Nghiên cứu đặc điểm hình thái màng ối, tế bào gốc màng ối người và khả năng biệt hóa thành tế bào giống tế bào bê ta tụy nội tiết tt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO BỘ QUỐC PHÒNG TẠO HỌC VIỆN QUÂN Y NGUYỄN BẢO TRÂN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI MÀNG ỐI, TẾ BÀO GỐC MÀNG ỐI NGƯỜI VÀ KHẢ NĂNG BIỆT HÓA THÀNH TẾ BÀO GIỐNG TẾ BÀO BÊ TA TỤY NỘI TIẾT Chuyên ngành: Giải phẫu người Mã số: 62 72 01 04 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC HÀ NỘI - 2018 Cơng trình hồn thành tại: HỌC VIỆN QN Y Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Trần Ngọc Anh PGS.TS Phạm Văn Trân Phản biện 1: PGS.TS Phạm Đăng Diệu Phản biện 2: PGS.TS Trịnh Tuấn Dũng Phản biện 3: GS.TS Nguyễn Đình Tảo Luận án bảo vệ Hội đồng chấm luận án cấp Trường Học viện Quân y vào hồi… giờ… ngày… tháng….năm… Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện quốc gia Thư viện Học viện Quân y GIỚI THIỆU LUẬN ÁN Đặt vấn đề Ở Việt Nam, nhiều sở y tế bắt đầu nghiên cứu ứng dụng tế bào gốc điều trị Tuy nhiên, lĩnh vực biểu nhiều hạn chế Trong đó, nhu cầu điều trị khuyết hổng mô suy chức tế bào/cơ quan lớn mà triển vọng áp dụng trị liệu tế bào gốc số lớn Các tế bào gốc từ màng ối người có ưu điểm rõ rệt sau: chúng biệt hóa thành tất ba lớp tế bào mầm; chúng có yếu tố sinh miễn dịch chúng nguồn rác thải sinh học; tránh tranh cãi liên quan đến việc sử dụng tế bào gốc phơi thai (human ES cell) Bên cạnh đó, màng ối áp dụng nhiều y học điều trị tổn thương, che phủ vết mổ tránh nhiễm khuẩn, ghép giác mạc công nghệ tế bào gốc Tuy nhiên, nhiều vấn đề cần nghiên cứu hiệu quả, chế ứng dụng Trong năm gần đây, tình trạng bệnh đái tháo đường ngày vấn đề trội sức khỏe Việt Nam toàn giới Theo Liên đoàn bệnh đái tháo đường quốc tế (IDF), ước tính có 415 triệu người mắc bệnh đái tháo đường vào năm 2017 Hướng điều trị bệnh đái tháo đường type I cách thay bổ sung tế bào tiết insulin cho bệnh nhân liệu pháp tế bào gốc mở triển vọng tốt nhiều hứa hẹn cho người bệnh Xuất phát từ thực tiễn đó, đề tài tiến hành nhằm mục tiêu sau: Mô tả đặc điểm cấu trúc vi thể, siêu vi thể màng ối tế bào gốc màng ối người Phân lập, nuôi cấy bước đầu đánh giá khả biệt hóa tế bào gốc màng ối người thành tế bào giống tế bào beta tụy nội tiết 2.Ý nghĩa luận án Đây cơng trình nước nghiên cứu xác định hình thái màng ối lúc phương pháp khác nhau: Nhuộm HE soi kính hiển vi quang học, quan sát kính hiển vi điện tử quét, kính hiển vi điện tử truyền qua Xác định đặc tính màng ối tính gốc tế bào biểu mơ màng ối phương pháp hóa mô miễn dịch Các tế bào biểu mô màng ối gần cuống rốn có dạng biểu mơ giả tầng, tồn tế bào gốc nằm xen tế bào biệt hóa Đây sở cho việc sử dụng màng ối vào mục đích thu gom, phân lập tế bào gốc đồng thời với việc sử dụng màng ối cho việc sản xuất màng ối đông khô che phủ vết bỏng, sử dụng để sử dụng để tạo giá thể nuôi cấy tế bào gốc Tiến hành thu gom, phân lập tế bào gốc từ màng ối phương pháp sử dụng enzyme trypsin kết hợp với biện pháp học Bước đầu đánh giá khả biệt hóa tế bào gốc thành tế bào giống tế bào beta tụy nội tiết khả tiết insulin cách sử dụng mơi trường (DMEM) có bổ sung 10mM nicotinamide, 55 μM ß- mercaptoethanol, 1mM sodium pyruvate Cấu trúc luận án: Gồm chương: Gồm chương, phần đặt vấn đề (2 trang), tổng quan tài liệu (27 trang), đối tượng phương pháp nghiên cứu (22 trang), kết nghiên cứu (34 trang), bàn luận (26 trang), kết luận (2 trang), kiến nghị (1trang), tài liệu tham khảo (với 137 tài liệu: tài liệu tiếng Việt, 129 tài liệu tiếng Anh) phần phụ lục CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm cấu trúc màng ối 1.1.1 Nguồn gốc màng ối Màng ối hình thành từ phơi ngồi có nguồn gốc từ khối nội bào Ở loài người, đến ngày thứ sau thụ tinh, cực phôi xuất khoang nhỏ lớn lên, tạo thành khoang ối Những tế bào phủ trần khoang tạo thành màng ối 1.1.2 Cấu trúc màng ối Màng ối cấu tạo lớp chính: lớp biểu mơ đơn, màng đáy dày lớp vô mạch Màng ối thần kinh, mạch máu hay bạch huyết, nằm sát khoang ối tế bào nuôi 1.1.3 Chức màng ối 1.2 Tế bào gốc màng ối 1.2.1 Một số khái niệm tế bào gốc 1.2.2 Các đặc điểm màng ối liên quan công nghệ tế bào gốc 1.2.2.1 Tính vạn tiềm ( pluripotent) 1.2.2.2 Tính chống viêm sinh miễn dịch thấp Màng ối tế bào gốc màng ối xem mơ tế bào thích hợp để ghép tự thân, ý kiến vào tính kháng viêm sinh miễn dịch thấp Có nhiều chứng chứng minh cho quan điểm dựa vào nghiên cứu thực đúc kết lại 1.2.2.3 Khơng gây tạo khối u Khơng có chứng cho thấy tạo khối u ghép tế bào phân lập từ màng ối vào người tình nguyện nhằm đánh giá tình trạng sinh miễn dịch ghép vào bệnh nhân bị bệnh rối loạn tích đọng lysosome (LSD) Tuy nhiên, tượng thể khảm nhiễm sắc thể (trisomy mosaicism) màng ối công bố 1.2.2.4 Vấn đề đạo đức sử dụng Do màng ối bỏ sau sinh nên dễ dàng thu nhận mà khơng ảnh hưởng đến người mẹ hay đứa trẻ khắc phục vấn đề đạo đức liên quan đến tế bào ES Tuy nhiên, vấn đề sở hữu người mẹ Vì vậy, sử dụng màng ối người phải quan y đạo đức viện nghiên cứu cho phép người mẹ chấp thuận 1.2.3 Khả biệt hóa tế bào gốc màng ối Tế bào gốc màng ối có khả biệt thành tế bào thần kinh, tế bào biểu bì da , tế bào gan, tế bào tim, tế bào sụn 1.2.3.6 Sử dụng tế bào gốc màng ối người lĩnh vực kỹ thuật tái tạo mô 1.3 Một số nghiên cứu tế bào gốc 1.3.1 Tế bào gốc bệnh đái tháo đường Các tế bào β tụy bị hỏng nguyên nhân đái tháo đường type I phần gây nên đái tháo đường type II Chính thay tế bào β phần quan trọng việc điều trị đái tháo đường 1.3.1.1 Nguyên tắc điều trị đái tháo đường tế bào gốc Mục tiêu phương pháp điều trị tế bào gốc cho bệnh tiểu đường bảo vệ tế bào lại bổ sung đầy đủ tế bào beta Để thực mục đích này, người ta tiến hành hai chiến lược sau: - Cấy ghép tế bào gốc: Cơ sở phương pháp tế bào gốc vào thể điều kiện thích hợp, chúng biệt hố thành tế bào thích hợp - Ghép tế bào tiết insulin biệt hoá từ tế bào gốc trước : chiến lược này, tế bào gốc thu nhận từ mô nuôi cấy tăng sinh biệt hoá thành tế bào tiết insulin in vivo; sau cấy ghép tế bào vào thể nhận 1.3.1.2 Các nhân tố ảnh hưởng đến phát triển tụy in vivo 1.3.1.3 Nguồn tế bào gốc sử dụng cho điều trị Nhiều nghiên cứu biệt hóa in vitro tế bào gốc tiền tế bào trở thành tế bào sản xuất insulin 1.3.1.4 Biệt hóa tế bào gốc màng ối thành tế bào tụy Trong điều kiện in-vitro, sau kích thích với nicotinamide, tế bào gốc màng ối biểu mARN insulin In-vivo, HAE có khả làm giảm đường máu chuột gây tiểu đường mơ hình streptozotocin sau vài lần ghép tế bào Các nhà nghiên cứu thành công việc sử dụng tế bào HAE chuyển nạp sản xuất insulin để ghép điều trị tiểu đường thực nghiệm Mặc dù có nhiều quy trình biệt hóa tế bào beta mơ tả, chưa có quy trình hồn hảo để tạo nên tế bào beta trưởng thành đầy đủ chức Chính việc nghiên cứu để biệt hóa thành tế bào beta đầy đủ chức tương lai cần thiết 1.3.2 Tình hình nghiên cứu ứng dụng tế bào gốc Việt Nam Về tế bào gốc màng ối, bên cạnh nghiên cứu Học viện Quân Y, Trường Đại học Y Hà Nội có nghiên cứu tạo màng ối làm ni cấy tế bào gốc vùng rìa giác mạc Về nghiên cứu biệt hóa tế bào gốc thành tế bào tiết insulin có nghiên cứu ban đầu Phòng thí nghiệm nghiên cứu ứng dụng tế bào gốc thuộc Đại học Khoa học tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh thời gian gần đây, với nguồn tế bào gốc thu nhận từ máu cuống rốn với kết ban đầu khả quan CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu Màng ối sản phụ mổ đẻ 18 tuổi, thai đủ tháng > 37 tuần Số lượng mẫu nghiên cứu: 30 màng ối Hình 2.1 Bánh rau màng ối thu nhận từ sản phụ Chúng tiến hành nghiên cứu 30 mẫu nhuộm HE, 10 mẫu soi kính hiển vi điện tử quét (SEM), mẫu kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) Do điều kiện nghiên cứu bước đầu tiến hành nuôi cấy, bảo quản tế bào gốc phân lập từ màng ối biệt hóa tế bào gốc phân lập từ màng ối thành tế bào giống tế bào beta tụy nội tiết nên tiến hành phân lập, nuôi cấy bảo quản 10 mẫu Biệt hóa thành tế bào giống tế bào beta tụy nội tiết từ mẫu thu gom, phân lập tế bào gốc từ màng ối 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Thu thập màng ối Bánh rau thu nhận từ Bệnh viện 103- Học viện Quân y, sản phụ mổ đẻ, thai đủ tháng, nước ối bình thường Rửa lớp màng ối nhiều lần (4-6 lần) dung dịch đệm PBS tạo thành màng mỏng suốt Kết thu màng ối gần suốt đảm bảo không bị rách nát, đảm bảo vô khuẩn trình vận chuyển từ bệnh viện trung tâm nghiên cứu 2.2.2 Xác định đặc điểm hình thái vi thể màng ối tiêu nhuộm HE 2.2.3 Nghiên cứu đặc điểm hình thái siêu vi thể màng ối kính hiển vi điện tử quét (SEM) 2.2.4 Nghiên cứu đặc điểm hình thái siêu vi thể màng ối kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) 2.2.5 Xác định đặc tính màng ối tế bào màng ối kỹ thuật hóa mơ miễn dịch 2.2.6 Phân lập, ni cấy bảo quản tế bào gốc màng ối người 2.2.6.1 Phân lập tế bào gốc từ màng ối Chúng tiến hành phân lập tế bào theo phương pháp Miki (2010) sử dụng enzym phân cắt mô phối hợp với biên pháp học 2.2.6.2 Nuôi cấy tăng sinh tế bào Tế bào gốc màng ối sau phân lập từ màng ối nuôi cấy mơi trường DMEM có bổ sung thêm penicillin (50 U/ml), streptomycin (50 µg/ml), L-glutamin (2 x 10 -3M), huyết bào thai bò (10%) tủ ấm 37oC, 5% CO2 Khi tế bào đạt mật độ 6080% diện tích bề mặt đĩa nuôi cấy, tiếp tục cấy chuyển nuôi cấy tăng sinh 2.2.7 Biệt hóa tế bào gốc thành tế bào beta tụy đảo 10 Biệt hóa tế bào gốc thành tế bào beta nuôi cấy môi trường khoảng ngày để tế bào gốc tăng sinh phủ kín bề mặt đĩa ni cấy Sau bổ sung thêm vào mơi trường yếu tố định hướng biệt hóa bao gồm 10mM nicotinamide, 55 μM ßmercaptoethanol, 1mM sodium Đánh giá kết biệt hóa thành tế bào giống tế bào beta tụy đảo cách theo dõi tượng giảm dấu ấn tế bào gốc (OCT-4) đồng thời quan sát xuất tăng dấu ấn insulin mức độ protein (định lượng theo phương pháp hóa miễn dịch phát quang) mức độ mARN (RT-PCR) 2.5 Đạo đức nghiên cứu CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Mơ tả đặc điểm hình thái vi thể siêu vi thể màng ối người Việt Nam 3.1.1 Thu thập mẫu màng ối Bánh rau thu nhận từ Bệnh viện 103- Học viện Quân y Sau tiến hành bóc tách màng ối, nhóm nghiên cứu thu thập 30 mẫu màng ối đạt tiêu chí chọn lọc không rách nát đảm bảo cho nghiên cứu 3.1.2 Đặc điểm hình thái vi thể màng ối tiêu nhuộm HE 3.1.2.1 Độ dày màng ối Bảng 3.1 Độ dày màng ối gần cuống rốn xa cuống rốn Độ dày màng ối (đơn vị: µm) 60 – 80 80-100 100-120 120-140 140-160 160-180 Màng ối gần cuống rốn Màng ối xa cuống rốn 0 11 10 13 dạng mỏm chêm (TEM x10.000) x10.000) Nhân tế bào có kích thước tương đối định, nhiên màng nhân khơng đều, có hình dáng thay đổi: múi, khía cuộn lại Chất nhân có đậm độ điện tử không Cạnh bên tế bào tương đối phức tạp với liên kết dạng cầu nối gian bào vị trí liên kết có tăng đậm độ điện tử khơng có tơ trương lực liên kết desmosom khơng có liên kết dính 3.1.3.3 Số lượng tế bào biểu mơ màng ối đếm kính hiển vi điện tử quét So sánh kết đếm số lượng tế bào biểu mơ kính hiển vi điện tử: số lượng tế bào biểu mơ vị trí gần cuống rốn nhiều vị trí xa cuống rốn 36-83 tế bào với độ tin cậy 95%, p