slide thuyết trình tìm hiểu kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ FISH (florescence in situ hybridization) trên vi sinh vật

TÌM HIỂU KỸ THUẬT LAI HUỲNH QUANG TẠI CHỖ TRÊN VI SINH VẬT SVTH : TRƯƠNG THÀNH ĐẠT MSSV : 60604096 GVHD : NGUYỄN THỊ THANH HUYỀN MỤC ĐÍCH Cung cấp xác thơng tin hình thái, số lượng, không gian phân bố hay mối tương quan với môi trường sống vi sinh vật Quy trình thực • Chuẩn bị mẫu đầu dị • Trộn mẫu với đầu dị • Lai đầu dị trình tự đích đặc hiệu nằm tế bào • Rửa mẫu để loại bỏ đầu dị khơng lai • Dị tìm mẫu (bước bỏ qua sử dụng đầu dò phát huỳnh quang trực tiếp) • Quan sát, hiển thị lưu trữ kết Quy trình thực Đầu dị - Đầu dò: Là oligonucleotide dài từ 15 đến 30 bp, có trình tự bổ sung với rRNA 16S tế bào vi sinh vật Quy trình thực Đánh dấu huỳnh quang lên đầu dị Có cách bản: - Đánh dấu trực tiếp: khơng cần bước dị tìm sau q trình lai - Đánh dấu gián tiếp: đánh dấu số hợp chất thị trung gian, đồng thời phải tiến hành dị tìm sau q trình lai Quy trình thực Quy trình thực Thuốc nhuộm huỳnh quang Đặc điểm quan trọng: chất huỳnh quang có mức lượng kích thích phát xạ khác Cho phép phát đồng thời hai hay nhiều vi sinh vật lai lần Quy trình thực Thuốc nhuộm huỳnh quang Tên thuốc Bước sóng Kích thích Phát xạ (nm) (nm) AMCA 351 450 Xanh dương FITC* 492 528 Xanh FluoXE** 488 520 Xanh TRITC*** 557 576 Đỏ Texas Red 578 600 Đỏ Cy3 550 570 Cam/Đỏ Cy5 651 674 Hồng ngoại nhuộm Màu Quy trình thực Chuẩn bị mẫu xử lý sơ Mục đích: đưa sớ lượng lớn các đầu dò thấm được vào tế bào, giữ lại tối đa số lượng các trình tự đích RNA, đồng thời bảo quản toàn vẹn cấu trúc tế bào và hình thái của chúng Hình thức: ngâm mẫu dung dịch xử lý enzym Ứng dụng FISH Sự đa dạng vi sinh vật Một ví dụ điển hình sử dụng FISH để phát trội chủng Bacillus đất đồng cỏ Hà Lan Đây loại vi khuẩn hình que, có chứa ribotype DA001 16S rRNA Ứng dụng FISH Sự đa dạng vi sinh vật Quá trình lai thực dung dịch bao gồm:  Dung dịch đệm (630 mM NaCl, 10mM Tris-HCl, 0,01% natri dodecyl sulfate; pH 7.2)  Formamide 20%  Đầu dò oligonucleotide REX72 (5’TGGGAGCAAG CTCCCAAAG-3’)  Đầu dò LGC353b (5’-GCGGAAGATT CCCTACTGC-3’) Ứng dụng FISH Sự đa dạng vi sinh vật Cuối cùng, mẫu nhuộm với dung dịch chứa 1mg 4,6-diamidino-2phenylindole (DAPI) Ứng dụng FISH Sự đa dạng vi sinh vật DAPI nhận biết tất vi sinh vật với tín hiệu màu xanh Các đầu dò LGC252b nhuộm với Cy3 để phát tế bào vi khuẩn Bacillus bào tử với tín hiệu màu đỏ Đầu dị REX72 gắn nhãn huỳnh quang với ribotype DA001 Bacillus Ứng dụng FISH Sự đa dạng vi sinh vật Dị tìm vi khuẩn bacillus mang gen DA001 sử dụng ba chất nhuộm khác mẫu đất Ứng dụng FISH Hệ vi sinh vật nước thải FISH sử dụng các đầu dò oligonucleotideđược tạo kỹ thuật phân tử PCR để nghiên cứu các quần thể vi khuẩn nước thải, bùn hoạt tính Ứng dụng FISH Vi sinh vật cộng sinh Khi sử kỹ thuật FISH với trình tự rRNA 16S, vi khuẩn cộng sinh có thể được phát hiện, từ tiến hành định danh và phân cấp phát sinh loài Ứng dụng FISH Ứng dụng vào y học Nghiên cứu quần thể vi khuẩn phức tạp thể người động vật Khoang miệng Dạ dày Phổi Ứng dụng FISH Ứng dụng vào y học Nghiên cứu phát bệnh có nguồn gốc từ nấm Candida bệnh nhân suy giảm miễn dịch Ứng dụng FISH Ứng dụng vào y học Xác định xác loài vi khuẩn gây bệnh động vật thực vật để từ kiểm sốt triệt tiêu mầm bệnh Khoai tây mục héo hóa nâu vi khuẩn Ralstonia solanacearum Penaeus vannamei gây bệnh lồi tơm trắng Triển vọng FISH Trên giới - Thực hồn tồn tự động, nhanh chóng chẩn đốn xác vi sinh vật - Kết hợp FISH với đánh dấu miễn dịch, giúp hiểu rõ chế gây bệnh vi khuẩn Triển vọng FISH Trên giới - Kỹ thuật FISH với độ nhạy cao, sử dụng mRNA, trình tự khơng ổn định có số lượng thấp - Sử dụng đầu dò acid nucleic peptide trung hòa điện thay cho oligonucleotide Triển vọng FISH Tại Việt Nam • • • • FISH hạn chế, chủ yếu ứng dụng chẩn đoán bệnh di truyền: Việc chẩn đoán trước sinh sau sinh bất thường cấu trúc số lượng nhiễm sắc thể thai nhi Phát đoạn nhỏ số hội chứng di truyền Xác định đoạn nhiễm sắc thể chưa rõ nguồn gốc Phát bất thường nhiễm sắc thể đặc hiệu ung thư Triển vọng FISH Tại Việt Nam Việc phát triển kỹ thuật FISH Việt Nam tương lai có nhiều triển vọng đầu tư cho kỹ thuật phù hợp với điều kiện kinh tế khoa học kỹ thuật nước ta Cám ơn lắng nghe quý thầy cô tất bạn! ... Ứng dụng FISH Sự đa dạng vi sinh vật Cuối cùng, mẫu nhuộm với dung dịch chứa 1mg 4,6-diamidino-2phenylindole (DAPI) 3 Ứng dụng FISH Sự đa dạng vi sinh vật DAPI nhận biết tất vi sinh vật với tín... FISH Vi sinh vật cộng sinh Khi sử kỹ thuật FISH với trình tự rRNA 16S, vi khuẩn cộng sinh có thể được phát hiện, từ tiến hành định danh và phân cấp phát sinh loài 3 Ứng dụng FISH Ứng... ung thư 4 Triển vọng FISH Tại Vi? ??t Nam Vi? ??c phát triển kỹ thuật FISH Vi? ??t Nam tương lai có nhiều triển vọng đầu tư cho kỹ thuật phù hợp với điều kiện kinh tế khoa học kỹ thuật nước ta Cám ơn