KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG NỒNG ĐỘ NaOCl, BA VÀ NAA ĐẾN KHẢ NĂNG VÀO MẪU, TÁI SINH CHỒI VÀ TẠO RỄ CÂY CHUỐI LABA (Musanensis L. Var GiantCavendishii) IN VITRO

Xuất phát từ những thực tiễn trên, đề tài: “Khảo sát ảnh hưởng nồng độ NaOCl , NAA và BA đến khả năng vào mẫu, tái sinh chồi, tạo rễ cây chuối Laba Musanensis L.. Gồm các kỹ thuật như s

KHÓA LU ẬN TỐT NGHIỆP

Đề tài

KHẢ NĂNG VÀO MẪU, TÁI SINH CHỒI VÀ TẠO RỄ CÂY CHU ỐI LABA (Musanensis L Var GiantCavendishii)

KH ẢO SÁT ẢNH HƯỞNG NỒNG ĐỘ NaOCl, BA VÀ NAA ĐẾN KHẢ NĂNG VÀO MẪU, TÁI SINH CHỒI VÀ TẠO RỄ CÂY CHUỐI LABA (Musanensi L Var Giant Cavendishii)

IN VITRO

Tác giả

Nguyễn Tuyết Nhung Tường

Khóa luận đệ trình để đáp ứng nhu cầu cấp bằng kỹ sư ngành Nông học

Gi ảng viên hướng dẫn

THS HỒ TẤN QUỐC

Tháng 07/ 2012

L ỜI CẢM ƠN

Con xin thành kính khắc ghi công ơn cha mẹ đã sinh thành, dưỡng dục con nên người, trân trọng biết ơn anh chị em và những người thân trong gia đình đã hết lòng yêu thương, động viên và tạo điều kiện thuận lợi cho con có được như ngày hôm nay

Em xin chân thành cảm ơn thầy Hồ Tấn Quốc - Khoa Nông học trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tập và thực hiện khóa luận tốt nghiệp

Em xin chân thành cảm ơn:

 Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh

 Ban chủ nhiệm khoa, các thầy cô khoa Nông Học Trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minhđã truyền đạt cho em những kiến thức bổ ích trong

suốt thời gian học tập tại trường

 Quý thầy cô trong bộ môn Di truyền – Giống khoa Nông học đã tạo điều

kiện cho em trong suốt thời gian làm đề tài

 Các anh, chị và các bạn trong và ngoài lớp đã luôn động viên và tận tình giúp đỡ em trong thời gian hoàn thành khóa luận

Xin chân thành cảm ơn!

Tp Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2012

Sinh viên

Nguyễn Tuyết Nhung Tường

TÓM T ẮT

Đề tài nghiên cứu “Khảo sát ảnh hưởng nồng độ NaOCl, BA và NAA đến

khả năng vào mẫu, tái sinh chồi, tạo rễ cây chuối Laba (Musanensis L Var Giant Cavendishii) in vitro” được tiến hành tại phòng nuôi cấy mô, bộ môn Di truyền Giống – Khoa Nông Học – Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh từ tháng 02/2012 đến tháng 06/2012 Thí nghiệm đơn yếu tố (thí nghiệm 2, 4) và 2 yếu tố (thí nghiệm 1, 3) được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại nhằm đánh giá tác động

của chất khử trùng NaOCl và chất kích thích sinh trưởng (BA, NAA)

Kết quả thu được như sau:

Xử lý mẫu bằng NaOCl với nồng độ 1 NaOCl : 2 H2O trong 10 phút cho tỷ lệ

mẫu hồi xanh cao nhất với 76,0% và tỷ lệ mẫu bật chồi 70,4%

Ở giai đoạn 50 NSC ở mức 5mg BA/l có số chồi đạt cao nhất xvới 2,7 chồi/mẫu, chiều cao cây đạt 37,6 mm/chồi và thấp nhất là nghiệm thức đối chứng không bổ sung BA đạt 0,7 chồi/mẫu với chiều cao chồi 17 mm/chồi

Ở nồng độ 0,5 mg/l NAA + 5 mg/l BA cho kết quả cao nhất về chiều cao chồi 5,5 mm/chồi (10NSC), 25,4 mm/chồi (20NSC), 39,5 mm/chồi (30NSC), 43,4 mm/chồi (40NSC), 70,9 mm/chồi (50NSC) Nồng độ 0,5 mg/l NAA + 5 mg/l BA cũng cho kết quả tốt nhất về số lá đạt cao nhất ở NT3 và NT9 6,6 lá/chồi, thấp nhất là NT4 (4,6 lá/chồi)

Các mức nồng độ NAA ảnh hưởng rất có ý nghĩa đến sự hình thành rễ và sự phát triển rễ của cây Mức nồng độ 2 mg NAA/l cho kết quả tốt nhất về sự hình thành rễ (14,1 rễ/cây) và nồng độ 0,5 mg NAA/l tác động rất tốt đến sự tăng trưởng chiều dài rễ (225,5 mm/rễ)

M ỤC LỤC

Trang

TRANG TỰA i

LỜI CẢM ƠN II TÓM TẮT III DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT VII DANH SÁCH CÁC BẢNG VIII DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ IX CHƯƠNG 1MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu của đề tài 2

1.3 Yêu cầu của đề tài 2

CHƯƠNG 2TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu về cây chuối 3

2.1.1 Phân loại 3

2.1.2 Nguồn gốc và phân bố 4

2.1.3 Đặc điểm thực vật học của cây chuối 4

2.1.3.1 Rễ chuối 4

2.1.3.2 Thân chuối 4

2.1.3.3 Lá chuối 5

2.1.3.4 Hoa và quả chuối 6

2.1.4 Điều kiện sinh thái của cây chuối 7

2.1.5 Một số giống chuối ở nước ta 8

2.1.5.1 Chuối ngự 8

2.1.5.2 Nhóm chuối tiêu (Cavendish) 9

2.1.5.3 Nhóm chuối tây (chuối sứ, chuối xiêm) 9

2.1.5.4 Chuối bom 9

2.1.5.5 Chuối ngốp 10

2.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ chuối trên thế giới và Việt Nam 10

2.2.1 Tình hình sản xuất 10

2.2.2 Tình hình tiêu thụ chuối: 12

2.3 Tình hình nghiên cứu chuối 13

2.3.1 Tình hình nghiên cứu của thế giới 13

2.3.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam 13

2.4 Giới thiệu về nuôi cấy mô tế bào thực vật: 15

2.4.1 Tầm quan trọng của kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật 15

2.4.2 Các bước nhân giống in vitro 15

2.4.2.1 Chọn lựa và khử trùng mẫu cấy 15

2.4.2.2 Tạo thể nhân giống in vitro 16

2.4.2.3 Nhân giống in vitro 16

2.4.2.4 Tái sinh cây in vitro hoàn chỉnh 16

2.4.2.5 Chuyển cây con in vitro ra vườn ươm 16

2.4.3 Ưu và nhược điểm của phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật 17

2.4.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô thực vật 18

2.4.4.1 Ảnh hưởng của mẫu cấy 18

2.4.4.2 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy 21

2.4.5 Nuôi cấy mô tạo ra cây hoàn chỉnh 24

2.4.5.1 Nuôi cấy nốt đơn thân 24

2.4.5.2 Nuôi cấy chồi bên 24

2.4.5.3 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng 25

2.4.5.4 Nuôi cấy bao phấn và hạt phấn 25

2.4.6 Một số hệ thống nuôi cấy mới 26

2.4.6.1 Nuôi cấy lỏng có sục khí – Bioreactor 26

2.4.6.2 Nuôi cấy quang tự dưỡng 26

CHƯƠNG 3VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 27

3.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 27

3.2.1 Giống 27

3.2.2 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 27

3.2.2.1 Trang thiết bị thí nghiệm 27

3.2.2.2 Môi trường cơ bản dùng trong thí nghiệm 29

3.3 Phương pháp nghiên cứu: 30

3.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian khử trùng và nồng độ hyponatri chlorua đến khả năng vào mẫu của cây chuối Laba 30

3.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng tạo chồi của chuối Laba trong nuôi cấy invitro 32

3.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NAA và BA đến khả năng sinh trưởng và phát triển của cây chuối Laba 33

3.3.4 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của chuối Laba trong nuôi cấy invitro 34

CHƯƠNG 4KẾT QUẢ THẢO LUẬN 4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng các nồng độ của Natri hypchlorite và thời gian khử trùng đến khả năng vào mẫu thân chuối Laba 36

4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của BA đến khả năng tạo chồi và phát triển chồi của mẫu thân chuối Laba invitro 40

4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng các nồng độ của BA và NAA đến khả năng sinh trưởng của mẫu thân chuối Laba invitro 44

4.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng các nồng độ của NAA đến sự hình thành rễ ở cây chuối Laba invitro 50

CHƯƠNG 5KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận 56

5.2 Đề nghị 56

TÀI LIỆU THAM KHẢO 58

PHỤ LỤC 61

DANH SÁCH CÁC CH Ữ VIẾT TẮT

DANH SÁCH CÁC B ẢNG

Trang

Bảng 3.1: Ảnh hưởng của thời gian và nồng độ Natri hypoclorua đến khả năng

vào mẫu của chuối laba 30

Bảng 4.1a: Ảnh hưởng của nồng độ NaOCl và thời gian khử mẫu đến tỷ lệ mẫu

sạch và và mẫu nhiễm của chuối Laba 37

B ảng 4.1b: Ảnh hưởng của nồng độ NaOCl và thời gian khử mẫu đến tỷ lệ hồi

xanh và bật chồi của cây chuối Laba 39

Bảng 4.2a: Ảnh hưởng của liều lượng BA đến hệ số nhân chồi (chồi/mẫu) chuối

gìa lùn Laba in vitro 41

Bảng 4.2b: Ảnh hưởng của BA đến chiều cao chồi (mm/chồi) chuối gìa lùn Laba

in vitro 42

B ảng 4.3a: Ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến sự tăng trưởng chiều cao

chồi (mm/chồi) chuối Laba in vitro 45

Bảng 4.3b: Ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến sự tăng trưởng số lá

(lá/chồi) chuối Laba in vitro 47

Bảng 4.3c: Ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến sự tăng trưởng diện tích lá

(mm2/ lá) chuối Laba in vitro 49

Bảng4.4a: Ảnh hưởng của NAA đến số rễ chuối già lùn Laba qua các giai đoạn 50 Bảng4.4b: Ảnh hưởng của NAA đến chiều dài rễ (mm/rễ) chuối gìa lùn Laba in vitro 52

B ảng4.4c: Ảnh hưởng của NAA đến tỷ lệ ra ngôi thành công (%) của cây chuối

Laba invitro 54

DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BI ỂU ĐỒ

Hình 4.1: Mẫu chuối Laba bật chồi sau 15 ngày quan sát 40

Hình 4.2: Sự tăng trưởng số chồi của cây chuối Laba ở NT6 (BA 5 mg/l) giai đoạn 30 NSC 42

Hình 4.3: Sự tăng trưởng chiều cao chồi chuối Laba ở NT6 (BA 5mg/l) giai đoạn 50 NSC 43

Hình 4.4: Sự sinh trưởng của cây chuối Laba invitro giai đoạn 50 NSC 48

Hình 4.5: Sự tăng trưởng số rễ cảu cây chuối Laba ở NT5 (NAA 2 mg/l) giai đoạn 50 NSC 51

Hình 4.6: Sự tăng trưởng chiều dài rễ chuối Laba ở NT2 ( NAA 0,5 mg/l) giai đoạn 50 NSC 53

Hình 4.7: Sinh trưởng của cây chuối Laba 20 ngày sau ra ngôi 55

Biểu đồ 1: Động thái hình thành chồi cây chuối Laba in vitro 65

Biểu đồ 2: Động thái tăng trưởng chiều cao chồi cây chuối Laba in itro 65

Biểu đồ 3:Động thái ra rễ cây chuối Laba in vitro 66

Biểu đồ 4: Động thái tăng trưởng chiều dài rễ cây chuối Laba in vitro 66

Biểu đồ 5: Động thái tăng trưởng chiều cao cây chuối Laba in vitro 67

Biểu đồ 6: Động thái tăng trưởng số lá cây chuối Laba in vitro 67

Chương 1

1.1 Đặt vấn đề

Cây chuối (Musa sp) có nguồn gốc ở Đông Nam Á, trồng chủ yếu ở các nước

nhiệt đới, nhiều nhất là ở châu Á và Trung Mỹ, trong đó đáng kể là Philippines, Malaysia, Trung Quốc (Đảo Hải Nam), Việt Nam, Panama, Hawaii… Trên thế giới chuối là một trong số cây ăn quả được trồng nhiều nhất, cùng với cam quít, nho, táo

Quả chuối có giá trị dinh dưỡng khá cao nhiều đạm, đường, bột, cho nhiều năng lượng nhưng lại dễ tiêu hóa, là một loại thức ăn quý cho con người ở bất kể lứa tuổi nào

Quả, hoa, thân cây, củ, lá và hạt chuối có thể nói hầu hết đều có ích cho con người

Chuối là loại cây ngắn ngày với nhiều công dụng và ít tốn diện tích nên chuối được trồng rất nhiều nơi trong các vườn cây ăn trái và hộ gia đình Trong đó chuối Laba rất dễ trồng, ít tốn công chăm sóc và không phải lo đầu ra cho sản phẩm Nhưng hiện nay, diện tích chuối Laba chính hiệu đang bị thu hẹp dần và có nguy cơ bị thoái hóa do ít được quan tâm trong khâu nhân giống nên đã trở nên già cỗi, thoái hóa, kéo theo năng suất giảm, chất lượng cũng sa sút nghiêm trọng Diện tích chuối Laba chính hiệu ở Phú Sơn, Lâm Hà, Lâm Đồng chỉ còn lại khoảng 20 – 30%, số còn lại là các

giống chuối già lùn Các giống chuối này có nhiều nét giống với chuối Laba nên vẫn hay được gọi chung là “chuối Laba” Đó cũng là một trong những nguyên nhân khiến

uy tín và thương hiệu của chuối Laba đang bị giảm sút và có nguy cơ bị mất gốc

Để có thể xếp chuối vào danh mục những loại cây ăn trái có thể xuất khẩu trên quy mô lớn, cần phải tập trung vào việc nhân giống và cải tiến các giống chuối để có được các giống chuối có sản lượng cao, chất lượng tốt Trồng chuối nuôi cấy mô sạch

bệnh là phương pháp rất hiệu quả và có rất nhiều ưu điểm: giá thành rẻ, dễ vận chuyển, sạch bệnh và nhân nhanh với số lượng lớn.Vì vậy vấn đề này có thể giải quyết được

nhờ công nghệ nhân giống vô tính in vitro

Xuất phát từ những thực tiễn trên, đề tài: “Khảo sát ảnh hưởng nồng độ

NaOCl , NAA và BA đến khả năng vào mẫu, tái sinh chồi, tạo rễ cây chuối Laba

(Musanensis L Var Giant Cavendishii) in vitro” được thực hiện

1.2 Mục tiêu của đề tài

- Xác định thời gian và nồng độ Natri hypoclorua đến khả năng vào mẫu của cây chuối

- Khảo sát ảnh hưởng của BA và NAA khả năng nhân chồi và sinh trưởng của cây chuối in vitro

- Xác định liều lượng NAA thích hợp cho khả năng ra rễ hoàn chỉnh của cây chuối

Laba in vitro

1.3 Yêu cầu của đề tài

- Bố trí thí nghiệm chính quy

- Theo dõi sự ảnh hưởng của Natri hypoclorua đến mẫu cấy

- Tìm ra nồng độ và thời gian khử trùng thích hợp nhất cho quá trình nhân, đưa mẫu vào ống nghiệm

- Theo dõi ảnh hưởng của việc kết hợp BA và NAA đến quá trình hình thành, phát triển của chồi qua từng giai đoạn

- Tìm ra môi trường thích hợp nhất cho quá trình nhân nhanh chồi và ra rễ cho cây chuối

Chương 2

2.1 Giới thiệu về cây chuối

2.1.1 Phân loại

Theo Phạm Văn Duệ (2005), cây chuối (Musa sp) được phân loại như sau:

Ngành: Angiospermae

Lớp: Monocotyledoneae Phân lớp: Zingiberidae

Bộ: Bromeliales Họ: Musaceae Cây chuối ăn thuộc chi Eumusa, thuộc loài Musa paradisiacal Loài này có bộ

nhiễm sắc thể tam bội 3n=33.Loài này được bắt nguồn từ hai loài: loài Musa

Amminata có b ộ nhiễm sắc thể nhị bội 2n=22 và loài Musa Balbisiana có bộ nhiễm sắc

thể nhị bội 2n=22 Chuối tam bội 3n thì không có hạt, chuối nhị bội 2 thì có hạt

Theo Simmond (1996), Chi Emusa có bộ nhiễm sắc thể cơ sở n=11 (để có bộ nhiễm sắc thể tam bội 3n = 33)

( Các chi khác có bộ nhiễm sắc thể cơ sở là n = 10 hoặc 14)

Có 131 giống chuối ăn được xếp trong 9 -1 0 loài của chi Eumusa

2.1.2 Nguồn gốc và phân bố

Chuối có nguồn gốc từ một vùng rộng lớn bao gồm từ Nam Ấn Độ kéo dài đến vùng Queensland Châu Úc đó là vùng Đông Dương, Indonesia, Philippin, Nhật Bản và các đảo của Thái Bình Dương

Hiện nay cây chuối mới được trồng hầu hết ở các vùng nhiệt đới, á nhiệt đới ẩm phân bố từ 300 vĩ độ Nam đến 300 vĩ độ Bắc (Nguyễn Văn Kế, 2005) Theo FAO tổng

diện tích trồng chuối năm 2010 trên thế giới đạt 4.801.991 ha tập trung ở các nước Trung và Nam Mỹ, Châu Á, Châu Phi Những nước trồng nhiều là Brazin, Ecuado, Ấn

Độ, Philippin, Honuras, Colombia, Costarica, Panama, Thái Lan.(Nguồn: FAOSTAT,

Đường kính rễ từ 5,1 – 8,5 mm Mỗi điểm mắt, thân, củ có 1 – 3 rễ Mỗi thân củ

có 200 – 300 rễ, đặc biệt có thể đạt tối đa 1000 rễ Đầu rễ chính bị tổn thương thì mọc

ra chùm rễ tại đó

Nhiệt độ tốt nhất cho rễ sinh trưởng ở ban ngày là 25o

C – 33oC, ban đêm là

18oC – 26oC

2.1.3.2 Thân chu ối

Thân giả là do các bẹ lá chuối mọc dài ôm sát lấy nhau tạo thành một khối trụ tròn nhẵn, cao có thể từ 2 - 5 m

Thân thật là củ chuối nằm trong đất khi phát triển đầy đủ có thể rộng đến 30 cm (ở giống Gros Michel) Phần bên ngoài xung quanh củ chuối được bao phủ bởi những vết sẹo từ bẹ lá cố dạng tròn Ở đáy mỗi bẹ lá đều có một chồi mầm nhưng chỉ khác

chồi ở phần giữa củ đến ngọn củ là phát triển được, có khuynh hướng mọc trồi dần lên Các sẹo bẹ lá mọc rất gần nhau làm thành khoảng cách lóng rất ngắn Thân củ có xu thế to chồi nhô lên khỏi mặt đất, gọi là hiện tượng “trồi gốc” Từ thân củ mọc ra chồi cây con

Khi cây trưởng thành, điểm tăng trưởng ở củ chuối chuyển dạng thành một hoa Trước tiên là làm hẹp thân thật từ 30 cm nhỏ lại còn 5 - 8 cm sau đó vươn dài ra khỏi thân giả cùng với một phát hoa (Nguyễn Văn Tó và Phan Thị Lài, 2005)

2.1.3.3 Lá chuối

Lá chuối bao gồm bẹ lá và phiến lá và cuống lá Từ khi trồng đến khi đốn quày cây chuối mọc ra từ khoảng 70 – 80 lá Các loại lá trên cây gồm:

- Lá vảy: mọc trên chồi lúc còn nhỏ, chỉ có bẹ và gân lá

- Lá mác: lá có bẹ với phiến lá rất nhỏ, hình lưỡi mác

- Lá mo (lá bắc): mọc trên phát hoa (cùi buồng) và trên buồng hoa (bắp chuối)

- Lá bàng: Là loại lá chính của cây, cấu tạo gồm bẹ lá, cuống lá, phiến lá với gân chính và các gân phụ

- Đọt xì gà: là giai đoạn phiến lá chưa nở ra, vẫn còn cuộn tròn lại

 Bẹ lá

Mọc từ thân thật vươn dài lên trên mặt đất Trên thân giả các bẹ lá xếp thành hình xoắn ốc chênh nhau một góc từ 150 – 170 Chân bẹ mở rộng bao quanh củ, khi chết để lại sẹo bị suberin hóa

Ngoài việc đếm lá còn xanh để biết chuối mọc tốt hay xấu, việc quan sát các bẹ chuối mà phiến lá đã khô sẽ biết chuối mọc mạnh hay yếu Ở các cây chuối mọc mạnh thì các bẹ này có khuynh hướng tách nghiêng ra khỏi thân giả Bẹ dính sát vào thân khi cây mọc yếu Bẹ lá thường sống lâu hơn phiến lá, mọc theo hình xoắn ốc, dài tối đa

30 cm mỗi ngày

 Phiến lá

Rất rộng mọc đối xứng qua gân chính, có dạng hình trứng kéo dài Phiến lá dày 0,35 – 1 mm, có gân phụ song song nhau và thẳng gốc với thân chính Tùy giống mà gân phụ nỗi rõ lên hay không Kích thước phiến là còn tùy thuộc vào thời kỳ tăng trưởng của cây chuối, chất dinh dưỡng, các yếu tố khí hậu (nhất là nhiệt độ)

 Cuống lá

Đỉnh bẹ hẹp dần và dày lên tạo thành cuống lá, các bó sợi trong bẹ xếp chặt hơn nhưng vẫn còn các lỗ không khí Cuống lá thường dai chắc để mang nổi phiến lá thì càng mọc sau càng dài hơn Khoảng cách giữa hai cuống trên thân giả gọi là lóng giả, lóng càng ngắn biểu hiện cây mọc kém Phiến lá chuối lớn dần mãi cho đến khi chuối sắp trổ buồng

Gân chính: Là nơi cuống lá kéo dài và nhỏ dần có mang phiến lá hai bên Ở phần gân chính có một tầng tế bào đặc biệt để trương nước Chuối thiếu nước sẽ héo

và phiến lá uốn cong vào tầng này để giảm bớt sự thoát hơi nước (Nguyễn Văn Tó – Phan Thị Lài, 2005)

2.1.3.4 Hoa và qu ả chuối

Buồng hoa là một phát hoa, hoa mọc thành từng chùm (nải hoa) trên chóp của thân thật, theo đường xoắn ốc Những chùm mọc sau có số hoa ít dần và kích thước cũng nhỏ đi Trên mỗi chùm có 2 hàng hoa phát triển từ trái sang luân phiên nhau

Hoa cái có nuốm và vòi nhụy lớn, cánh hoa thường có màu trắng chia thành 5 khía ở đỉnh, nhị đực không có túi phấn

Hoa đực có noãn sào thoái hóa, vòi nhụy nhỏ và nhị đực có bao phấn chứa phấn hoa

Thông thường, khi mới nở hoa thì bắp chuối hướng lên trên nhưng trong khoảng thời gian một đến hai ngày sau thì quay xuống đất

Ở các giống chuối trồng trọt thì những chùm hoa ở gần cuống bắp chuối là những hoa cái, còn những chùm hoa mọc sau là những hoa đực

Ở nhóm chuối già trung bình có khoảng từ 9 – 10 chùm hoa cái (nải), nếu điều kiện thuận lợi thì số chùm hoa có thể lên tới 13 – 15 chùm (nải) và khi thành trái mỗi buồng có thể nặng 15 – 18 kg, nếu tốt có thể đạt đến 30 kg/buồng

2.1.4 Điều kiện sinh thái của cây chuối

Theo Nguyễn Văn Tó và Phan Thị Lài (2005), nhu cầu sinh thái cây chuối như sau:

Nhiệt độ: Chuối sinh trưởng và phát triển thuận lợi trong phạm vi 25-35o

C Nhiệt độ cao là quả bị hóa nâu và ảnh hưởng không tốt đến việc tích lũy tinh bột và tạo

este thơm

Nước: Hàm lượng nước trong các bộ phận cây chuối rất cao, trong thân giả

92,4%, trong rễ 96%, trong lá 82,6% và trong quả 96% Chuối cần rất nhiều nước, tốc

độ thoát hơi nước của chuối là 600 ml/m2/h Nếu chuối bị hạn sẽ cháy lá, trỗ ngẹn, chùm hoa quả biến dạng, ít quả và quả nhỏ Cây chuối rất sợ úng, nếu ngập 3 – 5 ngày thì chuối vàng úa lá và chết

Ánh sáng: ánh sáng cần cho quang hợp, chuối có khả năng chịu bóng, có giống chịu bóng 50% Chuối có khả năng thích ứng trong phạm vi cường độ ánh sáng tương đối rộng từ 2.000 lux trở lên Cường độ ánh sáng thích hợp trong thời kỳ ra hoa và quả lúc lơn là 1000 – 10000 lux.Về độ dài ngày, chuối là cây trồng không nghiêm ngặt,

chúng có thể phân hóa ở bất kỳ độ chiếu sáng nào khi cây đã đạt được mức sinh trưởng nhất định

Ảnh hưởng của gió bão: Khi thiết lập vườn chuối, hạn chế những nơi có nhiều

gió Gió làm lá chuối rách nhiều ảnh hưởng đến quá trình quang hợp, giảm năng suất Gió nhẹ từ 4 – 5 m/s thích hợp và làm thông thoáng vườn, hạn chế sâu bệnh

Đất trồng: Đất trồng chuối tốt nhất là đất tơi xốp, nhiều mùn, nhất là đất phù

sa, bazan, bùn ao phơi ải, nơi không bị ngập úng, dễ tưới tiêu nước và giữ nước tốt, tạo điều kiện cân bằng ở trao đổi khí, có độ mùn 2 – 2,5%, tầng canh tác dày từ 60 cm trở lên Độ pH thích hợp là từ 5 - 7

Dinh dưỡng: Do tốc độ sinh trưởng mạnh, cây chuối cần khá nhiều phân Nếu

muốn đạt sản lượng 40 tấn quả/ha phải cần 80 kg N + 20 kg P2O5 + 240 kg K2O Mặc

dù trong phân tích, lượng kali cần nhiều nhất nhưng trong thực tế thì thiếu đạm là đáng

Theo bộ siêu tập các giống chuối ở nam bộ có khoảng 30 dòng khác nhau, trong

đó có các giống có giá trị là chuối Cau, chuối Ba Thơm… Trong nhóm này chuối Cau Mắm rất ngon nhưng còn trồng rất ít và rải rác Ngoài ra còn có các giống chuối có giá trị kinh tế cao như chuối Già Cui, Già Hương, Già Lùn, Laba, Bà Hương, Chuối Cơm, Chuối Sứ

Chuối Laba buồng dài, quả chuối thon có hình dáng đẹp, dài và hơi cong, khi chín có vỏ mỏng, màu vàng tươi Thịt quả có màu vàng sánh, dẻo, ngọt và có mùi thơm đặc trưng

Chuối Laba có 3 nhóm chính:

Giống chuối tiêu cao (thường gọi là giống chuối già hương vì khi chín có

hương thơm hấp dẫn): cây cao từ 3,5 – 5 m, buồng hình trụ, quả thẳng và to, đuôi hơi lõm, ăn ngọt và thơm Năng suất rất cao nhưng khó thu hoạch; cây dễ bị bệnh héo rũ,

dễ bị đổ ngã khi gặp gió bão Hiện nay giống chuối này đang có nguy cơ bị tuyệt chủng, số lượng còn lại không đáng kể (rất hiếm gặp)

Giống chuối tiêu vừa (thường gọi là chuối già Laba): cây cao 2,8 – 3 m, buồng

hình trụ, trung bình có từ 10 - 12 nải/buồng (đôi khi nhiều hơn), trái hơi cong, ăn ngọt, thơm ít

Giống chuối tiêu thấp (thường gọi là chuối lùn Laba): cây cao 2 - 2,5 m, buồng

hình nón cụt, 12-14 nải/buồng, trọng lượng bình quân 35 kg/buồng, nhiều buồng đạt tới 50 kg nếu được chăm sóc tốt Giống này hiện chiếm số lượng lớn vì thấp cây, dễ

canh tác (Ngu ồn: Nông nghiệp Việt Nam, 2009)

2.1.5.2 Nhóm chuối tiêu (Cavendish)

Nhóm này có 3 loại : Tiêu Lùn, Tiêu Nhỏ, Tiêu Cao, trái nhỏ và thơm ngon Chiều cao cây thấp đến trung bình, từ 2,0 – 3,5 m năng xuất quả từ trung bình đến rất cao, phẩm chất thơm ngon thích hợp để xuất khẩu quả tươi, sinh trưởng khỏe thích hợp

với các vùng có khí hậu mùa đông lạnh

2.1.5.3 Nhóm chuối tây (chuối sứ, chuối xiêm)

Gồm các giống chuối Tây Hồng, Tây Phấn, Tây Sứ được trồng phổ biến ở nhiều nơi, cây cao sinh trưởng khoẻ, không kén đất, có khả năng chịu hạn song dễ bị héo rụi (vàng lá banana), quả to, mập, ngọt đậm và kém thơm hơn so với giống khác

2.1.5.4 Chuối bom

Được trồng phổ biến ở Đông Nam Bộ, trái thường được dùng làm ăn tươi, chuối sấy

2.1.5.5 Chuối ngốp

Có 2 loại: chuối ngốp cao và chuối ngốp thấp, có chiều cao cây từ 3-5 m Cây sinh trưởng khỏe, chống chịu sâu bệnh, đẻ con ở vị trí khá thấp nên thích hợp ở vùng đồi Quả tương đối lớn, vỏ dầy, nâu đen khi chín, thịt quả nhão, hơi chua

2.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ chuối trên thế giới và Việt Nam

2.2.1 Tình hình sản xuất

Chuối là loại trái cây nhiệt đới được trồng phổ biến ở nhiều quốc gia và vùng miền trên thế giới, đồng thời cũng chiếm một tỷ trọng đáng kể trong thương mại rau quả của toàn cầu

Xuất khẩu chuối đứng đầu về khối lượng và đứng thứ hai về kim ngạch, sau quả cam trong cơ cấu xuất khẩu trái cây của thế giới Theo đánh giá của FAO, tổng kim ngạch xuất khẩu chuối đạt 102,1 triệu tấn vào năm 2010 Cùng với gạo, lúa mì, ngũ cốc, chuối cũng là một trong số những mặt hàng chủ lực của nhiều nước đang phát triển

Ngành công nghiệp chuối đem lại nguồn thu nhập quan trọng, tạo nhiều việc làm và góp phần tăng kim ngạch xuất khẩu lớn cho những nước xuất khẩu chuối chính trên thế giới, cả những nước đang phát triển ở Châu Mỹ Latinh và Caribean, cũng như

là Châu Á và Châu Phi

Việt Nam là nước nhiệt đới và là một trong những xứ sở của chuối với nhiều giống chuối rất quý như: chuối tiêu, chuối tây, chuối bom, chuối ngự, có loại chuối nổi tiếng như chuối ngự Đại Hoàng (Nam Định) Cao cấp nhất vẫn là chuối ngự, loại chuối tiến vua, quả thon nhỏ, vàng óng, thơm ngậy nhưng diện tích và sản lượng không cao.Với những đặc điểm trên, chuối là mặt hàng có triển vọng xuất khẩu của Việt Nam, nhất là đối với giống chuối già và chuối cau

Diện tích, sản lượng : Ở nước ta chuối là loại trái cây có diện tích và sản lượng cao Với diện tích 99600 ha năm 2010, cho sản lượng 1,48 triệu tấn (Nguồn: Faostat,

2010) Một số tỉnh miền Trung và miền Nam có diện tích trồng chuối khá lớn (Thanh Hóa, Nghệ An, Khánh Hòa, Đồng Nai, Sóc Trăng, Cà Mau có diện tích từ 3.000 ha đến gần 8.000 ha)

B ảng 2.1: Tình hình xuất khẩu chuối trên thế giới 2009

2.2.2 Tình hình tiêu thụ chuối:

Bảng 2.2: Tình hình nhập khẩu chuối trên thế giới 2009

STT Quốc gia Số lượng (tấn) Giá trị

(1000 USD)

Giá sản phẩm (USD/ tấn)

Chỉ riêng EU, Mỹ đã chiếm đến 45% lượng nhập khẩu trên toàn thế giới năm

2010 Mặc dù sự tập trung về mặt địa lý vẫn khá cao nhưng xu hướng đa dạng hóa ngày càng tăng, đặc biệt là vào những năm 1990, khi có sự xuất hiện của một số nước nhập khẩu mới Điều này cho thấy nhập khẩu chuối ngày càng lớn của một số thị

trường mới nổi như Liên bang Nga, Trung Quốc, Đông Âu Trong khi đó mức nhập khẩu của khu vực EU vẫn tương đối ổn định

2.3 Tình hình nghiên cứu chuối

2.3.1 Tình hình nghiên cứu của thế giới

Những nghiên cứu khoa học trong những năm gần đây đặc biệt là trong lĩnh vực phân tử và tế bào sinh học đã cung cấp sự hiểu biết tốt hơn về nhân giống, kỹ thuật gen, sinh trưởng và phát triển của thực vật Gồm các kỹ thuật như sau: Bảo quản lạnh, nuôi cấy mô tế bào thực vật, sự phát triển phôi soma và sự lai giống, hạt nhân tạo, các phân tử DNA chỉ thị và sự biến đổi của cây trồng góp phần vào việc tăng năng suất của cây chuối

Hiện nay nuôi cấy mô (đặc biệt là vi nhân giống) là phương pháp phổ biến nhất đối với việc nhân nhanh giống chuối đây là phương pháp nhân giống vô tính tiên tiến nhất cho phép tạo ra cây con đồng đều, sạch bệnh và có hệ số nhân cao Nhiều công ty thương mại sản xuất hơn 30.000.000 cây chuối giống mỗi năm bằng phương pháp vi nhân giống Từ một mẫu ban đầu có thể sản xuất ra 2.000 cây trong ống nghiệm mỗi năm (Robinson, 1982) Phương pháp thông dụng nhất là hủy đỉnh sinh trưởng, đỉnh chồi và nuôi cấy chúng trên môi trường thích hợp Đặc biệt chú ý loại bỏ các mẫu cấy

có nhiễm virus, chỉ có những mẫu được giám định bệnh mới được lựa chọn làm mẫu ban đầu

Mặc khác các phương pháp đặc biệt như nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, xử lý nhiệt

và các phương pháp giám định bệnh khác có thể được kết hợp vào quy trình sản xuất

2.3.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam

Hầu hết các viện, trường, trung tâm nghiên cứu các tỉnh trên cả nước đều có các nghiên cứu nhân và nuôi cấy mô tế bào trên nhiều loại cây trồng khác nhau Đặc biệt các Viện, trường, Trung tâm cũng đã nghiên cứu tạo ra giống chuối nuôi cấy mô sạch bệnh, trồng chuối nuôi cấy mô sạch bệnh là phương pháp rất hiệu quả và có rất nhiều

ưu điểm so với kỹ thuật trồng chuối bằng con, cây chuối nuôi cấy mô giá thành rẻ, dễ vận chuyển, sach bệnh và nhân nhanh với số lượng lớn

Viện Nghiên cứu Cây ăn quả Miền Nam đã có những công nghệ mới để hỗ trợ các tỉnh qua cây giống chuối nuôi cấy mô sạch bệnh và công nghệ chuyển màu chuối già sang màu vàng rất đẹp, có thể cạnh tranh xuất khẩu chuối với Philipin, Đài Loan vào thị trường châu Âu, Nhật Bản Thời gian gần đây các tỉnh Cà Mau, Đồng Nai, Quảng Ngãi… đã có những bước cải thiện trong việc trồng và phát triển cây chuối tiến tới xuất khẩu sản phẩm chuối

Một số kết quả nghiên cứu về nuôi cấy mô cây chuối:

+ Theo viện sinh học nhiệt đới Tạo protocorm và nhân chồi được tiên hành trên chuối tiêu (Cavendish sp.) giống La Ba, giống già lùn (Dwarf Cavendish) trên mối

trường MS với chất sinh trưởng được sử dụng là BA 5mg/l, L-tyrosine 100 mg/L, IAA 0,5 mg/L và adenine sulfate 100 mg/L, Thiamin HCL 10mg/l, m-inositol 100mg/l, nước dừa 20%

+ Theo Nguyễn Thị Hồng Nhung (2006), NAA 1 mg/l và BA 3 mg/l đạt thời gian tái sinh chồi sớm và số chồi hình thành, chiều cao chồi cao nhất

+ Theo Nguyễn Đức Lượng (2002), đỉnh sinh trưởng chuối được trên môi trường MS có bổ sung BA 5 ppm, IAA 0,5 ppm, tyrosine 100 ppm và nước dừa 15%

Tổng kết kỹ thuật canh tác chuối bằng cây giống chuối bằng nuôi cấy mô sạch bệnh có khả năng tăng năng suất 20%/ha/năm Ưu thế lớn nhất mang giá trị kinh tế cao

là buồng chuối đồng dạng, ra hoa đồng nhất, thu hoạch đồng loạt và dễ vận chuyển giúp người trồng có thu cao hơn

2.4 Giới thiệu về nuôi cấy mô tế bào thực vật:

2.4.1 T ầm quan trọng của kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật

Phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật có ý nghĩa vô cùng to lớn đối với việc nghiên cứu lý luận sinh học cơ bản, đồng thời đóng góp trực tiếp cho thực tiễn sản xuất và đời sống

Phương pháp nuôi cấy mô có thể khắc phục được khó khăn trên và dễ dàng tạo

ra các bước phát sinh hình thái được phân biệt một cách rõ rệt Điều này tạo thuận lợi cho công tác nghiên cứu về các quy luật sinh trưởng, phát triển cùng mối quan hệ giữa chúng với bên ngoài Từ đó có thể tìm ra các mấu chốt thúc đẩy sự phát triển của cây

trồng theo hướng mong muốn

Bằng phương pháp nuôi cấy mô, chỉ sau một thời gian ngắn có thể tạo được một sinh khối lớn có hoạt chất: sinh khối được tạo ra vẫn giữ nguyên được thuộc tính, nghĩa là vẫn giữ được khả năng tổ hợp các chất thứ cấp như alkaloid, glycosid, các steroid dùng trong y học, chất dính dùng trong công nghiệp thực phẩm, những chất kìm hãm sinh trưởng của vi khuẩn trong nông nghiệp

2.4.2 Các bước nhân giống in vitro

Theo Nguyễn Đức Lượng (2002), các bước nhân giống in vitro gồm:

2.4.2.1 Ch ọn lựa và khử trùng mẫu cấy

Mẫu cấy là mô thực vật được đặt vào trong môi trường nuôi cấy Để tiến hành nuôi cấy in vitro thành công, khi lựa chọn mô cấy cần lưu ý đến tuổi sinh lý của cơ quan được dùng làm mẫu cấy, vụ mùa lấy mẫu, chất lượng của cây lấy mẫu, kích thước và vị trí lấy mẫu đó Mẫu cấy sau khi chọn lựa được rửa sạch bằng xà phòng và

khử trùng bề mặt bằng các chất khử trùng hóa học như calcium hypochloride, sodium dichloroisocyanurate, chlorua thủy ngân,

2.4.2.2 Tạo thể nhân giống in vitro

Mẫu được nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng thích hợp để tạo thể nhân giống

in vitro Có 2 thể nhân giống in vitro là thể chồi và thể cắt đốt Tạo thể nhân giống in

vitro phụ thuộc vào đặc điểm nhân giống ngoài tự nhiên của cây trồng Đối với những loài không có khả năng nhân giống, người ta thường nhân giống bằng cách tạo cụm chồi từ mô sẹo Trong môi trường nhân giống thường bổ sung cytokinin, GA3 và các chất hữu cơ khác

2.4.2.3 Nhân giống in vitro

Đây là giai đoạn quan trọng trong nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật nhằm mục đích tăng sinh khối thể nhân giống Vật liệu nuôi cấy là những thể chồi, môi trường nuôi cấy thường giống môi trường tạo thể chồi, đôi khi nồng độ chất sinh trưởng giảm thấp cho phù hợp với quá trình nhân giống kéo dài Điều kiện nuôi cấy thích hợp giúp cho quá trình tăng sinh diễn ra nhanh Cây nhân

giống in vitro ở trạng thái trẻ hóa và được duy trì trong thời gian dài

2.4.2.4 Tái sinh cây in vitro hoàn chỉnh

Đây là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh có đầy đủ thân, lá và rễ để chuẩn bị chuyển ra vườn ươm Cây con phải khỏe mạnh để nâng cao sức sống khi ra môi trường bình thường Các chất có tác dụng tạo chồi được loại bỏ, thay vào đó là các chất kích thích quá trình tạo rễ Điều kiện nuôi cấy gần với điều kiện tự nhiên bên ngoài, một

bước làm thích nghi trước khi tách ra khỏi điều kiện in vitro Sự ra rễ phụ thuộc vào

nhiều yếu tố: hàm lượng auxin nội sinh, tỷ lệ C/N, ánh sáng, sự trẻ hóa của mẫu, kiểu

di truyền và thường bổ sung auxin để kích thích quá trình ra rễ in vitro

2.4.2.5 Chuyển cây con in vitro ra vườn ươm

Cây con đã ra rễ được lấy khỏi ống nghiệm, rửa sạch agar và được đặt trong chậu nơi có bóng râm, độ ẩm cao, cường độ chiếu sáng thấp Sau khoảng 2 tuần, cây

đã bắt đầu thích nghi với điều kiện bên ngoài, lúc này có thể tăng cường độ chiếu sáng

và hạ độ ẩm Đây là giai đoạn rất quan trọng trong quy trình nhân giống vô tính vì cây

con thường bị chết do sự khác biệt về điều kiện sống giữa in vitro và ex vitro Cây in

vitro được nuôi cấy trong điều kiện ổn định dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm nên khi chuyển ra đất, với điều kiện tự nhiên hoàn toàn khác hẳn như dinh dưỡng thấp, ánh sáng có cường độ mạnh, nhiệt độ cao, độ ẩm thấp, cây con dễ dàng bị stress, dễ mất nước và mau héo dẫn đến hiện tượng chết Để tránh tình trạng này, vườn ươm cây cấy

mô phải mát, cường độ chiếu sáng thấp, độ ẩm cao Cây con thường được cấy trong

luống ươm cây có cơ chất dễ thoát nước, tơi xốp, giữ độ ẩm, trong những ngày đầu tiên cần phủ nylon để giảm sự thoát hơi nước ở lá (thường 7 - 10 ngày kể từ ngày cấy)

Rễ được tạo ra trong quá trình nuôi cấy mô sẽ dần dần lụi đi và rễ mới xuất hiện, cây con thường được xử lý ra rễ bằng cách ngâm rễ hay phun lên lá các hợp chất kích thích

ra rễ ở nồng độ thấp để rút ngắn thời gian ra rễ

2.4.3 Ưu và nhược điểm của phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật

Phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật có những ưu điểm vượt trội so với phương pháp truyền thống:

- Có khả năng tái sinh cây con từ các vùng mô và cơ quan khác nhau của cây như: trục thân, lóng thân, phiến lá, cuống lá, hoa, chồi phát hoa, hạt phấn,

mà ngoài tự nhiên không thể thực hiện được

- Có thể sản xuất được số lượng lớn cây giống trong một thời gian ngắn, trên

một diện tích nhỏ nhằm đáp ứng nhu cầu thương mại

- Cây con tạo ra đồng nhất về mặt di truyền

- Tạo cây sạch virus thông qua xử lý nhiệt hay nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

- Sản xuất quanh năm và chủ động kiểm soát được các yếu tố ngoại cảnh như nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm

- Bảo quản nguồn giống cây in vitro với số lượng lớn nhưng lại chiếm diện

tích rất nhỏ

- Tạo cây có khả năng ra hoa, tạo quả sớm

- Tạo dòng toàn cây cái (cây chà là) hoặc toàn cây đực (cây măng tây) theo mong muốn

- Dễ dàng tạo giống cây trồng mới bằng phương pháp chuyển gene

Bên cạnh những ưu điểm nổi bật thuận lợi cho mục đích nhân giống như đã được đề cập ở phần trên thì phương pháp vi nhân giống cũng có những nhược điểm cần phải được khắc phục:

- Giá thành cây con được sản xuất từ kỹ thuật vi nhân giống còn khá cao

- Tiến trình nhân giống phức tạp gồm nhiều giai đoạn liên quan và cần khoảng thời gian dài trước khi có thể thích ứng trồng ngoài vườn ươm

- Sự đa dạng của dòng sản phẩm nhân giống rất hạn chế, nghĩa là cây con tạo

ra thường ít đồng nhất về mặt kiểu hình

- Có thể xảy ra đột biến do tác dụng của các chất điều hòa sinh trưởng được

bổ sung vào môi trường nuôi cấy

2.4.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô thực vật

Theo Trần Văn Minh (1997), các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô:

2.4.4.1 Ảnh hưởng của mẫu cấy

Vật liệu nuôi cấy là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự sinh

trưởng và phát triển in vitro:

Kiểu di truyền

Khả năng tái sinh của thực vật rất đa dạng Những cây hai lá mầm thông thường

có khả năng tái sinh mạnh hơn cây một lá mầm và cây hạt trần rất khó tái sinh (trừ khi chúng còn non) Nếu một loài dễ tái sinh cơ quan trong môi trường tự nhiên thì chúng

hầu như dễ tái sinh in vitro

Tu ổi của cây

Các mô phôi thường có khả năng tái sinh cao do đó ở ngũ cốc người ta thường dùng phôi và hạt làm vật liệu cấy mô Khi cây già đi, khả năng tái sinh của chúng cũng giảm theo và các bộ phận của cây non dễ tái sinh hơn như trong trường hợp cây bụi Khi mô phân sinh và chồi đỉnh được tách khỏi cây mẹ thì chúng vẫn giữ những đặc

tính già hay non trong điều kiện in vitro tùy vào điều kiện ban đầu Đôi khi qua nhiều

lần cấy chuyền, mô phân sinh già từng bước được trẻ hóa do tăng khả năng tái sinh và phân chia tế bào Điều này được chứng minh trên những đối tượng như nho (Pinus

vinifera), táo tây (Malus sylvestris), cây tuy ết tùng (Cryptomeria japonica)

Tuổi của mô và cơ quan

Những mô còn non và mềm thường dễ nuôi cấy hơn những mô cứng nhưng cũng có nhiều trường hợp ngoại lệ Các mẫu cấy từ cuống lá còn non tái sinh tốt hơn

những mẫu cấy từ cuống lá già do cơ quan của chúng già hơn nên khả năng tái sinh và phân chia tế bào giảm Khả năng tái sinh của những loài khác nhau tăng lên trong suốt giai đoạn ra hoa: các bộ phận của phát hoa còn non đôi khi tái sinh rất mạnh, ví dụ như cây cải âm (Lunaria annua), cây báo xuân (Primula obconica)

Tình tr ạng sinh lý

Tình trạng sinh lý ảnh hưởng mạnh đến khả năng tái sinh và phân chia tế bào in

vitro Thông thường các bộ phận của cây trong giai đoạn sinh dưỡng dễ tái sinh hơn trong giai đoạn sinh sản Các mẫu cấy từ vảy của cây huệ tây ở giai đoạn sinh dưỡng tái sinh tốt hơn những mẫu cấy ở giai đoạn sinh sản Các chồi của cây trong giai đoạn

ngủ đông khó nuôi cấy in vitro hơn chồi của những cây đã vượt qua được giai đoạn

này

Vị trí của mẫu cấy trên cây

Ever (1984) đã khảo sát sự ảnh hưởng của vị trí mẫu cấy lên sự sinh trưởng và phát triển in vitro sau khi tách mẫu ở cây lãnh sam (Pseudotsuga menziesii), ông nhận

thấy những chồi ban đầu được tách từ vị trí thấp trên cây phát triển trong môi trường in

vitro tốt hơn, và chồi gốc tăng trưởng nhanh hơn chồi nách Sự hình thành các giả

hành bất định của mẫu cấy Lan Dạ Hương được tách ra từ phần gốc của vảy hành tốt hơn từ phần đỉnh Điều đáng lưu ý là những mô sẹo phát sinh từ những mẫu cấy có nguồn gốc từ những phần khác nhau của cây như rễ, chồi, cuống lá đều có phản ứng in

vitro giống nhau

Kích thước mẫu cấy

Các cấu trúc nhỏ như tế bào, cụm tế bào và mô phân sinh khó cảm ứng để tăng trưởng hơn những cấu trúc lớn như thân, lá, củ Các phần được tách rời khỏi cây tự nó cung cấp chất dinh dưỡng và hormone, do đó mẫu cấy có kích thước càng lớn càng dễ tái sinh và phát triển Các bộ phận của cây có chứa nhiều chất dinh dưỡng dự trữ như

củ, thân hành thường dễ tái sinh trên môi trường in vitro hơn những cơ quan ít chất dự

trữ Đối với những mẫu bị cắt, phần trăm bề mặt bị tổn thương cũng ảnh hưởng đến

khả năng tái sinh

V ết thương

Sự tổn thương trên bề mặt mẫu cấy đóng vai trò quan trọng trong sự tái sinh

mẫu cấy Bề mặt tổn thương tăng lên làm gia tăng sự hấp thu chất dinh dưỡng và các

chất điều hòa đồng thời ethylene được tạo ra nhiều hơn Ngoài ra, có thể tăng cường sự hình thành rễ bất định bằng vết thương

Phương pháp cấy

Các mẫu cấy có thể được đặt trên môi trường theo nhiều cách khác nhau: có cực (thẳng đứng với phần gốc cắm xuống môi trường) hoặc không có cực (cắm phần ngọn

xuống môi trường) Chồi và rễ thường tái sinh dễ và nhanh khi mẫu được cấy không

cực Mẫu tái sinh tốt khi được cung cấp đầy đủ oxy nhưng những nhân tố khác cũng đóng vai trò quan trọng Phần gốc của mẫu cấy không cực có các chất dự trữ không có

khả năng khuếch tán vào trong agar do nó không tiếp xúc với môi trường Như ở trường hợp tất cả các cây thuộc họ Amaryllidaceae, sự tái sinh chỉ xảy ra ở phần gốc

của vảy hành, do đó phương pháp cấy không cực dẫn đến sự hình thành thân hành bất định tốt hơn phương pháp cấy có cực

2.4.4.2 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy

Theo Nguyễn Đức Lượng (2002), một trong những yếu tố quan trọng nhất đối với sự tăng trưởng và phát sinh hình thái của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy là thành phần môi trường Thành phần này thay đổi tuỳ theo loài và bộ phận nuôi cấy Môi trường còn thay đổi tùy theo giai đoạn phân hóa của mẫu cấy Tuy nhiên, tất cả các môi trường nuôi cấy đều bao gồm năm thành phần: khoáng đa lượng, khoáng vi lượng, vitamin, đường (nguồn carbon) và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật

Khoáng đa lượng: nhu cầu khoáng của mô, tế bào thực vật tách rời không khác

nhiều so với cây trồng trong điều kiện tự nhiên Các nguyên tố đa trung lượng cần phải cung cấp là N, P, K, Ca, Mg và Fe

Khoáng vi lượng: nhu cầu khoáng vi lượng trong nuôi cấy mô thực vật in vitro

là lĩnh vực còn ít được nghiên cứu Trước đây, khi kỹ thuật nuôi cấy mô mới ra đời, người ta không nghĩ đến việc bổ sung khoáng vi lượng vào môi trường nuôi cấy Các thí nghiệm lúc đó thành công là do agar và hoá chất dùng để pha môi trường không tinh khiết mà có lẫn một số nguyên tố vi lượng cung cấp phần nào cho môi trường nuôi cấy Các nguyên tố vi lượng cần cung cấp cho tế bào là: Mn, Zn, Cu, B, Co, I, Mo…

Carbon và ngu ồn năng lượng: trong nuôi cấy in vitro, nguồn carbon giúp mô

và tế bào thực vật tổng hợp nên các chất hữu cơ để tế bào phân chia, tăng sinh khối không phải từ quá trình quang hợp mà chính là nguồn carbon bổ sung vào môi trường dưới dạng đường Hai dạng đường thường gặp nhất là glucose và sucrose

Vitamin: thông thường thực vật tổng hợp các vitamin cần thiết cho sự tăng trưởng và phát triển của chúng Chúng cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau Khi tế bào và mô được nuôi cấy in vitro thì một vài vitamin trở thành yếu

tố giới hạn cho sự phát triển của chúng Các vitamin thường được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: thiamine (B1), acid nicotinic, pyridoxine (B6) và myo-inositol

Các ch ất điều hòa sinh trưởng thực vật: có 5 nhóm chất điều hoà quan trọng

trong nuôi cấy mô thực vật: auxin, gibberellin, cytokinin, abscisic acid và ethylen Miller là người đầu tiên nhận thấy tỉ lệ auxin/cytokinin xác định dạng phân hoá cơ quan của tế bào thực vật nuôi cấy Cả auxin và cytokinin đều được bổ sung vào môi trường nuôi cấy để kích thích sự phát sinh hình thái và tỷ lệ hormone sử dụng để kích thích sự tạo chồi hay tạo rễ không giống nhau

Auxin tự nhiên là một hợp chất tương đối đơn giản: indol-3-acetic acid (IAA) Các chất có cấu trúc gần giống IAA và có cùng vai trò với IAA trong vài cơ quan đều được gọi là auxin (như IBA, NAA, 2,4-D, 2,4,5-T và phenoxyaxetic acid) Auxin phối

hợp với cytokinin giúp sự tăng trưởng chồi non và khởi phát sự tạo mới mô phân sinh

ngọn chồi từ nhu mô Tuy nhiên, ở nồng độ cao, auxin cản trở sự phát triển của các phát thể chồi vừa được thành lập hay các chồi nách (các chồi ở trạng thái tiềm sinh) Auxin ở nồng độ cao kích thích sự tạo sơ khởi rễ (phát thể non của rễ), nhưng cũng cản trở sự tăng trưởng của các sơ khởi này Trong sự tạo rễ, auxin cần phối hợp với các vitamine (như thiamine mà rễ không tổng hợp được), amino acid (như arginin), và

nhất là các hợp chất ortho-diphenolic (như cafeic acid, chlorogenic acid)

Cytokinin là một loại hormone thực vật kích thích tế bào phân chia Các hợp

chất này xuất phát từ purine adenin, một trong các base của DNA và RNA Nhiều

chất tổng hợp có hoạt tính cytokinin, chúng đều là các aminopurin được thay thế ở vị trí thứ 6, thí dụ như BA Cytokinin kích thích sự phân chia tế bào với điều kiện có auxin Cytokinin tác động trên cả hai bước của sự phân chia tế bào: phân nhân và phân bào Trong nuôi cấy các mô nghèo cytokinin (mô lõi thuốc lá, vỏ rễ đậu), auxin kích thích sự phân đôi nhiễm sắc thể, thậm chí tạo tế bào hai nhân, nhưng không có sự phân vách; sự phân vách chỉ xảy ra khi có cytokinin ngoại sinh Cytokinin giúp sự gia tăng kích thước tế bào và sinh tổng hợp protein

Trong các nghiên cứu nuôi cấy mô thực vật, tỷ lệ Auxin/Cytokinin (A/C) là một

yếu tố rất quan trọng: A/C cao giúp sự tạo rễ, A/C thấp giúp tạo chồi Như vậy, cytokinin hỗ trợ auxin trong tăng trưởng nhưng đồng thời cũng có sự đối kháng giữa

auxin (giúp tạo rễ) và cytokinin (giúp tạo chồi); sự cân bằng giữa hai kiểu hormone này là một trong những yếu tố kiểm soát sự phát triển

Ngoài năm thành phần cơ bản trên, người ta còn bổ sung một số chất hữu cơ có thành phần xác định (amino acid, EDTA,…) và một số chất có thành phần không xác định như nước dừa, dịch chiết nấm men,… vào môi trường nuôi cấy

Các hợp chất hữu cơ không xác định: bổ sung nhiều chất trích hữu cơ khác

nhau vào môi trường nuôi cấy thường mang lại kết quả thuận lợi cho sự tăng trưởng

của mô Các chất bổ sung này là: protein hydrolysate, nước dừa, dịch chiết nấm men, dịch chiết lúa mạch, chuối, nước cam, nước cà chua Tuy nhiên, chỉ có nước dừa và protein hydrolysate được sử dụng rộng rãi

Amino acid và các nguồn cung cấp nitrogen khác: mặc dù tế bào có khả

năng tổng hợp tất cả các amino acid cần thiết nhưng sự bổ sung các amino acid vào môi trường nuôi cấy là để kích thích sự tăng trưởng của tế bào Amino acid cung cấp cho tế bào thực vật nguồn amino acid sẵn sàng cho nhu cầu của tế bào và nguồn nitơ này được tế bào hấp thu nhanh hơn so với nitơ vô cơ Các nguồn nitơ hữu cơ thường

sử dụng là hỗn hợp amino acid như casein hydrolysate, L-glutamine, L-asparine và adenine

Than ho ạt tính: việc bổ sung than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy có tác

dụng khử độc Ảnh hưởng của than hoạt tính: hút các hợp chất cản, hút các chất điều hoà sinh trưởng và làm đen môi trường Người ta cho rằng tác dụng cản tăng trưởng

của mô cấy trong môi trường có than hoạt tính là do nó hút các chất điều hoà sinh trưởng trong môi trường như: NAA, kinetin, BAP, IAA và 2IP Khả năng kích thích sự tăng trưởng của mô thực vật là do than hoạt tính kết hợp với các hợp chất phenol độc

do mô tiết ra trong suốt thời gian nuôi cấy

Yếu tố làm đặc môi trường: agar là chất thường sử dụng để tạo môi trường

đặc hay môi trường bán rắn trong nuôi cấy mô thực vật Khi agar được trộn chung với nước thì tạo ra dạng gel và tan ở nhiệt độ 60 - 100oC, đặc lại khi nhiệt độ xuống còn

45oC vì vậy agar ổn định trong tất cả các điều kiện nhiệt độ môi trường và không bị

phân hủy bởi enzyme thực vật Hơn nữa, agar không phản ứng với các chất trong môi trường Độ cứng của agar quyết định bởi nồng độ agar sử dụng và pH của môi trường

Có một số công thức môi trường thường được sử dụng chủ yếu để nuôi cấy mô

và tế bào thực vật như môi trường MS (Murashige và Skoog), B5 (Gamborg và cộng

sự), SH (Schenk và Hilderbrandt) có hàm lượng khoáng đa lượng cao và một số môi trường khác được mô tả bởi White, Gautheret, Nitsch, Loyd và Mc Cown có hàm lượng khoáng đa lượng thấp hơn

2.4.5 Nuôi cấy mô tạo ra cây hoàn chỉnh

Theo Nguyễn Đức Lượng (2002), công nghệ nuôi cấy mô tạo cây hoàn chỉnh

gồm:

2.4.5.1 Nuôi cấy nốt đơn thân

Phương pháp nuôi cấy này sử dụng mẫu cấy là chồi ngọn hoặc chồi bên có mang một đoạn thân ngắn Chồi này sẽ được kích thích cho tăng trưởng, ra rễ để tạo thành cây nguyên vẹn

Phương pháp này đã được thực hiện thành công trên một số đối tượng như: cây măng tây, khoai tây, lê, hoa hồng, cà chua, dưa chuột, cà tím,…

2.4.5.2 Nuôi cấy chồi bên

Về nguyên tắc, phương pháp này giống như phương pháp nuôi cấy nốt đơn thân Điểm khác nhau là trong phương pháp nuôi cấy nốt đơn thân có sự kéo dài chồi, thân và thường không cần đến cytokinin để phát triển

Trong phương pháp nhân chồi bên, chồi được cô lập trên môi trường dinh dưỡng và các chồi bên từ các nách lá phát triển dưới ảnh hưởng của cytokinin với

nồng độ cao Vai trò của cytokinin lúc này là hạn chế ưu tính ngọn để cho các chồi bên

có thể phát triển Các chồi bên này được tiếp tục chuyển sang môi trường mới có bổ sung cytokinin thì các chồi bên mới lại tiếp tục được tạo ra Sau đó các chồi này được chuyển sang môi trường ra rễ và được đưa ra ngoài vườn ươm khi đã có rễ hoàn chỉnh

Phương pháp nhân giống bằng chồi bên được tiến hành lần đầu tiên trên cây

cẩm chướng, dâu tây, cúc đồng tiền Hiện nay, phương pháp này được áp dụng cho nhiều loài thực vật và phổ biến là ở một số loài cây ăn trái

2.4.5.3 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Trong đỉnh sinh trưởng của thực vật có một sự cạnh tranh giữa sự sinh sản của virus và sự phân chia tế bào của mô phân sinh để tạo ra các tế bào con Ở vùng mô phân sinh, trong suốt quá trình phân chia của tế bào, khả năng sinh tổng hợp nucleic acid được tận dụng để phân chia tế bào sẽ gây bất lợi cho sự tăng sinh của virus

Để có được nhiều đỉnh sinh trưởng sạch bệnh virus làm nguồn mẫu cho nuôi

cấy in vitro, trước tiên phải tiến hành tạo chồi bất định, sau đó thu đỉnh sinh trưởng từ

các chồi bất định này Nếu đỉnh sinh trưởng cô lập đang ở trạng thái hoạt động thì cơ

hội loại trừ virus sẽ lớn hơn Nếu như đỉnh sinh trưởng được cô lập có kích thước lớn thì cơ hội thu được cây sạch bệnh thấp

Phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng được áp dụng với những cây trồng quan

trọng như: khoai tây, thuốc lá, lily Một số cây thân gỗ như anh đào, mâm xôi, nho, cây đầu xuân cũng được nuôi cấy đỉnh sinh trưởng để tạo cây sạch bệnh

2.4.5.4 Nuôi cấy bao phấn và hạt phấn

Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn và hạt phấn là kỹ thuật tạo ra cây đơn bội kép (DH, double haploid) Phương pháp tạo cây đơn bội kép và chọn lọc là phương pháp chọn tạo giống có hiệu quả chọn lọc rất cao, đặc biệt nếu được kết hợp với các phương pháp

tạo ra các biến dị di truyền khác như lai hữu tính hoặc gây đột biến nhân tạo Đây là kỹ thuật không phức tạp lắm, nhưng lại rất có hiệu quả trong chọn tạo giống cây trồng,

nhất là đối với cây trồng cho hạt như lúa

2.4.6 Một số hệ thống nuôi cấy mới

2.4.6.1 Nuôi c ấy lỏng có sục khí – Bioreactor

Hệ thống bioreactor với cấu trúc của các bình lên men nhưng các cánh khuấy

bằng kim loại được thay bằng các ống silicon sục khí, có thể điều khiển được tốc độ dòng khí vào để hạn chế sự tương tác bất lợi của mẫu cấy, hạn chế sự tổn thương của mẫu Vì thế, hệ thống bioreactor được sử dụng rộng rãi với nhiều mục đích khác nhau

như: nuôi cấy chồi và phôi thực vật, chồi hoa thu hải đường, củ khoai tây bi in vitro,

hoa lily, một số cây thân gỗ và đặc biệt là nuôi cấy thu nhận các hợp chất có hoạt tính sinh học như nuôi cấy rễ nhân sâm

2.4.6.2 Nuôi c ấy quang tự dưỡng

Phương pháp vi nhân giống quang tự dưỡng có nhiều ưu điểm hơn phương pháp truyền thống Nó thúc đẩy sự tăng trưởng của cây in vitro, rút ngắn thời gian nuôi

cấy và làm hạ giá thành cây in vitro

Phương pháp mới này chú trọng đến các tác nhân vật lý của môi trường nuôi

cấy (ion, sự khuyết tán khí hòa tan) và các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của cây con trong bình nuôi cấy (cường độ ánh sáng, thời gian chiếu sáng, thành phần không khí, ẩm độ, nhiệt độ và tốc độ luân chuyển của không khí trong bình nuôi cấy,…) Trong vi nhân giống quang tự dưỡng, đường không được sử dụng trong môi trường nuôi cấy

Nồng độ CO2 và ánh sáng là hai yếu tố quan trong nhất trong nuôi cấy mô quang tự dưỡng cùng với cơ quan có diệp lục tố Sự gia tăng khác biệt giữa nồng độ

CO2 bên trong và bên ngoài hộp nuôi cấy cùng với sự gia tăng cường độ ánh sáng làm cho hiệu suất quang hợp tăng

Chương 3

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian thực hiện từ tháng 02/2012 đến tháng 06/2012

- Địa điểm nghiên cứu thực hiện tại phòng nuôi cấy mô bộ môn Di truyền – Giống khoa Nông học của Trưởng Đại học Nông Lâm - Thành Phố Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

- Phòng chuẩn bị môi trường, hấp môi trường, chứa môi trường, chứa dụng cụ: Có

tủ đựng hoá chất, tủ đựng bình thuỷ tinh và các dụng cụ: máy khuấy từ, pH kế, cân kỹ thuật, cân phân tích, tủ sấy, nồi hấp khử trùng, tủ lạnh

- Phòng cấy vô trùng: nên là một phòng nhỏ, kín, sàn gạch men để dễ lau chùi và

khử trùng thường xuyên Cửa phòng nên là cửa kính Trong phòng có đèn UV

- Bình chứa 20 - 50 ml môi trường hấp trong 20 phút

- Bình không chứa môi trường, giấy, dụng cụ cấy hấp 30 phút

D ụng cụ cấy và vật dụng:

- Kẹp, dao cấy, đĩa petri, kéo cấy, bình nuôi cấy

- Cồn, bông gòn, dây cột, giấy

3.2.2.2 Môi trường cơ bản dùng trong thí nghiệm

Môi trường cơ bản dùng trong thí nghiệm là môi trường MS (Murashige and Skoog, 1962) gồm các thành phần sau:

Các nguyên tố đa lượng (Macro)

3.3 Phương pháp nghiên cứu:

3.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian khử trùng và nồng độ hyponatri chlorua đến khả năng vào mẫu của cây chuối Laba

Mục đích: Xác định thời gian khử trùng và nồng độ hyponatri chlorua thích hợp

nhất khi vào mẫu chuối LaBa

B ố trí thí nghiêm: thí nghiệm hai yếu tố được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu

nhiên với ba lần lặp lại, với môi trường nền là MS

Yếu tố A (tỷ lệ NaOCl: H2O) : 1:1; 1:2; 1:3

Yếu tố B (thời gian): 5 phút; 10 phút; 15 phút

Bảng 3.1: Ảnh hưởng của thời gian và nồng độ Natri hypoclorua đến khả năng vào

mẫu của chuối laba