Ứng dụng kĩ thuật Metagenimics trong nghiên cứu hệ vi sinh vật vùng rễ cây cà phê tại huyện CưmGra tỉnh Đăk Lăk (Luận văn thạc sĩ)

Ứng dụng kĩ thuật Metagenimics trong nghiên cứu hệ vi sinh vật vùng rễ cây cà phê tại huyện CưmGra tỉnh Đăk Lăk (Luận văn thạc sĩ)Ứng dụng kĩ thuật Metagenimics trong nghiên cứu hệ vi sinh vật vùng rễ cây cà phê tại huyện CưmGra tỉnh Đăk Lăk (Luận văn thạc sĩ)Ứng dụng kĩ thuật Metagenimics trong nghiên cứu hệ vi sinh vật vùng rễ cây cà phê tại huyện CưmGra tỉnh Đăk Lăk (Luận văn thạc sĩ)Ứng dụng kĩ thuật Metagenimics trong nghiên cứu hệ vi sinh vật vùng rễ cây cà phê tại huyện CưmGra tỉnh Đăk Lăk (Luận văn thạc sĩ)Ứng dụng kĩ thuật Metagenimics trong nghiên cứu hệ vi sinh vật vùng rễ cây cà phê tại huyện CưmGra tỉnh Đăk Lăk (Luận văn thạc sĩ)Ứng dụng kĩ thuật Metagenimics trong nghiên cứu hệ vi sinh vật vùng rễ cây cà phê tại huyện CưmGra tỉnh Đăk Lăk (Luận văn thạc sĩ)Ứng dụng kĩ thuật Metagenimics trong nghiên cứu hệ vi sinh vật vùng rễ cây cà phê tại huyện CưmGra tỉnh Đăk Lăk (Luận văn thạc sĩ)Ứng dụng kĩ thuật Metagenimics trong nghiên cứu hệ vi sinh vật vùng rễ cây cà phê tại huyện CưmGra tỉnh Đăk Lăk (Luận văn thạc sĩ)

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT HOÀNG THỊ HUYỀN TRANG ỨNG DỤNG KĨ THUẬT METAGENIMICS TRONG NGHIÊN CỨU HỆ VI SINH VẬT VÙNG RỄ CÂY CÀ PHÊ TẠI HUYỆN CƯM’GRA TỈNH ĐĂK LĂK LUẬN VĂN THẠC SĨ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 01 14 HÀ NỘI, 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn cơng trình nghiên cứu tơi hướng dẫn TS Phạm Bích Ngọc Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Tác giả luận văn Hồng Thị Huyền Trang i LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc, xin gửi lời cảm ơn tới TS Phạm Bích Ngọc tận tình hướng dẫn tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ suốt q trình học tập, làm việc hồn thành luận văn Xin chân thành cảm ơn TS Vũ Huyền Trang, Ths Nguyễn Hồng Hà, Ths Nguyễn Khắc Hưng tập thể cán bộ, nghiên cứu sinh, học viên phòng Cơng nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học công nghệ Việt Nam nhiệt tình giúp đỡ, truyền đạt kinh nghiệm quý báu cho suốt thời gian thực luận văn Xin chân thành cảm ơn đề tài : “Nghiên cứu metagenome vi sinh vật đất vùng rễ số trồng Việt Nam: thuốc có củ (cây nghệ), công nghiệp (cà phê) nhằm tăng suất chất lượng trồng” PGS TS Lê Mai Hương chủ nhiệm hỗ trợ kinh phí trang thiết bị trình thực luận văn Qua đây, xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô ban đào tạo viện Sinh thái tài nguyên sinh vật hướng dẫn, truyền đạt kiến thức cho suốt thời gian học tập nghiên cứu Cuối xin cảm ơn đến bạn bè gia đình giúp đỡ, chia sẻ, động viên tơi suốt q trình học tập thực luận văn Hà Nội, tháng 11 năm 2017 Học viên Hoàng Thị Huyền Trang ii MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cây cà phê tình hình sản xuất cà phê 1.1.1 Nguồn gốc,phân bố cà phê 1.1.2 Tình hình sản xuất cà phê Việt Nam 1.2 Hệ vi sinh vật đất ý nghĩa sinh trưởng, phát triển trồng 1.2.1 Giới thiệu hệ vi sinh vật 1.2.2 Vi sinh vật đất vùng rễ 1.3 Công nghệ metagenomics ứng dụng nghiên cứu đa dạng di truyền hệ vi sinh vật đất 1.4 Các bước ứng dụng công nghệ Metagenomics nghiên cứu da dạng khu hệ sinh vật từ môi trường 1.5 Ứng dụng đọc trình tự gen hệ nghiên cứu metagenomics 14 1.5.1 Cơng nghệ đọc trình tự bán dẫn ion 15 1.5.2 Cơng nghệ giải trình tự Illumina (Solexa) sequencing 17 1.6 Các nghiên cứu metagenomics giới Việt Nam 21 1.6.1 Các nghiên cứu metagenomics giới 21 1.6.2 Các nghiên cứu metagenomics Việt Nam 22 CHƯƠNG VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP 25 2.1 Vật liệu nghiên cứu 25 2.2 Phương pháp nghiên cứu 25 2.2.1 Phương pháp thu mẫu 25 2.2.2 Phương pháp tách chiết DNA tổng số 26 2.2.4 Khuếch đại vùng 16S rRNA 28 2.2.5 Tinh sản phẩm PCR 29 2.2.6 Gắn Index (Nextera XT Index kit) 29 iii 2.2.7 Tinh sản phẩm gắn Index 31 2.2.8 Đánh giá thư viện 31 2.2.9 Biến tính thư viện giải trình tự máy Miseq 31 2.2.10 Phân tích liệu 33 2.2.11 Phương pháp xác định tuyến trùng 35 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 3.1 Phân tính đặc điểm lý hóa sinh học chung mẫu 36 3.2 Kết tách chiết DNA tổng số 39 3.3 Chuẩn bị thư viện gắn adapter 40 3.4 Kết phân tích liệu trình tự 41 3.5 Kết phân tích mức độ đa dạng quần thể vi khuẩn đất vùng rễ cà phê 42 3.5.1 Kết đánh giá độ đa dạng mức phân loại nghành 43 3.5.2 Kết phân tích cấu trúc thành phần vi khuẩn chiếm ưu đất vùng rễ mức độ phân loại lớp họ vi khuẩn 44 3.5.3 Kết phân tích cấu trúc hệ vi khuẩn đất vùng rễ mức độ chi 47 3.5.4 Kết phân tích thành phần số loài vi khuẩn đặc trưng hệ vi sinh vật đất vùng rễ cà phê 49 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51 Kết luận 51 Kiến nghị 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Bảng thống kê thành phần hữu mẫu đất nghiên cứu 38 Bảng 3.2 Nồng độ độ tinh mẫu DNA tách từ đất 40 Bảng 3.3: Thống kê liệu trình tự thu sau bước giải trình tự 41 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Sơ đồ mô tả hoạt động hệ thống giải trình tự Illumina 20 giai đoạn 1: tổng hợp 20 Hình 1.2 Sơ đồ mơ tả hoạt động hệ thống giải trình tự Illumina 20 Hình 2.1 Vị trí tiến hành thu mẫu khu vực nghiên cứu 26 Hình 2.2 Quy trình khuếch đại giải trình tự vùng 16S rRNA 28 Hình 2.3 Bố trí ống mẫu 30 Hình 2.4 Quy trình phân tích sử dụng cơng cụ QIIME 34 Hình 3.1: Hình ảnh cà phê tái canh bệnh cà phê kinh doanh khu vực thu mẫu thí nghiệm Cây cà phê tái canh bệnh (A) mẫu rễ (C); Cây cà phê kinh doanh (B) mẫu rễ (D) 36 Hình 3.2 Biểu đồ thể thành phần loài tuyến trùng mẫu đất khu vực nghiên cứu 37 Hình 3.3 Kết điện di kiểm tra sản phẩm tách DNA tổng số 39 mẫuđất nghiên cứu 39 Hình 3.4 Biểu đồ ghi lại tín hiệu đo kích thước sản phẩm khuếch đại cặp mồi 16S 40 Hình 3.4 Biểu đồ ghi lại tín hiệu đo kích thước sản phẩm gắn index 41 Hình 3.5: Rarefaction curve dựa liệu trình tự bốn hệ vi sinh vậtcác OTU 0,1 42 Hình 3.6: Cấu trúc quần thể vi sinh vật mức độ ngành 43 Hình 3.7 Cấu trúc quần thể vi sinh vật mức độ lớp 45 v Hình 3.8 Cấu trúc quần thể vi sinh vật mức độ họ 46 Hình 3.9 Biểu đồ thể cấu trúc quần thể vi sinh vật có lợiở mức độ chi 47 Hình 3.10 Biểu đồ thể cấu trúc quần thể vi sinh vật có hại mức độ chi 49 Hình 3.11 Biểu đồ thể cấu trúc quần thể vi sinh vật có ích mức độ lồi 49 Hình 3.12 Biểu đồ thể cấu trúc quần thể vi sinh vật có hại mức độ lồi 50 vi DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT TCT : Tái canh tốt TCB : Tái canh bệnh NSC : Năng suất cao NSTB : Năng suất trung bình OM : Hữu tổng số Nts : Nitơ tổng số Pts : Photpho tổng số Kts : Kali tổng số Pdt : Photpho dễ tiêu Kdt : Kali dễ tiêu vii MỞ ĐẦU Quần thể sinh vật (archaeal, vi khuẩn, nấm, tuyến trùng) quanh hệ rễ thường tạo nên sinh thái điển hình đặc trưng cho lồi thực vật, đóng vai trò quan trọng sinh trưởng phát triển Các sinh vật cung cấp chất dinh dưỡng, chất kích thích cho việc tăng cường phát triển ngăn ngừa sâu bệnh giúp chống chịu với điều kiện bật lợi nóng, lạnh, muối hạn hán Cà phê công nghiệp dài ngày, chủ lực mang lại hiệu kinh tế cao cho ngượi trồng cho kinh tế chung cho nước Năm 2012 Việt Nam vượt qua Brasil trở thành quốc gia đứng đầu giới xuất cà phê Lượng cà phê xuất tăng liên tục hàng năm Năm 2016, Việt Nam xuất 1,78 triệu với kim ngạch 3,34 tỷ USD, tăng 32,8% khối lượng tăng 24,7% giá trị so với năm 2015 Tuy nhiên tập trung vào tăng sản lượng nên vùng đất trồng cà phê bị khai thác mức, gây ô nhiễm nguồn nước, đất bị xói mòn, bạc màu, phát sinh dịch bệnh, tạo điều kiện cho vi sinh vật kháng thuốc trừ sâu… Vấn đề nghiên cứu có tính hệ thống sinh vật (có lợi có hại, cộng sinh ký sinh…) nguồn gen chúng đất trồng vùng canh tác hiệu sở khoa học định hướng, xây dựng giải pháp cải tạo hiệu khu hệ sinh vật, góp phần thúc đẩy phát triển cà phê cách bền vững Hiện nay, metagenomics (phân tích DNA vi sinh vật mơi trường mà không cần nuôi cấy) công nghệ mới, kết hợp kỹ thuật công nghệ sinh học khác từ cơng nghệ gen, giải trình tự đến đến tin sinh học để nghiên cứu thành phần, chức động học quần thể vi sinh vật Các liệu thu từ nghiên cứu metagenomics cho phép phát đối tượng vi sinh vật gây bệnh, dự báo dịch bệnh để có biện pháp phòng trừ hiệu Việc đánh giá đa dạng quần thể vi sinh vật đất canh tác, xác định nhóm vi sinh vật có lợi, có hại… làm sở để nghiên cứu chế phẩm sinh học nhằm cải tạo đất, kích thích vi sinh vật có lợi, tăng cường sức đề kháng chống chịu, tăng suất, chất lượng trồng Xuất phát từ phân tích tiến hành đề tài nghiên cứu “Ứng dụng kĩ thuật metagenomics nghiên cứu hệ vi sinh vật vùng rễ cà phê huyện Cư M’gra tỉnh Đăk Lăk” Mục tiêu nghiên cứu Đánh giá cấu trúc hệ vi khuẩn đất vùng rễ cà phê bước đầu khảo sát tác động hệ vi sinh vật đến sinh trưởng phát triển cà phê tỉnh Đăk Lăk Nội dung nghiên cứu - Tách chiết DNA tổng số từ mẫu đất nghiên cứu - Giải trình tự phân đoạn 16S ribosome kỹ thuật metagenomics - Xác định so sánh thành phần nghành, lớp, họ, chi, loài hệ vi khuẩn đất vùng rễ cà phê Địa điểm nghiên cứu Phòng Cơng nghệ Tế bào Thực vật – Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam Xylella fastidiosa Các vi khuẩn ảnh hưởng đến trồng quan trọng nông nghiệp bao gồm cà chua, chuối, có múi, gạo, cà phê Tuy nhiên mẫu tái canh tốt họ chiếm số lượng ưu điều liên quan đến vấn đề tương tác hệ vi sinh vật mà chưa biết tới, nhóm cà phê kinh doanh có suất cao hệ vi sinh vật tồn mẫu ổn định nên số lượng loài vi sinh vật thuộc họ Xanthomonadaceae chiếm ưu mẫu suất trung bình Chúng tơi tiếp tục tiến hành phân tích cấu trúc, thành phần hệ vi khuẩn đất vùng rễ cà phê mức độ chi (Genus) 3.5.3 Kết phân tích cấu trúc hệ vi khuẩn đất vùng rễ mức độ chi Ở mức độ thấp mặt phân loại, nghiên cứu xác định 438 chi toàn liệu phân tích, chọn số chi quan trọng, cho có lợi hay hại cà phê (Hình 3.10 3.11), để tập trung phân tích Các nhóm có tỉ lệ phần trăm thấp 0,1% phân vào nhóm khác Các trình tự lại xếp nhóm chưa phân loại B A Hình 3.10 Biểu đồ thể cấu trúc quần thể vi sinh vật có lợi mức độ chi A Biểu đồ thể cấu trúc quần thể vi sinh vật mức độ chi có lợi nhóm cà phê tái canh B Biểu đồ thể cấu trúc quần thể vi sinh vật mức độ chi có lợi nhóm cà phê kinh doanh Từ hình 3.10 cho thấy có 11 chi vi sinh vật có lợi đất quanh vùng rễ cà phê Tuy nhiên số lượng loài chi phụ thược vào kiểu cảnh tác giai đoạn phát triển Kết hình 3.9A cho thấy, chi Sphingobium mẫu cà phê tái canh có số lượng cao gấp lần so với mẫu cà phê tái canh nhiễm bệnh Đây làchi bao gồm lồi biết có khả phân huỷ loạt hóa chất gây 47 độc cho môi trường hợp chất thơm clo, phenol nonylphenol pentachlorophenol, thuốc diệt cỏ (RS)-2-(4-chloro-2-methylphenoxy) propionic acid hexachlorocyclohexane, hydrocacbon thơm đa vòng Chi Chitinophaga chiếm số có khả phân hủy chitin (vỏ tuyến trùng) cellulose chi vi sinh vật đất có ảnh hưởng đến sinh trưởng cà phê chúng có khả phân hủy vỏ chitin tuyến trùng đất Chi Streptomyces tìm thấy chủ yếu đất thảm thực vật mục nát Streptomyces sinh bào tử, tạo mùi đặc trưng, kết từ sản sinh geosmin trình chuyển hóa chất Streptomyces nghiên cứu rộng rãi biết đến nhiều chi họ xạ khuẩn (Actinomyces) Streptomyces thường sống đất có vai trò vi sinh vật phân hủy quan trọng Chủng vi sinh sản xuất nửa số thuốc kháng sinh giới sản phẩm có giá trị lớn lĩnh vực y tế, có khả sinh kháng sinh nên mẫu cà phê tái canh khỏe mạnh phân tích lượng Streptomyces gấp lần so với mẫu cà phê tái canh nhiễm bệnh Từ hình 3.10 B cho thấy chi Sphingobium, Chitinophaga, Streptomyces chiếm ưu mẫu cà phê kinh doanh suất cao Ngoài chi ta thấy Bacillus lồi gần phổ biến tự nhiên, ví dụ đất, mà xảy môi trường khắc nghiệt pH cao ( B alcalophilus), nhiệt độ cao ( B thermophilus ), muối cao ( B halodurans ) B thuringiensis tạo độc tố giết trùng sử dụng làm thuốc trừ sâu (Joan L Slonczewski & John W Foster (2011), loại vi sinh vật tồn đất, chúng có tác dụng lên vật chủ giúp chủ tăng sức đề kháng với loại bệnh, nấm, côn trùng hại Chính qua số liệu thu đư Được nhận thấy nhóm cà phê kinh doanh suất cao có bacillus cao gấp lần so với nhóm cà phê kinh doanh có suất thấp 48 B A Hình 3.11 Biểu đồ thể cấu trúc quần thể vi sinh vật có hại mức độ chi A Biểu đồ thể cấu trúc quần thể vi sinh vật có hại mức độ chi nhóm cà phê tái canh B Biểu đồ thể cấu trúc quần thể vi sinh vật có hại mức độ chi nhóm cà phê kinh doanh Số lượng phân bố chi có hại sinh trưởng phát triển cà phê hình 3.11 A 3.11 B, chi Burkholderia có số lượng lớn Đặc biệt với nhóm tái canh bệnh, số lượng vi sinh vật cao gấp 13 lần so với nhóm cà phê tái canh tốt 3.5.4 Kết phân tích thành phần số lồi vi khuẩn đặc trưng hệ vi sinh vật đất vùng rễ cà phê Phân tích tồn liệu, chúng tơi xác định có mặt 155 loài chọn số loài đặc trưng để phân tích (Hình 3.12 3.13) A B Hình 3.12 Biểu đồ thể cấu trúc quần thể vi sinh vật có ích mức độ lồi A Biểu đồ thể cấu trúc quần thể vi sinh vật có ích mức độ lồi nhóm cà phê tái canh B Biểu đồ thể cấu trúc quần thể vi sinh vật có ích mức độ lồi nhóm cà phê kinh doanh Trong số loài phát hiện, S wittichii chiếm số lượng ưu đặc biệt với mẫu tái canh tốt có số lượng cao gấp lần so với mẫu tái canh bệnh Điều cho thấy S.wittichii ảnh hưởng trực tiếp đến sinh trưởng phát triển cà phê Các loài S wittichii lồi có khả phân hủy dioxin Ngồi có lồi tạo chất khác G fujikuroi sản xuất chất kích thích sinh trưởng thực vật, H 49 ochraceum chuyển hóa kháng nấm sinh kháng sinh; R leguminosarum có khả cố định đạm tự A B Hình 3.13 Biểu đồ thể cấu trúc quần thể vi sinh vật có hại mức độ lồi A Biểu đồ thể cấu trúc quần thể vi sinh vật có hại mức độ lồi nhóm cà phê tái canh B Biểu đồ thể cấu trúc quần thể vi sinh vật có hại mức độ lồi nhóm cà phê kinh doanh Trong số lồi phân tích, có lồi gây bệnh cà phê lồi thực vật khác.Kết thể Hình 3.13 cho thấy, có lồi gây hại cho thực vật điển R solanacearum gây bệnh héo lá, Fastidiosa gây bệnh cháy, Pseudomonas garcae gây bệnh đốm cà phê Đối với nhóm cà phê tai canh bị bệnh suất thấp ta thấy có mặt loài Fastidiosa, Pseudomonas garcae R solanacearum cao nhóm tái canh tốt cà suất cao Điều phần cho thấy chủng phần tác động tới phát triển suất cà phê 50 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận - Xác định 512.896 trình tự đoạn V3 V4 gen 16S rRNA, 133,661 trình tự cho cà phê tái canh bị bệnh,124,574 trình tự cho cà phê tái canh bị bệnh,122,816 trình tự cho cà phê kinh doanh suất cao 131,845 trình tự cho cà phê kinh doanh trung bình - Kết phân tích metagenomic cho thấy chiến đa số vi sinh vật vùng rễ cà phê thuộc ngành Proteobacteria, lớp Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria, Gamaproteobacteria, Saprospirae, Actinobacteria, Actinobacteria-6, họ Sphingomonadaceae, Chitinnophagaceae, Xanthomonadaceae, Burkholderiaceae, Chthonlobacteraceae, Streptomycetaceae (33,44%, 41,71%, 41,57% 40,49% cho cà phê tái canh tốt, cà phê tái canh bệnh, cà phê kinh doanh suất cao cà phê kinh doanh suất trung bình) - Chi Sphingobium thuộc họ Sphingomonadaceae, Chitinophaga thuộc họ Chitinnophagaceae, Streptomyces thuộc họ Streptomycetaceae chiếm ứu mẫu cà phê kinh doanh suất cao Chi Burkholderia thuộc họ Burkholderiaceae phổ biến vùng rễ nhóm cá phê tái canh bệnh (cao gấp 13 lần so với nhóm cà phê tái canh tốt) - Lồi Sphingobium wittichii chiếm ưu rễ cà phê tái canh tốt (gấp lần so với tái canh bệnh) Các lồi gây bệnh điển hình cà phê R solanacearum gây bệnh héo lá, Fastidiosa gây bệnh cháy, Pseudomonas garcae gây bệnh đốm cà phê phát vùng rễ khác nhau, đặc biệt vùng tái canh bệnh Kiến nghị Từ kết thu nghiên cứu hướng phát triển sử dụng chế phẩm sinh học làm tăng vi sinh vật tự nhiên có lợi giảm vi sinh vật có hại, trực tiếp gián tiếp lên sinh trưởng phát triển cà phê, nhằm mục tiêu phát triển bền vững, tăng suất chất lượng cà phê Việt Nam Tiến hành tiệp tục nghiên cứu để đánh giá ảnh hưởng hệ sinh vật tới khả sinh trưởng phát triển cà phê 51 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo Tài liệu Tiếng Anh Amann, R I., Ludwig, W., Schleifer, K H., (1995) “Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation” Microbiol Rev 59, 143–169 Atkinson, D and Watson, C A., (2000) “The beneficial rhizosphere: A dynamic entity” Appl Soil Ecol., 15, 99-104 Aragon AD, Torrez-Martinez N, Edwards JS, (2012) “Genomic analysis of Saccharomyces cerevisiae isolates that grow optimally with glucose as the sole carbon source” Electrophoresis 33(23): 3514-20 Azad AK, Curtis A, Papp A, Webb A, Knoell D, Sadee W, Schlesinger LS, (2013) “Allelic mRNA expression imbalance in C-type lectins reveals a frequent regulatory SNP in the human surfactant protein A (SP-A) gene” Genes Immun 14(2): 99-106 Barns SM; Cain EC; Sommerville L; Kuske CR, (2007) “Acidobacteria phylum sequences in uranium-contaminated subsurface sediments greatly expand the known diversity within the phylum” Appl Environ Microbiol 73 (9):31136 Beja, O., Koonin, E V., Aravind, L., Taylor, L T., (2002) “Comparative genomic analysis of archaeal genotypic variants in a single population and in two different oceanic provinces” Appl Environ Microbiol 68, 335–345 Bomar, L , Maltz, M., Colston, S and Graf, J (2011) Directed culturing of microorganisms using metatranscriptomics MBio 2: e00012-0001 Breitbart M, Salamon P, Andresen B, Mahaffy JM, Segall AM, Mead D, Azam F, Rohwer F "Genomic analysis of uncultured marine viral communities" Proceedings of the National Academy USA 2002, 99 (22): 14250–14255 53 Castro TL, Seyffert N, Ramos RT, Barbosa S, Carvalho RD, Pinto AC, Carneiro AR, Silva WM, Pacheco LG, Downson C, Schneider MP, Miyoshi A, Azevedo V, Silva A, (2013) “IonTorrent-based transcriptional assessment of a Corynebacterium pseudotuberculosis equi strain reveals denaturing highperformance liquid chromatography a promising rRNA depletion method” Microb Biotechnol 6(2): 168-177 10 Campos VP & Villain L, (2005) Nematodes parasites of coffee and cocoa In: Plant parasitic nematodes in subtropical and tropical agriculture Luc M, Sikora A & Bridge J (Eds.) Pp: 529-579 CABI Publishing, Wallingford, UK 11 Daniel R., (2005) “The metagenomics of soil” Nat Rev Microbiol.3(6): 470-488 12 Daves K (2010) It’s “Watson Meets Moore” as Ion Torrent Introduces Semiconductor Sequencing Bio-IT World 2010 http://www.bio- itworld.com/news/03/01/10/ion-torrent-semiconductor-sequencing.html 13 Delmont TO, Robe P, Clark I, Simonet P, Vogel TM, (2011) “Metagenomic comparison of direct and indirect soil DNA extraction approaches” J Microbiol Methods86(3):397–400 14 Edwards, RA; Rodriguez-Brito B, Wegley L, Haynes M, Breitbart M, Peterson DM, Saar MO, Alexander S, Alexander EC, Rohwer F (2006) "Using pyrosequencing to shed light on deep mine microbial ecology" BMC Genomics 7: 57 15 EJ Chung, TS Park, CO Jeon, YR Chung, (2012) “Chitinophaga oryziterrae sp nov., isolated from the rhizosphere soil of rice (Oryza sativa L.)”.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 16 Ferla MP, Thrash JC, Giovannoni SJ, Patrick WM (2013) "New rRNA gene-based phylogenies of the Alphaproteobacteria provide perspective on major groups, mitochondrial ancestry and phylogenetic instability" 54 17 Gams, W (2007) Biodiversity of soil-inhabiting fungi Biodivers Conserv 16, 69–72 18 Handelsman, J., (2004) “Metagenomics: application of genomics to uncultured microorganisms” Microbiol Mol Biol Rev 68, 669-685 19 Hartwig B, James GV, Konrad K, Schneeberger K, Turck F, (2012) “Fast isogenic mapping-by-sequencing of ethyl methanesulfonate-induced mutant bulks” Plant Physiol 160(2): 591-600 20 Hardeman, F., and S Sjoling., (2007) “Metagenomic approach for the isolation of a novel low-temperature-active lipase from uncultured bacteria of marine sediment” FEMS Microbiol Ecol.59:524-534 21 Hassan SS, Guimarães LC, Pereira Ude P, Islam A, Ali A, Bakhtiar SM, Ribeiro D, Rodrigues Dos Santos A, Soares Sde C, Dorella F, Pinto AC, Schneider MP, Barbosa MS, Almeida S, Abreu V, Aburjaile F, Carneiro AR, Cerdeira LT, Fiaux K, Barbosa E, Diniz C, Rocha FS, Ramos RT, Jain N, Tiwari S, Barh D, Miyoshi A, Müller B, Silva A, Azevedo V, (2012) “Complete genome sequence of Corynebacterium pseudotuberculosis biovar ovis strain P54B96 isolated from antelope in SOTUh Africa obtained by rapid next generation sequencing technology” Stand Genomic Sci7(2): 189–199 22 Hochmuth T, Niederkruger H, Gernert C, Siegl A, Taudien S,Platzer M, Crews P, Hentschel U & Piel J (2010) Linking chemical and microbial diversity in marine sponges: possiblerole for Poribacteria as producers of methyl-branched fatty acids Chembiochem 11: 2572 – 2578 23 Howden BP, McEvoy CR, Allen DL, Chua K, Gao W, Harrison PF, Bell J, Coombs G, Bennett-Wood V, Porter JL, Robins-Browne R, Davies JK, Seemann T, Stinear TP, (2011) “Evolution of multidrug resistance during Staphylococcus aureus infection involves mutation of the essential two component regulator WalKR” PLoS Pathog 7(11): e1002359 55 24 Hugenholz, P., (2002) “Exploring prokaryotic diversity in the genomic era” Genome Biology3 (2): 1–8 25 Iqbal, Z., Caccamo, M., Turner, I., Flicek, P and McVean, G., (2012)“De novo assembly and genotyping of variants using colored de Bruijn graphs” Nat Genet 44: 226–32 26 Jünemann S, Prior K, Szczepanowski R, Harks I, Ehmke B, Goesmann A, Stoye J, Harmsen D, (2012) “Bacterial community shift in treated periodontitis patients revealed by ion torrent 16S rRNA gene amplicon sequencing” PLoS One 7(8): e41606 27 Pace, N R., Stahl, D A., Lane, D J., Olsen, G J., The analysis of natural microbial populations by ribosomal RNA se-quences.Adv Microb Ecol 1986,9, 1–55 28 Pace, N.R.; Delong, EF (1991) Analysis of a marine picoplankton community by 16S rRNA gene cloning and sequencing Journal of Bacteriology 173 (14): 4371–4378 29 Parachin, Nádia Skorupa; Marie F Gorwa-Grauslund "Isolation of xylose isomerases by sequence- and function-based screening from a soil metagenomic library" Biotechnology for Biofuels (1): (2011) 30 Purushothaman S, Toumazou C, Ou C-P (2006) Protons and single nucleotide polymorphism detection: a simple use for the ion sensitive field effect transistor Sensors & Actuators: B Chemical 114 (2): 964-968 31 Perkel J (2011) Making contact with sequencing's fourth generation Biotechniques 2011 32 Poinar, HN; Schwarz, C, Qi, J, Shapiro, B, Macphee, RD, Buigues, B, Tikhonov, A, Huson, D, Tomsho, LP, Auch, A, Rampp, M, Miller, W, and Schuster, SC (2006) "Metagenomics to Paleogenomics: Sequencing of Mammoth DNA" Science 311 (5759): 392–394 56 Large-Scale 33 Kakirde, Kavita S.; Larissa C Parsley, Mark R Liles (1 November 2010) "Size Does Matter: Application-driven Approaches for Soil Metagenomics" Soil biology & biochemistry 42 (11): 1911–1923 34 Karow J., (2011) “At AGBT, Ion Torrent Customers Provide First Feedback” Life Tech OTUlines Platform's Growth In Sequence 35 Kennedy, A.C., (1999) “The rhizosphere and spermosphere In: Principles and applications of soil microbiology” (Eds.: Sylvia, D M., Fuhrmann, J J., Hartel, P G., and Zuberer, D A.) Prentice Hall, Upper Saddle River, NewJersy 36 Kuske CR; Barns SM; Busch JD (1997) “Diverse uncultivated bacterial groups from soils of the arid southwestern United States that are present in many geographic regions” Appl Environ Microbiol 63 37 Lussier FX, Chambenoit O, Côté A, Hupé JF, Denis F, Juteau P, Beaudet R, Shareck F, (2011)“Construction and functional screening of a metagenomic library using a T7 RNA polymerase-based expression cosmid vector” J Ind Microbiol Biotechnol 38 (9): 1321-8 38 Lynch, J M., (1981) “Promotion and inhibition of soil aggregate stability by microorganisms” J Gen Microbiol 126, 371-375 39 Madigan, M J Martinko (eds.) (2005) Brock Sinh học vi sinh vật (lần thứ 11 ed.) Prentice Hall ISBN 0-13-144329-1 40 Mardis ER, (2008) “Next-generation DNA sequencing methods” Annu Rev Genomics Hum Genet 9: 387–402 41 Maplestone, P A and Campbell, R., (1989) “Colonization of roots of wheat seedlings by Bacilli proposed as biocontrol against take all” Soil Biol Biochem 21, 543-550 42 Mellmann A, Harmsen D, Cummings CA, Zentz EB, Leopold SR, Rico A, Prior K, Szczepanowski R, Ji Y, Zhang W, McLaughlin SF, Henkhaus JK, Leopold B, Bielaszewska M, Prager R, Brzoska PM, Moore RL, Guenther S, 57 Rothberg JM, Karch H, (2011) “Prospective genomic characterization of the German enterohemorrhagic Escherichia coli O104:H4 OTUbreak by rapid next generation sequencing technology” PLoS One 11;6(7): e22751 43 Mendes, R cs (2011) Deciphering the rhizosphere microbiome for disease-suppressive bacteria Science 332, 1097–1100 44 Metzker M.L, (2005) “Emerging technologies in DNA sequencing” Genome Res 15(12): 1767-76 45 Metzker ML., (2010) “Sequencing technologies - the next generation” Nat Rev Genet 11(1): 31-46 doi: 10.1038/nrg2626 Epub 2009 Dec 46 Perkel J, (2011) “Making contact with sequencing's fourth generation” Biotechniques 2011 47 Purushothaman S, Toumazou C, Ou C-P, (2006) “Protons and single nucleotide polymorphism detection: a simple use for the ion sensitive field effect transistor” Sensors & Actuators: B Chemical114 (2): 964-968 48 Ramachandran C., Fonseca HB., Jhabvala P, Escalon EA., Melnick SJ (2002) Curcumin inhibits telomerase activity through human telomerase reverse transcriptase in MCF-7 breast cancer cell line Cancer Lett 184: 1–6 49 Rappe, M S.; Giovannoni, S J., (2003) “The Uncultured Microbial Majority” Annual Review of Microbiology57: 369–394 50 Ramos RT, Carneiro AR, Soares Sde C, dos Santos AR, Almeida S, Guimarães L, Figueira F, Barbosa E, Tauch A, Azevedo V, Silva A, (2013) “Tips and tricks for the assembly of a Corynebacterium pseudotuberculosis genome using a semiconductor sequencer” Microb Biotechnol 6(2): 150-6 51 Rothberg JM, Hinz W, Rearick TM, Schultz J, Mileski W, Davey M, Leamon JH, Johnson K, Milgrew MJ, Edwards M, Hoon J, Simons JF, Marran D, Myers JW, Davidson JF, Branting A, Nobile JR, Puc BP, Light D, Clark TA, Huber M, Branciforte JT, Stoner IB, Cawley SE, Lyons M, Fu Y, Homer N, 58 Sedova M, Miao X, Reed B, Sabina J, Feierstein E, Schorn M, Alanjary M, Dimalanta E, Dressman D, Kasinskas R, Sokolsky T, Fidanza JA, Namsaraev E, McKernan KJ, Williams A, Roth GT, Bustillo J, (2011) “An integrated semiconductor device enabling non-optical genome sequencing”.Nature 475(7356): 348-352 52 Rolf Daniel, (2005)“The metagenomics of soil” Nat Rev Microbiol.3(6):470-488 53 Rusch DB, Halpern AL, Sutton G, Heidelberg KB, Williamson S, et al The Sorcerer II Global Ocean Sampling Expedition: Northwest Atlantic through Eastern Tropical Pacific PLoS Biology 5: e77 (2007) 54 Rusk N, (2011) “Torrents of sequence” Nat Meth 8(1): 44-44 55 Slonczewski JL, Foster JW (2014) Microbiology: An Evolving Science (3rd ed.) W W Norton & Company pp 742–3 56 Tamilarasi, S., Lakshmanaperumalsamy, microorganismsof Nanthakumar, (2008) selected K., Karthikeyan, “Diversity medicinal plants of root and K., and associated influence of rhizomicroorganisms on the antimicrobial property of Coriandrum sativum” J Environ Biol 29, 127-134 57 Thomas, T., J Gilbert, and F Meyer, (2012) “Metagenomics - a guide from sampling to data analysis” Microb Inform Exp 2(1): p 58 Torsvik, V., Daae, F L., Sandaa, R.-A & Øvreås, L Microbial diversity and function in soil: from genes to ecosystems Curr Opin Microbiol 5, 240– 245 (2002) 59 Turnbaugh PJ, Ley RE, Hamady M, Fraser-Liggett CM, Knight R, et al The Human Microbiome Project Nature 449: 804–810 (2007) 59 60 Tringe SG, von Mering C, Kobayashi A, Salamov AA, Chen K, et al Comparative metagenomics of microbial communities Science 308: 554–557 (2005) 61 Tyson, GW; Chapman J, Hugenholtz P, Allen EE, Ram RJ, Richardson PM, Solovyev VV, Rubin EM, Rokhsar DS, Banfield JF () "Insights into community structure and metabolism by reconstruction of microbial genomes from the environment" Nature 2004, 428 (6978): 37–43 62 Schmeisser, C., Steele, H and Streit, W.R (2007) Metagenomics, biotechnology with nonculturable microbes Appl Microbiol Biotechnol 75, 955–962 63 Sylvia, D M and Chellemi, D O., (2001) “Interactions among rootinhabiting fungi and their implications for biological control of root pathogens” Adv Agron 73, 1-33 64 Venter, JC; Remington K, Heidelberg JF, Halpern AL, Rusch D, Eisen JA, Wu D, Paulsen I, Nelson KE, Nelson W, FOTUs DE, Levy S, Knap AH, Lomas MW, Nealson K, White O, Peterson J, Hoffman J, Parsons R, BadenTillson H, Pfannkoch C, Rogers Y, Smith HO (2004) "Environmental Genome Shotgun Sequencing of the Sargasso Sea" Science 304 (5667): 66–74 65 Visi DK, D'Souza N, Ayre BG, Webber Iii CL, Allen MS, (2013) “Investigation of the bacterial retting community of kenaf (Hibiscus cannabinus) under different conditions using next-generation semiconductor sequencing” J Ind Microbiol Biotechnol 40(5): 465-475 66 Vogel U, Szczepanowski R, Claus H, Jünemann S, Prior K, Harmsen D, (2012)“Iontorrent personal genome machine sequencing for genomic typing of Neisseria meningitidis for rapid determination of multiple layers of typing information” J Clin Microbiol.50(6): 1889-1894 67 Whiteley AS, Jenkins S, Waite I, Kresoje N, Payne H, Mullan B, Allcock R, O'Donnell A, (2012) “Microbial 16S rRNA Ion Tag and community 60 metagenome sequencing using the IonTorrent (PGM) Platform”.J Microbiol Methods 91(1):80-88 68 Woese, C R., (1987) “Bacterial evolution” Microbiol Rev 51, 221– 271 69 Wolfgang, K., Erich, C., Brigitte, K., (2002) “Microbial contamination of medicinal plants: A review” Planta Medica 68, 5-15 70 Yergeau E, Lawrence JR, Sanschagrin S, Waiser MJ, Korber DR, Greer CW, (2012) “Next-generation sequencing of microbial communities in the Athabasca River and its tributaries in relation to oil sands mining activities” Appl Environ Microbiol 78(21): 7626-37 61 ... đề tài nghiên cứu Ứng dụng kĩ thuật metagenomics nghiên cứu hệ vi sinh vật vùng rễ cà phê huyện Cư M’gra tỉnh Đăk Lăk Mục tiêu nghiên cứu Đánh giá cấu trúc hệ vi khuẩn đất vùng rễ cà phê bước... thiệu hệ vi sinh vật 1.2.2 Vi sinh vật đất vùng rễ 1.3 Công nghệ metagenomics ứng dụng nghiên cứu đa dạng di truyền hệ vi sinh vật đất 1.4 Các bước ứng dụng công nghệ... loài hệ vi khuẩn đất vùng rễ cà phê Địa điểm nghiên cứu Phòng Cơng nghệ Tế bào Thực vật – Vi n Công nghệ Sinh học – Vi n Hàn lâm Khoa học Vi t Nam CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cây cà phê tình