Hoàn chỉnh quy trình 5 brom paps để xác định nồng độ kẽm trong tinh dịch ở nam giới vô sinh

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP BÁC SỸ Y KHOA KHÓA 2009 – 2015 Hà Nội – 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI -*** - BỘ Y TẾ CAO THỊ HỒNG YẾN KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP BÁC SỸ Y KHOA KHÓA 2009 – 2015 Hướng dẫn khoa học: TS NGUYỄN THỊ TRANG Hà Nội - 2015 LỜI CẢM ƠN Trong suốt q trình học tập, nghiên cứu hồn thành khố luận này, tơi nhận hướng dẫn, giúp đỡ quý báu Thầy, Cô, anh chị gia đình Với lòng kính trọng biết ơn sâu sắc, tơi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành tới: Ban Giám hiệu trường Đại học Y Hà Nội, phòng Quản lí đào tạo Đại học, phòng Quản lí Nghiên cứu Khoa học Bộ mơn Y sinh học – Di truyền trường Đại học Y Hà Nội thầy cô anh chị môn tạo điều kiện, giúp đỡ tận tình nghiên cứu hồn thành khố luận Đặc biệt, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Thị Trang, người hết lòng giúp đỡ, dạy bảo, dìu dắt, hướng dẫn tơi suốt q trình làm khố luận Cơ khích lệ tơi, dẫn tơi nhiều để tơi hồn thành khố luận ngày hơm Các Thầy cô hội đồng khoa học thông qua đề cương bảo vệ luận văn đóng góp nhiều ý kiến q báu cho tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Xin cảm ơn bệnh nhân nhiệt tình tham gia vào nghiên cứu Cuối cùng, muốn gửi lời cảm ơn tới bố mẹ – người dù không bên cạnh động viên tôi, người bạn giúp đỡ, chia sẻ khó khăn với tơi suốt q trình hồn thành khố luận Xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, tháng năm 2015 Cao Thị Hoàng Yến LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan đề tài khố luận “Hồn chỉnh quy trình 5-BrPAPS để xác định nồng độ kẽm tinh dịch nam giới vô sinh” hồn tồn tơi thực hướng dẫn TS Nguyễn Thị Trang Các số liệu kết nêu khoá luận trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Tác giả Cao Thị Hồng Yến MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Lịch sử nghiên cứu vô sinh vô sinh nam 1.1.1 Tình hình nghiên cứu vô sinh vô sinh nam giới 1.1.2 Tình hình nghiên cứu vơ sinh vô sinh nam Việt Nam 1.2 Một số nguyên nhân gây vô sinh nam 1.2.1 Nhóm nguyên nhân di truyền 1.2.2 Nhóm nguyên nhân không di truyền 1.3 Vai trò kẽm thể người 1.3.1 Vai trò kẽm nam giới 10 1.3.2 Vai trò kẽm nữ giới…………………………………………….11 1.3.3 Vai trò kẽm chết tế bào theo chương trình (apoptosis)….12 1.4 Các xét nghiệm cần thiết để đánh giá ảnh hưởng nồng độ kẽm đến chất lượng tinh dịch đồ……………………………………………….12 1.4.1 Xét nghiệm tinh dịch đồ………………………………………………12 1.4.2 Định lượng kẽm tinh dịch 14 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Đối tượng nghiên cứu 15 2.1.1 Tiêu chuẩn chọn mẫu 15 2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ ………………………………………………… 15 2.2 Phương pháp nghiên cứu 15 2.2.1 Quy trình nghiên cứu 15 2.2.2 Định lượng kẽm phương pháp 5-Br-PAPS 15 2.2.3 Các tiêu nghiên cứu 17 2.2.4 Xử lí số liệu 18 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 19 3.1 Hoàn chỉnh quy trình kĩ thuật định lượng kẽm phương pháp 5-BrPAPS 19 3.2 Mối liên quan nồng độ kẽm tinh dịch với độ di động tinh trùng 23 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 27 4.1 Hồn chỉnh quy trình kĩ thuật định lượng kẽm tinh dịch phương pháp 5-Br-PAPS 27 4.2 Mối liên quan nồng độ kẽm tinh dịch với độ di động tinh trùng 30 4.3 Chỉ định ý nghĩa xét nghiệm kẽm 31 KẾT LUẬN 33 KIẾN NGHỊ 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC BẢNG Bảng 1.2.1 Tác dụng việc bổ sung kẽm nhóm nam giới vơ sinh 11 Bảng 1.3.1 Tinh dịch đồ theo tiêu chuẩn WHO 1999 2010 13 Bảng 3.1.1: Bảng kiểm quy trình kĩ thuật định lượng kẽm tinh dịch phương pháp 5-Br-PAPS 19 Bảng 3.1.1(tiếp): Bảng kiểm quy trình kĩ thuật định lượng kẽm tinh dịch phương pháp 5-Br-PAPS 20 Bảng 3.1.2: Bảng kiểm chứng quy trình định lượng kẽm phương pháp 5-Br-PAPS 21 Bảng 3.1.3 Nồng độ kẽm trước sau bảo quản 22 Bảng 3.1.4 Nồng độ kẽm nhóm đối tượng nghiên cứu nhóm chứng 23 Bảng 3.2: Tương quan nồng độ kẽm tinh dịch với độ di động tinh trùng 24 DANH MỤC HÌNH Hình 1.2: Quá trình tổng hợp ADN, chu trình folate chuyển hoá glutathione DANH MỤC BIỂU 3.2.2 Biểu đồ tương quan độ di động tiến tới tinh trùng với nồng độ kẽm tinh dịch 25 3.2.3 Biểu đồ tương quan tinh trùng không di động với nồng độ kẽm tinh dịch 26 ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, tỉ lệ vô sinh giới nước ta ngày tăng Nếu trước kia, người ta quan niệm nguyên nhân vô sinh phụ nữ nghiên cứu gần nguyên nhân vô sinh nam giới nữ giới Theo tổ chức y tế giới, số cặp vợ chồng độ tuổi sinh sản gặp vấn đề việc sinh 30 – 40% nam giới, 40% nữ giới, 10% nam nữ, 10% không rõ nguyên nhân [1] Từ đó, vơ sinh nam trở thành vấn đề có tính chất thời sự, nghiên cứu cách sâu sắc tồn diện Vơ sinh nam giới nhiều nguyên nhân gây nên, việc chẩn đốn ngun nhân quan trọng, giúp bác sỹ lâm sàng định phương pháp điều trị để đạt kết tốt Có nhiều xét nghiệm hỗ trợ giúp chẩn đoán nguyên nhân tinh dịch đồ, xét nghiệm di truyền, nội tiết tố…và gần xét nghiệm marker hóa sinh, bao gồm kẽm, fructose… triển khai Bộ mơn Y sinh học – di truyền, có ý nghĩa đáng kể chẩn đốn ngun nhân vơ sinh nam giới Trên giới, nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ kẽm tinh dịch đến tính chất tinh trùng qua thông số tinh dịch đồ công bố từ lâu Nhiều nghiên cứu rằng, kẽm đóng vai trò quan trọng q trình phát triển bình thường tinh hồn, tuyến tiền liệt khả di động tinh trùng [2] Thiếu hụt kẽm hệ thống sinh sản gây yếu sinh lí vơ sinh [3] Tuy nhiên, Việt Nam, vấn đề mới, chưa có báo cáo hay nghiên cứu cụ thể nào, dù vai trò kẽm q trình sinh sản, đặc biệt với nam giới biết đến từ lâu Vì vậy, để tham gia vào cơng tác chăm sóc sức khỏe sinh sản người dân Việt Nam góp phần vào việc chẩn đốn ngun nhân tình trạng vơ sinh nam giới, chúng tơi tiến hành đề tài “Hồn chỉnh quy trình – Brom – PAPS (5-BrPAPS) để xác định nồng độ kẽm tinh dịch nam giới vô sinh” Mục tiêu đề tài: Hồn chỉnh quy trình kĩ thuật để định lượng kẽm tinh dịch theo phương pháp 5-Br-PAPS So sánh độ di động tinh trùng nhóm có nồng độ kẽm thấp với nhóm có nồng độ kẽm bình thường theo tiêu chuẩn giới 27 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 4.1 Hoàn chỉnh quy trình kĩ thuật định lượng kẽm tinh dịch phương pháp 5-Br-PAPS Chúng tơi tiến hành hồn chỉnh quy trình kĩ thuật định lượng kẽm phương pháp 5-Br-PAPS thực tế phòng xét nghiệm Việt Nam sau:  Bước 1: Chuẩn bị hoá chất để tạo phản ứng cần thiết  Bước 2: Sử dụng dung dịch TCA 10% để làm biến tính protein Đây bước quan trọng quy trình kĩ thuật Vì chất tinh dịch có chứa nhiều protein, điều làm ảnh hưởng đến kết xét nghiệm định lượng kẽm Làm biến tính protein từ loại bỏ bớt protein tinh dịch sau li tâm, giúp hạn chế sai số, để kết xét nghiệm xác Ở bước lưu ý với mẫu tinh dịch có mật độ tinh trùng cao (≥200 triệu/ml), cần pha lỗng với nước muối sinh lí với tỉ lệ 1:100 Điều giúp đo mật độ quang ngưỡng máy đo mật độ quang học  Bước 3: Sử dụng dung dịch chromogen AB với tỉ lệ 4A : 1B để tạo phức chất chelate có màu sắc ổn định Đây điểm khác biệt quy trình kĩ thuật Việt Nam so với giới Trên giới, hoá chất để tiến hành xét nghiệm định lượng kẽm phương pháp 5-Br-PAPS thường pha sẵn thành dung dịch zinc-buffer để sử dụng Dung dịch bảo quản sử dụng vòng tuần từ ngày pha chế Tuy nhiên, pha sẵn thành dung dịch zinc – buffer phần hố chất khơng dùng hết sau tuần phải bỏ lãng phí Ở đây, chúng tơi tiến hành pha hai loại dung dịch A, B riêng để bảo quản, có thời gian bảo 28 quản lâu (3 tháng) Khi cần sử dụng, pha chế thành dung dịch zinc-buffer AB với tỉ lệ 4A : 1B Mặt khác, trình pha hố chất khơng thể tránh khỏi sai số Tuy nhiên, phương pháp định lượng kẽm chưa có hàm hiệu chỉnh cho lần pha hoá chất khác Vì vậy, việc pha nhiều hố chất lúc, thành dung dịch A, B riêng để bảo quản lâu dài vừa giúp hạn chế sai số, vừa giúp sử dụng hoá chất cách hiệu quả, tiết kiệm, phù hợp với điều kiện phòng xét nghiệm Việt Nam  Bước - 5: Đo mật độ quang học từ xác định nồng độ kẽm Vì phức chất chelate tạo có màu sắc ổn định độ đậm màu hỗn hợp tỉ lệ thuận với nồng độ kẽm tinh dịch nên đo mật độ quang giúp định lượng hàm lượng kẽm tinh dịch nam giới Sau xây dựng bảng kiểm quy trình định lượng kẽm tinh dịch theo phương pháp 5-Br-PAPS trên, tiến hành kiểm nghiệm lại quy trình nhóm 10 nam giới có kết tinh dịch đồ bình thường nhóm gồm 10 nam giới vơ sinh có độ di động tinh trùng thấp giá trị tối thiểu Lựa chọn nhóm nam giới có độ di động tinh trùng thấp giá trị tối thiểu nhóm gặp kết nồng độ kẽm thấp Từ kiểm tra để điều chỉnh bước sóng hấp thụ với nồng độ kẽm thấp Chúng nhận thấy với quy trình vừa hồn chỉnh phản ứng xảy ra, có khác biệt nồng độ kẽm nhóm có ý nghĩa thống kê Điều chứng tỏ áp dụng quy trình kĩ thuật để định lượng nồng độ kẽm tinh dịch nam giới Tuy nhiên, xét nghiệm cho kết xác mẫu tinh dịch tiến hành làm xét nghiệm Nhưng số lí số lượng bệnh nhân tăng, số bệnh nhân đến môn làm xét nghiệm vào cuối ngày, mẫu tinh dịch vận chuyển từ xa đến, trình lấy 29 mẫu cộng đồng… nên số mẫu tinh dịch chưa làm xét nghiệm Điều đặt vấn đề bảo quản tinh dịch mẫu tinh dịch Chúng tơi hi vọng có phương pháp bảo quản mẫu tinh dịch phù hợp, không làm ảnh hưởng đến kết xét nghiệm Ở đây, thử bảo quản điều kiện - 18C, khơng có chất bảo quản nhận thấy khác biệt mẫu tinh dịch sau bảo quản 24 Như biết, kẽm tham gia vào nhiều trình sinh học thể Vì chúng tơi cho rằng, điều kiện bảo quản trên, tinh trùng có hoạt động sống có sử dụng đến kẽm trình trao đổi chất lượng, trình vận động, trình chống tác nhân oxy hố,… Những q trình làm lượng kẽm tinh dịch bị giảm sau bảo quản Kết cho thấy, phương pháp bảo quản lạnh sau 24 -18C khơng có chất bảo quản khơng phù hợp để bảo quản tinh dịch Vì cần tìm phương pháp bảo quản tinh dịch khác phù hợp Sau hồn chỉnh quy trình kĩ thuật định lượng kẽm phương pháp 5-Br-PAPS, tiến hành xác định nồng độ kẽm tinh dịch 80 nam giới vơ sinh (nhóm đối tượng nghiên cứu) 80 bệnh nhân có khả sinh sản bình thường (nhóm chứng) Kết cho thấy nồng độ kẽm tinh dịch nhóm đối tượng nghiên cứu thấp nhóm chứng khác biệt có ý nghĩa thống kê Kết tương tự nhiều nghiên cứu khác Ali cộng (2005, 2007), Basil cộng (2008) nồng độ kẽm tinh dịch giảm số nhóm nam giới vơ sinh so với nhóm chứng [46], [47] Tuy nhiên Oluyemi Akinloye (2011) N Amidu (2012) lại khơng có khác biệt đáng kể nồng độ kẽm nhóm nam giới vơ sinh với nam giới có khả sinh sản bình thường [48], [49] Nồng độ kẽm trung bình tinh dịch nhóm đối tượng nghiên cứu thấp nhóm chứng, gợi ý cho ta vai trò kẽm sức khoẻ sinh sản 30 nam giới Sự thiếu hụt kẽm nguyên nhân gây vơ sinh Tuy nhiên, ngồi kẽm, nhiều yếu tố ảnh hưởng đến trình sinh sản nam giới, yếu tố di truyền, nội tiết tố, mơi trường yếu tố sinh hố khác Đồng thời nhận thấy nồng độ kẽm trung bình tinh dịch nhóm chứng nước ta đáp ứng tiêu chuẩn chung giới nồng độ kẽm bình thường tinh dịch nam giới 0,3–1,5 mmol/l Sau tiến hành xét nghiệm 160 nam giới, thấy kết xét nghiệm phù hợp Từ chúng tơi hồn chỉnh quy trình kĩ thuật định lượng kẽm tinh dịch nam giới theo phương pháp 5-Br-PAPS bảng kiểm 3.1.1 4.2 Mối liên quan nồng độ kẽm tinh dịch với độ di động tinh trùng Trên 160 đối tượng làm xét nghiệm định lượng kẽm, nhận thấy có mối tương quan nồng độ kẽm độ di động tinh trùng Cụ thể nhóm có nồng độ kẽm thấp có độ di động tiến tới thấp nhóm có nồng độ kẽm bình thường Mặt khác nhóm có nồng độ kẽm thấp có tỉ lệ tinh trùng khơng di động cao nhóm có nồng độ kẽm bình thường khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 Ta nhận thấy tỷ lệ tinh trùng di động tiến tới có mối tương quan đồng biến chặt chẽ với nồng độ kẽm, tỷ lệ tinh trùng khơng di động lại có tương quan nghịch biến chặt chẽ với nồng độ kẽm có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 Ở giới có nhiều nghiên cứu mối liên quan nồng độ kẽm tinh dịch với độ di động tinh trùng Kết tương tự với nhiều nghiên cứu giới Fuse (1999), Chia (2000), Basil (2008), N Amidu (2012) [47], [49], [50], [51] Các tác giả cho 31 có mối tương quan đồng biến nồng độ kẽm tinh dịch với độ di động tinh trùng Một số tác giả khác không đưa kết trên, đồng ý kẽm có ảnh hưởng đến độ di động tinh trùng Omu (1998), Mahmoud Hussein Hadwan (2013) cho độ di động tinh trùng tăng lên sau cho đối tượng nghiên cứu uống bổ sung kẽm [52], [53] Tuy nhiên, Omar F Abdul-Rasheed (2009) lại cho khơng có mối tương quan rõ ràng nồng độ kẽm tinh dịch với độ di động tinh trùng [54] Kẽm có ảnh hưởng đến độ di động tinh trùng kẽm có vai trò tham gia hàng rào bảo vệ thể, chống lại q trình oxy hố tạo gốc tự dẫn đến khiếm khuyết khả di động tinh trùng Mặt khác, nhờ chức chống oxy hố mà kẽm góp phần cải thiện độ di động tinh trùng qua chế bảo vệ enzyme Creatine kinase khỏi gốc oxy hóa tự Đây enzyme quan trọng chu trình chuyển hóa lượng tế bào, tạo ATP - nguồn cung cấp lượng cho hoạt động roi tinh trùng giúp tinh trùng di chuyển Vì vậy, kẽm có ảnh hưởng đến độ di động tinh trùng Tuy nhiên, phải nói thêm rằng, ngồi kẽm, có số yếu tố khác nữa, ảnh hưởng đến độ di động tinh trùng fructose, thuốc lá…[49], [55], [56] 4.3 Chỉ định ý nghĩa xét nghiệm kẽm Như biết, xét nghiệm định lượng kẽm tinh dịch nam giới xét nghiệm dễ thực cần thiết, có ý nghĩa chẩn đốn ngun nhân vơ sinh nam Từ góp phần hỗ trợ bác sĩ lâm sàng điều trị vô sinh nam giới Tuy nhiên, khác với xét nghiệm tinh dịch đồ, xét nghiệm thường quy Nghĩa nam giới vô sinh bắt buộc phải làm xét nghiệm 32 Dựa kết mà tiến hành, nhận thấy kẽm độ di động tinh trùng có mối tương quan chặt chẽ với Vì vậy, với nam giới vô sinh kết tinh dịch đồ có độ di động tinh trùng thấp giá trị tối thiểu định làm xét nghiệm định lượng kẽm Với nam giới vô sinh làm xét nghiệm định lượng kẽm, cho kết hàm lượng kẽm tinh dịch thấp giá trị bình thường, bác sĩ định uống bổ sung kẽm Trên giới có nhiều nghiên cứu việc bổ sung kẽm để điều trị vô sinh nam Hadwan (2014) tiến hành thử nghiệm bổ sung kẽm nhóm nam giới vơ sinh có độ di động thấp giá trị tối thiểu kết tinh dịch đồ Nhóm uống bổ sung viên kẽm (220mg kẽm/viên) ngày tháng liền Kết cho thấy kẽm làm tăng số lượng độ di động tinh trùng Hadwan cho kẽm có vai trò chống oxy hố, nên cải thiện chất lượng số lượng tinh trùng [57] Nghiên cứu cho kết tương tự nhiều kết nghiên cứu trước (Wong cộng (2002), Ebisch cộng (2006), Mahmoud Hussein Hadwan (2013) [34], [52], [58] Ở Việt Nam, tiến hành điều trị bổ sung kẽm nam giới vơ sinh có kết thiếu kẽm làm xét nghiệm Tuy nhiên, phải nhấn mạnh rằng, khơng phải trường hợp có độ di động tinh trùng thấp giá trị tối thiểu thiếu kẽm Và việc bổ sung kẽm thực cách tuỳ tiện, khơng định Bởi nghiên cứu giới chứng minh rằng, nồng độ kẽm cao cao gây độc, gây apoptosis chí gây hoại tử tế bào [25], [39] Chính vậy, cần thực xét nghiệm này, để có biện pháp điều trị bổ sung kẽm hợp lí cho bệnh nhân có thiếu kẽm thực 33 KẾT LUẬN Hồn chỉnh quy trình kĩ thuật định lượng kẽm tinh dịch phương pháp so màu 5-Br-PAPS gồm bước sau: - Lấy 0,5ml tinh dịch có mật độ tinh trùng