CÔNG NGHỆ sản XUẤT KHÁNG SINH ERYTHROMYCIN

CHỦ ĐỀ: CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT KHÁNG SINH ERYTHROMYCIN I - - - - - - - - Giới thiệu chung Lịch sử Từ đầu kỷ 19 bệnh truyền nhiễm chiếm phần lớn bệnh người động vật Tỷ lệ tử vong nhiễm trùng cao, đặc biệt chiến tranh Nửa sau thể kỷ 19, người ta phát nguyên nhân từ VSV Con người bắt đầu tập trung tìm hiểu lồi vi sinh vật phương pháp điều trị bệnh vi sinh vật gây Vào năm 1928 Fleming phát chất kháng sinh Penicillin, dùng điều trị năm 1940 Penicillin mở kỷ nguyện điều trị bệnh vi sinh vật gây Từ năm 1940 đến năm 1960, nhiều kháng sinh phát hầu hết từ xạ khuẩn, trở thành thời kỳ vàng son cho q trình tổng hợp cững nhưu điều trị chất kháng sinh Và năm 1952 chất kháng sinh Erythromycin phát Erythromycin chất kháng sinh tiêu biểu sử dụng phổ biến nhóm macrolide Đặc điểm cấu tạo CTPT : C37H67NO13 Khối lượng phân tử: 733,93 g/mol Liên kết protein: 90% Erythromycin base hỗn hợp ba chất erythromycin A, B,C chủ yếu erythromycin A A C37H67NO13OHCH3 B C37H67NO12HCH3 C C36H65NO13OHH Macrolide nhóm kháng sinh có cấu trúc aglycon, nhân lacton,vòng gồm 12-19 C, chiết từ môi trường nuôi cấy nấm streptomyces có chế tác dụng phổ tác dụng giốnng Erythromycin gồm phân tử đường gồm desosamin cladinose gắn vào Erythronolide Trong nhóm có phân nhóm: + Macrolide thực thụ (erythromycin thuộc nhóm này) + Macrolide dùng nhiều đường nối đơi, có vòng lacton thường khơng có nhánh methyl, chứa nhât nối đôi liên hợp + Macrolide phân tử có vòng lớn chứa nhân trơn - Macrolide dungf nhiều đường nối đơi, có vòng lacton, thường khơng có nhánh metyl, chứa cặp đơi liên hợp, nhóm thường kháng sinh chống nấm: ntain, amphotericin B, grycefulvin,… Tính chất Erythromycin base dạng bột tinh thể màu trắng ánh vàng , dễ hút ẩm , tan nước ( độ tan giảm nhiệt độ tăng ) , tan nhiều dung môi hữu cơ: ethanol , methanol , tan acid lỗng Erythromycin hoạt hóa pH kiềm pH trung tính khơng bền pH acid Erythromycin có tác dụng diệt khuẩn tốt loài vi khuẩn Gram [+] hiệu việc chữa trị nhiễm khuẩn Staphylococcus mà kháng lại Penicillin Mycoplasma, Staphylococcus, Streptococcus, Neisseria, Haemophylus, Corynebacterium, Listeria, Pasteurella multocida, Brucella, Rickettsia, Treponema nhạy cảm với erythromycin Erythromycin có phổ tác dụng rộng với vi khuẩn gây bệnh chủ yếu kiềm khuẩn VK gram dương, gram âm vi khuẩn khác bao gồm Mycoplasma, Spirochetes, Chlamydia, Rikettsia, khơng có tác dụng vi khuẩn ưa khí gram âm - - - Cơ chế tác dụng *** Erythromycin macrolid khác gắn thuận nghịch với tiểu đơn vị 50S ribosom vi khuẩn ức chế peptidin-tranferate trình tổng hợp protein vi khuẩn, không ức chế tế bào vậ chủ - Tác dụng erythromycin kìm khuẩn diệt khuẩn nồng độ cao chủng nhạy cảm Tác dụng thuốc tăng lên pH kiềm nhẹ (khoảng 8,5), đặc biệt với vi khuẩn Gram âm - Nhóm Macrolide có tác dụng đối kháng với Cloramphenicol, lincosamide, ngồi đối kháng với nhóm beta-lactamin Nhưng lại kết hợp với nhóm Tetracilin (trong điều trị tụ cầu liên cầu khuẩn), Rifampicin ( điều trị bệnh lao) - Sau tiếp xúc vài với thuốc erythromycin tích lũy vi khuẩn, lúc vi khuẩn không tiếp tục phát triển được, khả gây bệnh, dễ bị thực bào khả phòng vệ vật chủ Tính kháng thuốc Kháng tự nhiên gồm vi khuẩn gram âm hiếu khí Kháng thu được: + Do thay đổi sinh hóa tiểu phần 50s Bản chất thể kháng đột biến gen có cấu trúc tương ứng với hay nhiều protein 50s, từ vi khuẩn kháng thuốc trở nên dột biến - + Kháng mắc phải có nguồn gốc ngồi thể nhiễm sắc phổ biến, gồm tụ cầu, liên cầu nhóm D, Clostridium perfringens Cơ chế kháng methylase có từ trước hay cảm ứng Macrolide làm xúc tac cho phản ứng dimethyl hóa demin ( xảy giai đoạn 23s tiểu phần 50s ribixom), làm cho riboxom giảm lực với Macrolide làm giảm tác dụng nhóm Macrolide II     - Công nghệ sản xuất Erythromycin Chủng vi sinh Erythromycin tổng hợp từ xạ khuẩn Streptomyces eryhreus Đặc điểm: Xạ khuẩn Streptomyces eryhreus sinh sản vơ tính bào tử, đầu sợi khí sinh hình thành cuống sinh bào tử chuỗi bào tử Xạ khuẩn có cấu tạo giống vi khuẩn gram dương, hiếu khí, dị dưỡng chất hữu Lồi có khả sinh chất kháng sinh Erythromycin Phân lập Streptomyces eryhreus phân lập từ đất từ vườn độ sâu 1020cm, 10 địa điểm khác với khoảng cách từ 5km đến 10km sau trộn phân lập chủng Môi trường phân lập: Môi trường Gauze-1 điều chỉnh(g/ml): + Tinh bột khoai tây 20g + K2HPO4 3g + NaCl 0,5g + MgSO4.7H2O 3g + KNO3 1g + FeSO4.7H2O 0,01g + Agar 20g + Nước cất 1000ml + pH 7-7,2 Hấp khử trùng 1210C 30 phút Tiến hành: + Cân 10g mẫu có chứa xạ khuẩn cho vào bình tam giác chứa 90ml nước cất vơ trùng, khuấy đũa thủy tinh cho tan hết mẫu Pha loãng mẫu đất từ 10-6 -10-8 Dùng pipet vô trùng nhỏ 0,1ml dịch huyền phù pha loãng lên bề mặt môi trường thạch pha Dùng que trang dàn bề mặt môi trường thạch Đậy petri bỏ tủ ấm 28-300C từ 7-14 ngày Quan sát khuẩn lạc có đường kính -   • • mm với màu xám hồng sắc tố màu nâu nhạt Phần khuẩn lạc xuất màu nâu đậm Chọn chủng: + Nhuộm gram: kết có màu xanh đen hay tím + Thử nghiệm thủy phân casein + Xác định hoạt tính amylase + Thử nghiệm endoglucanase Chủng chọn định danh sinh học phân tử Lên men Giống: giống công nghiệp S Erythreus bảo quản lâu dài dạng khô, bảo quản siêu lạnh -70oC bảo quản nito lỏng Nhân giống: giống từ môi trường bảo quản cấy chuyền môi trường thạch hộp để hoạt hóa ni bào tử Dịch huyền phù bào tử thu tiếp tục cấy chuyển tiếp sang mơi trường bình tam giác, sang thiết bị nhân giống nhỏ đến thiết bị nhân giống trung gian… Và cuối thiết bị nhân giống sản xuất Yêu cầu: + Đảm bảo cung cấp đủ giống hoạt lực cao, chất lượng đảm bảo thời điểm cho công đoạn nhân giống + Cung cấp đủ lượng giống đạt yêu cầu kỹ thuật cho lên men sản xuất Thành phần môi trường lên men: (w/v) + Glucose 2,5% + Tinh bột 2,5% + Bột đậu 4,7% + Cao ngô 1% + Cao nấm men 0,5% + (NH4)2SO4 0,3 + NaCl 0,5% + CaCO3 0,2% + COCl2 • Ý nghĩa thành phần lên men: cung cấp nguồn N, C, khoáng giúp xạ khuẩn sinh trưởng phát triển tối ưu, tăng tổng hợp sản xuất lượng kháng sinh lớn - Các thành phần bột đậu, cao ngô, cao nấm men…là nguồn N dinh dưỡng dùng để nuôi cấy vi sinh vật Đối với xạ khuẩn S Erythreus sử dụng cao ngô nhanh cao đậu tương hay khô lạc Cao ngô coi nguồn nito tốc hiệu, có lợi cho sinh trưởng phát triển vi sinh vật (NH4)2SO4: thành phần aminoacid chứa S , số viatmin, glutathione có tác dụng điều chủng oxy hóa khử tế bào - NaCl: Giúp trì áp suất thẩm thấu, trì tính ổn dịnh Sau pha thành phần môi trường phải trùng lọc bơm lên thùng len men -  - - - - - Giai đoạn lên men: Quy trình lên men (của cơng ty Mountaineer Biocorp, Inc,) + E-702: thiết bj trao đổi nhiệt + E-701: Thiết bị làm lạnh khô + V-701: thùng điều chỉnh pH + F-702: Tiết bị lọc thùng quay + R-701: thiết bị lên men + T-701, T-702: thiết bị trích ly Phương pháp lên men: Kỹ thuật lên men chìm Ưu điểm: có khả giới hóa, đại hóa, q trình xảy cách liên tục, kiểm soát yếu tố ảnh hưởng q trình lên men, diện tích sử dụng, cho hiệu suất cao Lên men theo phương thức lên men gián đoạn (72h), tiến hành lên men mẻ, tính tốn pha trộn nguyên liệu theo mẻ cấp vào thùng lên men lấy dịch theo mẻ Vi sinh vật ni cố định bình lên men với thể tích mơi trường xác định Vi sinh vật phát triển theo giai đoạn (pha tiềm phát, pha nhân lên chậm, pha logarit, pha cân bằng, pha suy vong) tạo sản phẩm Kết thúc trình, người ta tiến hành công đoạn cần thiết để thu lấy sản phẩm Phương pháp lên men chu kỳ ứng dụng để sản xuất nhiều hoạt chất quan trọng amino acid, chất kháng sinh Thực theo mẻ nên thường có suất thấp chu kỳ sản xuất bị kéo dài Điều kiện lên men: +Nhiệt độ cho trình lên men: 280C + pH: 7,5 + Thể tích tấp lên men 0,4:1 V kí oxi/dịch men/phút + Độ ẩm: 40-55% Các yếu tố ảnh hưởng: + Nhiệt độ: Đa số xạ khuẩn phát triển tốt 28-30 0C nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng tổng hợp chất kháng sinh nằm khoảng từ 18- 280C Do nhiệt độ cao chất kháng sinh dễ bị phá hủy nên tiến hành nhiệt độ thấp dể xạ khuẩn phát triển tốt khả sinh tổng hợp chất kháng sinh cao Nhiệt độ cho trình lên men 280C + pH: tác động trực tiếp dến tính chất hệ keo tế bào, hoạt lực enzym pH kiềm hay acid ức chế trình sinh tổng hợp chất kháng sinh pH tối ưu cho sinh tổng hợp chất kháng sinh thường pH trung tính Trong lên men Erythromycin pH=7,5 + Oxy: Xạ khuẩn loại vi sinh vật có nhu cầu oxy cao vi sinh khác, giai đoạn nhân giống Thể tích cấp lên men Erythromycin 0,4V khí/V dịch/phút + Độ ẩm thích hợp 40-55% + Tuổi giống: tuổi giống cấy truyền vào môi trường lên men cho hiệu suất chất kháng sinh cao 24 tuổi Lượng giống cấy truyền khoảng 2-10% - - - Tách tinh chế Dịch lên men-> Kiềm hóa-> Lọc ->Trích ly butyl acetat ->Trích ly nước-> Kết tinh-> Sấy Erythromycin tinh khiết Quy trình : Sau lên men, dịch lên men bơm vào thùng V-701 chứa dung dịch NaOH để điều chỉnh pH từ 7,5 lên 10,7 Sau đó, dịch đem lọc thiết bị lọc thùng quay F702, Erythromycin sản phẩm ngoại bào nên hòa tan dịch lên men, lọc thiết bị xác tế bào nằm phía ngồi lưới lọc, cạo bỏ, thu hồi dịch lọc chứa Erythromycin Dịch lọc bơm vào thiết bị trích ly sử dụng dung mơi butylacetat T-701, để loại bỏ chất tan dung môi, Tiến hành trích ly nước pH = T702 để loại chất tan nước Butyl acetat thu hồi T702 tuần hoàn lại sang T701 để tránh lãng phí tránh thải butyl acetat ngồi gây nhiễm mơi trường Nước sau thu T-701 tải sử dụng V-701 Dịch chứa Erythromycin đưa vào thiết bị V-702, dịch trộn với dung dịch NaOH, pH điều chỉnh lên 9,5, cách làm giảm khả hòa tan erythromycin vào dịch kết tinh dễ dàng - - - - III - - IV Tách tinh thể erythromycin cách lọc thiết bị F-703, nước sau lọc sử lý tia UV deion hóa để tái sử dụng Các tinh thể Erythromycin thô trộn với dung dịch aceton thiết bị CR-701, thêm lượng nước thích hợp thêm chất mầm kết tinh hydroxyl methyl cellulose Erythromycin dạng dihydrat lọc lại F-704 sấy D-701 Kiểm định Độ chuẩn erythromycin sản xuất bình lắc máy tạo bioreactor S erythraea xác định cách sử dụng phương pháp thử nghiệm sinh học thơng thường với thương mại erythromycin sẵn có tiêu chuẩn: + Rót 35 mL mơi trường TSB vào đĩa Petri (12 x 12 cm) + Một môi trường kiên cố, thêm lớp thứ hai bao gồm 35 mL môi trường TSB chứa 35 μL vi khuẩn Micrococcus luteus qua đêm (nuôi 18 30 ° C LB) + Xác định mức độ erythromycin cách chuyển 10 gmL dịch bề mặt nuôi cấy (hoặc pha lỗng thích hợp methanol) đĩa thử nghiệm kháng sinh đặt lên kiểm tra Sau 48 ủ 30°C, vùng ức chế phát triển M luteus đo độ mịn erythromycin (g / L) tính đường cong chuẩn Ứng dụng Y học : Erythromycine dùng để điều trị nhiều dạng bệnh nhiễm trùng vi khuẩn bệnh giang mai, bệnh nhiễm trùng đường hô hấp, bệnh viêm phế quản, bệnh nhiễm trùng Chlamydia, bệnh Lyme, bệnh viêm phổi Legionella, nhiễm trùng viêm nội tâm mạc, chuẩn bị phẫu thuật ruột, bệnh dự phòng sốt thấp khớp, trẻ em mắc bệnh ho gà, viêm kết mạc; viêm giác mạc; lúa mạch (meybolit); chlamydia; blahoma; viêm bờ mi vi khuẩn Làm đẹp : trị mụn trứng cá có viêm mụn mủ, mụn bọc, mụn viêm, tổn da ( dạng bôi, mỡ) sẹo mụn, vết thâm mụn để lại Tài liệu tham khảo Nguyễn Văn Cách 2000, Công nghệ lên men hợp chất kháng sinh, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Từ Minh Koong 2007, Kỹ thuật sản xuất dược phẩm tập II, Nhà xuất Y học https://tusach.thuvienkhoahoc.com/wiki/Erythromycin http://duocdien.net/sinh-tong-hop-erythromycin/ https://text.123doc.org/document/3411212-cong-nghe-san-xuat-chatkhang-sinh-erythomycin.htm http://www.benhhoc.com/thuoc/181-Erythromycin.html http://doc.edu.vn/tai-lieu/de-tai-nghien-cuu-tach-chiet-va-tim-hieutinh-chat-cua-khang-sinh-co-nguon-goc-tu-mot-so-chung-xa-khuanphan-lap-o-thai-11533/ https://docslide.net/documents/tl-khang-sinh.html https://www.dieutri.vn/e/erythromycin/#ixzz5CwJoXEfG 10 https://vi.scribd.com/doc/242594068/%C4%90%E1%BA%A1i-c %C6%B0%C6%A1ng-Khang-sinh-Macrolid-va-so-sanh-gi%E1%BB %AFa-erythromycin-clarithromycin-azithromycin 1 - - Trả lời câu hỏi bổ sung: Tác dụng phụ kháng sinh: Hiếm có phản ứng không mong muốn nặng Khoảng - 15% người bệnh dùng erythromycin có tác dụng khơng mong muốn Phổ biến vấn đề tiêu hóa, đặc biệt với liều cao kích ứng chỗ, tránh cách truyền chậm (tối đa ml/phút) Có nhận xét dung dịch tiêm có chứa cồn benzylic làm chất bảo quản gây độc cho hệ thần kinh, nên không dùng cho trẻ nhỏ Thường gặp: + Ðau bụng, nôn mửa, tiêu chảy, biếng ăn + Ngoại ban + Viêm tĩnh mạch đau chỗ tiêm Ít gặp: Mày đay Hiếm gặp: + Phản ứng phản vệ + Loạn nhịp tim + Transaminase tăng, bilirubin huyết tăng, ứ mật gan + Ðiếc, có hồi phục + Một số tác dụng khơng mong muốn hồi phục, cách xử trí ngừng thuốc Sự ảnh hưởng yếu tố ảnh hưởng tới trình lên men tinh chế: Các yếu tố nhiệt độ, độ pH, độ thơng khí,tuổi giống… thông số nêu điều kiện tối ưu để trình sản xuất kháng sinh đạt hiệu suất cao nhất, không gây biến đổi kháng sinh + Nhiệt độ: Đa số xạ khuẩn phát triển tốt 28-30 0C nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng tổng hợp chất kháng sinh nằm khoảng từ 18280C Do nhiệt độ cao chất kháng sinh dễ bị phá hủy nên tiến hành nhiệt độ thấp dể xạ khuẩn phát triển tốt khả sinh tổng hợp chất kháng sinh cao Do vậy, nhiệt độ cho trình lên men 280C thích hợp + Độ ẩm thích hợp 40-55% + pH: Độ pH môi trường chuẩn bị cần phải nằm phạm vi nhà sản xuất nêu ra, thường trung tính, pH tăng hay giảm kích thước vòng ức chế bị thay đổi, với mức độ thay đổi xác định nhóm kháng sinh, tăng pH làm tăng đường kính vòng ức chế cho Macolid pH trung tính kiềm yếu, acid yếu, giới hạn pH khoảng 6,87,5 Vì nơi có pH acid kiềm thường có xạ khuẩn, đó, với pH=7,5 điều kiện tối ưu giúp xạ khuẩn sinh trưởng phát triển tốt nhất, từ tăng lượng kháng sinh mong muốn Thay đổi pH thay đổi điểm đẳng điện chất tan đó, điểm đẳng điện phù hợp có chất tan chất tủa + Độ thơng khí: Xạ khuẩn S Erythreus vi khuẩn hiếu khí có nhu cầu thơng khí cao so với VSV khác, giai đoạn nhân giống (khhoangr từ 6-12h q trình ni cấy) Do đó, yếu tố thơng khí có ảnh hưởng định đến sinh tổng hợp chất kháng sinh, tối ưu 0,4V khí/V dịch.phút - - - Trong chế ức chế tổng hợp protein Erythromycin xảy q trình thực bào: + Erythromicin gắn vào vị trí “cửa vào” tARN mang axit amin, chặn đường tổng hợp protein vi khuẩn Điều khiến vi khuẩn không sản sinh sản phẩm có chất protein enzyme sinh trưởng, ezyme phân giải, độc tố, … không trám-sửa lại lão hóa bào quan… Vi khuẩn yếu đi, dễ bị kháng thể thể bắt giữ, dẫn tới tế bào bạch cầu trung tính dễ dàng thâu tóm bắt giữ, tiêu diệt vi khuẩn, →làm tăng khả thực bào + Tuy nhiên thực bào hướng hoạt động Erythromycin Bản thân Erythromycin có tính kìm hãm tăng sinh vi khuẩn, với liều cao, gây nhiễm độc nên dễ dàng diệt khuẩn Cơ chế tác dụng chế đề kháng kháng sinh vi khuẩn: Erythromycin kháng sih thuộc nhóm Macrolide chúng gắn với tiểu phàn 50S ribosom, ngăn cản dịch chuyển robosom từ codon tới codon kế tiếp, kết trình dịch mã bị cản trở tổng hợp protein bị dừng lại Cơ chế đề kháng kháng sinh: Phần tinh chế có sử dụng NaOH tác dụng việc sử dụng NaOH: Sử dụng NaOH nhằm tăng độ pH dung dịch, pH tác động trực tiếp đến tính chất hệ keo tế bào, hoạt lực enzym pH kiềm hay acid ức chế trình sinh tổng hợp chất kháng sinh Erythromycin kháng sinh nằm sinh khối tế bào nên chiết rút acid hữu cơ, sử dụng Butyl acetat - Để loại sinh khối tế bào, pH dịch nuoi cấy có ảnh hưởng quan trọng ảnh hưởng lớn đến việc chất kháng sinh môi trường nhiều hay tích tụ sinh khối nhiều Ở đây, lên men điều chỉnh pH tăng từ 7,5 lên 10,5 nhằm tạo mơi trường kiềm để kháng sinh tích tụ sinh khối nhiều Trích ly nước với pH=5 làm cho kháng sinh môi trường nhiều hơn, sau thu hồi dịch lại trộn tiếp với NaOH nhằm tăng độ pH làm giảm khả hòa tan erythromycin vào dịch kết tinh dễ dàng Trong trình tách tinh chế có sử dụng Butylacetat để trích ly trước, sau trích ly nước: + Dịch lọc bơm vào thiết bị trích ly sử dụng dung mơi hữu butylacetat erythromycin sản phẩm ngoại bào nên hòa tan dịch, sau thu dịch tiếp tục sử dụng nước để kết tủa erythromycin thu sinh khối đem kết tinh sấy thu lượng kháng sinh erythromycin tinh khiết  ... nhiều kháng sinh phát hầu hết từ xạ khuẩn, trở thành thời kỳ vàng son cho trình tổng hợp cững nhưu điều trị chất kháng sinh Và năm 1952 chất kháng sinh Erythromycin phát Erythromycin chất kháng sinh. ..   - Công nghệ sản xuất Erythromycin Chủng vi sinh Erythromycin tổng hợp từ xạ khuẩn Streptomyces eryhreus Đặc điểm: Xạ khuẩn Streptomyces eryhreus sinh sản vơ tính bào tử, đầu sợi khí sinh hình... trình sinh tổng hợp chất kháng sinh pH tối ưu cho sinh tổng hợp chất kháng sinh thường pH trung tính Trong lên men Erythromycin pH=7,5 + Oxy: Xạ khuẩn loại vi sinh vật có nhu cầu oxy cao vi sinh