ỨNG DỤNG KỸ THUẬT REAL TIME RTPCR SỬ DỤNG EVAGREEN ĐỊNH LƯỢNG VÀ ĐỊNH CHỦNG VIRÚT GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP TRÊN HEO (PRRSV)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG KỸ THUẬT REAL TIME RT-PCR SỬ DỤNG EVAGREEN ĐỊNH LƯỢNG VÀ ĐỊNH CHỦNG VI-RÚT GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP TRÊN HEO (PRRSV) Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khoá : 2007 – 2011 Sinh viên thực : NGUYỄN VĂN CHÍ Tháng năm 2011 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG KỸ THUẬT REAL TIME RT-PCR SỬ DỤNG EVAGREEN ĐỊNH LƯỢNG VÀ ĐỊNH CHỦNG VI-RÚT GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP TRÊN HEO (PRRSV) Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực PGS.TS TRẦN THỊ DÂN NGUYỄN VĂN CHÍ KS VÕ KHÁNH HƯNG Tháng năm 2011 LỜI CẢM ƠN Lời mà tơi muốn nói là: “Con xin cảm ơn cha mẹ anh chị thật nhiều!” Gia đình ln bên cạnh con, động viên giúp đỡ lần “té ngã” để đứng lên trình dài học tập trong đời Em xin cảm ơn Thầy Cô trường Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh – Bộ mơn Cơng nghệ sinh học tận tình giảng dạy, truyền đạt cho em kiến thức khoa học, kiến thức chuyên ngành, kinh nghiệm quý báu năm học trường tạo cho em nguồn động lực nghiên cứu khoa học Lòng biết ơn chân thành sâu sắc xin gửi đến PGS.TS Trần Thị Dân KS Võ Khánh Hưng, người dành hết nhiệt tâm trách nhiệm để hướng dẫn, dạy em suốt trình thực đề tài Xin chân thành cảm ơn đến ban lãnh đạo Viện Công Nghệ Sinh Học Môi Trường Công ty Nam Khoa giúp đỡ em trình thực đề tài Xin gửi lời cảm ơn đến bạn lớp DH07SH, Đại học quy khóa 2007 2011 quan tâm động viên thời gian học tập thực đề tài Đặc biệt gửi lời cảm ơn đến KS Nguyễn Phan Thành, chị Trang (công ty Nam Khoa) nhóm nghiên cứu bạn Lê Thị Thơm giúp đỡ mặt tinh thần, nguồn động lực lớn trình học tập nghiên cứu i TÓM TẮT Đề tài: “Ứng dụng kỹ thuật real time RT-PCR sử dụng EvaGreen nhằm định lượng và định chủng vi-rút gây bệnh rối loạn sinh sản và hơ hấp heo (PRRSV)” có ý nghĩa quan trọng phòng chống ngăn ngừa lây lan hợi chứng rối loạn sinh sản hô hấp heo Mẫu máu thu thập heo có dấu hiệu nghi ngờ nhiễm bệnh PRRS ly trích RNA virus Quy trình real time RT-PCR dùng để định lượng định chủng RNA virus PRRS mẫu thu thập Phản ứng real time RT-PCR sử dụng chất phát huỳnh quang EvaGreen dựa đường chuẩn plasmid DNA gắn khung đọc mở ORF7 xây dựng Kết thu gồm: Đường chuẩn real time RT-PCR với DNA tạo phương pháp plasmid DNA Toàn vùng ORF7 gen PRRSV gắn vào plasmid pGEM T Easy chuyển vào tế bào chủ E coli DH5α Cặp mồi F7 R7 sử dụng quy trình real time RT-PCR cho phép định chủng định lượng PRRSV hai chủng Bắc Mỹ (NA), Châu Âu (EU) Độ nhạy quy trình real time RT-PCR 101 Tính đặc hiệu phản ứng khẳng định với PCV (porcine circovirus) Phân biệt chủng PRRSV châu Âu PRRSV Bắc Mỹ dựa vào chệnh lệch nhiệt độ Tm phân tích đường cong nhiệt độ nóng chảy Nhiệt độ Tm sản phẩm khuếch đại PRRSV châu Âu 83,4oC PRRSV Bắc Mỹ 84,4oC Lượng PRRSV máu nhiều so với mẫu ngoáy hầu họng từ – tuần tuổi Như quy trình real time RT-PCR sử dụng EvaGreen cho kết nhanh, nhạy, xác việc định chủng định lượng PRRSV mẫu bệnh phẩm Điều giúp cho việc sử dụng vacxin hiệu giảm thiệt hại kinh tế cho người chăn nuôi ii SUMMARY Recently, the Vietnam pig livestock industry has been influenced by infection diseases Especially, porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) which caused by PRRSV is detrimental to economy The thesis: “To establish EvaGreenbased real time RT-PCR assay for quantifying and genotyping porcine reproduction and respiratory virus” plays an important role to control and prevent the widespread of the virus Blood and swab samples taken from swines suspected of PRRSV infection were extracted to get virus RNA The real time RT-PCR protocol was used to quantify and genotype PRRSV RNA in the collected samples A standard curve used in the EvaGreen-based real time RT-PCR assay was created by a plasmid DNA template All the length of ORF7 of PRRSV genome was inserted into pGEM T Easy plasmid Results obtained from the study: A pair of primers F7 and R7 used in the EvaGreen-based real time RT-PCR assay could quantify and distinguish the genotypes of PRRSV The sensibility of the assay was 101 copies The speciality of the assay was confirmed by using PCV (porcine circovirus) Genotyping of EU PRRSV and US PRRSV was based on the differences of Tm when considering melt curve analysis The Tm temperature of EU PRRSV amplification product was 83,4oC and the Tm temperature of US PRRSV amplification product was 84,4oC The number of virus in the blood sample was larger than that of the swab one in the period of – weeks old In conclusion, by using the EvaGreen-based real time RT-PCR assay, we could offer quick, sensitive and accurate results of testing for quantify and genotype PRRSV It helps for using vaccine more effectively and decreases the economic devastation iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT ii SUMMARY iii DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT vii DANH SÁCH CÁC BẢNG viii DANH SÁCH CÁC HÌNH ix Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Yêu cầu 1.3 Nội dung thực Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở heo 2.2 Vi-rút gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp ở heo (PRRSV) 2.2.1 Các chủng PRRSV và sự phân bố của chúng 2.2.2 Cấu trúc phân tử của PRRSV 2.2.2.1 Cấu trúc virion 2.2.2.2 Tổ chức bộ gen của PRRSV 2.2.3 Cơ chế sinh bệnh 10 2.3 Mợt sớ phương pháp chẩn đốn phòng thí nghiệm 11 2.3.1 Chẩn đoán PRRSV môi trường nuôi cấy tế bào 11 2.3.2 Phương pháp kháng thể huỳnh quang và hoá mô miễn dịch 12 2.3.3 Kỹ thuật huỳnh quang gián tiếp 12 2.3.4 Kỹ thuật RT-PCR chẩn đoán PRRSV 12 2.4 Kỹ thuật real time RT-PCR 13 2.4.1 Kỹ thuật real time PCR 13 2.4.1.1 Nguyên tắc kỹ thuật real time PCR 13 2.4.1.2 Hóa chất định lượng 14 2.4.1.3 Công cụ phát 19 2.4.1.4 Phân tích liệu real time PCR 19 2.4.1.5 Ưu nhược điểm 23 iv 2.4.1.6 Ứng dụng 23 2.4.2 Phương pháp tổng hợp cDNA với mồi ngẫu nhiên 24 2.5 Sơ lược nghiên cứu có liên quan 24 2.5.1 Trên giới 24 2.5.2 Trong nước 25 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 26 3.2 Nội dung nghiên cứu 26 3.3 Vật liệu hóa chất 26 3.3.1 Vật liệu nghiên cứu 26 3.3.2 Hóa chất 26 3.4 Phương pháp tiến hành 28 3.4.1 Thu nhận mẫu 28 3.4.2 Ly trích RNA từ huyết 29 3.4.3 Đánh giá đoạn mồi dùng phản ứng real time RT-PCR 30 3.4.3.1 Đánh giá khả khuếch đại đoạn mồi 32 3.4.3.2 Đánh giá khả khuếch đại đoạn mồi 32 3.4.4 Xây dựng đường chuẩn (standard curve) 32 3.4.5 Thực phản ứng real time RT-PCR 34 3.4.5.1 Phản ứng phiên mã ngược (reverse transcription) 34 3.4.5.2 Phản ứng real time PCR 34 3.4.5.3 Đánh giá khả định lượng phương pháp real time RT-PCR 35 3.4.5.4 Đánh giá khả định chủng phương pháp real time RT-PCR 36 3.4.6 Ứng dụng phương pháp real time RT-PCR để kiểm tra mầm bệnh PRRS 36 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 4.1 Đánh giá đoạn mồi dùng phản ứng real time RT-PCR 38 4.2 Xây dựng đường chuẩn 39 4.2.1 Phản ứng RT-PCR khuếch đại vùng gen chứa ORF7 40 4.2.2 Kiểm tra plasmid chèn đoạn gen ORF7 40 4.2.2.1 Ly trích plasmid từ khuẩn lạc 41 4.2.2.2 Kiểm tra plasmid DNA PCR 41 4.3 Kết thực real time RT-PCR 42 v 4.3.1 Đánh giá khả định lượng phương pháp real time RT-PCR 42 4.3.2 Tính đặc hiệu phản ứng real time RT-PCR 45 4.3.3 Kết phân tích đường cong nhiệt độ nóng chảy định chủng PRRSV 46 4.4 Ứng dụng phương pháp real time RT-PCR để định chủng định lượng PRRS 47 4.4.1 Định lượng 47 4.4.2 Định chủng 48 Chương V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 52 5.1 Kết luận 52 5.2 Đề nghị 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 I Tiếng Việt 53 II Tiếng Anh 53 PHỤ LỤC vi DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT aa Acid amin cDNA Complementary deoxyribonucleotide acid Ct Threshold cycle dNTP Deoxyribonucleoside triphosphate EDTA Ethylene diamine tetra acetic acid EU European IFA Indirect flourescent antibody IPMA Immunoperoxidase monolayer assay LOD Limit of detection MSD Mystery swine disease NA North American ORF Open reading frame PAMs Porcine alveolar macrophage PRRS Porcine reproductive and respiratory syndrome virus qPCR PCR quantitative RNA Ribonucleic acid RT-PCR Reverse transcriptase polymerase chain reaction TBE Tris borate EDTA TE Tris EDTA UTR Untranlated region vii DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1 Tỉ lệ tương đồng về trình tự gen của các chủng PRRSV .6 Bảng 3.1 Nguồn mẫu nghiên cứu 28 Bảng 3.2 Cặp đoạn mồi phản ứng real time RT-PCR 31 Bảng 3.3 Thành phần chất phản ứng phiên mã ngược .34 Bảng 3.4 Quy trình nhiệt của phản ứng phiên mã ngược 34 Bảng 3.5 Thành phần phản ứng real time PCR .34 Bảng 3.6 Chu kỳ nhiệt phản ứng real time PCR 35 Bảng 4.1 Phân tích sản phẩm khuếch đại mẫu vacxin trình tự tham khảo .39 Bảng 4.2 Hệ số biến động giá trị Ct 43 Bảng 4.3 Kết định lượng số mẫu thực địa, vacxin, dịch tế bào nuôi cấy 48 Bảng 4.4 Nhiệt độ nóng chảy sản phẩm khuếch đại mẫu xét nghiệm .50 viii Phụ luc Bảng thống kê thành phần loại nucleotide chiều dài sản phẩm khếch đại chủng PRRSV Bắc Mỹ Chủng PRRSV Bắc Mỹ 82DMVN VD/BRVT/VN 3428DNVN 07BJ 07HEBTJ 07HEN 07/QN/VN SY0608 T2HCMVN T5HHCMVN CH-1A HB-2 P129 INGELVAC PRRS JA142 1/BRVT/VN 6/BRVT/VN PRIMEPAC SP F1 HN1 BS-PS100 PA8 BJ-4 RESPPRRS MLV PL97-1 01NP1.2 S1 VR-2332 Trung bình Standard Deviation T(U) 21,3 21,3 20,9 20,9 20,6 20,6 20,6 21,3 20,6 21,3 21,3 19,9 20,6 20,3 21,3 21,3 22,9 22,9 21,3 21,3 22,3 21,6 21,6 21,6 21,6 21,6 21,6 21,6 21,9 21,3 0,678 C 25,6 25,6 25,6 25,6 25,9 25,9 25,9 25,2 25,9 25,2 25,2 26,9 26,2 26,9 26,6 26,6 25,2 25,2 26,6 26,6 24,9 25,9 25,6 25,6 25,6 25,6 25,6 25,6 25,2 25,8 0,542 A 26,9 26,9 27,2 27,2 27,2 27,2 27,6 27,2 26,9 27,2 27,2 26,9 26,2 26,6 26,9 26,9 26,6 26,6 27,6 27,6 27,9 27,6 27,9 27,9 27,9 27,9 27,9 27,9 27,9 27,3 0,495 G 26,2 26,2 26,2 26,2 26,2 26,2 25,9 26,2 26,6 26,2 26,2 26,2 26,9 26,2 25,2 25,2 25,2 25,2 24,6 24,6 24,9 24,9 24,9 24,9 24,9 24,9 24,9 24,9 24,9 25,6 0,710 Chiều dài 301,0 301,0 301,0 301,0 301,0 301,0 301,0 301,0 301,0 301,0 301,0 301,0 301,0 301,0 301,0 301,0 301,0 301,0 301,0 301,0 301,0 301,0 301,0 301,0 301,0 301,0 301,0 301,0 301,0 301,0 Phụ lục Danh sách chủng PRRSV tham khảo NCBI * sơ đồ sinh chủng PRRSV Chủng vi-rút Nơi phân lập Năm phân lập Type Mã số Genbank Genome ORF7 01NP1.2 Thailand MLV Resp USA 1999 NA AF159149 PA8 Canada 2000 NA AF176348 PL97-1 Korea 1997 NA AY585241 VR-2332 USA 1993 NA U87392 P129 USA 2002 NA AF494042 LV4.2.1 Netherlands 2004 EU AY588319 Vaccine NA AF066183 SP USA NA AF184212 Prime Pac Vaccine NA DQ779791 Spain EU DQ324698 Porcilis PRRS Netherlands EU DQ324710 Ingelvac PRRS Germany NA 07QN/VN Quảng Nam RespPRRS MLV AmervacPRRS/A3 DQ056373 2007 * số trình tự chưa cơng bố EF532801.1 FJ394029.1 Phu lục Kết giải trình tự đoạn gen ORF7 loại vacxin AmerVac Vacxin IngelVac Trình tự nucleotide đoạn gen ORF7 vacxin AmerVac Trình tự xi Trình tự ngược Trình tự nucleotide đoạn gen ORF7 vacxin IngelVac Trình tự xi Trình tự ngược Phụ lục Kết giải trình tự sản phẩm khuếch đại sau phản ứng PCR kiểm chứng Trình tự xi Trình tự ngược Phụ lục Phân tích nhiệt độ nóng chảy hai PRRSV châu Âu PRRSV Bắc Mỹ Bảng Bảng ANOVA thí nghiệm phân tích nhiệt độ nóng chảy hai PRRSV châu Âu PRRSV Bắc Mỹ số liệu bảng 4.4 ANALYSIS OF VARIANCETABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 17 5,321 0,313 70,432 0,0000 Within 36 0,160 0,004 Total 53 5,481 Coefficient of Variation = 0,08% Var VARIABLE No.2 Number Sum Average SD SE -1 3,00 253,400 84,467 0,12 0,04 3,00 253,200 84,400 0,00 0,04 3,00 253,200 84,400 0,00 0,04 3,00 253,200 84,400 0,00 0,04 3,00 253,200 84,400 0,00 0,04 3,00 253,200 84,400 0,00 0,04 3,00 253,200 84,400 0,00 0,04 3,00 253,200 84,400 0,00 0,04 3,00 253,800 84,600 0,00 0,04 10 3,00 253,600 84,533 0,12 0,04 11 3,00 252,800 84,267 0,12 0,04 12 3,00 253,200 84,400 0,00 0,04 13 3,00 252,800 84,267 0,12 0,04 14 3,00 253,200 84,400 0,00 0,04 15 3,00 250,600 83,533 0,12 0,04 16 3,00 250,200 83,400 0,00 0,04 17 3,00 253,800 84,600 0,00 0,04 0,12 0,04 18 3,00 253,400 84,467 -Total 54,00 4553,200 84,319 0,32 0,04 Within 0,07 Bảng Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm phân tích nhiệt độ nóng chảy hai PRRSV châu Âu PRRSV Bắc Mỹ số liệu bảng 4.4 Duncan's Multiple Range Test LSD value = 0,1404 s_ = 0,03651 at alpha = 0,010 x Original Order Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean 10 11 12 13 14 15 16 17 18 = = = = = = = = = = = = = = = = = = 84,47 84,40 84,40 84,40 84,40 84,40 84,40 84,60 84,60 84,53 84,27 84,40 84,27 84,40 83,53 83,40 84,60 84,47 Ranked Order AB BC BC BC BC BC BC A A AB C BC C BC D D A AB Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean 17 10 18 12 14 11 13 15 16 = = = = = = = = = = = = = = = = = = 84,60 84,60 84,60 84,53 84,47 84,47 84,40 84,40 84,40 84,40 84,40 84,40 84,40 84,40 84,27 84,27 83,53 83,40 A A A AB AB AB BC BC BC BC BC BC BC BC C C D D ... NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG KỸ THUẬT REAL TIME RT-PCR SỬ DỤNG EVAGREEN ĐỊNH LƯỢNG VÀ ĐỊNH CHỦNG VI-RÚT GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP TRÊN HEO (PRRSV). .. LIỆU 2.1 Hô i chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở heo 2.2 Vi-rút gây hô i chứng rối loạn sinh sản hô hấp ở heo (PRRSV) 2.2.1 Các chủng PRRSV và sự phân bố... 2.1 Hợi chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở heo Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp (PRRS) bệnh xảy heo với đặc điểm gây sẩy thai heo nái rối loạn đư ờng hô hấp heo sơ sinh heo choai