Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh học và đánh giá hiệu quả của các chủng nấm beauveria và paecilomyces ký sinh trên côn trùng gây hại được phân lập tại đồng bằng sông cửu long tt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC CẦN THƠ TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: Bảo Vệ Thực Vật Mã ngành: 9620112 HUỲNH HỮU ĐỨC NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, SINH HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA CÁC CHỦNG NẤM Beauveria VÀ Paecilomyces KÝ SINH TRÊN CÔN TRÙNG GÂY HẠI ĐƯỢC PHÂN LẬP TẠI ĐỒNG BẰNG SƠNG CỬU LONG Cần Thơ, 2018 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ Người hướng dẫn chính: PGS.TS Trần Văn Hai Luận án bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp trường Họp tại: Vào lúc … … ngày … tháng … năm … Phản biện 1: Phản biện 2: Có thể tìm hiểu luận án thư viện: Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ Thư viện Quốc gia Việt Nam DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ Huỳnh Hữu Đức Trần Văn Hai, 2016 Xác định loài, đặc diểm sinh học bước đầu đánh giá hiệu trừ sùng khoai lang (Cylas formicarius Fabricius) điều kiện phòng thí nghiệm chủng nấm Beauveria ký sinh côn trùng gây hại phân lập Đồng sông Cửu Long Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Số chuyên đề: Nông nghiệp ISSN 1859-2333 (3): 36-46 Huỳnh Hữu Đức, Trần Văn Hai, 2016 Phân lập, định danh bước đầu đánh giá hiệu phòng trừ rệp sáp Planococcus lilacinus chủng nấm Paecilomyces javanicus thu thập Đồng sơng Cửu Long Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển Nông thôn Số chuyên đề: Nông Nghiệp Xanh ISSN 1859-4581: 109-116 Huỳnh Hữu Đức, Trần Văn Hai, 2018 Hiệu chế phẩm nấm Paecilomyces javanicus (Friedrichs and Bally) phòng trừ rệp sáp Planococcus lilacinus (Cockerell) điều kiện phòng thí nghiệm nhà lưới Tạp chí Bảo vệ thực vật ISSN 2354-0710 1(276): 32-37 Huỳnh Hữu Đức, Trần Văn Hai, 2018 Ảnh hưởng số loài thuốc trừ nấm đến tỷ lệ nảy mầm, phát triển tản nấm khả hình thành bào tử nấm Beauveria bassiana (Bals.) Vuill Tạp chí Bảo vệ thực vật ISSN 2354-0710 1(276): 42-48 CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1.1 Tính cấp thiết nghiên cứu Một tập hợp đa dạng vi sinh vật khác xem xét tác nhân sinh học kiểm sốt trùng như: virus, vi khuẩn, động vật nguyên sinh nấm Trong giới nấm, theo ước tính nhà khoa học có khoảng 1,5 triệu lồi (Hawksworth, 2001; Mueller and Schmit, 2007; Schmit and Mueller, 2007), với khoảng 110.000 loài mô tả (Kirk et al., 2008) Trong số này, 700 lồi 90 chi cơng nhận tác nhân gây bệnh côn trùng (Roberts and Humber, 1981), khoảng 170 sản phẩm kiểm soát dịch hại phát triển dựa 12 lồi nấm ký sinh côn trùng (De Faria and Wraight, 2007) Các nghiên cứu tập trung phát triển ứng dụng loài ký sinh trùng thuộc Hyphomycetes có nấm Beauveria Paecilomyces Nấm ký sinh gây bệnh trùng Beauveria bassiana Paecilomyces javanicus lồi nấm quan tâm nghiên cứu phát triển ứng dụng nhiều có phổ ký chủ rộng, ký sinh gây chết nhiều loại côn trùng gây hại nông lâm nghiệp, nghiên cứu ứng dụng rộng rãi giới tác nhân phòng trừ sinh học Nấm B bassiana nhiều nước giới Mỹ, Canada, Anh, Úc, Nhật, Philippines, Trung Quốc… sử dụng để phòng trừ nhiều đối tượng sâu hại trồng bọ hại mía, bọ hại củ cải đường, ruồi hại rễ bắp cải, củ cải… đạt kết tốt, đặc biệt loài sâu hại rừng sâu róm thơng, bọ hại dừa, châu chấu hại tre, mía, mối đất hại ăn quả, sùng hại mía (Ferron, 1978; Rombach et al., 1988; Phạm Thị Thùy, 2004; Trần Văn Mão, 2004) Chủng nấm P javanicus kết hợp hoạt chất Azadirachtin (tỷ lệ 100:0,05-0,25) dạng bột hòa nước, huyền phù dạng nhũ dầu để phòng trừ số loại sâu hại trồng sâu tơ, rầy phấn trắng, rầy mềm… Việc kết hợp nấm tím P javanicus hoạt chất Azadirzachtin giúp tăng hiệu lực nấm ký sinh đồng thời giảm lượng hoạt chất Azadirachtin phòng trừ sâu hại, ngồi kết hợp với hoạt chất Cypermethrin (100 : 0,25 - 0,56) Acetamiprid (tỉ lệ 100 : 1,5 - 10) dạng bột hòa nước để phòng trừ sâu hại, đặc biệt lồi chích hút, có tác dụng ngăn ngừa tốt lồi dịch hại bướm sâu tơ, rầy mềm, bọ trĩ., (Huang Zhen and Ren Shunxiang, 2008a, 2008b, 2008c) Tại Đồng Sông Cửu Long, khoai lang ăn trái chiếm diện tích tương đối lớn Dịch hại thường xuất sùng (Cylas formicarius Fabricius) gây hại khoai lang rệp sáp (Planococcus lilacinus Cockerell) gây hại nhiều loại ăn trái (mãng cầu, sầu riêng, khóm,…) gây ảnh hưởng lớn đến chất lượng sản phẩm nên nông dân sử dụng nhiều thuốc bảo vệ thực vật để quản lý đối tượng trên, làm lưu tồn lượng lớn thuốc BVTV sản phẩm có ảnh hưởng không tốt đến sức khỏe người tiêu dùng Vì thế, việc nghiên cứu tác nhân phòng trừ sinh học để quản lý trùng gây hại có hiệu thay dần thuốc BVTV cần thiết thực tế sản xuất Xuất phát từ thực tế, đề tài “Nghiên cứu số đặc điểm hình thái, sinh học đánh giá hiệu chủng nấm Beauveria Paecilomyces ký sinh côn trùng gây hại phân lập Đồng Sông Cửu Long” thực 1.2 Mục tiêu nghiên cứu đề tài Thu thập định danh đến loài chủng nấm thuộc hai chi Beauveria Paecilomyces ký sinh số lồi trùng gây hại tỉnh vùng ĐBSCL Nghiên cứu số đặc điểm sinh học, khả ký sinh gây bệnh, yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển chủng nấm Beauveria Paecilomyces định danh đến loài Tuyển chọn chủng nấm Beauveria có khả ký sinh cao sùng khoai lang C formicarius Fabricius điều kiện phòng thí nghiệm để sản xuất chế phẩm Đánh giá hiệu chế phẩm nấm Beauveria ký sinh SKL điều kiện phòng thí nghiệm, nhà lưới ngồi đồng Tuyển chọn chủng nấm Paecilomyces có khả ký sinh cao rệp sáp P lilacinus điều kiện phòng thí nghiệm để sản xuất chế phẩm Đánh giá hiệu chế phẩm nấm Paecilomyces ký sinh rệp sáp P lilacinus điều kiện phòng thí nghiệm, nhà lưới ngồi đồng 1.3 Ý nghĩa khoa học thực tiễn Đề tài có ý nghĩa khoa học cao nghiên cứu chi tiết có hệ thống từ phòng thí nghiệm, nhà lưới đến đồng ruộng nên cung cấp nhiều số liệu khoa học đặc điểm hình thái, sinh học đánh giá hiệu lực nấm B bassiana P javanicus (I javanica) nhằm thiết lập thông tin chủng nấm phân lập ĐBSCL Ngoài ra, kết đề tài mở hướng quản lý phòng trừ số lồi trùng gây hại trồng theo IPM, để thay loại thuốc hóa học sở cho hướng nghiên cứu đấu tranh sinh học trùng 1.4 Những đóng góp luận án Phân lập 16 chủng nấm Beauveria ký sinh trùng tỉnh ĐBSCL thuộc lồi B bassiana Trong đó, tuyển chọn hai chủng Bb4(SKL-VL) Bb5(SKL-HG) để sản xuất chế phẩm Phân lập 22 chủng nấm Paecilomyces ký sinh côn trùng tỉnh ĐBSCL định danh 14 chủng nấm thuộc loài P javanicus chủng nấm thuộc loài Purpureocillum lilacinum Kết quả, tuyển chọn hai chủng Pj6(Pl-TG) Pj8(PlCT) để sản xuất chế phẩm Xác định số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển nấm B bassiana P javanicus điều kiện phòng thí nghiệm Xác định số hoạt chất hố học trừ nấm vơ hại phát triển nấm B bassiana nồng độ thấp (½ nồng độ liều khuyến cáo) ảnh hưởng vừa (ở nồng độ liều khuyến cáo) Metalaxyl, Fenoxanil Validamycin Đối với P javanicus hợp chất Fenxanil, Kasugamycin Picoxystrobin tỏ vô hại ảnh hưởng vừa Tuy nhiên, nấm B bassiana dễ bị ảnh hưởng nồng độ thấp (½ nồng độ liều khuyến cáo) so với P javanicus hợp chất thuốc hoá học trừ nấm Đối với chế phẩm nấm B bassiana dạng tươi để phòng trừ SKL chế phẩm nấm P javanicus dạng tươi để phòng trừ rệp sáp P lilacinus gây hại mãng cầu xiêm cho kết phòng trừ tốt sử dụng liều lượng 3,0 - 3,5 kg/ha với mật số bào tử chế phẩm khoảng > 108 bt/gram CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu Thời gian: từ tháng 9/2013 - 9/2017 Địa điểm: Các thí nghiệm phòng, nhà lưới thực Phòng thí nghiệm phòng trừ sinh học, Bộ mơn Bảo Vệ Thực Vật, Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ Ly trích DNA phản ứng PCR thực Viện Công Nghệ sinh học, trường Đại học Cần Thơ Giải trình tự DNA gởi thực công ty MacroGen Hàn Quốc Các thí nghiệm ngồi đồng thực tỉnh Vĩnh Long 3.2 Phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Thu thập định danh loài nấm ký sinh từ chi Beauveria Paecilomyces phương pháp truyền thống dựa đặc điểm hình thái học kỹ thuật công nghệ sinh học phân tử 3.2.1.1 Phân lập định danh loài nấm ký sinh số sâu hại trồng thuộc chi nấm Beauveria Paecilomyces theo phương pháp truyền thống Thu thập côn trùng gây hại bị nhiễm nấm ký sinh tỉnh vùng Đồng Sông Cửu Long như: Cần Thơ, Vĩnh Long, Hậu Giang, An Giang, Kiên Giang, Sóc Trăng Trà Vinh phòng thí nghiệm Bộ mơn BVTV để phân lập tác nhân Nấm nuôi cấy môi trường PDA, tạo dòng phương pháp ni cấy đơn bào tử nấm Beauveria Paecilomyces môi trường PDA, lưu trữ trực tiếp môi trường nhiệt độ -37oC Định danh nấm theo Barnett and Barry (1972), Lawrence (1994), De Hoog (1972), Luangsa-Ard et al (2006) Các chủng nấm Beauveria Paecilomyces sau tách dòng nuôi cấy môi trường PDA đĩa petri (đường kính 9cm) nhiệt độ 27±2oC 12 sáng tối Lấy khoanh sợi nấm từ rìa mép tản nấm ngày tuổi đặt vào đĩa petri chứa khoảng 10 mL môi trường nuôi cấy vị trí úp ngược cho sợi nấm tiếp xúc trực tiếp với mơi trường ni cấy, tất thí nghiệm lập lại lần cho mẫu phân lập Đặc điểm nhận dạng tiêu theo dõi: đặc điểm tản nấm, đặc điểm quan sinh bào tử hình dạng bào tử kích thước bào tử 3.2.1.2 Định danh lồi phân tích số khác biệt di truyền chủng nấm Beauveria sp Paecilomyces spp dựa trình tự DNA vùng ITS-rDNA Chiết xuất DNA tổng số theo quy trình Saitoh et al (2006) Sau có lượng DNA thực phản ứng PCR khuếch đại vùng ITS-rDNA, đọc kết giải trình tự vùng ITS-rDNA Vùng ITS-rDNA nhân lên phản ứng PCR sử dụng cặp mồi ITS5 (5’- GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G - 3’) ITS4 (5’- TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC - 3’) Các sản phẩm PCR giải trình tự dựa vào kết giải trình tự để so sánh với trình tự vùng ITS-rDNA chủng nấm Beauveria Paecilomyces giới biết tên loài từ sở liệu Genbank làm sở xác định tên loài chủng nấm Beauveria Paecilomyces thu thập Sơ đồ phân nhóm xác định lồi nấm thuộc chi Beauveria Paecilomyces xử lý phương pháp Maximum likelihood dựa tình tự vùng ITS-rDNA phân tích bootstrap với 1.000 lần lập lại Sử dụng chương trình phylogenetic (BioEdit, Clustalx 3.1 Treeview) để quan sát mối quan hệ di truyền qua phả hệ lồi nấm tính tỷ lệ tương đồng DNA mẫu nấm thu thập 3.2.2 Nghiên cứu số đặc điểm sinh học nấm Beauveria Paecilomyces 3.2.2.1 Xác định thời gian nẩy mầm bào tử nấm Beauveria Paecilomyces Trải 0,1 mL dịch bào tử (106 bào tử/mL dung dịch nước cất trùng có chứa 0,05% Tween 20) lame có phủ lớp mơi trường ni cấy, đặt nhiệt độ phòng tối Mỗi mẫu phân lập thực lame tương ứng với lần lặp lại Tỷ lệ bào tử nẩy mầm (%) đánh giá lần vòng 24 kính hiển vi OLYMPUS DP20 với độ phóng đại 400 lần Quan sát thị trường/lame 25 bào tử/thị trường, tổng số bào tử quan sát 400 cho mẫu phân lập 3.2.2.2 Ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng đến phát triển nấm Beauveria Paecilomyces Thí nghiệm thực theo phương pháp bố trí hai nhân tố, nhân tố A chủng nấm Beauveria Paecilomyces phân lập nhân tố B năm loại môi trường dinh dưỡng khác PDA, CDA, SDAY1, SDAY3, SDAY - Chitin với lần lặp lại Mỗi lần lặp lại sử dụng đĩa petri có chứa 10 mL môi trường cần khảo sát Cấy khoanh nấm có đường kính khoảng 10 mm vào đĩa môi trường để úp ngược tiếp xúc trực tiếp môi trường ni cấy đặt nhiệt độ phòng 12 sáng tối Các tiêu theo dõi: (d1+d2) Đường kính tản nấm (cm) = Trong đó: d1 d2 độ dài hai đường chéo phần tản nấm phân bố Thời gian theo dõi: sau ngày ni cấy đo khơng có khác biệt Tốc độ phát triển trung bình (mm/ngày): trung bình lần đo đường kính tản nấm từ - 7, - - 11 ngày sau cấy Mật số bào tử/cm2: tính lần thời điểm 15 ngày sau nuôi cấy theo phương pháp sau: Tính mật số bào tử theo phương pháp đếm mật số bào tử trực tiếp buồng đếm Thoma Số bào tử/mL = (4 a x 106) / b Trong đó: a: số bào tử có thể tích huyền phù ứng với diện tích ô nhỏ (= 1/400 mm2) x độ sâu 0,1 mm; b: hệ số pha loãng Mật số bào tử/cm2= Số bào tử (bt/mL) * V (mL) huyền phù thu đĩa Diện tích tản nấm (cm2) 3.2.2.3 Ảnh hưởng nhiệt độ đến phát triển hình thành bào tử nấm Beauveria Paecilomyces Thí nghiệm thực theo phương pháp Uma et al (2005), Võ Thị Thu Oanh (2010) Thí nghiệm lập lại lần cho mẫu phân lập, cấy khoanh nấm (10 mm) lên bề mặt đĩa petri có chứa khoảng 10ml môi trường nuôi cấy lựa chọn từ thí nghiệm 3.2.2.2 đặt mức nhiệt độ 20, 25, 28, 30, 35oC tủ ổn định Các tiêu theo dõi: tốc độ phát triển trung bình (mm/ngày), số lượng bào tử/cm2 (tương tự thí nghiệm 3.2.2.2) Khả bào tử nẩy mầm nhiệt độ cao (%) Đánh giá khả nẩy mầm chủng nấm Beauveria Paecilomyces mức nhiệt độ cao, bao gồm nghiệm thức sau: 25o - 30o - 35o - 38oC, đó, nghiệm thức 25oC nhiệt độ đối chứng Trải 0,1 mL dịch bào tử (106 bào tử/mL) lame có phủ lớp môi trường nuôi cấy đặt đĩa petri có lót giấy thấm để giữ ẩm, mẫu phân lập thực lame tương ứng với lần lặp lại Tiếp theo, tiến hành đặt đĩa petri vào tủ định ôn cài đặt mức nhiệt độ cao (30o - 35o - 38o) giờ, sau chuyển nhiệt độ đối chứng 25oC 16 Tỷ lệ bào tử nẩy mầm (%) đánh giá lần sau 24 (8 nhiệt độ cao (30o - 35o - 38oC) 16 nhiệt độ đối chứng 25oC) Phương pháp lấy tiêu tương tự thí nghiệm 3.2.2.1 Nguyễn Thị Thúy (2015) thấy kích thước bào tử nấm - 7,4 x 1,4 - 1,7 µm lồi Paecilomyces javanicus Bảng 4.16 Kích thước bào tử chủng nấm Paecilomyces spp STT Chủng nấm Đường kính bào tử (µm) Hình dạng bào tử Pae1(Pl-ST) 5,14 ± 0,19 x 1,69 ± 0,08 Hình thoi Pae2(Cj-ST) 5,06 ± 0,13 x 1,64 ± 0,09 Hình thoi Pae3(Pl-AG) 5,09 ± 0,18 x 1,68 ± 0,07 Hình thoi Pae4(Pl-AG) 5,01 ± 0,14 x 1,66 ± 0,07 Hình thoi Pae5(Pl-TG) 5,04 ± 0,12 x 1,60 ± 0,09 Hình thoi Pae6(Pl-TG) 5,14 ± 0,11 x 1,65 ± 0,05 Hình thoi Pae7(Cj-CT) 5,45 ± 0,11 x 1,64 ± 0,06 Hình thoi Pae8(Pl-CT) 5,56 ± 0,13 x 1,65 ± 0,09 Hình thoi Pae9(Pl-CT) 5,51 ± 0,14 x 1,57 ± 0,14 Hình thoi 10 Pae10(Pl-CT) 5,39 ± 0,18 x 1,62 ± 0,10 Hình thoi 11 Pae11(Cj-CT) 5,21 ± 0,14 x 1,51 ± 0,09 Hình thoi 12 Pae12(Pl-VL) 5,74 ± 0,11 x 1,65 ± 0,09 Hình thoi 13 Pae13(Pl-VL) 5,24 ± 0,11 x 1,51 ± 0,11 Hình thoi 14 Pae14(Pl-HG) 5,18 ± 0,10 x 1,61 ± 0,10 Hình thoi 15 Pae15(RS-ST) 2,65 ± 0,14 x 2,11 ± 0,09 Hình thoi 16 Pae16(RS-AG) 2,60 ± 0,08 x 2,18 ± 0,05 Hình thoi 17 Pae17(SAT-TG) 2,61 ± 0,11 x 2,14 ± 0,07 Hình thoi 18 Pae18(BN-TG) 2,68 ± 0,17 x 2,15 ± 0,13 Hình thoi 19 Pae19(BXN-CT) 2,64 ± 0,13 x 2,14 ± 0,08 Hình thoi 20 Pae20(BXN-CT) 2,66 ± 0,15 x 2,13 ± 0,11 Hình thoi 21 Pae21(RN-CT) 2,62 ± 0,13 x 2,18 ± 0,09 Hình thoi 22 Pae22(RN-VL) 2,67 ± 0,16 x 2,17 ± 0,12 Hình thoi Ghi chú: Kích thước bào tử tính theo độ lệch chuẩn trung bình (TB ± SD) 40 bào tử cho chủng nấm Tám chủng nấm lại ký hiệu từ Pae15 - Pae22 có dạng bào tử hình thoi, nhiên kích thước chiều dài chiều rộng nhỏ 14 chủng nấm trước nằm khoảng từ 2,60 - 2,68 x 2,11 2,18 μm Kết quan sát đặc điểm chủng nấm ký hiệu từ Pae15 - Pae22 cho thấy, giống với mô tả khóa phân loại Samson (1974) lồi Paecilomyces lilacinus Tuy nhiên, theo nghiên cứu phân loại định danh lồi dựa vào cơng nghệ sinh học phân tử hai tác giả Luangsa-Ard et al (2011) Perdomo et al (2013) đổi tên nấm Paecilomyces lilacinus thành Purpureocillum lilacinum, quan sát đặc điểm quan sinh bào tử giống mô tả Samson (1974), nhiên kích thước bào tử có biến động chút nằm khoảng từ - x - μm (Luangsa-Ard et al., 2011) 2,5 - x 1,4 1,6 (Perdomo et al., 2013) 4.2.2 Định danh chủng nấm thuộc chi nấm Paecilomyces dựa kỹ thuật sinh học phân tử (ITS-rDNA) Phản ứng PCR thực với primer ITS4 ITS5 (White et al., 1990) khuyếch đại vùng ITS-rDNA 22 chủng nấm tím Kết (Hình 4.7) cho thấy sản phẩm sau khuếch đại phản ứng PCR vùng ITS-rDNA băng màu xuất 22 vạch có chiều dài nằm khoảng 580 - 600 bp phân tích điện di agarose 1% Tiếp theo mẫu tinh để giải trình tự gene với primer ITS4 ITS5 (White et al., 1990) nhằm so sánh với loài P javanicus P lilacinus biết trước đăng ký liệu Genbank với chủng nấm ký sinh thu thập A B C D E F G H I J 500 bp MK K L M N 500 bp O P Q R S T U V MK Hình 4.7 Sản phẩm PCR khuếch đại vùng ITS-rDNA chủng phân lập Paecilomyces spp., sử dụng hai primer ITS4 ITS5 (White et al., 1990) (MK: maker chuẩn, A - V: ký hiệu 22 chủng nấm Paecilomyces spp từ Pae1 - Pae22) Sơ đồ phân nhóm lồi 14 chủng P javanicus chủng P lilacinus trình bày Hình 4.8 cho thấy, phân nhóm lồi chia thành nhánh chính: Nhánh thứ lồi nấm thuộc chi Paecilomyces Trong bao gồm 14 chủng nấm phân lập với chủng nấm có ký hiệu AB263744.1, KM234218.1, JN204422.1 JQ425658.1 định danh loài P javanicus, tách biệt với hai nhánh nhỏ gồm hai chủng nấm EU573343.1 AB083033.1 định danh loài P farinosus hai chủng nấm AB233338.1 AY624182.1 định danh loài P fumosoroseus Nhánh thứ hai lồi nấm thuộc chi Purpureocillum Trong bao gồm chủng nấm phân lập với chủng nấm có ký hiệu FJ973076.1, KF938913.1, AB124670.1 KY082755.1 định danh loài P lilacinus tách biệt với nhánh nhỏ khác định danh loài P marquandii với mã số AB244775.1 lấy từ GenBank Paecilomyces javanicus (Isaria javanica) Paecilomyces fumosoroseus (Isaria fumosoroseus) Paecilomyces farinosus (Isaria farinose) Paecilomyces lilacinus (Purpureocillum lilacinum) Paecilomyces marquandii Hình 4.8 Sơ đồ phân nhóm lồi 14 chủng phân lập P javanicus chủng P lilacinus phân lập phương pháp Maximum Likelihood dựa tình tự vùng ITS-rDNA Phần trăm giá trị bootstrap từ 1.000 lần lặp lại nhánh Các mẫu P fumosoroseus, P farinosus P marquandii xem loài lai xa Như vậy, từ kết định danh theo phương pháp truyền thống dựa đặc điểm hình thái học, hình dạng kích thước bào tử nấm, cấu trúc quan sinh bào tử, kỹ thuật PCR khuyết đại vùng ITS- rDNA kết phân nhóm lồi dựa trình tự vùng ITS-rDNA tất 14 chủng nấm phân lập ký hiệu từ Pae1 - Pae14 thuộc chi nấm Paecilomyces định danh loài Paecilomyces javanicus (Isaria javanica) Tám chủng nấm lại ký hiệu từ Pae15 - Pae22 thuộc chi Purpureocillum định danh loài Purpureocillum lilacinum Do giới hạn luận án nghiên cứu loài nấm thuộc chi Paecilomyces nên tám chủng nấm phân lập thuộc chi Purpureocillum không đề cập nghiên cứu sau 4.2.3 Một số đặc điểm sinh học nấm Paecilomyces javanicus ký sinh số loại sâu hại trồng 4.2.3.1 Xác định thời gian bào tử nấm P javanicus nẩy mầm Thời gian nẩy mầm chủng nấm thời điểm thể qua Bảng 4.17 cho thấy, tỷ lệ bào tử nẩy mầm 14 chủng nấm Paecilomyces javanicus bắt đầu tăng cao sau 12 nuôi cấy đạt 50% có tỷ lệ nấm nẩy mầm cao 93% giai đoạn 20 GSKC nhiệt độ 25 ± 2oC Bảng 4.17 Tỷ lệ nẩy mầm chủng nấm P javanicus qua quan sát T = 25 ± 2oC, RH = 68 ± 6% Tỷ lệ (%) bào tử nẩy mầm GSKC 12 16 20 Pj1(Pl-ST) 8,3 ef 53,8 i 86,0 efg 96,3 b-e Pj2(Cj-ST) 9,3 cde 54,8 hi 84,9 g 97,3 abc Pj3(Pl-AG) 10,3 c 57,5 fgh 87,8 def 95,3 def Pj4(Pl-AG) 9,6 cde 60,9 cde 91,1 b 97,6 ab Pj5(Pl-TG) 13,0 a 65,9 a 95,8 a 98,8 a Pj6(Pl-TG) 12,3 ab 65,6 ab 92,3 b 97,0 a-d Pj7(Cj-CT) 9,8 cde 59,4 def 84,3 g 95,8 b-e Pj8(Pl-CT) 8,5 def 56,8 f-i 89,8 bcd 94,3 ef Pj9(Pl-CT) 10,8 bc 56,5 f-i 88,3 cde 96,0 b-e Pj10(Pl-CT) 10,4 c 63,9 abc 90,3 bc 95,9 b-e Pj11(Cj-CT) 10,0 cd 62,3 cde 90,3 bc 96,5 bcd Pj12(Pl-VL) 8,4 def 59,0 efg 92,0 b 94,4 ef Pj13(Pl-VL) 7,5 f 56,0 ghi 85,8 fg 93,5 f Pj14(Pl-HG) 9,5 cde 62,5 bcd 86,0 efg 95,5 cde Mức ý nghĩa * * * * CV(%) 0,58 2,16 0,58 0,46 Ghi chú: Trong cột số trung bình có chữ theo sau giống không khác biệt qua phép thử TUKEY HSD *: Khác biệt có ý nghĩa mức 5% GSKC: sau cấy Chủng nấm 4.2.3.2 Ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng đến sinh trưởng phát triển nấm P javanicus Kết Hình 4.9 cho thấy, tất 14 chủng nấm có tốc độ phát triển nhanh 0,3 cm/ngày môi trường PDA, CDA SDAY3 Trên môi trường SDAY1 SDAY+Chitin chủng thường cho tốc độ phát triển chậm so với mơi trường lại Tốc độ phát triển cm/ngày 0.50 0.40 0.30 0.20 0.10 0.00 PDA CDA SDAY1 SDAY3 SDAY+Chitin Chủng nấm Hình 4.9 Tốc độ phát triển trung bình 14 chủng nấm P javanicus năm loại môi trường dinh dưỡng x 107 Mật số bào tử/cm2 Mật số bào tử 14 chủng P javanicus năm loại môi trường dinh dưỡng thời điểm 15 NSKC trình bày Hình 4.10 cho thấy, chủng nấm cho mật số bào tử cao loại mơi trường PDA, CDA, SDAY3 SDAY+Chitin Trong đó, tất 14 chủng nấm cho mật số bào tử cao môi trường CDA Trên môi trường SDAY3 SDAY+Chitin 14 chủng nấm cho mật số gần tương đương cao PDA Tuy nhiên, tất 14 chủng nấm tạo bào tử môi trường SDAY1 20.00 PDA CDA SDAY1 SDAY3 SDAY-Chitin 15.00 10.00 5.00 0.00 Chủng nấm Hình 4.10 Mật số bào tử 14 chủng nấm P javanicus năm loại môi trường dinh dưỡng thời điểm 15 ngày sau cấy Tóm lại, mơi trường PDA, CDA SDAY3 cho tốc độ phát triển đường kính tản nấm nhanh cho mật số bào tử cao khoảng từ 1,2 - 1,6 x 108 bào tử/cm2, môi trường SDAY+Chitin có tốc độ phát triển chậm cho mật số bào tử cao tương đương hai môi trường PDA SDAY3 Chủng Pj6(Pl-TG) có tốc độ phát triển nhanh mật số bào tử cao năm mơi trường ni cấy, sử dụng chủng để nghiên cứu sản xuất chế phẩm sinh học 4.2.3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ đến phát triển hình thành bào tử nấm Paecilomyces javanicus Tốc độ phát triển trung bình tản nấm P javanicus mức nhiệt độ khác trình bày Bảng 4.18 cho thấy: Khoảng nhiệt độ từ 25 - 28oC, điều kiện nhiệt độ tối hảo để nấm P javanicus sinh trưởng phát triển Trong đó, nhiệt độ 25oC điều kiện nhiệt độ lý tưởng để nấm P javanicus phát triển tốt điều kiện nhiệt độ 30oC chủng nấm phân lập phát triển từ 2,33 - 2,79 mm/ngày cao nhiệt độ 20oC Khi nhiệt độ 35oC hầu hết chủng nấm không phát triển Bảng 4.18 Tốc độ phát triển trung bình tản nấm P javanicus mức nhiệt độ khác Chủng nấm Pj1(Pl-ST) Pj2(Cj-ST) Pj3(Pl-AG) Pj4(Pl-AG) Pj5(Pl-TG) Pj6(Pl-TG) Pj7(Cj-CT) Pj8(Pl-CT) Pj9(Pl-CT) Pj10(Pl-CT) Pj11(Cj-CT) Pj12(Pl-VL) Pj13(Pl-VL) Pj14(Pl-HG) Mức ý nghĩa CV(%) Tốc độ phát triển trung bình tản nấm (mm/ngày) 20oC 25oC 28oC 30oC 35oC 2,01 ef 3,74 efg 3,24 ef 2,41 efg 2,14 cde 4,04 c 3,47 c 2,33 g 1,96 f 3,85 de 3,29 de 2,38 fg 2,10 cde 3,72 fg 3,24 ef 2,56 cd 2,36 ab 4,28 b 3,69 b 2,69 ab 2,39 a 4,44 a 3,81 a 2,77 a 2,22 bcd 3,97 cd 3,49 cd 2,72 a 2,30 abc 4,06 c 3,60 c 2,79 a 2,15 cde 3,76 ef 3,28 ef 2,53 a 2,07 def 3,70 fg 3,17 fg 2,34 g 2,23 a-d 3,86 de 3,39 cd 2,59 bc 1,99 ef 3,61 g 3,12 g 2,34 g 2,14 de 3,80 ef 3,42 c 2,71 a 2,23 a-d 4,01 c 3,49 c 2,47 def * * * * 2,93 1,4 1,31 1,76 - Ghi chú: Trong cột số trung bình có chữ theo sau giống khơng khác biệt qua phép thử TUKEY HSD *: Khác biệt có ý nghĩa mức 5% Khả sinh bào tử 14 chủng nấm P javanicus điều kiện nhiệt độ khác trình bày Bảng 4.19 cho thấy, khoảng nhiệt độ thích hợp cho nấm tạo bào tử từ 25o - 28oC Các chủng nấm tạo bào tử nhiệt độ 20oC Hai chủng nấm Pj7(CjCT) Pj8(Pl-CT) tạo bào tử cao so với chủng nấm lại mức nhiệt độ khác Bảng 4.19 Khả sinh bào tử chủng nấm P javanicus điều kiện nhiệt độ khác Mật số bào tử (x107 bt/cm2) mức nhiệt độ 20oC 25oC 28oC 30oC Pj1(Pl-ST) 4,90 c 15,3 bcd 11,6 c-f 6,56 bc Pj2(Cj-ST) 5,13 c 17,3 abc 11,5 c-f 6,59 bc Pj3(Pl-AG) 3,85 c 10,1 e 8,97 g 4,84 c Pj4(Pl-AG) 6,39 abc 11,9 de 10,2 fg 5,71 bc Pj5(Pl-TG) 5,13 bc 12,8 cde 10,4 efg 5,84 bc Pj6(Pl-TG) 6,50 abc 16,0 a-d 13,8 a-d 7,21 b Pj7(Cj-CT) 9,95 a 20,9 ab 16,6 ab 12,1 a Pj8(Pl-CT) 8,65 ab 21,3 a 17,3 a 12,6 a Pj9(Pl-CT) 5,73 abc 17,1 abc 13,0 c-f 7,59 b Pj10(Pl-CT) 5,36 bc 16,7 a-d 12,0 c-f 6,84 bc Pj11(Cj-CT) 5,01 c 13,8 cde 11,0 d-g 6,21 bc Pj12(Pl-VL) 5,63 bc 15,4 a-d 14,5 abc 7,19 bc Pj13(Pl-VL) 4,69 c 12,6 cde 13,1 cde 5,73 bc Pj14(Pl-HG) 4,43 c 12,0 de 12,6 c-f 5,48 bc Mức ý nghĩa * * * * CV(%) 1,16 0,67 0,55 0,81 Ghi chú: Trong cột số trung bình có chữ theo sau giống khơng khác biệt qua phép thử TUKEY HSD *: Khác biệt có ý nghĩa mức 5% Chủng nấm Kết nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện nhiệt độ lên sinh trưởng phát triển tạo bào tử chủng nấm P javanicus khẳng định nấm P javanicus thuộc lồi thích nhiệt độ trung bình với khoảng nhiệt độ tối hảo từ 25o - 28oC Tuy nhiên, phản ứng biến thiên nhiệt độ số chủng nấm P javanicus có khác biệt đáng kể Một số chủng có phổ thích nghi cho sinh trưởng phát triển dãy nhiệt độ rộng (25 - 38oC) tiếp xúc với nhiệt độ cao khoảng thời gian ngắn (8 giờ) số khác hoàn toàn bị giới hạn (Bảng 4.20) Từ đó, tuyển chọn chủng nấm có khả chịu nhiệt tốt, nên có tiềm để nghiên cứu phát triển chế phẩm nấm P javanicus sử dụng tháng nắng nóng Bảng 4.20 Tỷ lệ (%) bào tử chủng nấm P javanicus nẩy mầm nhiệt độ cao Tỷ lệ (%) bào tử nẩy mầm khoảng nhiệt độ 25oC(1) 30o/25oC(2) 35o/25oC(3) 38o/25oC(4) Pj1(Pl-ST) 96,8 ab 92,88 abc 91,91 abc 88,91 abc Pj2(Cj-ST) 98,0 ab 94,25 abc 92,74 abc 89,98 ab Pj3(Pl-AG) 95,8 b 91,81 c 82,25 d 0,00 d Pj4(Pl-AG) 98,5 ab 94,53 abc 93,51 abc 89,51 abc Pj5(Pl-TG) 99,4 a 95,42 a 94,38 a 90,55 a Pj6(Pl-TG) 98,3 ab 94,79 ab 93,75 ab 88,86 abc Pj7(Cj-CT) 96,3 b 92,30 bc 91,27 abc 88,80 abc Pj8(Pl-CT) 96,0 b 92,08 bc 91,64 abc 87,58 bc Pj9(Pl-CT) 96,5 b 92,62 bc 91,13 bc 86,90 c Pj10(Pl-CT) 96,4 b 92,66 abc 83,75 d 0,00 d Pj11(Cj-CT) 97,0 ab 93,21 abc 79,25 e 0,00 d Pj12(Pl-VL) 95,9 b 91,97 bc 90,38 c 87,47 bc Pj13(Pl-VL) 95,8 b 91,87 c 76,70 e 0,00 d Pj14(Pl-HG) 97,5 ab 93,71 abc 92,61 abc 89,78 abc Mức ý nghĩa * * * * CV(%) 0,56 0,57 0,67 0,74 Ghi chú: Trong cột số trung bình có chữ theo sau giống khơng khác biệt qua phép thử TUKEY HSD *: Khác biệt có ý nghĩa mức 5% GSKC: sau cấy (1) : nhiệt độ đối chứng 25oC (2) : đặt nấm 30oC giờ, sau chuyển sang nhiệt độ đối chứng 25oC 16 (3) : đặt nấm 35oC giờ, sau chuyển sang nhiệt độ đối chứng 25oC 16 (4) : đặt nấm 38oC giờ, sau chuyển sang nhiệt độ đối chứng 25oC 16 Chủng nấm 4.2.3.4 Ảnh hưởng số loài thuốc trừ nấm đến phát triển nẩy mầm nấm Paecilomyces javanicus Kết thí nghiệm ảnh hưởng thuốc trừ bệnh lên phát triển nẩy mầm nấm P javanicus trình bày Bảng 4.21 cho thấy, đa số thuốc trừ bệnh có ảnh hưởng bất lợi đến phát triển nẩy mầm nấm P javanicus: hai hoạt chất Azoxytrobin + Difenoconazole Fenbuconazole gây độc sinh trưởng phát triển nấm P javanicus nồng độ Hoạt chất Kasugamycin gây độc hại với nấm hai nồng độ (LKC) (2 x LKC), hai hoạt chất lại Fenoxanil Picoxystrobin gây hại nấm P javanicus nồng độ cao (2 x LKC) Từ kết cho thấy, nên thận trọng xử lý thuốc trừ bệnh nấm ký sinh côn trùng để không làm ảnh hưởng lên hiệu nấm ký sinh côn trùng gây hại chọn lọc sử dụng thuốc trừ nấm bệnh luân phiên với chế phẩm sinh học nấm ký sinh côn trùng Bảng 4.21 Ảnh hưởng nồng độ thuốc trừ nấm đến phát triển, tỷ lệ nẩy mầm mật số bào tử nấm P javanicus T = 26 ± 2oC, RH = 72 ± Đường kính tản nấm (cm) Hoạt chất Nồng độ Mật số bào tử (x107/cm2) (%) (TB ± SD) (%) (TB ± SD) Tỷ lệ nẩy mầm (%) sau 24 Độ độc thuốc (*) Ức Ức chế chế 0,5 x 3,98 ± 0,08 h 38 7,40 ± 0,09 fg 56 49,0 ± 1,80 i Ảnh hưởng vừa (47,3) Azoxytrobin + x 3,04 ± 0,09 j 53 6,10 ± 0,10 g 64 39,3 ± 1,30 j Ảnh hưởng (38,2) Difenoconazole x 2,92 ± 0,04 j 55 4,30 ± 0,07 h 75 30,1 ± 0,55 k Rất ảnh hưởng (29,3) 0,5 x 4,58 ± 0,08 d 29 9,20 ± 0,09 b-f 46 60,9 ± 0,55 c Ảnh hưởng vừa (57,6) Fenbuconazole x 4,46 ± 0,05 d 31 8,70 ± 0,10 c-f 49 57,9 ± 0,89 fg Ảnh hưởng vừa (54,9) x 4,43 ± 0,04 de 31 7,60 ± 0,07 ef 55 52,6 ± 0,55 h Ảnh hưởng vừa (49,6) 0,5 x 4,77 ± 0,08 c 23 11,3 ± 0,09 b 33 71,9 ± 1,14 b Vô hại (68,6) Fenoxanil x 4,30 ± 0,07 ef 25 10,6 ± 0,10 bcd 38 68,0 ± 1,00 c Vô hại (64,8) x 4,26 ± 0,05 fg 35 9,70 ± 0,06 bcd 43 61,7 ± 0,45 de Ảnh hưởng vừa (58,7) 0,5 x 4,93 ± 0,04 b 26 10,4 ± 0,06 bcd 39 66,9 ± 0,55 c Vô hại (63,6) Kasugamycin x 4,83 ± 0,04 bc 33 9,50 ± 0,04 bcd 44 61,1 ± 0,89 de Ảnh hưởng vừa (58,2) x 4,18 ± 0,08 fg 34 8,50 ± 0,04 def 50 56,2 ± 1,30 g Ảnh hưởng vừa (53,3) 0,5 x 4,26 ± 0,05 fg 34 10,7 ± 0,06 bc 37 66,7 ± 0,84 c Vô hại (63,7) Picoxystrobin x 4,14 ± 0,09 gh 36 10,1 ± 0,04 bcd 40 63,3 ± 0,82 d Vô hại (60,5) x 4,02 ± 0,04 hi 38 9,40 ± 0,07 b-e 44 59,7 ± 0,84 ef Ảnh hưởng vừa (56,8) Đối chứng - 6,44 ± 0,05 a 16,9 ± 0,10 a 99,1 ± 0,68 a Mức ý nghĩa * * * CV (%) 1,65 0,56 1,44 Ghi chú: Trong cột số trung bình có chữ theo sau giống khơng khác biệt qua phép thử TUKEY HSD *: Khác biệt có ý nghĩa mức 5% (*) Độ độc thuốc tính theo cơng thức Usha et al (2014) với cấp độ: 0-30 (rất ảnh hưởng), 31-45 (ảnh hưởng), 46-60 (ảnh hưởng vừa) và> 60 vơ hại (cơng thức tính nêu mục 3.2.2.6) 4.2.4 Kết đánh giá hiệu lực chủng nấm P javanicus trừ rệp sáp Planococcus lilacinus (Cockerell) 4.2.4.1 Bước đầu đánh giá hiệu lực nấm P javanicus trừ rệp sáp Planococcus lilacinus (Cockerell) điều kiện phòng thí nghiệm Kết trình bày Bảng 4.22 cho thấy, đa số chủng nấm phân lập có hiệu cao rệp sáp P lilacinus từ 42 - 93% thời điểm từ đến 11 ngày Điều chứng tỏ chủng nấm P javanicus có phổ ký chủ rộng khơng có chủng nấm phân lập từ rệp sáp P lilacinus cho hiệu diệt rệp sáp P lilacinus cao mà có chủng nấm phân lập từ rệp sáp Crypticerya jacobsoni địa phương khác cho hiệu diệt rệp sáp P lilacinus cao Bảng 4.22 Độ hữu hiệu chủng nấm P javanicus thành trùng rệp sáp Planococcus lilacinus điều kiện PTN T = 27 ± 2oC, RH = 72 ± % Độ hữu hiệu (%) thời điểm sau phun nấm 11 Pj1(Pl-ST) 11,81 24,54 cd 38,10 c 65,29 b 81,35 Pj2(Cj-ST) 12,76 24,57 d 38,13 c 64,45 b 80,52 Pj3(Pl-AG) 11,84 28,79 a-d 42,36 bc 67,82 abc 81,38 Pj4(Pl-AG) 14,34 31,29 a-d 44,86 abc 68,59 abc 82,16 Pj5(Pl-TG) 15,2 32,16 a-d 45,72 abc 69,45 abc 81,35 Pj6(Pl-TG) 18,65 45,66 ab 59,22 ab 82,96 a 91,47 Pj7(Cj-CT) 17,79 47,39 a 60,95 a 83,02 a 92,36 Pj8(Pl-CT) 19,43 47,53 a 61,09 a 83,99 a 93,25 Pj9(Pl-CT) 14,4 32,18 a-d 49,08 abc 72,82 abc 86,38 Pj10(Pl-CT) 14,48 28,85 a-d 46,58 abc 70,32 abc 83,88 Pj11(Cj-CT) 13,59 27,96 bcd 45,69 abc 69,43 abc 82,99 Pj12(Pl-VL) 13,51 44,11 abc 57,67 ab 81,41 ab 86,47 Pj13(Pl-VL) 13,48 30,43 a-d 48,30 abc 72,04 abc 85,6 Pj14(Pl-HG) 16,95 43,97 abc 57,53 ab 81,26 abc 88,05 Mức ý nghĩa ns * * * ns CV(%) 22,4 21,5 14,7 3,3 Ghi chú: Trong cột số trung bình có chữ theo sau giống khơng khác biệt qua phép thử TUKEY *: khác biệt có ý nghĩa mức 5% ns: khơng khác biệt mức ý nghĩa 5% Nghiệm thức 4.2.4.2 Hiệu lực chế phẩm nấm P javanicus ký sinh rệp sáp Planococcus lilacinus (Cockerell) điều kiện phòng thí nghiệm Từ kết nghiên cứu số đặc điểm sinh học nấm P javanicus bước đầu đánh giá hiệu lực chủng nấm P javanicus ký sinh rệp sáp Planococcus lilacinus điều kiện phòng thí nghiệm tuyển chọn chủng Pj6(Pl-TG) Pj12(PlVL) để sản xuất chế phẩm nấm P javanicus dạng tươi theo quy trình nhân ni nấm nêu phụ chương Hiệu lực chế phẩm nấm tím P javanicus thành trùng rệp sáp P lilacinus mật số bào tử (5 x 107), (5 x 108) (5 x 109) ghi nhận từ - 11 ngày sau phun nấm trình bày Bảng 4.23 cho thấy: tỷ lệ chết thành trùng rệp sáp 50% cá thể thời điểm ngày sau phun nấm (NSPN) nồng độ (5 x 109), NSPN nồng độ (5 x 108) NSPN nồng độ (5 x 107) Mật số bào tử chế phẩm nấm P javanicus từ (5 x 108) (5 x 109) cho hiệu cao thành trùng rệp sáp P lilacinus Bảng 4.23 Độ hữu hiệu mật số bào tử (bt/mL) chế phẩm nấm tím P javanicus thành trùng rệp sáp P lilacinus (Cockerell) điều kiện PTN T = 27 ± 2oC, RH = 72 ± % Độ hữu hiệu (%) thời điểm sau phun nấm 11 Pj (5 x 107) 6,75 c 19,45 c 31,29 c 50,03 c 60,11 b Pj (5 x 108) 17,73 b 41,47 b 61,01 b 82,21 b 90,66 a Pj (5 x 109) 31,32 a 51,70 a 76,29 a 89,83 a 94,91 a Mức ý nghĩa * * * * * CV (%) 12,5 7,95 7,89 3,04 3,76 Ghi chú: Trong cột số trung bình có chữ theo sau giống khơng khác biệt qua phép thử TUKEY HSD *: khác biệt thống kê mức ý nghĩa 5% Nghiệm thức Kết đánh giá hiệu liều lượng chế phẩm nấm tím P javanicus thành trùng rệp sáp P lilacinus điều kiện phòng thí nghiệm trình bày Bảng 4.24 cho thấy, độ hữu hiệu liều lượng chế phẩm nấm tím P javanicus đạt khoảng 66,09 - 91,10% sau 11 ngày phun nấm Hai nghiệm thức Pj - 3,0 kg Pj - 3,5 kg xử lý chế phẩm nấm tím P javanicus với liều lượng 3,0 kg/ha 3,5 kg/ha cho hiệu cao thành trùng rệp sáp P lilacinus qua thời điểm lấy tiêu, áp dụng hai liều lượng để khảo sát hiệu lực chế phẩm nấm tím P javanicus ký sinh rệp sáp P lilacinus điều kiện nhà lưới Bảng 4.24 Độ hữu hiệu liều lượng chế phẩm nấm tím P javanicus thành trùng rệp sáp P lilacinus (Cockerell) điều kiện PTN T = 27 ± 2oC, RH = 78 ± % Độ hữu hiệu (%) thời điểm sau phun nấm 11 Pj - 2,0 kg 25,34 a 37,21 a 45,10 b 56,62 b 66,09 c Pj - 2,5 kg 27,93 a 41,52 a 48,58 b 61,88 b 77,70 bc Pj - 3,0 kg 28,82 a 48,28 a 64,56 a 81,43 a 90,14 ab Pj - 3,5 kg 29,66 a 52,50 a 68,10 a 87,65 a 91,10 a CLTBM 5,89 b 6,72 b 7,94 c 8,84 c 8,90 d Mức ý nghĩa * * * * * CV(%) 13,48 12,19 7,64 9,57 8,93 Ghi chú: Trong cột số trung bình có chữ theo sau giống khơng khác biệt qua phép thử TUKEY HSD *: Khác biệt có ý nghĩa mức 5% Nghiệm thức 4.2.4.3 Hiệu lực chế phẩm nấm P javanicus ký sinh rệp sáp Planococcus lilacinus (Cockerell) điều kiện nhà lưới Kết khảo sát hiệu lực chế phẩm nấm P javanicus với liều lượng chế phẩm nấm P javanicus để phòng trừ rệp sáp điều kiện nhà lưới trình bày Bảng 4.25 cho thấy, độ hữu hiệu liều lượng chế phẩm nấm tím P javanicus đạt cao khoảng 56,14 - 80,76% sau 11 ngày phun nấm Hai nghiệm thức Pj - 3,0 kg Pj - 3,5 kg chế phẩm nấm tím P javanicus cho hiệu ký sinh RS tương đối cao Vì thế, sử dụng hai nghiệm thức Pj - 3,0 kg Pj - 3,5 kg với liều lượng tương đương 3,0 kg/ha 3,5 kg/ha chế phẩm nấm tím P javanicus để quản lý phòng trừ rệp sáp P lilacinus điều kiện đồng Bảng 4.25 Độ hữu hiệu liều lượng chế phẩm nấm P javanicus thành trùng rệp sáp P lilacinus điều kiện nhà lưới T = 30 ± 2oC, RH = 78 ± % Độ hữu hiệu (%) thời điểm sau phun nấm 11 Pj - 2,0 kg 20,40 a 30,11 c 42,00 b 51,33 c 56,14 c Pj - 2,5 kg 21,65 a 36,59 bc 47,30 b 57,97 bc 62,99 bc Pj - 3,0 kg 26,14 a 43,78 ab 63,35 a 73,42 ab 78,72 ab Pj - 3,5 kg 29,94 a 48,38 a 65,31 a 78,70 a 80,76 a CLTBM 4,47 b 6,55 d 7,31 c 7,98 d 8,93 Mức ý nghĩa * * * * * CV(%) 12,09 9,22 7,48 9,84 9,78 Ghi chú: Trong cột số trung bình có chữ theo sau giống khơng khác biệt qua phép thử TUKEY HSD *: Khác biệt có ý nghĩa mức 5% Nghiệm thức 4.2.4.4 Hiệu lực chế phẩm nấm Paecilomyces javanicus ký sinh rệp sáp Planococcus lilacinus (Cockerell) điều kiện đồng Kết đánh giá hiệu lực chế phẩm nấm Paecilomyces javanicus (Isaria javanica) ký sinh rệp sáp Planococcus lilacinus điều kiện ngồi đồng trình bày Bảng 4.26 cho thấy, qua lần xử lý rệp sáp P lilacinus chế phẩm nấm tím P javanicus cho hiệu lực phòng trừ rệp sáp tăng sau lần xử lý có hiệu kéo dài 14 ngày sau phun, nhiên hiệu lực chế phẩm thấp so với kết khảo sát hiệu lực chế phẩm nấm điều kiện nhà lưới, cho hiệu lực phòng trừ rệp sáp tương đương với biện pháp phòng trừ thuốc hố học Tasodant 600EC Hiện nay, với quy trình sản xuất nấm tím P javanicus nghiên cứu để chuyển giao cho nơng dân sản xuất chế phẩm nấm tím P javanicus nơng hộ, người dân dễ dàng áp dụng chế phẩm nấm tím P jsavanicus thay dần thuốc trừ sâu hóa học việc phòng trừ rệp sáp P lilacinus đồng ruộng mà không ảnh hưởng đến sức khỏe người thân thiện với môi trường Bảng 4.26 Hiệu lực chế phẩm nấm tím P javanicus thành trùng rệp sáp P lilacinus gây hại mãng cầu xiêm giống Thái Vĩnh Long, 2017 T = 30 ± 2oC, RH = 78 ± % Độ hữu hiệu (%) thời điểm sau phun 11 14 A - Chế phẩm nấm tím 46,36 b 63,45 ab 55,74 Phun lần B - BIO-Pro Pests 35,23 b 50,26 b 43,68 (Khi điều tra có rệp sáp gây hại) C - Tasodant 600EC 72,72 a 78,34 a 57,80 Mức ý nghĩa * * ns CV (%) 8,87 6,54 9,27 A - Chế phẩm nấm tím 69,52 ab 71,80 ab 72,17 Phun lần B - BIO-Pro Pests 58,50 b 60,95 b 63,13 (Phun cách lần sau 14 ngày) C - Tasodant 600EC 82,95 a 84,54 a 74,17 Mức ý nghĩa * * ns CV (%) 7,21 7,82 5,66 A - Chế phẩm nấm tím 72,47 ab 74,96 ab 75,64 Phun lần B - BIO-Pro Pests 60,14 b 62,12 b 64,33 (Phun cách lần sau 14 ngày) C - Tasodant 600EC 84,45 a 85,58 a 74,50 Mức ý nghĩa * * ns CV (%) 8,74 7,88 5,55 Ghi chú: Trong cột số trung bình có chữ theo sau giống khơng khác biệt qua phép thử TUKEY *: khác biệt có ý nghĩa mức 5% ns: không khác biệt mức ý nghĩa 5% Thời điểm xử lý rệp sáp Nghiệm thức CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận 1) Đã thu thập 16 chủng nấm Beauveria 22 chủng nấm Paecilomyces tỉnh vùng ĐBSCL Cần Thơ, Vĩnh Long, Hậu Giang, An Giang, Kiên Giang, Sóc Trăng Trà Vinh, gây bệnh nhiều lồi trùng gây hại tập trung sùng khoai lang rệp sáp Kết quan sát, phân loại hình thái học hình dạng bào tử, cành bào đài, quan sinh bào tử, kích thước bào tử kết hợp với kỹ thuật PCR, giải trình tự, so sánh phân tích trình tự DNA vùng ITS-rDNA khẳng định 16 chủng phân lập Beauveria thuộc loài Beauveria bassiana; 22 chủng nấm Paecilomyces khẳng định 14 chủng nấm tím phân lập ký hiệu từ Pae1 - Pae14 thuộc chi Paecilomyces loài Paecilomyces javanicus chủng nấm tím lại thuộc chi Purpureocillum loài Purpureocillum lilacinum 2) Nghiên cứu đặc điểm sinh học 16 chủng nấm B bassiana 14 chủng nấm P javanicus cho thấy: Tỷ lệ nẩy mầm chủng nấm P javanicus đạt 94% sau 20 GSKC sớm so với chủng nấm B bassiana đạt 94% sau 24 GSKC Môi trường SDAY3 PDA ln cho tốc độ phát triển đường kính tản nấm nhanh cho mật số bào tử cao, chủng nấm P javanicus phát triển tốt môi trường CDA Nhiệt độ tối hảo cho nấm B bassiana chủng nấm P javanicus phát triển đồng thời tạo nhiều bào tử từ 25o - 28oC Khi nhiệt độ tăng lên cao 30oC hai lồi nấm phát triển chậm lại khơng phát triển Bào tử chủng nấm B bassiana chủng nấm P javanicus có khả sống sót sau tiếp xúc với điều kiện nhiệt độ cao Đa số thuốc hoá học trừ nấm bệnh có ảnh hưởng bất lợi đến phát triển nẩy mầm nấm B bassiana nấm P javanicus nồng độ (LKC) (2 x LKC) 3) Dựa vào kết nghiên cứu đặc điểm sinh học bước đầu đánh giá hiệu lực 16 chủng nấm B bassiana 14 chủng nấm P javanicus, tuyển chọn chủng Bb4(SKL-VL), Bb5(SKL-HG), Pj6(Pl-TG) Pj8(Pl-CT) để sản xuất chế phẩm dạng tươi theo quy trình nhân nuôi nấm nêu phụ chương 4) Đánh giá hiệu lực chế phẩm nấm B bassiana phòng trừ thành trùng SKL C formicarius (Fabricius) chế phẩm P javanicus phòng trừ thành trùng rệp sáp P lilacinus (Cockerell) điều kiện PTN nhà lưới hai chế phẩm đạt hiệu cao 80% sau - 11 ngày phun chế phẩm với nồng độ bào tử chế phẩm từ 108 - 109 (bt/mL) liều lượng chế phẩm từ 3,0 kg/ha 3,5 kg/ha Kết đánh giá hiệu lực chế phẩm nấm B bassiana P javanicus diện hẹp điều kiện đồng ruộng cho thấy, phun lần chế phẩm nấm B bassiana để phòng trừ SKL lần chế phẩm P javanicus để phòng trừ rệp sáp với liều lượng 3,0 kg/ha cho hiệu tương đương với biện pháp sử dụng thuốc hoá học theo nơng dân Vì vậy, kết thu nghiên cứu sở để khuyến cáo ứng dụng nấm ký sinh B bassiana P javanicus tác nhân kiểm soát sinh học chương trình IPM, để thay loại thuốc hóa học sở cho hướng nghiên cứu lĩnh vực đấu tranh sinh học côn trùng 5.2 Đề nghị Nghiên cứu khả sinh độc tố giết côn trùng, ảnh hưởng yếu tố môi trường lên khả ký sinh, độc tính nấm khả tồn lâu dài chế phẩm phóng thích ngồi đồng ruộng hai loài nấm B bassiana P javanicus Nghiên cứu đánh giá hiệu lực điều kiện đồng diện rộng đánh giá hiệu lực ký chủ khác hai chế phẩm nấm B bassiana P javanicus ... sinh côn trùng gây hại phân lập Đồng Sông Cửu Long thực 1.2 Mục tiêu nghiên cứu đề tài Thu thập định danh đến loài chủng nấm thuộc hai chi Beauveria Paecilomyces ký sinh số loài côn trùng gây hại. .. trùng gây hại có hiệu thay dần thuốc BVTV cần thiết thực tế sản xuất Xuất phát từ thực tế, đề tài Nghiên cứu số đặc điểm hình thái, sinh học đánh giá hiệu chủng nấm Beauveria Paecilomyces ký sinh. .. nghệ sinh học phân tử 3.2.1.1 Phân lập định danh loài nấm ký sinh số sâu hại trồng thuộc chi nấm Beauveria Paecilomyces theo phương pháp truyền thống Thu thập côn trùng gây hại bị nhiễm nấm ký sinh