CÔNG NGHỆ sản XUẤT KHÁNG SINH ERYTHROMYCIN

- Từ những năm 1940 đến năm 1960, nhiều kháng sinh mới được phát hiện hầu hết từ xạ khuẩn, và đó trở thành thời kỳ vàng son cho quá trình tổng hợp cững nhưu điều trị bằng chất kháng sinh

CHỦ ĐỀ: CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT KHÁNG SINH

ERYTHROMYCIN

I. Giới thiệu chung

1. Lịch sử

- Từ đầu thế kỷ 19 các bệnh truyền nhiễm chiếm phần lớn trong các bệnh ở người và động vật Tỷ lệ tử vong do nhiễm trùng rất cao, đặc biệt là trong chiến tranh

- Nửa sau thể kỷ 19, người ta phát hiện rằng nguyên nhân là từ VSV Con người bắt đầu tập trung tìm hiểu về các loài vi sinh vật và phương pháp điều trị các bệnh do các vi sinh vật gây ra

- Vào năm 1928 Fleming phát hiện ra chất kháng sinh Penicillin, được dùng điều trị trong những năm 1940 Penicillin đã mở ra kỷ nguyện mới trong điều trị các bệnh do vi sinh vật gây ra

- Từ những năm 1940 đến năm 1960, nhiều kháng sinh mới được phát hiện hầu hết từ xạ khuẩn, và đó trở thành thời kỳ vàng son cho quá trình tổng hợp cững nhưu điều trị bằng chất kháng sinh

- Và năm 1952 thì chất kháng sinh Erythromycin được phát hiện Erythromycin là chất kháng sinh tiêu biểu và được sử dụng phổ biến nhất trong nhóm macrolide

2. Đặc điểm cấu tạo

- CTPT : C37H67NO13

- Khối lượng phân tử: 733,93 g/mol

- Liên kết protein: 90%

- Erythromycin base là hỗn hợp của ba chất erythromycin A, B,C trong

đó chủ yếu là erythromycin A

A C37H67NO13OHCH3

B C37H67NO12HCH3

C C36H65NO13OHH

- Macrolide là nhóm kháng sinh có cấu trúc aglycon, nhân lacton,vòng gồm 12-19 C, được chiết ra từ môi trường nuôi cấy nấm streptomyces

có cơ chế tác dụng và phổ tác dụng giốnng nhau

- Erythromycin gồm 2 phân tử đường gồm desosamin và cladinose gắn vào Erythronolide

- Trong nhóm có 3 phân nhóm:

+ Macrolide thực thụ (erythromycin thuộc nhóm này)

+ Macrolide dùng nhiều đường nối đôi, có 4 vòng lacton thường không có nhánh methyl, chứa ít nhât 4 nối đôi liên hợp

+ Macrolide trong phân tử có vòng lớn chứa nhân trơn

- Macrolide dungf nhiều đường nối đôi, có 4 vòng lacton, thường không

có nhánh metyl, chứa 4 cặp đôi liên hợp, nhóm này thường là các kháng sinh chống nấm: ntain, amphotericin B, grycefulvin,…

- Erythromycin base là dạng bột tinh thể màu trắng hoặc hơi ánh vàng ,

dễ hút ẩm , tan ít trong nước ( độ tan giảm khi nhiệt độ tăng ) , tan nhiều trong dung môi hữu cơ: ethanol , methanol , tan trong acid loãng

- Erythromycin hoạt hóa ở pH kiềm hơn là pH trung tính và không bền

ở pH acid

- Erythromycin có tác dụng diệt khuẩn tốt ở các loài vi khuẩn Gram [+]

và hiệu quả trong việc chữa trị nhiễm khuẩn Staphylococcus mà đã kháng lại Penicillin Mycoplasma, Staphylococcus, Streptococcus, Neisseria, Haemophylus, Corynebacterium, Listeria, Pasteurella multocida, Brucella, Rickettsia, Treponema rất nhạy cảm với erythromycin

- Erythromycin có phổ tác dụng rộng với các vi khuẩn gây bệnh chủ yếu là kiềm khuẩn đối với VK gram dương, gram âm và các vi khuẩn khác bao gồm Mycoplasma, Spirochetes, Chlamydia, và Rikettsia, hầu như không có tác dụng trên vi khuẩn ưa khí gram âm

4. Cơ chế tác dụng

*** Erythromycin và các macrolid khác gắn thuận nghịch với tiểu đơn

vị 50S của ribosom vi khuẩn ức chế peptidin-tranferate trong quá trình tổng hợp protein của vi khuẩn, không ức chế tế bào vậ chủ

- Tác dụng chính của erythromycin là kìm khuẩn nhưng có thể diệt khuẩn ở nồng độ cao đối với các chủng rất nhạy cảm Tác dụng của thuốc tăng lên ở pH kiềm nhẹ (khoảng 8,5), đặc biệt với các vi khuẩn Gram âm

- Nhóm Macrolide có tác dụng đối kháng với Cloramphenicol, lincosamide, ngoài ra còn đối kháng với nhóm beta-lactamin Nhưng lại kết hợp với nhóm Tetracilin (trong điều trị tụ cầu và liên cầu khuẩn), Rifampicin ( trong điều trị bệnh lao)

- Sau khi tiếp xúc vài giờ với thuốc erythromycin sẽ tích lũy trong vi khuẩn, lúc này vi khuẩn không tiếp tục phát triển được, mất khả năng gây bệnh, dễ bị thực bào bởi khả năng phòng vệ của vật chủ

5. Tính kháng thuốc

- Kháng tự nhiên gồm các vi khuẩn gram âm hiếu khí

- Kháng thu được:

+ Do thay đổi sinh hóa ở tiểu phần 50s Bản chất của thể kháng này là

do đột biến một gen có cấu trúc tương ứng với một hay nhiều protein của 50s, từ đó vi khuẩn kháng thuốc trở nên dột biến

+ Kháng do mắc phải có nguồn gốc ngoài thể nhiễm sắc là phổ biến,

gồm tụ cầu, liên cầu nhóm D, Clostridium perfringens Cơ chế kháng

ở đây là methylase có từ trước hay được cảm ứng bởi Macrolide làm xúc tac cho phản ứng dimethyl hóa của demin ( xảy ra ở giai đoạn 23s của tiểu phần 50s ở ribixom), làm cho riboxom giảm ái lực với Macrolide là làm giảm tác dụng của nhóm Macrolide

II. Công nghệ sản xuất Erythromycin

1. Chủng vi sinh

 Erythromycin được tổng hợp từ xạ khuẩn Streptomyces eryhreus

 Đặc điểm: Xạ khuẩn Streptomyces eryhreus sinh sản vô tính bằng bào

tử, trên đầu sợi khí sinh hình thành cuống sinh bào tử và chuỗi bào tử

Xạ khuẩn này có cấu tạo giống vi khuẩn gram dương, hiếu khí, dị dưỡng các chất hữu cơ Loài này có khả năng sinh ra các chất kháng sinh Erythromycin

2. Phân lập

 Streptomyces eryhreus được phân lập từ đất hoặc từ vườn ở độ sâu

10-20cm, tại 10 địa điểm khác nhau với khoảng cách từ 5km đến 10km sau đó trộn đều rồi phân lập chủng

 Môi trường phân lập: Môi trường Gauze-1 điều chỉnh(g/ml):

+ Tinh bột khoai tây 20g

+ K2HPO4 3g

+ NaCl 0,5g

+ MgSO4.7H2O 3g

+ KNO3 1g

+ FeSO4.7H2O 0,01g

+ Agar 20g

+ Nước cất 1000ml

+ pH 7-7,2

Hấp khử trùng 1210C trong 30 phút

- Tiến hành:

+ Cân 10g mẫu có chứa xạ khuẩn cho vào bình tam giác chứa 90ml nước cất vô trùng, khuấy bằng đũa thủy tinh cho tan hết mẫu Pha loãng mẫu đất từ 10-6 -10-8 Dùng pipet vô trùng nhỏ 0,1ml dịch huyền phù đã pha loãng trên lên bề mặt môi trường thạch đã pha Dùng que trang dàn đều trên bề mặt môi trường thạch Đậy petri và bỏ

tủ ấm 28-300C từ 7-14 ngày Quan sát các khuẩn lạc có đường kính 3

mm với một màu xám hơi hồng và một sắc tố màu nâu nhạt Phần dưới của các khuẩn lạc xuất hiện màu nâu đậm

- Chọn chủng:

+ Nhuộm gram: kết quả có màu xanh đen hay tím

+ Thử nghiệm thủy phân casein

+ Xác định hoạt tính amylase

+ Thử nghiệm endoglucanase

Chủng chọn được định danh bằng sinh học phân tử

3. Lên men

 Giống: giống công nghiệp S Erythreus được bảo quản lâu dài ở dạng

khô, bảo quản siêu lạnh ở -70oC hoặc bảo quản trong nito lỏng

 Nhân giống: giống từ môi trường bảo quản được cấy chuyền ra trên

môi trường thạch hộp để hoạt hóa và nuôi bào tử Dịch huyền phù bào

tử thu được tiếp tục cấy chuyển tiếp sang môi trường bình tam giác, rồi sang thiết bị nhân giống nhỏ đến thiết bị nhân giống trung gian…

Và cuối cùng là trên thiết bị nhân giống sản xuất

• Yêu cầu:

+ Đảm bảo cung cấp đủ giống và hoạt lực cao, chất lượng đảm bảo đúng thời điểm cho các công đoạn nhân giống kế tiếp

+ Cung cấp đủ lượng giống đạt yêu cầu kỹ thuật cho lên men sản xuất

• Thành phần môi trường lên men: (w/v)

+ Glucose 2,5%

+ Tinh bột 2,5%

+ Bột đậu 4,7%

+ Cao ngô 1%

+ Cao nấm men 0,5%

+ (NH4)2SO4 0,3

+ NaCl 0,5%

+ CaCO3 0,2%

+ COCl2

• Ý nghĩa các thành phần lên men: cung cấp nguồn N, C, và các khoáng giúp xạ khuẩn sinh trưởng phát triển tối ưu, tăng tổng hợp sản xuất lượng kháng sinh lớn

- Các thành phần bột đậu, cao ngô, cao nấm men…là nguồn N dinh

dưỡng dùng để nuôi cấy vi sinh vật Đối với xạ khuẩn S Erythreus

sử dụng cao ngô nhanh hơn cao đậu tương hay khô lạc Cao ngô được coi là nguồn nito tốc hiệu, có lợi cho sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật

- (NH4)2SO4: là thành phần của aminoacid chứa S , một số viatmin, glutathione có tác dụng điều chủng thế oxy hóa khử trong tế bào

- NaCl: Giúp duy trì áp suất thẩm thấu, duy trì tính ổn dịnh

 Sau khi pha các thành phần môi trường phải được thanh trùng hoặc lọc rồi mới bơm lên thùng len men

- Giai đoạn lên men: Quy trình lên men (của công ty Mountaineer

Biocorp, Inc,)

+ E-702: thiết bj trao đổi nhiệt

+ E-701: Thiết bị làm lạnh khô

+ V-701: thùng điều chỉnh pH

+ F-702: Tiết bị lọc thùng quay

+ R-701: thiết bị lên men

+ T-701, T-702: thiết bị trích ly

- Phương pháp lên men: Kỹ thuật lên men chìm

- Ưu điểm: có khả năng cơ giới hóa, hiện đại hóa, quá trình xảy ra một cách liên tục, có thể kiểm soát được các yếu tố ảnh hưởng trong quá trình lên men, diện tích sử dụng, cho hiệu suất cao

- Lên men theo phương thức lên men gián đoạn (72h), tiến hành lên men từng mẻ, tính toán pha trộn nguyên liệu theo từng mẻ cấp vào thùng lên men và lấy dịch theo từng mẻ

Vi sinh vật được nuôi cố định trong bình lên men với một thể tích môi trường xác định Vi sinh vật phát triển theo giai đoạn (pha tiềm phát, pha nhân lên chậm, pha logarit, pha cân bằng, pha suy vong) và tạo ra các sản phẩm Kết thúc quá trình, người ta tiến hành các công đoạn cần thiết để thu lấy sản phẩm Phương pháp lên men chu kỳ được ứng dụng để sản xuất nhiều hoạt chất quan trọng như amino acid, các chất kháng sinh

Thực hiện theo từng mẻ nên thường có năng suất thấp và chu kỳ sản xuất bị kéo dài

- Điều kiện lên men:

+Nhiệt độ cho quá trình lên men: 280C

+ pH: 7,5

+ Thể tích tấp lên men là 0,4:1 V kí oxi/dịch men/phút

+ Độ ẩm: 40-55%

- Các yếu tố ảnh hưởng:

+ Nhiệt độ: Đa số xạ khuẩn phát triển tốt ở 28-300C nhưng nhiệt độ tối

ưu cho sinh trưởng tổng hợp chất kháng sinh nằm trong khoảng từ

18-280C Do ở nhiệt độ cao thì chất kháng sinh dễ bị phá hủy nên tiến hành ở nhiệt độ thấp hơn dể xạ khuẩn vẫn phát triển tốt và khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh cao Nhiệt độ cho quá trình lên men là

280C

+ pH: tác động trực tiếp dến tính chất hệ keo của tế bào, hoạt lực của enzym pH kiềm hay acid đều ức chế quá trình sinh tổng hợp chất kháng sinh pH tối ưu cho sinh tổng hợp chất kháng sinh thường là pH trung tính Trong lên men Erythromycin thì pH=7,5

+ Oxy: Xạ khuẩn là loại vi sinh vật có nhu cầu oxy cao hơn các vi sinh khác, nhất là giai đoạn nhân giống Thể tích cấp lên men Erythromycin là 0,4V khí/V dịch/phút

+ Độ ẩm thích hợp là 40-55%

+ Tuổi giống: tuổi giống cấy truyền vào môi trường lên men cho hiệu suất chất kháng sinh cao nhất 24 giờ tuổi Lượng giống cấy truyền khoảng 2-10%

4. Tách và tinh chế

Dịch lên men-> Kiềm hóa-> Lọc ->Trích ly trong butyl acetat

->Trích ly trong nước-> Kết tinh-> Sấy Erythromycin tinh khiết

Quy trình :

- Sau khi lên men, dịch lên men được bơm vào thùng V-701 chứa dung dịch NaOH để điều chỉnh pH từ 7,5 lên 10,7

- Sau đó, dịch được đem lọc bằng thiết bị lọc thùng quay F702, do Erythromycin là sản phẩm ngoại bào nên hòa tan ở trong dịch lên men, khi lọc ở thiết bị này xác tế bào nằm ở phía ngoài lưới lọc, được cạo bỏ, thu hồi dịch lọc chứa Erythromycin

- Dịch lọc được bơm vào thiết bị trích ly sử dụng dung môi butylacetat T-701, để loại bỏ các chất tan trong dung môi,

- Tiến hành trích ly trong nước ở pH = 5 ở T702 để loại các chất tan trong nước Butyl acetat thu hồi ở T702 được tuần hoàn lại sang T701

để tránh lãng phí và tránh thải butyl acetat ra ngoài gây ô nhiễm môi trường

- Nước sau thu được ở T-701 được tải sử dụng trong V-701

- Dịch chứa Erythromycin được đưa vào thiết bị V-702, tại đây dịch được trộn với dung dịch NaOH, pH được điều chỉnh lên 9,5, bằng cách đó sẽ làm giảm khả năng hòa tan của erythromycin vào trong dịch và kết tinh dễ dàng hơn

- Tách các tinh thể erythromycin bằng cách lọc trong thiết bị F-703, nước sau khi lọc được sử lý bằng tia UV và được deion hóa để tái sử dụng

- Các tinh thể Erythromycin thô được trộn với dung dịch aceton trong thiết bị CR-701, thêm một lượng nước thích hợp rồi thêm chất mầm kết tinh hydroxyl methyl cellulose

- Erythromycin dưới dạng dihydrat được lọc lại ở F-704 và được sấy trong D-701

5. Kiểm định

- Độ chuẩn của erythromycin được sản xuất trong bình lắc hoặc máy tạo

bioreactor của S erythraea được xác định bằng cách sử dụng một

phương pháp thử nghiệm sinh học thông thường với thương mại erythromycin sẵn có như một tiêu chuẩn:

+ Rót 35 mL môi trường TSB vào đĩa Petri (12 x 12 cm)

+ Một khi môi trường được kiên cố, thêm một lớp thứ hai bao gồm 35

mL môi trường TSB chứa 35 μL vi khuẩn Micrococcus luteus qua đêm (nuôi 18 giờ ở 30 ° C trong LB)

+ Xác định mức độ erythromycin bằng cách chuyển 10 gmL dịch trên

bề mặt nuôi cấy (hoặc pha loãng thích hợp trong methanol) trên đĩa thử nghiệm kháng sinh được đặt lên tấm kiểm tra Sau 48 giờ ủ ở 30°C, các vùng ức chế sự phát triển của M luteus được đo và độ mịn erythromycin (g / L) được tính bằng đường cong chuẩn

III. Ứng dụng

- Y học : Erythromycine được dùng để điều trị nhiều dạng bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn như bệnh giang mai, bệnh nhiễm trùng đường hô hấp, bệnh viêm phế quản, bệnh nhiễm trùng Chlamydia, bệnh Lyme, bệnh viêm phổi do Legionella, nhiễm trùng viêm nội tâm mạc, chuẩn

bị phẫu thuật ruột, bệnh dự phòng sốt thấp khớp, trẻ em mắc bệnh ho

gà, viêm kết mạc; viêm giác mạc; lúa mạch (meybolit); chlamydia; blahoma; viêm bờ mi do vi khuẩn

- Làm đẹp : trị mụn trứng cá có viêm như mụn mủ, mụn bọc, mụn viêm, các tổn do da ( dạng bôi, mỡ) như sẹo do mụn, vết thâm do mụn để lại

IV. Tài liệu tham khảo

1. Nguyễn Văn Cách 2000, Công nghệ lên men các hợp chất kháng sinh, Nhà xuất bản Khoa học Kỹ thuật

2. Từ Minh Koong 2007, Kỹ thuật sản xuất dược phẩm tập II, Nhà xuất bản Y học

3. https://tusach.thuvienkhoahoc.com/wiki/Erythromycin

4. http://duocdien.net/sinh-tong-hop-erythromycin/

5. https://text.123doc.org/document/3411212-cong-nghe-san-xuat-chat-khang-sinh-erythomycin.htm

6. http://www.benhhoc.com/thuoc/181-Erythromycin.html

7. http://doc.edu.vn/tai-lieu/de-tai-nghien-cuu-tach-chiet-va-tim-hieu- tinh-chat-cua-khang-sinh-co-nguon-goc-tu-mot-so-chung-xa-khuan-phan-lap-o-thai-11533/

8. https://docslide.net/documents/tl-khang-sinh.html

9. https://www.dieutri.vn/e/erythromycin/#ixzz5CwJoXEfG

10. https://vi.scribd.com/doc/242594068/%C4%90%E1%BA%A1i-c

%C6%B0%C6%A1ng-Khang-sinh-Macrolid-va-so-sanh-gi%E1%BB

%AFa-erythromycin-clarithromycin-azithromycin

Trả lời câu hỏi và bổ sung:

1. Tác dụng phụ của kháng sinh:

Hiếm có các phản ứng không mong muốn nặng Khoảng 5 - 15% người bệnh dùng erythromycin có tác dụng không mong muốn Phổ biến nhất là các vấn đề tiêu hóa, đặc biệt với liều cao và sự kích ứng tại chỗ, có thể tránh được bằng cách truyền chậm (tối đa 5 ml/phút)

Có nhận xét là các dung dịch tiêm có chứa cồn benzylic làm chất bảo quản gây độc cho hệ thần kinh, nên không được dùng cho trẻ nhỏ

- Thường gặp:

+ Ðau bụng, nôn mửa, tiêu chảy, biếng ăn

+ Ngoại ban

+ Viêm tĩnh mạch và đau ở chỗ tiêm

- Ít gặp: Mày đay

- Hiếm gặp: + Phản ứng phản vệ

+ Loạn nhịp tim

+ Transaminase tăng, bilirubin huyết thanh tăng, ứ mật trong gan

+ Ðiếc, có hồi phục

+ Một số tác dụng không mong muốn có thể hồi phục, cách

xử trí là ngừng thuốc

2. Sự ảnh hưởng của các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men và tinh chế:

Các yếu tố như nhiệt độ, độ pH, độ thông khí,tuổi giống… các thông

số nêu ra ở trên là các điều kiện tối ưu để quá trình sản xuất kháng sinh đạt hiệu suất cao nhất, không gây biến đổi kháng sinh

+ Nhiệt độ: Đa số xạ khuẩn phát triển tốt ở 28-300C nhưng nhiệt độ tối

ưu cho sinh trưởng tổng hợp chất kháng sinh nằm trong khoảng từ

18-280C Do ở nhiệt độ cao thì chất kháng sinh dễ bị phá hủy nên tiến hành ở nhiệt độ thấp hơn dể xạ khuẩn vẫn phát triển tốt và khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh cao Do vậy, nhiệt độ cho quá trình lên men 280C là thích hợp nhất

+ Độ ẩm thích hợp là 40-55%

+ pH: Độ pH của môi trường đã chuẩn bị cần phải nằm trong phạm vi được nhà sản xuất nêu ra, thường ở trung tính, pH tăng hay giảm thì kích thước của vòng ức chế có thể sẽ bị thay đổi, với mức độ thay đổi được xác định bởi nhóm kháng sinh, tăng pH có thể làm tăng đường kính vòng ức chế cho Macolid