Mục tiêu: Xác định tính hiệu quả của kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ FISH trong chẩn đoán trước sinh các trường hợp lệch bội nhiễm sắc thể thường gặp Phương pháp: Đối tượng: 1302 sản p
Trang 1ỨNG DỤNG KỸ THUẬT LAI HUỲNH QUANG TẠI CHỖ
TÓM TẮT
Đặt vấn đề: Phần lớn các dị bội nhiễm sắc thể được chẩn đoán trước sinh liên quan đến các nhiễm sắc thể 13, 18, 21, X và Y Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) giúp xác định nhanh các bất thường về số lượng của nhiễm sắc thể trên nhân tế bào ở gian kỳ
Mục tiêu: Xác định tính hiệu quả của kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ
(FISH) trong chẩn đoán trước sinh các trường hợp lệch bội nhiễm sắc thể thường gặp
Phương pháp: Đối tượng: 1302 sản phụ có chỉ định chọc ối khảo sát tình
trạng lệch bội nhiễm sắc thể (13, 18, 21, X, Y) bằng kỹ thuật FISH Thời gian: 01/2004 – 09/2006 Thực hiện kỹ thuật FISH theo qui trình chuẩn của hãng VYSIS
Kết quả: Trong thời gian từ 01 / 2004 đến 09 /2006 chúng tôi đã thực hiện
kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ trên 1302 trường hợp thai kỳ có nguy cơ dị bội nhiễm sắc thể 136 (10,45%) trường hợp dị bội nhiễm sắc thể được phát hiện 66 trường hợp tam nhiễm sắc thể 18, 60 trường hợp tam nhiễm sắc thể 21, 3 trường hợp tam nhiễm sắc thể 13, 3 trường hợp XO, 2 trường hợp XXY, 1 trường hợp
Trang 2XXX và 1 trường hợp tam bội đã được phát hiện thông qua kỹ thuật FISH Không
có trường hợp âm tính giả hay dương tính giả nào được ghi nhận
Kết luận: Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ trên nhân tế bào ối ở gian kỳ là
một phương pháp chẩn đoán nhanh và chính xác cho những thai kỳ có nguy cơ cao
dị bội nhiễm sắc thể
ABSTRACT
Introduction: Most of aneuploidies diagnosed prenatally involve the
autosomes 13, 18, 21 and sex chromosomes X and Y Fluorescence in situ hybridization (FISH) technique allows rapid analysis of chromosome copy number
in interphase cells
Objective: Identify the effectiveness of applying the FISH tecnique in
prenatally diagnosing the common aneuploidies
Method: Subjects: 1302 pregnant women were indicated to have an
amniocentesis to detect aneuploidies of chromosome 13, 18, 21, X, Y by using FISH technique Time of research: from January 2004 to September 2006 Applying FISH technique following the Vysis’s standard protocol
Results: From January 2004 to September 2006, we applied FISH technique
on 1302 pregnancies having a risk of chromosome aneuploidy Aneuploidies were detected in 136 (10,45%) samples 66 cases of trisomy 18, 60 cases of trisomy 21, 03 cases of trisomy 13, 03 cases of monosomy X, 02 cases of XXY, a case of XXX and
Trang 3a case of triploidy were diagnosed by FISH There were no false negative or false positive results
Conclusion: We conclude that FISH analysis of interphase, uncultured
amniotic cells is an fast and accurate method for routine prenatal diagnosis of the most common aneuploidies in high-risk pregnancies
ĐẶT VẤN ĐỀ
Bất thường nhiễm sắc thể được chẩn đoán trước sinh phần lớn là những dạng lệch bội của các nhiễm sắc thể thường (13, 18, 21) và của nhiễm sắc thể giới (X, Y)
Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH: Fluorescence in situ hybridization) với việc sử dụng những đoạn dò đặc hiệu cho từng nhiễm sắc thể đã được chứng minh là có hiệu quả cao cho việc xác định nhanh số lượng của các nhiễm sắc thể trong nhân tế bào ở giai đoạn gian kỳ[2,3,5,9,10] Với đặc tính nhanh, nhạy và chính xác, việc sử dụng kỹ thuật FISH trong chẩn đoán trước sinh các lệch bội nhiễm sắc thể thường gặp đã trở nên phổ biến[4,8,12] Ngoài ra kỹ thuật FISH còn được xem như là một lựa chọn giúp giảm sự lo âu cho các sản phụ có thai kỳ nguy cơ cao[7]
Tại thành phố Hồ Chí Minh, kỹ thuật FISH bước đầu đã được ứng dụng trên 33 mẫu dịch ối vào năm 2003[1] Tuy nhiên với một cỡ mẫu nhỏ nên chưa thể khẳng định được giá trị của kỹ thuật FISH trong chẩn đoán trước sinh các lệch bội nhiễm sắc thể thường gặp
Trang 4Vì vậy, chúng tôi thực hiện nghiên cứu này với mục tiêu “Xác định tính
hiệu quả của kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) trong chẩn đoán trước sinh các trường hợp lệch bội nhiễm sắc thể thường gặp”
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
1302 sản phụ có chỉ định chọc ối để khảo sát tình trạng lệch bội nhiễm sắc thể (13, 18, 21, X, Y) bằng kỹ thuật FISH tại phòng Di truyền tế bào bệnh viện Phụ sản Từ dũ và phòng khám thai bệnh viện Hùng vương trong thời gian từ 01 /
2004 đến 09/ 2006
Phương pháp nghiên cứu
Tất cả các sản phụ đều được tham vấn về việc chọn lựa kỹ thuật nhanh FISH hay kỹ thuật nuôi cấy tế bào ối, và được giải thích cặn kẽ về những giới hạn của kỹ thuật FISH
Thực hiện nuôi cấy tế bào ối đi kèm với kỹ thuật FISH trong các trường hợp: kiểm định kết quả FISH, tiền căn gia đình có người mang chuyển đoạn nhiễm sắc thể liên quan đến các nhiễm sắc thể 13, 18, 21, theo yêu cầu của sản phụ
Thu thập vào bảng câu hỏi các thông tin về họ tên, tuổi của sản phụ, kết quả siêu âm sản khoa (ghi nhận loại bất thường siêu âm: nhỏ, lớn hay cả hai)[11], kết quả xét nghiệm sàng lọc sinh hóa (MAFP, bhCG, uE3), kết quả phân tích của kỹ thuật FISH, kết quả phân tích nhiễm sắc thể (nếu có)
Trang 5Thu thập 6 – 8 ml dịch ối cho các trường hợp thực hiện kỹ thuật FISH, tối thiểu là 10 ml cho trường hợp thực hiện cả hai kỹ thuật FISH và nuôi cấy tế bào
ối Làm phồng tế bào ối bằng dung dịch KCl 0.075M, định hình tế bào bằng hỗn hợp dung dịch methanol : acid acetic (3:1) Nhỏ cặn tế bào lên phiến kính sạch Khử nước bằng ethanol 70% - 90% - 100%
Sử dụng các đoạn dò DNA đặc hiệu cho các nhiễm sắc thể 13, 18, 21, X, Y của hãng VYSIS (Mỹ) Thực hiện xử lý trước khi lai, tiến hành lai và rửa sau lai theo qui trình hướng dẫn của VYSIS
Thực hiện đếm tối thiểu trên 50 nhân tế bào đối với từng loại đoạn dò DNA Đánh giá kết quả lai là bình thường khi có # 80% nhân tế bào có 2 tín hiệu lai đối với từng loại đoạn dò DNA Đánh giá kết quả là bất thường khi có # 70% nhân tế bào có
số tín hiệu lai bất thường đối với từng loại đoạn dò DNA
Kết quả FISH được bao gồm các thông tin: mô tả loại đoạn dò được sử dụng, số tín hiệu của từng loại nhiễm sắc thể được kiểm tra, tình trạng lệch bội của các nhiễm sắc thể 13, 18, 21, X, Y (nếu có)
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
136 / 1302 (10,45%) trường hợp dị bội nhiễm sắc thể được phát hiện thông qua kỹ thuật FISH Trong đó, 66 trường hợp tam nhiễm sắc thể 18, 60 trường hợp tam nhiễm sắc thể 21, 3 trường hợp tam nhiễm sắc thể 13, 3 trường hợp XO, 2 trường hợp XXY, 1 trường hợp XXX và 1 trường hợp tam bội
Trang 6Bảng 1 Kết quả FISH
trường hợp
Tỉ lệ (%)
Bình
thường
Bất
thường
Tam
nhiễm sắc thể
18
Tam
nhiễm sắc thể
21
Tam
nhiễm sắc thể
13
XO
XXY
136
66
60
03
03
02
01
01
10,45
Trang 7XXX
Tam bội
Có 1 trường hợp cần thực hiện kỹ thuật FISH lần thứ hai vì tín hiệu lai huỳnh quang yếu không thể phân tích được
Có 2 trường hợp nghi ngờ tam nhiễm sắc thể 21 khi ghi nhận có 8 - 10 nhân tế bào trong tổng số 50 nhân tế bào được phân tích có 3 tín hiệu huỳnh quang Cả 2 trường hợp này được thực hiện kỹ thuật lai huỳnh quang lần thứ hai và ghi nhận chỉ
có 2 – 3 nhân tế bào có 3 tín hiệu huỳnh quang Ghi nhận sau sinh, cả hai cháu bé đều bình thường
Có 3 trường hợp nghi ngờ tam nhiễm sắc thể 18 thuộc loại bất thường cấu trúc nhiễm sắc thể (isochromosome: nhiễm sắc thể đều) khi ghi nhận 45 – 48 nhân
tế bào có 1 tín hiệu lớn và 1 tín hiệu nhỏ của nhiễm sắc thể 18, 2 – 5 nhân tế bào
có 3 tín hiệu của nhiễm sắc thể 18 Cả 3 trường hợp được yêu cầu làm thêm kỹ thuật nuôi cấy tế bào ối để phân tích bộ nhiễm sắc thể thai nhi đồng thời thực hiện
kỹ thuật FISH lần hai trên mẫu dịch ối đã thu thập lần đầu Kết quả cả 3 bộ nhiễm sắc thể đều bình thường về số lượng và cấu trúc của nhiễm sắc thể 18, không ghi nhận nhân tế bào có 3 tín hiệu nhiễm sắc thể 18
Trang 8219 trường hợp được thực hiện nuôi cấy tế bào ối đi kèm với thực hiện kỹ thuật FISH Các bất thường lệch bội nhiễm sắc thể 13, 18, 21, X, Y đều tương đồng giữa hai kỹ thuật Có 2 trường hợp bất thường cấu trúc nhiễm sắc thể không được phát hiện bởi kỹ thuật FISH là chuyển đoạn tương hỗ nhiễm sắc thể t(13;14)
và t(14;21)
Bảng 2 Kết quả nuôi cấy tế bào ối
trường hợp
47,XX/XY,+18 30
47,XX/XY,+21 17
46,XY/47,XXY 01
Trang 969,XXX 01
45,XX,t(13;14) 01
45,XY,t(14;21) 01
Chỉ định chính để chọc ối làm kỹ thuật FISH là có hình ảnh bất thường trên siêu âm (41,32%) và kết quả xét nghiệm sàng lọc sinh hóa máu mẹ bất thường (35,87%) Phần lớn số trường hợp lệch bội 5 nhiễm sắc thể (13, 18, 21, X, Y) cũng được phát hiện qua hai chỉ định này Có một trường hợp XO được phát hiện tình
cờ thông qua chỉ định chọc ối là tiền căn sẩy thai liên tiếp
Bảng 3 Chỉ định chọc ối và khả năng phát hiện lệch bội của kỹ thuật FISH
Chỉ
định chọc
ối
Số trường
hợp
Tỉ lệ (%)
Số trường hợp lệch bội
Bất
thường siêu
âm
Trang 10Chỉ
định chọc
ối
Số trường
hợp
Tỉ lệ (%)
Số trường hợp lệch bội
Bất
thường xét
nghiệm
sinh hóa
Mẹ
lớn tuổi
Bất
thường siêu
âm + sinh
hóa
Tiền
căn sinh
con Down
Tiền
căn sinh
Trang 11Chỉ
định chọc
ối
Số trường
hợp
Tỉ lệ (%)
Số trường hợp lệch bội
con dị tật
bẩm sinh
Tiền
căn gia
đình có
chuyển
đoạn NST
Tiển
căn gia
đình có hội
chứng
Down
Sẩy
thai liên
tiếp
Trang 12Chỉ
định chọc
ối
Số trường
hợp
Tỉ lệ (%)
Số trường hợp lệch bội
Tỉ lệ phát hiện lệch bội nhiễm sắc thể 13, 18, 21, X, Y khi có cả hai loại bất thường siêu âm là 40,9% (27/66), khi chỉ có loại bất thường lớn là 15,8% (68/431) và khi chỉ có loại bất thường nhỏ là 11,4% (20/176) Có 1 trường hợp bất thường cấu trúc nhiễm sắc thể (chuyển đoạn nhiễm sắc thể t(13;14)) được phát hiện bằng kỹ thuật nuôi cấy tế bào ối với hình ảnh siêu âm là sứt môi – chẻ vòm hầu
Bảng 4 Kết quả siêu âm và kết quả FISH ± kết quả cấy ối
Loại bất thường siêu âm Kết
quả FISH
± cấy ối
hai
Tổng
Lệch
bội (13, 18,
21, X, Y)
Trang 13thường cấu
trúc NST
Bình
thường
Với kết quả xét nghiệm sàng lọc cho thấy cả nguy cơ tam nhiễm sắc thể 18
và 21 thì không có trường hợp lệch bội nào được ghi nhận
Bảng 5 Kết quả xét nghiệm sàng lọc sinh hóa và khả năng phát hiện lệch
bội của kỹ thuật FISH
Kết quả sinh hóa bất
thường
Số trường hợp
Tỉ lệ (%)
Số trường hợp lệch bội
26
16
Trang 14AFP giảm 35 5,76 T18:
03/ T21:
01
01 /T21:
01
AFP+bhCG/bhCG
/bhCG+uE3 giảm
03
AFP+bhCG/bhCG/AFP+uE3
tăng
01
BÀN LUẬN
Trong chẩn đoán trước sinh, việc đưa ra kết luận một thai nhi bình thường về
số lượng hay cấu trúc của bộ nhiễm sắc thể đòi hỏi phải có tính chính xác cao vì kết luận đó sẽ đưa đến hành động can thiệp chấm dứt thai kỳ hoặc sẽ không cần can thiệp
gì thêm
Kỹ thuật nuôi cấy tế bào ối để phân tích bộ nhiễm sắc thể thai nhi đã được xem là một kỹ thuật chẩn đoán mang tính chính xác cao và đã được ứng dụng trong chẩn đoán trước sinh suốt một thời gian dài Tuy nhiên việc phân tích bộ nhiễm sắc
Trang 15thể đòi hỏi phải thực hiện trên các nhiễm sắc thể ở kỳ giữa được thu hoạch sau một thời gian dài nuôi cấy Trong phần lớn trường hợp, việc chờ đợi kết quả gây nên tâm
lý lo âu, căng thẳng cho sản phụ, và càng tăng thêm khi sản phụ được báo tin “mẫu
cấy này không đạt, cần thực hiện chọc ối lần hai”
Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) thực hiện trên nhân tế bào ở gian kỳ nên có thể giúp chẩn đoán nhanh vì không phải tốn thời gian nuôi cấy tế bào Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã thực hiện việc so sánh giữa hai kỹ thuật nuôi cấy tế bào
và kỹ thuật FISH đã chứng minh khả năng sử dụng kỹ thuật FISH như một công cụ chẩn đoán độc lập trong chẩn đoán trước sinh các trường hợp lệch bội của nhiễm sắc thể 13, 18, 21, X, Y[2,5,9] Những nghiên cứu này cũng đã đưa ra những giới hạn của kỹ thuật FISH như tình trạng lẫn máu mẹ, lượng tế bào ối thu thập không đủ để phân tích, tính đặc hiệu của đoạn dò DNA
Trong nghiên cứu của chúng tôi, tỉ lệ phát hiện lệch bội nhiễm sắc thể 13, 18,
21, X, Y là khá cao (10,45%) với hầu hết các dạng lệch bội thường gặp Kết quả này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Baruch Feldman khi thực hiện kỹ thuật FISH có chọn lọc trên những thai kỳ có nguy cơ cao đối với các lệch bội nhiễm sắc thể 13, 18, 21, X, Y[9] Như vậy đối với những thai kỳ có nguy cơ cao đối với các lệch bội nhiễm sắc thể 13, 18, 21, X, Y thì kỹ thuật FISH có thể xem như là lựa chọn hàng đầu
Để đạt được hiệu quả phát hiện lệch bội cao, chúng tôi đã thực hiện một số hiệu chỉnh thích hợp
Trang 16Chúng tôi thu thập thể tích dịch ối tối thiểu là 6 - 8 ml vì với lượng thể tích này lượng tế bào ối thu thập được nhiều hơn và đặc biệt có giá trị đối với các trường hợp tuổi thai # 20 tuần hoặc các trường hợp đa ối Các nghiên cứu của các tác giả khác và nghiên cứu của chúng tôi năm 2003[1] cũng đã cho thấy khi chỉ thu thập 2 –
3 ml dịch ối thì chắc chắn sẽ có một số trường hợp không thực hiện kỹ thuật FISH được vì không đủ tế bào để phân tích
Các nghiên cứu xác định tính đặc hiệu của đoạn dò DNA được sử dụng đều cho thấy phần lớn những trường hợp lai không đặc hiệu, độ sáng của tín hiệu không ổn định đều liên quan đến những đoạn dò DNA tự tổng hợp hoặc những đoạn dò DNA không được kiểm định chất lượng Đối với các đoạn dò DNA của VYSIS dùng cho việc phát hiện bất thường số lượng nhiễm sắc thể 13, 18, 21, X, Y chỉ ghi nhận âm tính giả nhiễm sắc thể 13, 21 do mẫu lẫn máu mẹ nhiều và tín hiệu lai không rõ[6,13]; ghi nhận dương tính giả nhiễm sắc thể 21 chưa giải thích được nguyên nhân[13]; ghi nhận âm tính giả nhiễm sắc thể 18[6,13] do lẫn máu mẹ nhiều, do sự không đồng bộ về kích thước của hai tín hiệu nhiễm sắc thể 18; ghi nhận dương tính giả nhiễm sắc thể 18 do lai chéo với nhiễm sắc thể 22[13] Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng bộ đoạn dò DNA của hãng VYSIS với một số điều chỉnh nhỏ để hạn chế những sai lầm mà các nghiên cứu trên đã đưa ra Chúng tôi thực hiện phương pháp ly tâm nhiều lần đối với mẫu lẫn máu
mẹ nhiều để giảm lượng máu mẹ trong mẫu dịch ối trước khi tiến hành các bước tiếp theo, nhờ vậy trong mẫu nghiên cứu này không có trường hợp thất bại kỹ thuật FISH
do lẫn máu mẹ Chúng tôi thực hiện xử lý pepsin các nhân tế bào ối với thời gian thích
Trang 17hợp cho từng nhóm tuổi thai, đảm bảo đủ thể tích đoạn dò DNA cần thiết và đảm bảo điều kiện lai tối ưu nhằm mục đích giảm trường hợp tín hiệu lai yếu Trong mẫu nghiên cứu này có 1 trường hợp tín hiệu lai yếu do người gởi mẫu xét nghiệm không nhớ chính xác tuổi thai của sản phụ Sau khi đã có thông tin chính xác về tuổi thai, chúng tôi thực hiện lại kỹ thuật FISH trên mẫu dịch ối đã thu thập lần trước với việc điều chỉnh thời gian xử lý pepsin Kết quả đạt được tín hiệu lai rõ ràng
Có 2 trường hợp nghi ngờ tam nhiễm sắc thể 21 được loại trừ sau khi thực hiện lại kỹ thuật FISH lần thứ hai Có 3 trường hợp nghi ngờ tam nhiễm sắc thể 18 do sự không đồng bộ về kích thước của tín hiệu lai và có một tỉ lệ nhỏ nhân tế bào có ba tín hiệu lai đều được loại trừ sau khi thực hiện kỹ thuật FISH lần hai và kỹ thuật nuôi cấy
tế bào ối Như vậy đối với các trường hợp nghi ngờ tam nhiễm sắc thể chúng ta nên thực hiện kỹ thuật FISH lần thứ hai, nếu tỉ lệ nhân tế bào có 3 tín hiệu giảm nhiều so với lần đầu thì có thể kết luận bình thường Đối với trường hợp không đồng bộ về kích thước tín hiệu nhiễm sắc thể 18, nếu tất cả nhân tế bào được phân tích đều có hai tín hiệu không đồng bộ về kích thước thì có thể xem như bình thường, nếu có một tỉ lệ nhỏ nhân tế bào có ba tín hiệu lai thì nên kiểm định lại bằng kỹ thuật FISH lần hai
Trong 219 trường hợp được thực hiện kỹ thuật nuôi cấy tế bào ối đi kèm với kỹ thuật FISH, chúng tôi chưa ghi nhận có sự bất tương hợp giữa hai kỹ thuật FISH và nuôi cấy tế bào ối Điều này chứng tỏ với những điều chỉnh thích hợp thì
kỹ thuật FISH thật sự hiệu quả trong việc phát hiện các lệch bội nhiễm sắc thể 13,
18, 21, X, Y Có 2 trường hợp bất thường cấu trúc được phát hiện qua nuôi cấy tế
