trung gian để tách nấm mốc - Nấm mốc thiết bị không tan lọc cách sử dụng hệ thống lọc băng liên tục Tạo canxi citrate: - Dung dịch lên men hỗn hợp gồm: acid citric, acid gluconic, acid oxalic, đường không lên men hợp chất khoáng - Dịch lọc cho vào thiết bị trung hòa đun sơi Sau mở cánh khuấy cho Ca(OH)2 vào để trung hòa Q trình trung hòa kết thúc pH = 6,8-7,5 - Khi trung hòa tạo thành: C6H8O7 + 3Ca(OH)2  Ca3(C6H5O7)2 + 6H2O Acid citric Canxi citrate 2C6H12O7 + Ca(OH)2  Ca(C6H11O7)2 + 2H2O Acid glucomic Canxi gluconat C2H2O4 + Ca(OH)2  CaC2O4 + 2H2O Acidoxalic Canxioxalate - Dựa vào độ tan khác nhau, tách được: canxi citrat tan nước sôi không tan nước lạnh; oxalat canxi không tan nhiệt độ - Dùng thiết bị lọc chân không tách chất kết tủa canxi citrat canxi oxalat đem sấy khô Trước sấy cần rửa kết tủa để loại bỏ tạp chất bám theo: đường, protein thủy phân từ sinh khối nấm Tách riêng canxi citrat tạo acid citric: - Cho tinh thể acid sulfuric 98% chuyển (nhưng riêng biệt) vào thiết bị tách có cánh khuấy, ống phun thoát - Đầu tiên cho nước vào thiết bị 0,25 - 0,5 m 3/tấn acid citric chứa citrat, mở cánh khuấy cho tinh thể vào - Sau đun nóng lên 60C cho H2SO4 98% vào với 0,425l H2SO4/1kg acid citric có citrat Khuấy đun sôi 10-15 phút Để làm acid citric dùng than hoạt tính với lượng 2% so với lượng acid citric citrat Ca3(C6H5O7)2 + 3H2SO4  2C6H8O7 + 3CaSO4 - Để tách canxi oxalate có mặt acid citric, ta sử dụng lượng dư acid sunfuric, canxi oxalate kết tủa với CaSO4 tạo thành, dung dịch acid citric - Để tách riêng acid citric khỏi thạch cao (CaSO 4) hợp chất sunfua kim loại nặng (loại khống) canxi oxalat sót lại, ta chuyển hỗn hợp vào lọc chân không Sấy dung dịch acid citric: - Dung dịch sau lọc chứa ( 250-280 kg/m3 acid citric khan) cô đặc tới nồng độ 700 kg/m3 - Chuyển vào hệ thống sấy chân không  Giai đoạn đầu sấy đến tỷ trọng 1,24-1,26  Giai đoạn sau sấy đến tỷ trọng 1,32-1,36 tuong ứng nồng độ 80% Kết tinh sấy khô acid citric: - Khi nhiệt độ dung dịch 35-37C cho kết tinh (tinh thể acid citric) vào để kết tinh tiếp tục làm nguội 8-10C, cho khuấy liên tục 30 phút - Sau đó, cho qua thiết bị ly tâm để tách tinh thể - Tinh thể acid citric làm khô hệ thống sấy tầng sôi giai đoạn:  Giai đoạn đầu sử dụng khí nóng 90C  Giai đoạn sau sử dụng khí 20C với độ ẩm 30-40% tinh thể tạo háo nước - Khoảng 20% dịch gốc hòa loãng vào nước rửa thiết bị, loại màu chuyển ngược bước xử lý Ca(OH)2 - Phần lại dịch gốc loại màu, loại khoáng quay phận kết tinh - Tinh thể acid citric thu đem đóng gói Đóng gói, bảo quản: - Tinh thể khan acid citric dạng hạt, bột - Sản phẩm bảo quản thùng cứng, tránh nơi ẩm thấp - Vật liệu để chứa, ống dẫn, máy bơm tay, acid citric thép không rỉ 316 stell, polyethylene, polypropylene, poly vinylchloride V Ứng dụng thực phẩm công nghiệp  Với vai trò chất phụ gia thực phẩm, axít citric dùng làm gia vị, chất bảo quản thực phẩm đồ uống, đặc biệt nước giải khát, mang mã số E3305 Muối Citrat nhiều kim loại dùng để vận chuyển khoáng chất thành phần chất ăn kiêng vào thể Tính chất đệm phức Citrat dùng để hiệu chỉnh độ pH chất tẩy rửa dược phẩm  Citric axít có khả tạo phức với nhiều kim loại có tác dụng tích cực xà phòng chất tẩy rửa Bằng cách phức hóa kim loại nước cứng, phức cho phép chất tẩy rửa tạo nhiều bọt tẩy mà không cần làm mềm nước trước Bên cạnh axít citric dùng để sản xuất chất trao đổi ion dùng để mềm nước cách tách ion kim loại khỏi phức Citrat  Axít citric dùng cơng nghệ sinh học công nghiệp dược phẩm để làm ống dẫn thay phải dùng axít nitric Ở Anh, axít citric dùng làm chất đệm heroin nâu dễ hòa tan Một túi axít citric loại nhỏ dùng để ép người nghiện thay kim tiêm bẩn nhằm hạn chế lây nhiễm AIDS bệnh viêm gan Các axít khác dùng để hòa tan heroin nâu ascobbic, axetic axít lactic, trường hợp thiếu thuốc nghiện tiêm nước chanh vắt hay dấm  Citric axít hóa chất cần thiết cho q trình tổng hợp Hexametylen triperoxit diamin (HMDT) chất dễ phát nổ giống Axeton peroxit, nhạy với nhiệt ma sát Ở số nước bạn mua số lượng lớn axít citric bạn bị liệt kê vào sổ đen âm mưu khủng bố Axít citric cho vào thành phần kem để giữ giọt chất béo tách biệt Ngồi thêm vào nước ép chanh tươi Tài liệu tham khảo https://text.123doc.org/document/3279348-quy-trinh-len-men-acid-citric-tuaspergillus-niger.htm https://vi.scribd.com/doc/250166757/s%E1%BA%A3n-xu%E1%BA%A5tacid-citric Sách Vi sinh vật học Thực phẩm – Trường Đại học Công nghiêp Thực phẩm TP.HCM – Khoa Công nghệ Thực phẩm – Năm 2015 ... sản xuất acid citric phải đảm bảo yêu cầu sau: - Có khả tạo acid mạnh - Có khả chịu mơi trường acid lượng acid citric tăng cao - Ít tạo acid hữu khác như: acid oxalic, acid gluconic, acid fumaric... Để tách canxi oxalate có mặt acid citric, ta sử dụng lượng dư acid sunfuric, canxi oxalate kết tủa với CaSO4 tạo thành, dung dịch acid citric - Để tách riêng acid citric khỏi thạch cao (CaSO 4)... cho H2SO4 98% vào với 0,425l H2SO4/1kg acid citric có citrat Khuấy đun sôi 10-15 phút Để làm acid citric dùng than hoạt tính với lượng 2% so với lượng acid citric citrat Ca3(C6H5O7)2 + 3H2SO4 