Là kĩ thuật cho phép hiển thị, nhận dạng, liệt kê và định vị các tế bào vi khuẩn. Nhận ra các dạng vsv quen thuộc, đã biết môi trường nuôi cấy đặc hiệu. Xác định các vsv lạ, chưa biết rõ điều kiện môi trường nuôi cấy. Hệ thống phức tạp của các quần thể sinh vật. Kết hợp chính xác kĩ thuật di truyền phân tử . Hình dung và nhận biết các tế bào vi khuẩn
Kĩ thuật lai huỳnh quang chỗ Fish Là kĩ thuật cho phép hiển thị, nhận dạng, liệt kê định vị tế bào vi khuẩn Nhận dạng vsv quen thuộc, biết môi trường nuôi cấy đặc hiệu Xác định vsv lạ, chưa biết rõ điều kiện & môi trường nuôi cấy Hệ thống phức tạp quần thể sinh vật Kết hợp xác kĩ thuật di truyền phân tử Hình dung nhận biết tế bào vi khuẩn môi trường tự nhiên hay mô bệnh Kĩ thuật lai huỳnh quang chỗ Fish Mô tả quần thể vsv mơi trường tự nhiên ( bật trần tích Wadden, vịnh na-uy……) Trong y học: xác định mầm bệnh có nguồn gốc từ vi khuẩn (hơ hấp, tiêu hóa,….) Chuẩn đốn bất thường cấu trúc số lượng NST ( trước sau sinh) thai nhi Quy trình thực • Dò tìm phát trình tự acid nucleic lồi vsv cách dùng đầu dò đánh dấu huỳnh quang lai đặc biệt với trình tự đặc hiểu bổ sung với bên tế bào nguyên vẹn ( không cần phá vỡ tế bào) Quy trình gồm bước • • • • • • • Chuẩn bị mẫu đầu dò Cố định mẫu Lai đầu dò trình tự đích đặc hiệu nằm tế bào Rửa mẫu để loại bỏ đầu dò khơng lai Dò tìm mẫu (bước bỏ qua sử dụng đầu dò phát huỳnh quang trực tiếp) Quan sát, hiển thị lưu trữ kết Lựa chọn đầu dò đánh dấu huỳnh quang • Đầu dò: Là olionucleotide dài từ 15 đến 30 bp, có trình tự bổ sung với rRNA 16S tế bào vi sinh vật Gần trình tự đích khác rRNA 23s,rRNA 18s hay mRNA xác định thành cơng thí nghiệm Fish rRNA 16 S sử dụng ổn định mặt di truyền, số lượng nhiều cấu trúc dc bán bảo toàn đoạn gen rRNA 16S giúp cho việc nhận biết định danh loài vi sinh vật trở nên dễ dàng xác Đánh dấu huỳnh quang lên đầu dò có cách: • • Trực tiếp: đánh dấu chất nhuộm huỳnh quang lên đầu dò, khơng cần bước dò tìm sau q trình lai Gián tiếp: đánh dấu số hợp chất thị trung gian, đồng thời phải tiến hành dò tìm sau trình lai Chất thị Dioxygenin (DIG) Enzyme nhằm khuếch đại tín hiệu Đầu dò polyribonucleotide Trực tiếp: thuốc nhuộm huỳnh quang • Đặc điểm quang trọng: chất huỳnh quang có mức lượng kích thích phát xạ khác -> cho phép phát đồng thời hay nhiều vsv lai lần Nhược điểm kỹ thuật Fish Các chất tự phát huỳnh quang Kết khơng xác Đầu dò thiếu tính đặc hiệu Số lượng đầu dò q Cấu trúc đầu dò hay trình tự đích q phức tạp Không thu kết Hàm lượng RNA thấp Ảnh chụp bị màu Ứng dụng Fish Fish sử dụng toàn giới để nghên cứu quần thể vi khuẩn tự nhiên môi trường nước,trong đất hay bề mặt rễ thực vật Vd: Khi sử dụng fish để phát trội chủng Bacillus đất đồng cỏ Hà Lan Loại vi khuẩn có hình que, có chứa ribotype DA001 16S rRNA Vi khuẩn cộng sinh Sử dụng rRNA 16S để định danh phân cấp phát sinh lồi Dùng FISH để chứng minh tính chất cộng sinh vi khuẩn Hệ vi sinh vật nước thải Fish sử dụng đầu dò oligonnucleotide tạo kĩ thuật phân tử PCR để nghiên cứu quần thể vi khuẩn nướn thải, bùn hoạt tính Hình 4: Sự tự phát huỳnh quang Paraformaldehyde tế bào Candida albicans(Moter et al., 2000) Sự đa dạng vsv Ứng dụng y học Nghiên cứu quần thể vi khuẩn phức tạp cở thể người động vật dày khoang miệng phổi Phát vi khuẩn xoắn khoang miệng Hình nhuộm hình quang lớp vi khuẩn từ bệnh nhân viêm (a) lai với huỳnh quang đầu dò vi khuẩn EUB338 gắn nhân FITC (b) lai với đầu dò TRE I gắn nhãn FITC (xanh cây)và TRE II gắn nhãn Cy3 (vàng) Nghiên cứu phát bệnh có nguồn gốc từ nấm Candida mầm bệnh suy giảm miễn dịch Xác định xác lồi vi khuẩn gây bệnh động vật thực vậtđể từ kiểm sốt triệt tiêu mầm bệnh Khoai tây mục héo hóa nâu vi khuẩn Ralstonia solanacearum Penaeus vannamei gây bệnh tôm trắng Triển vọng FISH Trên giới - Thực hoàn toàn tự động, nhanh chóng chuẩn đốn xác vi sinh vật - Kết hợp FISH với đánh dấu miễn dịch, giúp hiểu rõ chế gây bệnh vi khuẩn Trên giới - Kỹ thuật FISH với độ nhạy cao, sử dụng mRNA, trình tự khơng ổn định có số lượng thấp - Sử dụng đầu dò acid nucleic peptide trung hòa điện thay cho oligonucleotide Tại Việt Nam • • FISH hạn chế sử dụng, chủ yếu ứng dụng chẩn đoán bệnh di truyền: • • • Phát đọa nhỏ số hội chứng di truyền Việc chẩn đoán trước sinh sau sinh bất thường cấu trúc số lượng nhiễm sắc thể thai nhi Xác định đoạn nhiễm sắc thể chưa rõ nguồn gốc Phát bất thường nhiễm sắc thể đặc hiệu ung thư • Tại Việt Nam Việc phát triển kỹ thuật FISH Việt Nam tương lai có nhiều triển vọng đầu tư cho kĩ thuật phù hợp với điều kiện kinh tế khoa học kĩ thuật nước ta ... thể đặc hiệu ung thư • Tại Việt Nam Việc phát triển kỹ thuật FISH Việt Nam tương lai có nhiều triển vọng đầu tư cho kĩ thuật phù hợp với điều kiện kinh tế khoa học kĩ thuật nước ta .. .Kĩ thuật lai huỳnh quang chỗ Fish Mô tả quần thể vsv môi trường tự nhiên ( bật trần tích Wadden, vịnh na-uy……)... kính hiển vi laze quét đồng tiêu) Máy ảnh CCD Phần mềm xử lý ảnh kĩ thuật số Nhược điểm kỹ thuật Fish Các chất tự phát huỳnh quang Kết khơng xác Đầu dò thiếu tính đặc hiệu Số lượng đầu dò q Cấu