Tối ưu quy trình xác định đột biến ATP7B trên bệnh nhân nhân wilson

1 ĐẶT VẤN ĐỀ Đồng nguyên tố vi lượng thiết yếu cho thể sinh vật, tham gia vào cấu tạo nhiều enzym quan trọng, nhiên, nồng độ đồng caogây độc cho tế bào Bệnh Wilson số bệnh lý gây nhiễm độc đồng, lần mô tả năm 1912 nhà thần kinh học người Anh, Samuel Alexander Kinnier Wilson Bệnh Wilson hay gọi bệnh thối hoá gan- nhân đậu bệnh thoái hoá gan não, bệnh gây rối loạn chuyển hoá đồng, đặc trưng tích luỹ đồng gan, não số mô khác [2, 3] Trong bệnh Wilson, đồng khơng chuyển hố thành ceruloplasmin để vận chuyển vào máu mà tích luỹ gan gây tổn thương tế bào Khi tế bào gan chức năng, đồng vào máu dạng tự kết tủa nhiều mô đặc biệt thận, mắt não Mặc dù bệnh gặp song ảnh hưởng đến nhiều mô quan, người bệnh dễ dẫn đến tử vong khơng chẩn đốn điều trị kịp thời Các nghiên cứu bệnh Wilson có nhiều thành cơng đó, nghiên cứu có giá trị cơng bố năm 1993, Cox,D.W Bull,P.C cộng mối liên quan bệnh Wilson đột biến gen ATP7B quy định cấu trúc protein vận chuyển đồng Theo đó, bệnh Wilson chịu chi phối quy luật di truyền lặn nhiễm sắc thể thường Bố mẹ mang kiểu gen dị hợp tử sinh bị bệnh Wilson Vì vậy, việc nghiên cứu sinh học phân tử phát đột biến bệnh nhân người nhà bệnh nhânkhơng có vai trò chẩn đốn bệnh mà có ý nghĩa tư vấn di truyền Mặt khác,đột biến gen ATP7B ảnh hưởng đến vùng chức khác protein, làm hoàn toàn phần chức vận chuyển đồng protein, theo thời gian lắng đọng đồng mô ngày nhiều, mức độ tổn thương tế bào nghiêm trọng Sử dụng thuốc điều trị nhằm giảm lượng đồng tích luỹ phải phù hợp với thể bệnh, mức độ bệnh, tuổi phát bệnh… biểu kiểu hình có mối liên hệ với đột biến gen Dó đó, nghiên cứu “Tối ưu hốquy trình xác định đột biến gen ATP7B bệnh nhân Wilson”được thực nhằm mục tiêu: Áp dụng quy trình xác định đột biến gen ATP7B gây bệnh Wilson phương pháp giải trình tự gen Bước đầu xác định đột biến gen ATP7B gây bệnh Wilson Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bệnh Wilson 1.1.1 Lịch sử phát bệnh Từ cuối kỉ XIX, bệnh lý với biểu xơ gan kết hợp thần kinh biết đến, song không mơ tả hồn thiện triệu chứng ngun nhân gây bệnh Cho đến năm 1912, nhà thần kinh học người Anh, Samuel Alexander Kinnier Wilson (1878-1937), công bố báo cáo 12 trường hợp “rối loạn thần kinh gặp” bao gồm bệnh nhân đề cập đến y văn trước bệnh nhân ông theo dõi[4] Theo ông, “một tác nhân gây bệnh” dẫn đến biểu lâm sàng kim loại Ơng chứng minh hàm lượng đồng tăng não gan bệnh nhân này[5] Sau đó, bệnh biết đến với tên gọi bệnh Wilson 1948, báo cáo Cuming có xuất lượng kim loại dư thừa gan não bệnh nhân Wilson tử vong[6] Năm 1985, bất thường gen gây bệnh Wilson nhận định nằm nhánh dài nhiễm sắc thể số 13[7] Năm 1993, Peter Bull cộng xác định vị trí phân lập đoạn gen Protein mà gen mã hố protein thuộc nhóm ATPase loại P vận chuyển qua màng tế bào có ảnh hưởng đến bệnh Wilson, nhiên vị trí xác chức tế bào gan chưa làm rõ [8, 9] Từ đó, hàng trăm cơng trình nghiên cứu xác định đột biến, biến đổi cấu trúc, chức protein, phân tích mối tương quan kiểu gen kiểu hình thực hiện, dần làm sáng tỏ chế gây bệnh đột biến[10, 11, 12, 13] 1.1.2 Dịch tễ học Wilson bệnh di truyền gặp dân tộc giới với tỉ lệ mắc bệnh xấp xỉ 1/30000 trẻ sơ sinh[14], tần số alen 0,56%; tần số người mang alen đột biến 1/90 Tỉ lệ không đồng vùng dân cư: cộng đồng người Mỹ da trắng 1/55000[15];trong đó, cộng đồng người Hàn Quốc 1/37000 [16] Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu sàng lọc bệnh Wilson thực tế khu vực khác giới lại cho thấy số lớn nhiều: cộng đồng Đơng Á có tỉ lệ ~1/1500[17]đến ~1/3000[18]; cộng đồng Ireland, tần số gen 0,41% cho thấy 122 người có người mang gen đột biến[19]; Anh, tỉ lệ ~1/7000; đặc biệt tỉ lệ mắc bệnh cao làng nhỏ đảo Crete với tỉ lệ mắc 1/15 trẻ sơ sinh tần số người mang đột biến 1/11[20] Wilson bệnh bẩm sinh triệu chứng không xuất từ lúc sinh ra, thường xuất độ tuổi từ đến 35, có nghiên cứu cho thấy tuổi khởi phát từ đến 70 tuổi[2], tuổi trung bình phát bệnh 15,9[21] Đa số bệnh nhân có biểu thần kinh nhỏ (dưới 12 tuổi) chủ yếu số khơng có triệu chứng gan xuất sau năm theo dõi[1] Bệnh Wilson đột biến gen lặn nằm nhiễm sắc thể thường,nên mặt lý thuyết tỉ lệ mắc bệnh hai giới Một số báo cáo phân tích thấy tỉ lệ mắc bệnh nam giới cao nữ giới phần nhỏ (52%)[22] Tại thời điểm chẩn đốn, nam giới có triệu chứng thần kinh cao nữ giới (75% 58%), có tỉ lệ mắc bệnh gan thấp (25% 41%) Một số nghiên cứu khác thấy nữ giới có khả phát triển suy gan cấp tính bệnh Wilson cao nam giới[23, 24] Nghiên cứu khác hai giới thể gan thể thần kinh bệnh Wilson 627 bệnh nhân cho thấy, thể thần kinh chiếm ưu hai giới Bệnh gan xảy thường xuyên nữ thường phát triển triệu chứng thần kinh muộn gần hai năm so với nam giới Các nhà khoa học cho khác biệt tác dụng bảo vệ estrogen chuyển hoá sắt khác nhau[22] 1.1.3 Triệu chứng, chẩn đoán điều trị 1.1.3.1 Triệu chứng lâm sàng Do tích luỹ đồng dẫn đến tổn thương nhiều mô khác nên biểu lâm sàng hầu hết bệnh nhân Wilson khơng giống Tuy nhiên, ln có biểu gan thần kinh bị tổn thương[25, 26, 27] Thể gan: gan to khơng triệu chứng (có khơng có lách to), viêm gan cấp mạn, suy gan cấp (có thể kèm theo thiếu máu tan máu) Tăng huyết áp tĩnh mạch, xơ gan không rõ nguyên nhân, phù, giãn mạch, cổ trường rối loạn chức gan khác (chậm dậy thì, vơ kinh, rối loạn đơng máu ) biểu bệnh Wilson[28] Ung thư biểu mô tế bào gan gặp bệnh nhân Wilson[29] Rối loạn thần kinh âm thầm đột ngột với triệu chứng run, rối loạn vận ngôn, co cứng, biểu bệnh Parkinson, hạn chế phối hợp vận động, múa vờn, suy giảm trí tuệ rối loạn hành vi[28] Giai đoạn toàn phát, bật tăng trương lực lan toả kiểu ngoại tháp mặt, cổ, gáy thắt lưng Cổ điển mô tả mặt “Wilson” với đặc điểm bất động mặt, miệng, hầu Có thể xảy động kinh, đột quỵ Triệu chứng tâm thần phổ biến từ thay đổi hành vi đến trầm cảm rối loạn tâm thần[30, 31] Vòng Kayser-Fleischer phát sinh lắng đọng đồng màng Descemet xuất bệnh nhân với triệu chứng thể gan, hầu hết suy gan tối cấp, thường không gặp trường hợp viêm gan mạn[32], ln ln xuất bệnh nhân có biểu thần kinh[28] Hình 0.1: Vòng Kayser-Fleischer[33] Các dấu hiệu triệu chứng khác phản ánh tổn thương tế bào lắng đọng đồng mô khác bao gồm thiếu máu tan máu, bệnh tim, rối loạn nội tiết[3, 34] Ở trẻ em, thể gan thường phổ biến nhất, với độ tuổi trung bình 10 -13, khởi phát sớm khoảng 10 năm so với thể thần kinh[32] Khoảng 45% bệnh nhân thể gan, 35% có dấu hiệu thần kinh, 20% có rối loạn tâm thần triệu chứng khác[25] 1.1.3.2 Chẩn đoán Chẩn đoán Wilson dựa tiêu chí lâm sàng cận lâm sàng Triệu chứng lâm sàng thường gặp: viêm gan cấp mạn không rõ nguyên nhân, biểu thần kinh, xuất vòng Kayser-Fleischer, tan máu cấp tính, rối loạn tâm thần, thay đổi hành vi, hội chứng Fanconi bệnh xương (lỗng xương, gãy xương khơng rõ ngun nhân) hay hiểu cơ, khớp[28] Các số hoá sinh bổ sung cho chẩn đoán xác định bệnh Wilson: nồng độ ceruloplasmin 100mg/ngày[35]; nồng độ đồng gan 250mg 100g trọng lượng khô [35] Tuy nhiên, số bệnh nhân Wilson có lượng đồng nồng độ ceruloplasmin huyết cao mức tham chiếu[36] Phân tích đột biến việc giải trình tự tồn gen giúp chẩn đốn trường hợp khó khăn lâm sàng xét nghiệm hoá sinh, sàng lọc người nhà cấp bệnh nhân[36] 1.1.3.3 Điều trị Wilson bệnh gan đáp ứng tốt với việc điều trị thuốc Các loại thuốc sử dụng chủ yếu theo chế tạo phức với đồng để loại bỏ đồng tích luỹ mơ,giảm hấp thu đồng, kèm với chế độ ăn nghèo đồng Các thuốc sử dụng công nhận hiệu điều trị: D-penicillamine, Trientine, kẽm 1.1.4 Cơ chế bệnh sinh Bệnh Wilson hay gọi bệnh thối hố gan- nhân đậu bệnh thoái hoá gan não, bệnh gây rối loạn chuyển hoá đồng, đặc trưng tích luỹ đồng gan, não số mơ khác [2, 3] Trong tế bào gan bình thường, hấp thụ đồng thông qua protein Ctr1 (constitutive triple response – 1)[37], sau lượng đồng liên kết với metallothioneins[11]giúp bảo vệ tế bào khỏi độc tính đồng; phân tử lại liên kết với protein HAH1 vận chuyển vào máy Golgi thông qua tương tác protein – protein với ATP7B [11, 33, 38] Hình 0.2: Chuyển hố đồng tế bào gan[39] Trong Golgi, đồng kết hợp với apo-ceruloplasmin thành ceruloplasmin, chất tiết vào máu dạng vận chuyển chủ yếu đồng huyết tương Khoảng 10% đồng lưu hành huyết tương lại liên kết với albumin gắn với amino acid, hình thức vận chuyển vào mơ khác nhau[33] Lượng đồng dư thừa tế bào gan chuyển tế bào vào mật nhờ đường qua ATP7B[40] ATP7B protein xuyên màng, thực chức vận chuyển đồng sử dụng ATP Chu kì vận chuyển đồng bao gồm nhiều giai đoạn, giai đoạn bị ảnh hưởng đột biến gen Đầu tiên, ATP7B gắn đồng vào vùng N-terminal gắn ATP vào vùng nucleotid-binding Sau đó, ATP bị thuỷ phân ATP7B trở thành dạng phosphoryl hoá Cuối cùng, phản ứng dephosphoryl giải phóng lượng đồng vận chuyển qua màng[10] Hình 0.3: Chu kì vận chuyển đồng nhờ protein ATP7B[10] Bệnh nhân Wilson có mang đột biến gen ATP7B, làm giảm chức protein, dẫn đến việc đồng tế bào không vận chuyển vào mạng lưới Golgi Như vậy, tế bào không tổng hợp ceruloplasmin, tiết vào máu apo-ceruloplasmin nhanh chóng bị phân giải[3] Trong đó, đồng tiếp tục vận chuyển từ huyết tương vào tế bào gan nhờ protein Ctr1, khiến cho hàm lượng đồng tế bào tăng lên, tích luỹ cao hàm lượng protein liên kết với Đồng tích luỹ 10 lysosome, tạo gốc tự có tính oxi hố gây hại cho tế bào Do nồng độ ceruloplasmin huyết tương giảm xuống, đồng dư thừa gan tiết vào máu, không liên kết với apo-ceruloplasmin nên đồng liên kết với albumin acid amin chế chưa rõ ràng[39] Kết quả, đồng không liên kết apo-ceruloplasmin tăng huyết tương tiết vào nước tiểu, lắng đọng đồng mô khác não, thận, giác mạc, khớp, xương[41] Sắt tích luỹ gan bệnh nhân Wilson[42] Ceruloplasmin có hoạt tính xúc tác phản ứng biến đổi Fe2+ thành Fe3+, giảm nồng độ ceruloplasmin bệnh Wilson phá vỡ cân nồng độ sắt thể[33] Tổn thương gan bệnh Wilson phần ngun nhân tích luỹ sắt [42] 1.1.5 Cơ sở phân tử 1.1.5.1 Cơ chế di truyền Bệnh Wilson tuân theo quy luật di truyền lặn, có nghĩa tỉ lệ sinh mắc bệnh bố mẹ dị hợp tử 25% Về mặt di truyền, bệnh nhân Wilson có kiểu gen đồng hợp tử dị hợp tử hai loại đột biến khác Mỗi đột biến ảnh hưởng đến chức protein di truyền từ bố mẹ[2] Người mang alen đột biến (dị hợp tử) có tỉ lệ quần thể 1/90, người mang alen bệnh alen không gây bệnh kiểu gen[15, 19] Hình 0.4: Phả hệ gia đình bệnh nhân Wilson 33 Kodama, H., C Fujisawa, and W Bhadhprasit (2012).Inherited copper transport disorders: biochemical mechanisms, diagnosis, and treatment Curr Drug Metab, 13, 237-50 34 Cartwright, G.E (1978).Diagnosis of treatable Wilson's disease N Engl J Med, 298, 1347-50 35 Martins da Costa, C., et al (1992).Value of urinary copper excretion after penicillamine challenge in the diagnosis of Wilson's disease Hepatology, 15, 609-15 36 Roberts, E.A., M.L Schilsky, and D American Association for Study of Liver (2008).Diagnosis and treatment of Wilson disease: an update Hepatology, 47, 2089-111 37 Kuo, Y.M., et al (2001).The copper transporter CTR1 provides an essential function in mammalian embryonic development Proc Natl Acad Sci U S A, 98, 6836-41 38 Hamza, I., et al (1999).Interaction of the copper chaperone HAH1 with the Wilson disease protein is essential for copper homeostasis Proc Natl Acad Sci U S A, 96, 13363-8 39 Shim, H and Z.L Harris (2003).Genetic defects in copper metabolism J Nutr, 133, 1527S-31S 40 Schaefer, M and J.D Gitlin (1999).Genetic disorders of membrane transport IV Wilson's disease and Menkes disease Am J Physiol, 276, G311-4 41 Kodama H, F.C (year) Copper metabolism and inherited copper transporter disorders: molecular mechanisms, screening, and treatment 42 Hayashi, H., et al (2006).Compound overload of copper and iron in patients with Wilson's disease Med Mol Morphol, 39, 121-6 43 Curtis, D., et al (1999).A study of Wilson disease mutations in Britain Hum Mutat, 14, 304-11 44 Gromadzka, G., et al (2005).Frameshift and nonsense mutations in the gene for ATPase7B are associated with severe impairment of copper metabolism and with an early clinical manifestation of Wilson's disease Clin Genet, 68, 524-32 45 Panagiotakaki, E., et al (2004).Genotype-phenotype correlations for a wide spectrum of mutations in the Wilson disease gene (ATP7B) Am J Med Genet A, 131, 168-73 46 Kusuda, Y., et al (2000).Novel mutations of the ATP7B gene in Japanese patients with Wilson disease J Hum Genet, 45, 86-91 47 Riordan, S.M and R Williams (2001).The Wilson's disease gene and phenotypic diversity J Hepatol, 34, 165-71 48 de Bie, P., et al (2007).Molecular pathogenesis of Wilson and Menkes disease: correlation of mutations with molecular defects and disease phenotypes J Med Genet, 44, 673-88 49 Fatemi, N and B Sarkar (2002).Molecular mechanism of copper transport in Wilson disease Environ Health Perspect, 110 Suppl 5, 695-8 50 Genschel, J., et al (2000).Three novel mutations, c314C>A, C778insC, and c1285+2T>A, in exon of the Wilson disease gene Hum Mutat, 16, 278 51 Gromadzka, G., et al (2006).p.H1069Q mutation in ATP7B and biochemical parameters of copper metabolism and clinical manifestation of Wilson's disease Mov Disord, 21, 245-8 52 Deguti, M.M., et al (2004).Wilson disease: novel mutations in the ATP7B gene and clinical correlation in Brazilian patients Hum Mutat, 23, 398 53 Mak, C.M., et al (2008).Mutational analysis of 65 Wilson disease patients in Hong Kong Chinese: identification of 17 novel mutations and its genetic heterogeneity J Hum Genet, 53, 55-63 54 Bae SH1, K.J., Seo JK (2009).[Haplotype analysis and possible founder effect at the R778L mutation of the ATP7B gene in Korean patients with Wilson's disease] 55 Văn, T.T (2011).Xây dựng quy trình xác định đột biến gen ATP7B gây bệnh Wilson Tạp chí Y học, 26-29 56 Khánh, t.V., Nghiên cứu phát đột biến gen ATP7B gây bệnh Wilson 2014, Trung tâm Nghiên cứu Gen - Protein Trường Đại học Y Hà Nội 57 Văn, T.T (year) PCR số kỹ thuật y sinh học phân tử, Nhà xuất Y học 58 Sanger, F., S Nicklen, and A.R Coulson (1977).DNA sequencing with chain-terminating inhibitors Proc Natl Acad Sci U S A, 74, 54637 59 Sternlieb, I (1978).Diagosis of Wilson's disease Gastroenterol 60 Grunenwald, H (2003).Optimization of polymerase chain reactions Methods Mol Biol, 226, 89-100 61 http://www.wilsondisease.med.ualberta.ca/ 62 Lam, C.W and C.M Mak (2006).Allele dropout in PCR-based diagnosis of Wilson disease: mechanisms and solutions Clin Chem, 52, 517-20 63 Lee, C.C., et al (2000).Molecular analysis of Wilson disease in Taiwan: identification of one novel mutation and evidence of haplotype-mutation association J Hum Genet, 45, 275-9 Phụ lục 1: Exon Mồi Trình tự 1F 5'-CGCAACTTTGAATCATCCGT-3' 1R 5'AACGCGGGGAGGAAAATCCT-3' 2aF 5'-ATGGGCTTCGAGGCCAGCAT-3' 2aR 5'-CCTATACCACCATCCAGGAG-3' 2bF 5'ATGGGCTTCGAGTTCGAGAGCAT-3' 2bR 5'AATTCCCAGGTGGAAGTGCC-3' 2cF 5'AGAAGCTGGGATGTTGTAGAA-3' 2cR 5'-AATGGAGGTGACACAGGACTG-3' 2dF 5'-ATATTGGCCAGCTCCTAGGG-3' 2dR 5’-ATGCTTCGATCATGCTGAGTC-3’ 3F 5'-GCCCTGAAACCTCTTGTTCTG-3' 3R 5'-CTACTGATAAACACAGTTGCT-3' 4F 5'-CTTTGTTCGGTTATATTGACTG-3' 4R 5'-CCGTAACGCACCCACAGTA-3' 5F 5'-AGACTCCCTGGACTGGCTTT-3' 5R 5'-TTCCATGGGAAAAGTTGAAGA-3' 6F 5'-GCTTTCTGCCAATGCATATTTT-3' 6R 5'-AGAGTTGGCCCCACCTAGAC-3' 7F 5'-AGGGGAGTGCCTTGTAATCC-3' 7R 5'-CTTAGCGGGGAGAATATCTGA-3' 8F 5'-CGCTCATTGAACTCTCCTCC-3' 8R 5'-AACATGGTGTTCAGAGGAAGT-3' 9F 5'-CAGCTGTCTCTAACACCACGC-3' 9R 5'-ATACAACATGGGCATCTGAT-3' 10F 5'-CTATTGTAACAGCTGGCCTAG-3' 10 Exon 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Mồi Trình tự 10R 5'-CTGTCACTTGCTCAGCCCC-3' 11F 5'-GCTGTCAGGTCACATGAGTGC-3' 11R 5'-CTGATTTCCCAGAACTCTTCA-3' 12F 5'-TTCTTCATAGGTTGTAATTTC-3' 12R 5'-GGATCAATGTCAGTAGATTAT-3' 13aF 5'-CCCTGAAATGTCCTTATGTGA-3' 13aR 5'-CTCTCAGGCTTTTCTCTCAAT-3' 13bF 5'-AAATGTCCTTATGTGATTAGA-3' 13bR 5'-GGCTTTTCTCTCAATGTGAAAT-3' 14F 5'-CAGCTAGGAGAGAAGGACATG-3' 14R 5'-AGTTCTGCCTCAGGAGTGTGA-3' 15F 5'-TCTTGGCTTACAGTTTCCTCTT-3' 15R 5'-TCTGTGGTTTGACCCACCTC-3' 16F 5'-GACTCTTTTGCCTGATATCTG-3' 16R 5'-TGCTGTTAAAAGGATTGCATG-3' 17F 5'-CATTGCAAGTGTGGTATGTTG-3' 17R 5'-TACAGCTCAGTGCTGGGCC-3' 18F 5'-CAAGGGTAACTTGAGGTTTCT-3' 18R 5'-TGATTCTGATGGAGAGGAGCA-3' 19F 5'-TGGGCAGACCCCTTCCTCAC-3' 19R 5'-AAGCCTTTCTGGGCGCAGCT-3' 20F 5'-CTAGGTGTGAGTGCGAGTT-3' 20R 5'-CAGCATTTGTCCCAGGT-3' 21F 5'-AATGGCTCAGATGCTGTT-3' 21R 5'-GCTTGTGGTGAGGGTAGG-3' BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI  NG TH AN LY TốI ƯU QUY TRìNH XáC ĐịNH ĐộT biến gen atp7b bệnh nhân wilson KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA KHÓA 2011 – 2015 Hướng dẫn khoa học: TS TRẦN VÂN KHÁNH HÀ NỘI - 2015 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khoá luận này, trước hết em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Y Hà Nội, Thầy, Cô Cán Trung tâm Nghiên cứu Gen - Protein Trường Đại học Y Hà Nội tạo điều kiện giúp đỡ em trình thực đề tài Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: TS Trần Vân Khánh – Phó Giám đốc Trung tâm Nghiên cứu Gen Protein, người cô tận tâm trực tiếp hướng dẫn, bảo động viên em khố trình học tập thực đề tài GS TS Tạ Thành Văn – Giám đốc Trung tâm Nghiên cứu Gen – Protein người thầy nhắc nhở, động viên không em mà tất sinh viên, học viên tiến hành khóa luận mơn, tạo điều kiện thuận lợi cho chúng em thực hồn thành khóa luận cách tốt CN Phạm Lê Anh Tuấn người dạy dỗ, dìu dắt, hướng dẫn giúp đỡ cung cấp cho em phương pháp thực hành suốt thời gian em thực đề tài Trung tâm Nghiên cứu Gen - Protein Trường Đại học Y Hà Nội Cùng toàn thể Thầy, Cô Cán Trung tâm Nghiên cứu Gen Protein Trường Đại học Y Hà Nội dành cho em giúp đỡ quý báu tạo điều kiện thuận lợi em thực khoá luận tốt nghiệp Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, người thân, bạn bè ln động viên tinh thần, giúp đỡ em trình thực đề tài Hà Nội, tháng 05 năm 2015 Sinh viên Đặng Thị An Ly Cộng hòa xã hội chủ nghĩa Việt Nam Độc lập – Tự – Hạnh phúc LỜI CAM ĐOAN Kính gửi: Phòng Đào tạo Đại học – Trường Đại học Y Hà Nội, Hội đồng chấm khóa luận tốt nghiệp Cử nhân Y khoa 2011 – 2015 Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu thực giúp đỡ TS.BS Trần Vân Khánh Thầy Cô,anh chị Trung tâm nghiên cứu Gen – Protein, TrườngĐại học Y Hà Nội tất số liệu khóa luận trung thực Hà Nội, tháng 05 năm 2015 Sinh viên Đặng Thị An Ly MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC TỪ VÀ CỤM TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bệnh Wilson 1.1.1 Lịch sử phát bệnh 1.1.2 Dịch tễ học 1.1.3 Triệu chứng, chẩn đoán điều trị 1.1.4 Cơ chế bệnh sinh 1.1.5 Cơ sở phân tử 10 1.2 Gen protein ATP7B 12 1.2.1 GenATP7B 12 1.2.2 Protein ATP7B 12 1.2.3 Mối tương quan gen protein 13 1.2.4 Một số nghiên cứu đột biến gen ATP7B 14 1.3 Một số kỹ thuật sinh học phân tử 14 1.3.1 Polymerase Chain Reaction ( PCR) 14 1.3.2 Giải trình tự gen 17 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Thời gian địa điểm 21 2.2 Đối tượng 21 2.3 Thiết kế nghiên cứu 22 2.4 Dụng cụ, trang thiết bị hóa chất nghiên cứu 22 2.4.1 Dụng cụ trang thiết bị 22 2.4.2 Hóa chất 23 2.5 Quy trình thực 24 2.5.1 Thu thập mẫu 24 2.5.2 Quy trình tách chiết DNA 24 2.5.3 Quy trình kỹ thuật PCR 26 2.5.4 Quy trình giải trình tự 28 2.6 Vấn đề đạo đức nghiên cứu 30 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ 31 3.1 Kết tách chiết DNA 31 3.1.1 Kết đo OD 31 3.1.2 Kết điện di DNA tổng số 33 3.2 Kết PCR 34 3.3 Kết giải trình tự 35 3.3.1 Một số hình ảnh giải trình tự : 35 3.3.2 Kết giải trình tự gen ATP7B bệnh nhân 38 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 41 4.1 Đặc điểm nhóm nghiên cứu 41 4.2 Kết tách chiết DNA 41 4.3 Kết PCR 43 4.3.1 Kết tối ưu điều kiện phản ứng PCR 45 4.3.2 Các sai số gặp phản ứng PCR 46 4.4 Kết giải trình tự 47 KẾT LUẬN 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC TỪ VÀ CỤM TỪ VIẾT TẮT dATP Deoxyadenosine triphosphate dTTP Deoxythymidine triphosphate dGTP Deoxyguanosine triphosphate dCTP Deoxycytidine triphosphate DNA Deoxyribose nucleic acide RNA Ribose nucleic acide dNTP Deoxyribonucleotid – – triphosphate ddNTP Dideoxyribonucleotid – – triphosphate ATP7B ATPase, Cu2+ transporting, beta polypeptide P-type ATPasa ATP Adenosin triphosphat TE Tris – EDTA EDTA Ethylen Diamin Tetra Acetic PCR Polymerase Chain Reaction OD Optical Density (Độ hấp thụ quang) MK Marker Bp Base pair SNP Single Nucleotide Polymorphism (tính đa hình thái đơn nucleotide) DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Vòng Kayser-Fleischer [33] Hình 1.2: Chuyển hoá đồng tế bào gan [39] Hình 1.3: Chu kì vận chuyển đồng nhờ protein ATP7B [10] Hình 1.4: Phả hệ gia đình bệnh nhân Wilson 10 Hình 1.5: Vị trí gen ATP7B nhiễm sắc thể 13 12 Hình 1.6: Cấu trúc protein ATP7B [49] 13 Hình 1.7: Các vùng chức protein tương ứng gen [1] 13 Hình 1.8: Thành phần giai đoạn phản ứng PCR 17 Hình 1.9: Minh hoạ phương pháp giải trình tự gen 18 Hình 2.1: Chu trình nhiệt phản ứng PCR 27 Hình 3.1: Hình ảnh đo OD mẫu DNA tách chiết Phenol/Chloroform 32 Hình 3.2: Hình ảnh đo OD mẫu DNA tách chiết Kit promega 33 Hình 3.3: Hình ảnh điện di DNA tổng số 33 Hình 3.4: Chuẩn nhiệt độ gắn mồi exon 34 Hình 3.6: Hình ảnh giải trình tự gen bệnh mã số W1 35 Hình 3.7: Hình ảnh giải trình tự gen bệnh nhân mã số W10 36 Hình 3.8: Hình ảnh giải trình tự gen bệnh nhân mã số W6 37 Hình 3.9: Hình ảnh giải trình tự bệnh nhân mã số W2 38 DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Thành phần phản ứng PCR 27 Bảng 2.2: Thành phần phản ứng PCR-giải trình tự 28 Bảng 3.1: Kết đo OD phương pháp Phenol/Chloroform 31 Bảng 3.2: Kết đo OD số mẫu DNA kit promega 32 Bảng 3.3: Kết phát đột biến gen ATP7B 39 ... Áp dụng quy trình xác định đột biến gen ATP7B gây bệnh Wilson phương pháp giải trình tự gen Bước đầu xác định đột biến gen ATP7B gây bệnh Wilson Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bệnh Wilson 1.1.1... phù hợp với thể bệnh, mức độ bệnh, tuổi phát bệnh biểu kiểu hình có mối liên hệ với đột biến gen Dó đó, nghiên cứu Tối ưu h quy trình xác định đột biến gen ATP7B bệnh nhân Wilson được thực... bệnh nhân Hàn Quốc, tần số đột biến 65% [54] Ở Việt Nam, nghiên cứu phát đột biến gen gây bệnh Wilson bước đầu triển khai thu kết tốt Năm 2011, xây dựng quy trình phát đột biến gen gây bệnh Wilson[ 55]