Đề tài quy trình lên men acid citric từ aspergillus niger

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP & TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN NHÓM LỚP DH11SH QUY TRÌNH LÊN MEN ACID CITRIC TỪ Aspergillus niger SEMINAR MÔN CÔNG NGHỆ LÊN MEN Khóa học: 2010 - 2014 An Giang, 2013 TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP & TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN NHÓM LỚP DH11SH QUY TRÌNH LÊN MEN ACID CITRIC TỪ Aspergillus niger SEMINAR MÔN CÔNG NGHỆ LÊN MEN Khóa học: 2010 - 2014 GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN ThS Nguyễn Phú Thọ DANH SÁCH NHÓM Nguyễn Hoàng Nhựt Lynh Bung San Ny Thanh Hồng Anh Hoàng Nguyễn Trung Nghĩa Nguyễn Viết Thanh Lê Hoàng Yên Nguyễn Ngọc Hồ Nguyễn Phạm Toại Nguyện An Giang, 2013 Mục lục Nội dung Trang Mục lục i Danh sách hình iii Danh sách bảng iv Chương Đặt vấn đề Chương Tổng quan acid citric 2.1 Khái quát 2.2 Tên gọi 2.3 Tính Chất Chương Tổng quan công nghệ sản xuất acid citric 3.1 Yêu cầu nguyên liệu lên men acid citric 3.2 Một số nguyên liệu gluxit 3.2.1 Mật rỉ 3.2.2 Tinh bột sắn 3.2.3 Ngô 3.3.3 Phân tích chọn nguyên liệu thích hợp cho việc sản xuất acid citric 3.3 Vi sinh vật 3.4 Cơ sở lý thuyết chế hình thành acid nitrit 3.4.1 Cơ sở lý thuyết quy trình lêm men acid citrit 3.4.2 Cơ chế hình thành acid citric 3.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình sản xuất acid citric 3.5.1 Vi sinh vật 3.5.2 Nguyên liệu 3.5.3 Môi trường dinh dưỡng 3.5.4 pH môi trường 3.5.5 Sự thoáng khí 3.6 Các yếu tố định đến trình sản xuất acid citric 3.6.1 Môi trường th c n i 3.6.2 Môi trường lên men 3.6.3 ự thoáng khí 3.6.4 nh hưởng nhiệt độ 3.6.5 Thời gian lên men Chương Công nghệ ản ấ ac c c 4.1 Công nghệ sản uất acid citric 4.1.1 Nuôi cấy nấm mốc nuôi cấy ph ng thí nghiệm nhân giống sản uất 4.1.2 Chu n bị dịch lên men 4.1.3 Lên men 4.1.4 Tách nấm mốc 10 4.1.5 Tạo can i citrat 10 4.1.6 Tách can i citrat 10 4.1 dung dịch acid citric thiết bị sấy chân không 11 4.1 Kết tinh sấy khô acid citric 11 4.2 Sản xuất acid citric nấm mốc Aspergillus niger 11 4.2.1 Môi trường lên men 11 4.2.3 Quá trình lên men 12 4.2.4 Thu hồi tinh chế acid citric 12 Chương Ứng dụng acid citric thực phẩm công ngh ệp 15 5.1 Trong thực ph m 15 5.2 Trong công nghiệp 15 Chương Kết luận k ến nghị 16 5.1 Kết luận 16 5.2 Kiến nghị 16 Tà l ệu tham khảo 17 ii Danh ách hình Nội dung Trang Hình 1: Một số sản ph m ch a acid citric Hình 2: Công th c cấu tạo acid citric Hình 3: Một số loại trái giàu hàm lượng acid citric cần dùng cho lên men Hình 4: Aspergilus niger 11 Hình 5: Tinh thể acid citric 13 Hình 6: đồ quy trình sản xuất acid citric nấm Aspergillus niger 14 iii Danh ách bảng Nội dung Trang Bảng 1: Thành phần môi trường sử dụng ph ng thí nghiệm sản xuất acid citric nấm mốc Aspergillus niger 11 iv Chương Đặt vấn đề Được xem chất bảo quản tự nhiên sử dụng để bổ sung vị chua cho thực ph m hay loại nước Acid citric loại acid hữu có nhiều ng dụng gần gủi đời sống bên ng dụng nhiều acid citric công nghiệp Trong sinh hoá, tác nhân trung gian quan trọng chu trình acid citric xuất trao đổi chất gần sinh vật, coi tác nhân làm tốt mặt môi trường đóng vai tr chất chống ô i hóa, lượng acid citric dư thừa dễ dàng trao đổi tiết khỏi thể Chính tầm quan trọng có nhiều ng dụng acid citric nên tiến hành tìm hiểu trình lên men acid citric từ nấm mốc Aspergillus niger từ nguồn nguyên liệu rẻ tiền mật rỉ, tinh bột sắn, ngô,… thu hồi acid citric nhiều hạn chế sử dụng loại hoá chất tổng hợp hoá học gây hại thực ph m cho người Chương Tổng quan acid citric 2.1 Khá q Acid citric acid hữu phổ biến thực vật có nhiều nước chanh 6% , nước lựu (9%), cam, quýt, d a, dâu tây,… Acid citric dùng nhiều công nghiệp thực ph m làm nước giải khát, bánh kẹo, đồ hộp, y dược, dệt, nhuộm, nghề ảnh, nghề in Nước cam Nước chanh Nước lựu Nước d a Hình 1: Một số sản phẩm chứa acid citric Acid citric có công th c chung C6H8O7 Acid citric sản ph m kết tinh suốt, không màu thể rắn dạng viên màu trắng; điểm nóng chảy 1530C, tỷ trọng 1.542; 1000C bị dung giải; 1500C bị bay thành acid citric khan 2.2 Tên gọi Tên theo IUPAC: Axit 2-hydroxypropan-1,2,3-tricacboxylic Tên thông thường: Axit chanh Công th c phân tử: C6H8O7 Khối lượng phân tử: 192.13 g/mol Có dạng: Tinh thể mà ắng Nhiệt độ nóng chảy: 153 C Nhiệt độ sôi: 175oC (phân hủy) Hình 2: Công thức cấu tạo acid citric (Nguồn: http://en.wikipedia.org/wiki/Citric_acid) 2.3 Tính Chất Tính acid a it citric ảnh hưởng nhóm carbo yl - COOH, nhóm carbo yl cho proton để tạo thành ion citrat Các muối citrat dùng làm dung dịch đệm tốt để hạn chế thay đổi pH dung dịch acid Các ion citrat kết hợp với ion kim loại để tạo thành muối, phổ biến muối can i citrat dùng làm chất bảo quản giữ vị cho thực ph m Bên cạnh ion citrat kết hợp với ion kim loại tạo thành ph c dùng làm chất bảo quản làm mềm nước Ở nhiệt độ ph ng acid citric tồn dạng tinh thể màu trắng dạng bột dạng khan dạng monohydrat có ch a phân tử nước phân tử acid citric Dạng khan thu acid citric kết tinh nước nóng, trái lại dạng monohydrat lại kết tinh nước lạnh Ở nhiệt độ 40C dạng monohydrat chuyển sang dạng khan Về mặt hóa học acid citric có tính chất tương tự acid carbo ylic khác Khi nhiệt độ 50C phân hủy tạo thành CO2 nước Chương Tổng quan công nghệ sản xuất acid citric Trước acid citric sản xuất từ chanh, giá thành cao, hiệu suất thu hồi thấp Hiện người ta dùng phương pháp o y hoá glu it để tạo thành acid citric nhờ nấm mốc, 90% acid citric sản xuất theo phương pháp lên men Hình 3: Một số loạ ấ g hàm lượng acid citric cần ùng cho lên men 3.1 Yê cầ đối vớ ng yên l ệ lên men ac c c Nguyên liệu phải đảm bảo đủ lượng đường cho vi sinh vật phát triển Giống vi sinh vật dùng sản xuất acid citric phải đảm bảo yêu cầu sau:  Có khả n ng tạo acid citric mạnh  Có khả n ng chịu môi trường acid lượng acid citric t ng cao  Ít tạo acid hữu khác như: acid o alic, acid gluconic, acid fumaric 3.2 Một số ng yên l ệu gluxit 3.2.1 Mật rỉ Mật rỉ phụ ph m ngành sản xuất đường, sản ph m cuối trình sản xuất đường mà từ đường không c n kết tinh cách kinh tế công nghệ thông thường Thành phần mật rỉ đường, chủ yếu sucroza với glucoza fructoza Nói chung, sản lượng mật rỉ khoảng 1/3 sản lượng đường sản xuất C khoảng 100 mía đem ép có - rỉ mật sản xuất 3.2.2 Tinh bột sắn Độc tố sắn có tên chung Phazeolunatin ch a nhiều sắn đắng, chủ yếu vỏ cùi, hàm lượng Phazeolunatin vào khoảng 0,001 - 0,04% Phazeolunatin không độc bị thủy phân glucozit giải phóng HCN, chất gây độc cho thể Tuy nhiên dễ bay dễ h a tan nước lạnh hay nước vơi nên dễ loại bỏ Sắn thái lát, phơi khô giảm đáng kể số lượng HCN 3.2.3 Ngô Hạt ngô gồm hai phần chính: Phôi nội nhũ Phôi chiếm 10 - 13% trọng lượng hạt, nội nhũ chiếm 83 - 85%, vỏ chiếm - 5% 3.3.3 Phân ích chọn ng yên l ệu hích hợp cho việc sản xuất acid citric Hàm lượng glu it có ngô cao (67,9%), tiếp đến mật rỉ, khoai lang, sắn, cuối khoai tây Tuy nhiên chất lên men citric trình o y hóa đường thành acid citric tác dụng vi sinh vật mà nguyên liệu tinh bột (ngô, sắn, khoai,…) muốn sản xuất acid citric cần phải trải qua giai đoạn thủy phân tinh bột thành đường, từ đường tác dụng vi sinh vật tạo thành acid citric nhiều thời gian chi phí, mật rỉ thành phần hóa học chủ yếu đường vi sinh vật trực tiếp sử dụng đường để tạo thành acid citric Mặt khác mật rỉ nguyên liệu rẻ tiền dễ kiếm mật rỉ nguyên liệu sử dụng nhiều việc sản xuất acid citric, nhiên cần xử lí mật rỉ trước sử dụng mật rỉ ch a chất màu, hệ keo, đặc biệt kim loại nặng ảnh hưởng đến trình lên men, c chế vi sinh vật phát triển 3.3 Vi sinh vật Aspergillus niger loại nấm sợi loài phổ biến chi Aspergillus có nhiều ng dụng công nghệ sinh học, nhiệt độ tối ưu 35 - 370C, pH từ 1,4 - 9, Nó gây c n bệnh gọi nấm mốc đen số loại trái rau nho, hành tây, đậu phộng, chất gây ô nhiễm phổ biến thực ph m Aspergillus niger vi sinh vật hiếu khí phát triển chất hữu cơ, tìm thấy gần khắp nơi môi trường có ch a đất Ngoài ra, tìm thấy chất thải, nguyên liệu thực vật phân hủy phân hữu môi trường trời Môi trường m nhà tạo môi trường sống tốt cho phát triển nấm mốc Chẳng hạn lĩnh vực hộ gia đình thông thường, b c tường ph ng tắm khu vực khu vực khác có mositure 3.4 Cơ lý h yết chế hình hành ac n .1 Cơ lý h yết q y ình lêm men ac c Trong trình glucose chuyển hoá thành a it pyruvic theo đường EMP (Embden-Mayerhof-Parnas , sau a it pyruvic tiếp tục chuyển hoá thành a it citric Phương trình tổng quát trình sau: 2C6H12O6 + 3O2 → 6C6H8O7 + 4H2O Glucose Acid citric Các loại vi sinh vật để sản xuất acid citric: Aspergillus niger, Aspergillus clavarus, Penicillium citrinum, Mucor piriformis loài Mucor khác Những chủng Aspergillus cho kết cao 3.4.2 Cơ chế hình hành ac c c Phương trình chung trình chuyển hoá đường thành acid citric là: 2C6H12O6 + 3O2 → 2C6H8O7 + 4H2O Cơ chế chuyển hoá biểu diễn sau: Đường C6H12O6 thuỷ phần thành acid pyruvic CH3COCOOH) CH3COCOOH + CO2 → HOOCCH2COCOOH Acid oxaloacetic HOOCCH2COCOOH + CH3COOH → CH2COOHCOHCOOHCH2COOH Acid citric 3.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến q ình ản xuất acid citric 3.5.1 Vi sinh vật Vi sinh vật đóng vai tr quan trọng trình lên men Do cần lựa chọn vi sinh vật phù hợp cho trình lên men citric, thông thường để trình tổng hợp acid citric xảy mạnh vi sinh vật phải có khả n ng tạo acid cao, khả n ng tạo acid vi sinh thấp sản xuất lượng lớn acid citric được; mặt khác vi sinh vật phải có khả n ng chịu acid lượng acid t ng cao không trình lên men acid hình thành lớn vi sinh vật chết c chế khả n ng tạo acid citric, chủng vi sinh vật sử dụng cần phải tạo acid hữu khác như: acid o alic, acid gluconic, acid fumaric acid hình thành nhiều gây ảnh hưởng đến chất lượng acid citric 3.5.2 Ng yên l ệu Nguyên liệu thích hợp cho sản xuất acid citric nguyên liệu ch a nhiều đường ví dụ: mật rỉ, sinh vật o i hóa đường để tạo thành acid citric, Nồng độ axit citric cao đạt phát triển môi trường có nồng độ đường ban đầu cao (15 - 20% w/v), không đủ lượng đường cho vi sinh vật sử dụng khả n ng tổng hợp acid citric kém, nguyên liệu phải không lẫn nhiều tạp, chất kim loại nặng đặc biệt sắt hàm lương sắt giới hạn cần phải loại bỏ 3.5.3 Mô ường nh ưỡng Nấm mốc cần đường, tinh bột muối vô Trong điều kiện thường nấm mốc phát triển sinh khối tạo a it citric Trong trường hợp môi trường nhiều cabon nitơ lượng đường - 20%, nitơ 0,0 %, c n bổ sung thêm nguyên tố khoáng P, Fe, Zn… trình tổng hợp axit citric xảy mạnh 3.5.4 pH mô ường pH thích hợp để tạo thành a it citric từ - 4, tùy thuộc vào chủng nấm mốc sử dụng Ta a it hoá môi trường HCl, pH môi trường phụ thuộc vào nguồn nitơ Nếu sử dụng NH4NO3 pH thích hợp 3, sử dụng NH4Cl pH thích hợp Trong trình lên men tạo thành a it citric nên pH giảm mạnh, cần phải điều chỉnh pH môi trường cho thích hợp 3.5.5 Sự hoáng khí Quá trình o i hoá cần lượng lớn o y, cần phải cung cấp không khí cho trình lên men cách thông thoáng khí môi trường Ngoài thông thoáng khí c n giảm lượng khí cacbonic môi trường 3.6 Các yếu tố quyế định đến q ình ản xuất acid citric 3.6.1 Mô ường hức n Bao gồm đường, hợp chất hữu cơ, vô Để nuôi cấy Aspergillus niger sử dụng môi trường có thành phần g l : accaroza - 140; NH4NO3 - 2,23; KH2PO4 - 1; MgSO4.7H2O - 0,23 3.6.2 Mô ường lên men Nước 1000 ml đường 150 g NH4Cl 1,9 g bổ sung Zn O4 làm t ng khả n ng tích lũy acid citric pH môi trường:  Để nấm mốc phát triển tốt giữ pH  Để lên men tốt giữ pH 3,4 - 3,5  Để điều chỉnh pH thường dùng HCl ì điều kiện môi trường để nấm phát triển để thu acid citric khác nên sản uất phải chu n bị môi trường cho nấm phát triển đầy đủ, sau điều chỉnh môi trường thích hợp để lên men citric 3.6.3 Sự hoáng khí Tất mi en nấm mốc loại hiếu khí điên hình, cần o y tự Trong sản uất thực quạt gió vô trùng vào ph ng lên men thổi khí vô trùng vào dịch lên men 3.6.4 nh hưởng nh ệ độ Nhiệt độ thích hợp khoảng 31 - 370C inh khối nấm mốc phát triển mạnh 34 - 370C Để tạo nhiều acid cần trì nhiệt độ 31 - 320C Nhiệt độ thấp tích lũy nhiều acid gluconic Nhiệt độ cao việc tạo acid citric bị kìm h m Thời gian nuôi cấy từ đến 10 ngày Trong thực tế sản xuất người ta thường thổi không khí vô trùng vào dịch lên men Nhiệt độ thích hợp cho trình lên men tạo a it citric 31 – 370C Thấp tạo a it gluconic, cao việc tạo axit citric bị kìm h m Thời gian lên men khoảng – 10 ngày 3.6.5 Thờ g an lên men Thời gian tối ưu để trình sản xuất a it citric đạt tối đa phụ thuộc vào chủng sử dụng, thành phần hóa học môi trường, hệ thống lên men, nói chung, điều kiện theo trình lên men diễn Trong trình lên men bề mặt, thời gian lên men thường hoàn thành 10-20 ngày, trình lên men chìm thời gian ủ ngắn nhiều khoảng từ (510 ngày Trong trình lên men trạng thái rắn thời gian lên men phụ thuộc mạnh mẽ vào chất tiêm chủng sử dụng, độ m bề mặt, độ pH ban đầu, nhiệt độ lượng mẫu môi trường ví dụ, vỏ hạt carob sung) Trong trường hợp này, nồng độ tối đa acid citric đạt từ khoảng 10 đến 15 ngày Chương Công nghệ ản ấ acid citric ản uất acid citric thực theo phương pháp bề mặt cấy chìm Trong phương pháp bề mặt mốc tạo thành màng môi trường th c n; Trong phương pháp chìm cấy sâu mốc tạo thành sợi nằm toàn môi trường lỏng Phương pháp chìm có nhiều ưu việc phương pháp nổi, cho phép t ng n ng suất Hiện nuôi cấy chủ yếu phương pháp chìm công đoạn trùng, tạo chế độ công nghệ bền vững, rút ngắn thời gian lên men, dễ tự động hóa, giảm lao động nặng nhọc 4.1 Công nghệ ản ấ acid citric 4.1.1 N ô cấy nấm mốc (n ô cấy ong ph ng hí ngh ệm nhân g ống ong ản ấ Chu n bị dung dịch rỉ đường - 4% thùng nuôi cấy nhiệt độ 35 - 380C Bổ sung dung dịch chất dinh dưỡng vào thùng nuôi cấy Chuyển men giống từ ph ng thí nghiệm vào theo tỷ lệ gam bào tử khô - lít dung dịch rỉ đường au mở cánh khuấy cung cấp không khí vô trùng nạp không khí đảo trộn suốt trình nhân giống Duy trì áp suất thùng 0,1 - 0,2 at, t0 = 34 – 350C thời gian - 36 h Thời k đầu cho o y vào với lượng - 10 m3 h, thời k cuối 24 - 30 h 90 - 100 m3/h 4.1.2 Ch ẩn bị ịch lên men Trước hết phải dùng cao áp để tiệt trùng thiết bị đường ống ỉ đường pha thành hai loại nồng độ: nồng độ - 4% để nuôi cấy mốc giống lên men ban đầu Nồng độ 25 - % để bổ sung trình lên men Để pha chế dịch lên men, dùng nước vô trùng trộn với dung dịch muối dinh dưỡng rỉ đường khuấy Môi trường - 4% pha chế thiết bị lên men au cho mốc giống từ thiết bị nuôi cấy vào tiếp tục khuấy trộn 30 phút 4.1.3 Lên men Trong trình lên men, lượng đường giảm nhanh, để bù lại dùng dung dịch rỉ có nồng độ 25 - % để bổ sung gián đoạn vào thiết bị lên men Thời k đầu giữ 33 - 340C, tạo acid mạnh giữ nhiệt độ 31 - 320C Thời k đầu cung cấp 100 m3 h thể tích thiết bị 50 m3) Thời k cuối 00 - 1000 m3/h 4.1 Tách nấm mốc Kết thúc trình lên men cách kiểm tra mẫu Nếu hai mẫu kiểm tra cách - h mà có độ acid coi kết thúc trình lên men Thời gian lên men kéo dài - 10 ngày, phụ thuộc vào hoạt lực nấm mốc Khi kết thúc trình lên men đun nóng dịch lên men 60 - 650C chuyển vào thùng trung gian để tách nấm mốc Nấm mốc tách máy lọc chân không 4.1.5 Tạo can c a Dung dịch đ lên men hỗn hợp gồm: acid citric, acid gluconic, acid o alic, đường không lên men hợp chất khoáng Tách acid citric cách cho liên kết với cation can i để tạo muối tan can i citrat Dung dịch đ lên men cho vào thiết bị trung h a đun sôi au mở cánh khuấy cho sữa vôi vào để trung h a Quá trình trung h a kết thúc pH 6, - 7,5 Khi trung hoà tạo thành: C6H8O7 + 3Ca(OH)2 → Ca3(C6H5O7)2↓ 6H2O Acid citric Canxi citrat 2C6H12O7 + Ca(OH)2 → Ca C6H11O7)2 + 2H2O Acid gluconic Canxi gluconat C2H2O4 + Ca(OH)2 → CaC2O4↓ 2H2O Acid oxalic Canxi oxalat Dùng thiết bị lọc chân không tách chất kết tủa can i citrat can i o alat đem sấy khô 4.1.6 Tách can citrat Dùng H2SO4 để tách can i citrat thiết bị tách có cánh khuấy, ống phun thoát Đầu tiên cho nước vào thiết bị 0,25 - 0,5 m3/1 acid citric ch a citrat, mở cánh khuấy cho chất kết tủa vào Để làm acid citric dùng than hoạt tính với lượng 2% so với lượng acid citric citrat au đem đun nóng lên 600C cho H2SO4 có tỷ trọng 1, - 1, vào 0,425 lít H2SO4/1kg acid citric có citrat) Khuấy đun sôi 10 - 15 phút Ca3(C6H5O7)2 + 3H2SO4 → 2C6H8O7 + 3CaSO4 Để tách can i o alat có mặt acid citric, sử dụng lượng dư acid sunfuric, can i o alat kết tủa với thạch cao tạo thành lúc dung dịch c n acid citric Để tách dung dịch acid citric khỏi kết tủa có ch a thạch cao, can i o alat, than, hợp chất sunfua kim loại nặng Chuyển hỗn hợp vào lọc chân không, dung dịch sau lọc đem sấy 10 4.1 Sấy ng ịch acid c c ong h ế bị chân không iai đoạn đầu sấy đến tỷ trọng 1,24 - 1,26 iai đoạn hai sấy đến tỷ trọng 1,32 - 1,36 tương ng với nồng độ 0% 4.1 Kế nh khô acid citric Khi nhiệt độ dung dịch 35 - 370C cho mầm kết tinh tinh thể acid citric vào để kết tinh tiếp tục làm nguội - 100C cho khuấy liên tục 30 phút au cho qua thiết bị ly tâm để tách tinh thể đưa sấy khô dùng thiết bị sấy kiểu b ng tải, tác nhân sấy không khí với nhiệt độ không 350C) 4.2 Sản xuất acid citric nấm mốc Aspergillus niger Hình 4: Aspergilus niger 4.2.1 Mô ường lên men Bảng 1: Thành phần môi trường sử dụng ph ng thí nghiệm sản xuất acid citric nấm mốc Aspergillus niger Thành phần Khoảng g ị G ị chung -3 Sucrose glucose 125-225 kgm 180 kgm-3 NH4NO3 (hoặc muối NH4+khác 0.5 – 3.5 kgm-3 1.5 kgm-3 KH2PO4 0.5 – kgm-3 0.5 kgm-3 MgSO4.7H2O 0.1 – 2.0 kgm-3 0.25 kgm-3 Fe2+ - 1300 mgm-3 < 200 mgm-3 Zn2+ 0-2900 mgm-3 200-1500 mgm-3 Cu2+ 1-10200 mgm-3 200-1500 mgm-3 Mn2+ 0-46 mgm-3