CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU - ORIGINAL PAPERS CHẨN ĐỐN VI KHUẨN BODERTELLA PERTUSSIS TRỰC TIẾP TỪ BỆNH PHẨM LÂM SÀNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP KHUẾCH ĐẠI GEN TẠI VIỆT NAM Hoàng Thị Thu Hà1*, Nguyễn Thùy Trâm1, Phạm Thanh Hai1, Lương Minh Hòa1, Nguyễn Thị Anh Xn2, Hồng Thị Bích Ngọc3, Vũ Ngọc Hà4, Đặng Đức Anh1 Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương, Hà Nội Bệnh viện Việt Nam- Cu Ba, Hà Nội Bệnh viện Nhi Trung ương, Việt Nam Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia, Hà Nội TĨM TẮT Ho gà, bệnh đường hơ hấp, vi khuẩn Bodertella pertussis gây ra, dễ lây nhiễm, đe dọa tính mạng ngun nhân gây bệnh tử vong trẻ em, đặc biệt trẻ tháng tuổi Ở Việt Nam, việc tiêm vắc xin phòng bệnh ho gà triển khai nhiều năm, số ca mắc ho gà xuất hiện, có xu hướng mắc trẻ trưởng thành người lớn với triệu chứng ho cấp tính mạn tính.Phương pháp PCR xác định vi khuẩn cặp mồi đặc hiệu BP-1 BP2-MOD (thiết kế dựa vào IS481- trình tự cài) có ngưỡng phát 1vk/ pư, độ đặc hiệu cao sử dụng để chẩn đoán trực tiếp từ bệnh phẩm lâm sàng Kết cho thấy 23,5% (24/102) bệnh nhi nghiên cứu dương tính với PCR, bao gồm trẻdưới tháng tuổi (33,3%), tiêm phòng chưa đủ liều (58,3%) tiêm đủ liều theo lịch tiêm chủng (8,3%) Hầu hết trẻ điều trị kháng sinh nhập viện với triệu chứng khơng điển hình Vì vậy, để chẩn đoán phát bệnh ho gà sớm, bác sĩ cần quan tâm đến bệnh nhân có triệu chứng ho kéo dài và/hoặc sốt Trong tương lai, việc áp dụng PCR chẩn đoán bệnh ho gà phòng xét nghiệm bệnh viện cần thiết khả thi Từ khóa: B.pertussis, bệnh nhi, PCR, tiêm chủng mở rộng, Việt Nam I ĐẶT VẤN ĐỀ Ho gà bệnh lây nhiễm cao, thường biểu cấp tính đường hô hấp, gây nên vi khuẩn Bordetella pertussis, trực khuẩn Gram âm [1] Bệnh thường gặp trẻ nhỏ với triệu chứng điển ho kịch phát, làm trẻ khó thở, thở nhanh, kèm theo tiếng rít ”whoop” cuối ho, dễ gây tử vong khơng chẩn đốn điều trị kịp thời [2] Gần đây, nghiên cứu rarằng tỷ lệ mắc bệnh tăng trở lại có biểu nhiễm bệnh trẻ vị thành niên người lớn, nước phát triển thực chương trình tiêm phòng đầy đủ [3] Các triệu chứng biểu thường khơng điển hình kết hợp với bội nhiễmcác vi khuẩn khác Hemophilus influenzae, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae, gây khó khăn cho việc chẩn đốn, dẫn đến nguy lây lan cho cộng đồng Theo số liệu Tổ chức Y tế Thế giới ước tính, năm 2008 tỷ lệ mắc ho gà khoảng 16 triệu trường hợp, 95% nước phát triển, xấp xỉ 195.000 trường hợp chết ho gà Tỷ lệ chết / mắc (CFR) nước phát triển cao, khoảng 4% trẻ nhũ nhi Hầu hết trường hợp mắc Châu Phi, Tây Thái Bình Dương Đông Nam Á [3] Theo kinh điển, ho gà chẩn đốn phương pháp ni cấy, huyết học, huỳnh quang trực tiếp Các phương pháp không thiết thực cho chẩn đoán sớm bệnh bị ảnh hưởng số yếu tố: Chất lượng mẫu bệnh phẩm,thời gian vận chuyển bệnh phẩm, việc tiêm phòng hay sử dụng kháng sinh trước *Tác giả: Hoàng Thị Thu Hà Ngày nhận bài: 22/10/2014 Địa chỉ: Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương Ngày phản biện: 02/12/2014 Điện thoại: 0904126943 Ngày đăng bài: 31/12/2014 Email: hoangha.nihe@gmail.com Tạp chí Y học dự phòng, Tập XXIV, Số 11 (160) 2014 [4] Gần đây, nhiều nghiên cứu cơng bố PCR xác định vi khuẩn B.pertussis cặp mồi đặc hiệu BP-1 BP2-MOD (thiết kế dựa IS481- trình tự cài) có ngưỡng phát 1vk/pư, độ đặc hiệu cao (không phản ứng chéo với vi khuẩn gây viêm đường hô hấp) sử dụng rộng rãi chẩn đoán [ 4, 5, 7, 11] Ở Việt Nam, tỉ lệ bệnh ho gà giảm sau thực chương trình tiêm chủng mở rộng, xuất ca bệnh trẻ tháng tuổi từ 6-12 tuổi Năm 2011, 105 ca ho gà báo cáo số ca bệnh năm 2012 gần tương tự với 98 ca Trong số này, 50 % số ca bệnh trẻ tuổi, 10% đối tượng 15 tuổi Tuy nhiên, số liệu thu thập từ ca bệnh chẩn đoán dựa vào dấu hiệu lâm sàng Hơn nữa, kỹ thuật chẩn đốn phòng thí nghiệm ni cấy, huyết học thường âm tính bệnh nhân tự điều trị kháng sinh dài ngày phát kháng thể IgG (khó phân biệt với kháng thể sinh việc tiêm phòng vắc xin) Mặc dù phòng thí nghiệm thực kỹ thuật sinh học phân tử chẩn đoán nhiều tác nhân gây bệnh PCR chưa ứng dụng chẩn đoán B pertussis Vì vậy, nghiên cứu này, chúng tơi tiến hành xác định tỉ lệ bệnh nhi mắc bệnh ho gà số bệnh viện Hà Nội kỹ thuật PCR, góp phần phát sớm bệnh tăng hiệu điều trị, tránh lây lan cộng đồng II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Mẫu bệnh phẩm tiêu chuẩn chọn Từ tháng đến tháng 12/2013,cácmẫu dịch tỵ hầu thu thập từ bệnh nhi tuổi 6-12 tuổi bệnh viện Việt Nam – Cu Ba, Nhi Trung ương với triệu chứng: sốt, ho kéo dài, ho cơn, chảy nước mũi Các mẫu bệnh phẩm xử lý, tách ADN thực phản ứng PCR với cặp mồi BP1/BP2-MOD (IS481151bp) [6] Các mẫu bệnh phẩm lấy stăm vô trùng theo thường qui bệnh viện, cho vào týp vơ trùng có nắp, vận chuyển Phòng xét nghiệm vi khuẩn đặc biệt, Khoa Vi khuẩn, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương điều kiện nhiệt độ15-250C ngày 2.2 Chủng vi khuẩn quốc tế Chủng vi khuẩn B.pertussis: chủng B.pertussis ATCC®9340 (nguồn MediMark® Europe, Pháp) nuôi cấy, tách ADN làm chứng dương cho phản ứng PCR 2.3 Phân tích phòng thí nghiệm 2.3.1 Ni cấy Chủng B.pertussis ATCC®9340được ni cấy mơi trường Charcoal có 10% v/v máu cừu 40mg/mlkháng sinh cephalexin (Thermo Scientific), để điều kiện ẩm, 350C-370C từ 3-5 ngày Sau quan sát thấy khuẩn lạc mọc, chọn khuẩn lạc điển hình tiến hành định danh nhuộm Gram, thử nghiệm oxidase, catalase (BioMerieux, Pháp) 2.3.2 Tách chiết ADN Chủng vi khuẩn: Khuẩn lạc B.pertussis môi trường nuôi cấy cho vào týp effendorf 1,5 ml chứa 1ml muối sinh lý 0,85% vô trùng Trộn máy votex tạo huyền dịch Nồng độ vi khuẩn xác định 1,5x 108vk/ml, ủ nhiệt độ từ 95-990C/30 phút, ly tâm 8000 vòng/ phút phút Hút lấy phần dịch nổi, sử dụng làm chứng dương cho phản ứng PCR Bệnh phẩm lâm sàng: Tăm lấy bệnh phẩm chuyển từ týp vận chuyển sang týp eppendorf 1,5 ml chứa 1ml nước muối sinh lý 0,85% vơ trùng Ủ nhiệt độ phòng phút Sau lắc nhẹ 60giây, bỏ phần tăm bơng (sử dụng kẹp vô trùng gắp), chia làm týp Tiếp tục ủ týp thứ nhiệt độ từ 95-990C 60 phút Làm nguội nhiệt độ phòng phút Ly tâm 8000 vòng/phút phút Hút lấy phần dịch nổi, sử dụng làm ADN cho phản ứng PCR Týp thứ hai tiến hành tách ADN theo thường qui kít tách chiết QIAamp mini kit (QIAgen, Đức) 2.3.3 PCR phát IS481 PCR phát có mặt ADN B.pertussis mẫu bệnh phẩm sử dụng cặp mồi đặc hiệu thiết kế dựa vùng thuộcchuỗi trình tự cài (IS 481) B.pertussis với kích thước sản phẩm PCR 151 bp là: BP-1 (GATTCAATAGGTTGTATGCATGGTT) BP2MOD (TGGACCATTTCGAGTCGACG) [6] PCR sử dụng cặp mồi BP1/BP2-MOD có thành phần phản ứng gồm: 10µl Taq PCR master mix (QIAgen, Đức), 1µl loại mồi Tạp chí Y học dự phòng, Tập XXIV, Số 11 (160) 2014 (nồng độ 20pM), µl ADN khuôn µl nước tinh Chu trình nhiệt: 950C phút; 35 chu kỳ gồm 950C 15 giây, 560C 15 giây, 720C 15giây; chu kỳ 720C 10 phút [6] µl sản phẩm PCR điện di thạch agarose 1,5% dung dịch đệm TBE 0.5X (Invitrogen) 100V/45 phút, nhuộm thạch dung dịch SYBR®Safe (Invitrogen) chụp ảnh gel ánh sáng tia UV gà: chảy nước mũi, ho nhiều cơn, ho kéo dài (>7 ngày), mặt đỏ, sốt, nôn, 25 bệnh nhi tháng tuổi chưa tiêm vắc xin phòng bệnh Hầu hết bệnh nhi điều trị kháng sinh nhà (thời gian điều trị ngày) đến khám sau tuần xuất triệu chứng khởi phát Duy trường hợp chưa dùng kháng sinh bệnh nhi bệnh viện Nhi Trung ương 24 ngày tuổi, có triệu chứng ho liên tục cơn, mặt đỏ, sốt nhẹ, suy hô hấp độ Kết nghiên cứu cho thấy 23,5% (24/102) trường hợp dương tính với PCR-B.pertussis Tuy nhiên, khơng có khác biệt kết PCR sử dụng ADN tách từ mẫu bệnh phẩm phương pháp nhiệt (ủ 980C/30 phút) vàsử dụng kít thương mại (QIAamp, Đức) (Hình1) III KẾT QUẢ 102 mẫu bệnh phẩm thu thập bao gồm 92 mẫu từ bệnh nhi tháng tuổi 10 mẫu trẻ 2-12 tuổi Trong 75 bệnh nhi có triệu chứng giống bệnh lý lâm sàng bệnh ho z1 10 11 12 13 500bp 151bp Hình Kết PCR sử dụng cặp mồi BP1/BP2-MOD phân tích ADN tách phương pháp nhiệt kít thương mại (QIAamp) Đường 1: 100 bp ladder; Đường 2: chứng âm; Đường 3: B pertussis ATCC®9340; Đường 4: BP25VNCB-13 (ADN tách kít); Đường 5: BP25VNCB-13 (ADN tách nhiệt); Đường 6: BP56-NPH-13(ADN tách kít); Đường 7: BP56-NPH-13 (ADN tách nhiệt); Đường 8: BP69VNCB-13(ADN tách kít); Đường BP69VNCB-13 (ADN tách nhiệt), Đường 10: BP76VNCB-13 (ADN tách kít); Đường 11: 10 BP76VNCB-13 (ADN tách nhiệt); Đường 12: BP92VNCB-14(ADN tách kít); Đường 13: BP92VNCB-14 (ADN tách nhiệt) Tất bệnh nhi xác định PCR dương tính có biểu ho cơn, ho kéo dài, 41.7% (10/24) có triệu chứng ho kèm theo sốt viêm long đường hô hấp, bệnh nhi với triệu chứng ho kéo dài, viêm long đường hô hấp, nôn (25%) bệnh nhi có triệu chứng sốt kèm ho (16.7%) (Bảng 1) Tạp chí Y học dự phòng, Tập XXIV, Số 11 (160) 2014 Bảng Kết PCR bệnh phẩm lâm sàng PCR (+) PCR (-) Tổng cộng (N) (N) (N) Ho cơn, ho kéo dài 10 Sốt + ho cơn, ho kéo dài + viêm long 10 10 20 Ho cơn, ho kéo dài + viêm long + nôn 14 20 Sốt + ho cơn, ho kéo dài 48 52 24 78 102 Tổng cộng Trong trường hợp PCR dương tính có 33,3% (8/24) trẻ chưa tiêm chủng vắc xin phòng Bạch hầu – Ho gà – Uốn ván – Bại liệt; 58.3% (14/24) trẻ chưa tiêm phòng đủ mũi vắc xin 8.3% (2/24) trẻ tiêm đủ mũi nhắc lại mũi vào lúc tuổi (Bảng 2) Bảng Kết PCR tình trạng tiêm phòng vắc xin bệnh nhi Tiền sử tiêm chủng Chưa tiêm vắc xin (N) Tiêm chưa đủ liều vắc xin (N) Tiêm đủ liều vắc xin (N) Tiêm đủ liều vắc xin + mũi lúc tuổi (N) Tổng số (N) PCR dương tính 14 1 24 PCR âm tính 23 33 14 78 Tổng số 31 47 15 102 IV BÀN LUẬN có nghiên cứu cho PCR sử dụng cặp mồi thiết kế dựa vùng trình tự cài đặc hiệu cho Trên giới, việc tiêm vắc xin B pertussis (IS481) có phản ứng chéo với B phòng bệnh thực tốt số ca mắc ho gà ngày tăng xuất đối holmesii [9] Trong nghiên cứu bệnh nhân tượng thiếu niên người lớn Tuy nhiên, mắc ho gà Hà Lan Đan Mạch cho thấy B tỉ lệ mắc tử vong chủ yếu đối tượng holmessi nguyên nhân gây bệnh trẻ tuổi Trong số ca nhập viện, nhóm trẻ người [8,9] Hầu hết phòng thí nghiệm tuổi chiếm tỉ lệ cao nhất, dễ biến chứng sử dụng PCR với cặp mồi thiết kế thuộc IS481 tử vong nhóm chưa tiêm vắc xin cho độ nhạy cao thấy liên quan B holmessi với nhiễm trùng người phòng bệnh đầy đủ [7] chưa rõ ràng [8, 9] Hơn nữa, nhiều nghiên cứu Gần đây, việc phát axít nucleic sử dụng cơng cụ chẩn đốn PCR tiến hành với 14 chủng phòng thí nghiệm vi sinhs y học PCR coi B.bronchiseptica, chủng B parapertussis làkỹ thuật triển khai rộng rãi độ chủng B pertussis, cho thấy đoạn ADN nhạy đặc hiệu cao tính đa dạng 151bp xác định với ADN khn [7] Hiện phòng thí nghiệm vi sinh y B pertussis Theo kết nghiên cứu năm học Việt Nam trang bị đầy đủ 2008, nhóm tác giả đãchỉ raPCR sử dụng cặp hệ thống PCR phục vụ chẩn đoán tác nhân mồi BP1/BP2-MOD thiết kế dựa gây bệnh.Tuy nhiên, nhiều phòng thí nghiệm vùng IS481, đảm bảo độ nhạy phương pháp bệnh viện, việc chẩn đoán tác nhân gây bệnh phát tác nhân với 1vk/phản ứng độ kỹ thuật chưa phổ biến, đặc biệt với vi đặc hiệu cặp mồi BP1/BP2-MOD cho khuẩn B pertussis trình khuếch đại B pertussis mẫu ADN Do giống đặc điểm gen của vi khuẩn gây bệnh hô hấp khác lồi Bordetella gây nhiễm trùng đường hơ hấp K pneumoniae, H influenzae, M pneumoniae, S người nên việc chọn lựa đoạn gen đặc pneumoniae cho kết âm tính với PCR hiệu để phát lồilà quan trọng sử dụng cặp mồi [10] Trong nghiên cứu Vùng trình tự cài IS481 có tới 80-100 chép này, mẫu ADN sử dụng để khuếch đại trong gen B.pertussis [8] Tuy nhiên, phản ứng PCR cho thấy khơng có khác 11 Tạp chí Y học dự phòng, Tập XXIV, Số 11 (160) 2014 biệt việc tách chiết kít thương mại tách nhiệt (Hình 1) Do vậy, việc sử dụng phương pháp nhiệt để tách ADN trực tiếp từ bệnh phẩm dịch tỵ hầu thay cho việc sử dụng kít thương mại, góp phần giảm giá thành thời gian chẩn đoán bệnh Việc sử dụng PCR cho chẩn đốn B pertussis phát sớm bệnh ho gà vòng 1-2 ngày, đặc biệt nhóm trẻ sơ sinh [ 7, 11], B.pertussis vi khuẩn khó phân lập phòng thí nghiệm [ 4, 6, 7] Phương pháp ni cấy huyết học phát vi khuẩn tuần thứ bệnh, khó xác định bệnh nhân dùng kháng sinh và/hoặc tiêm phòng trước [7] Hơn nữa, trẻ nhỏ năm tuổi nhóm tuổi chưa tiêm phòng vắc xin đầy đủ, triệu chứng lâm sàng thường biểu khơng điển hình Do vậy, đây, PCR coi phương pháp chẩn đoán nhanh B.pertussis có độ nhạy so với ni cấy huyết học [1, 4, 6] Mặt khác, PCR bị ảnh hưởng xác định tác nhân đối tượng dùng kháng sinh Kết nghiên cứu nàycho thấy 23,5% PCR dương tính với B.pertussis chứng tỏ PCR có giá trị phát bệnh giai đoạn muộn; bệnh nhi độ tuổi > tuổi; bệnh nhân điều trị kháng sinh bệnh nhi tiêm phòng vắc xin Thơng thường, trường hợp này, số lượng vi khuẩn tập trung vùng hầu họng thấp, việc sử dụng kháng sinh ảnh hưởng đến phát triển vi khuẩn nên kết chẩn đoán ni cấy thường âm tính [7] Trong đó, PCR sử dụng cặp mồi BP1/BP2-MOD có khả phát tác nhân với ngưỡng phát 1vk/pứ vi khuẩn tình trạng sống chết Điều chứng minh nghiên cứu tỉ lệ phát B.pertussis bệnh nhi điều trị kháng sinh (95,8%) tiêm phòng vắc xin (62,5%) Mặt khác, kết nghiên cứu cho thấy 100% bệnh nhi có PCR dương tính có triệu chứng lâm sàng ho cơn, kéo dài, 41.7% bệnh nhi có biểu ho kèm sốt viêm long đường hô hấp Không thấy khác biệt nhóm bệnh nhi PCR dương tính âm tính biểu lâm sàng có ho cơn, ho kéo dài Nhóm bệnh nhi có triệu chứng sốt, kèm ho cơn, ho kéo dài tỉ lệ PCR dương 12 tính chiếm 7,7% (4/52) Điều chứng tỏ, tỉ lệ bệnh nhi mắc ho gà phổ biến so với bệnh viêm nhiễm đường hơ hấp khác Tuy nhiên, việc chẩn đốn bệnh giúp bác sĩ lâm sàng sàng lọc để đưa phác đồ điều trị phù hợp Mặt khác, việc phát bệnh nhi tiêm phòng vắc xin có triệu chứng lâm sàng kết PCR dương tính với B.pertussis cần tiếp tục theo dõi, nghiên cứu sâu với số mẫu lớn để có kết luận cụ thể, xác Thêm nữa, thông thường trẻ nhỏ không biểu triệu chứng điển hình bệnh ho gà, bác sĩ lâm sàng lưu tâm đến bệnh yêu cầu xét nghiệm sớm khả chẩn đốn sàng lọc cao, giúp tăng hiệu điều trị, phòng ngừa bệnh lây lan cộng đồng, bổ sung số liệu cho cơng tác giám sát bệnh dịch Ngồi ra, với biến đổi triệu chứng lâm sàng bệnh, ho gà cần quan tâm để chẩn đốn trẻ trưởng thành người lớn có triệu chứng hokéo dài [12] Đồng thời, việc chẩn đoán phân biệt bệnh ho gà bệnh nhiễm trùng hô hấp tác nhân khác cần thiết Trong trường hợp này, PCR rõ ràng công cụ chẩn đoán nhanh, đơn giản hữu hiệu Tuy nhiên, bệnh nhân có kết PCR dương tính cần có kết hợp với triệu chứng lâm sàng để đưa định xác kết hợp với kết huyết học V KẾT LUẬN Bằng kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi BP1/ BP2-MOD thuộc vùng IS481 B.pertussis, 23,5% bệnh nhi có biểu viêm đường hơ hấp chẩn đoán mắc bệnh ho gà mộ số bệnh viện Hà Nội Trong tương lai, việc áp dụng PCR chẩn đốn bệnh ho gà phòng xét nghiệm bệnh viện cần thiết khả thi Thêm nữa, việc phát triển PCR đa mồi để phát B.pertussis tác nhân vi khuẩn gây bệnh hô hấp phản ứng hướng nghiên cứu cần quan tâm Lời cảm ơn: Nhóm tác giả chân thành cám ơn cán y tế khoa Nhi, khoa Hô hấp, bệnh viện Việt Nam Cu Ba bệnh viện Nhi Trung ương hỗ trợ cho việc thu thập mẫu bệnh phẩm Tạp chí Y học dự phòng, Tập XXIV, Số 11 (160) 2014 TÀI LIỆU THAM KHẢO Cherry JD1, G.E., Guiso N, Heininger U, Mertsola J, Defining pertussis epidemiology: Clinical, microbiologic and serologic perspectives Pediatr Infect Dis 2005, 24 (5 Suppl): 25-34 Jusot, V., et al., Prevalence of Bordetella infection in a hospital setting in niamey, niger J Trop Pediatr, 2014 60(3): 223-30 WHO, Pertussis vaccines: WHO position paper Wkly Epidemiol Rec., 2010 85(40): 385-400 Fry, N.K., et al., Laboratory diagnosis of pertussis infections: the role of PCR and serology J Med Microbiol, 2004 53(Pt 6): 519-525 J R Lingappa, W.L., S West-Keefe , Diagnosis of Community-Acquired Pertussis Infection: Comparison of Both Culture and Fluorescent-Antibody Assays with PCR Detection Using Electrophoresis or Dot Blot Hybridization Journal of Clinical Microbiology 2002, p 2908–2912 Vol 40, No 8., 2002 40(8): 2908–2912 Dragsted, D.M., et al., Comparison of culture and PCR for detection of Bordetella pertussis and Bordetella parapertussis under routine laboratory conditions J Med Microbiol, 2004 53(Pt 8): 749-754 Leber, A.L., Pertussis: Relevant Species and Diagnostic Update Clin Lab Med, 2014 34(2): 237-255 Cherry., S.M.a.J.D., Molecular Pathogenesis, Epidemiology, and Clinical Manifestations of Respiratory Infections Due to Bordetella pertussis and Other Bordetella Subspecies Clinical Microbiology Reviews, 2005 18(2): 326-382 Van Loo Inge HM, M.F., Changes in the Dutch Bordetella pertussis population in the first 20 years after the introduction of whole-cell vaccines Microbiology, 2002 148: 2011-2018 10 H.T.T.H., Ứng dụng kỹ thuật PCR chẩn đoán vi khuẩn Bodertella pertussis Việt Nam Đề tài cấp Viện, 2008 11 Heininger, U., et al., A controlled study of the relationship between Bordetella pertussis infections and sudden unexpected deaths among German infants Pediatrics, 2004 114(1): 9-15 12 De Schutter, I., et al., Molecular typing of Bordetella pertussis isolates recovered from Belgian children and their household members Clin Infect Dis, 2003 36(11): 1391-1396 DIRECT PCR FOR DETECTION OF BORDETELLA PERTUSSIS FROM CLINICAL SPECIMENS IN VIETNAM Hoang Thi Thu Ha1, Nguyen Thuy Tram1, Pham Thanh Hai1, Luong Minh Hoa1 Nguyen Thi Anh Xuan2, Hoang Thi Bich Ngoc3, Vu Ngoc Ha4, Dang Duc Anh1 National Institute of Hygiene and Epidemiology, Hanoi, Vietnam Vietnam-Cuba Hospital, Hanoi, Vietnam National Peadiatric Hospital, Hanoi, Vietnam Medical Faculty, National University, Hanoi, Vietnam Pertussis, caused by Bordetella pertussis, is a highly contagious, potentially life-threatening respiratory illness and a major cause of childhood morbidity and mortality, especially in children under months of age Despite the long history of pertussis vaccination in Vietnam, thenumber ofreportedpertussiscasesstill occur and and tend to appear in adolescents or adults with acute or chronic cough A conventinal PCR using specific primers BP1 and BP2MOD (based on IS481- insertion sequence) has performed to detect B.pertussis directly from clinical specimens, with adetection threshold 1bact./reaction, and high specificity.The result showed 23.5% (28/102) of pediatric patients were B.pertussis -PCR positive, including children were less than months (33,3%), not fully immunized (58,3%) and completely vaccination schedule (8,3%) Most of the children presented atypical symptoms and treated by antibiotics when they hospitalized For the purpose of early diagnosis, therefore, the general practitioners should be considered in patientswith persistent cough and/or fever In the future, the performance of B pertussis - PCR in the hospital laboratories is necessary and feasible Keywords: B.pertussis, pediatric patients, PCR, Expanded Immunization Program, Vietnam 13 Tạp chí Y học dự phòng, Tập XXIV, Số 11 (160) 2014 ... Thi Bich Ngoc3 , Vu Ngoc Ha4 , Dang Duc Anh1 National Institute of Hygiene and Epidemiology, Hanoi, Vietnam Vietnam-Cuba Hospital, Hanoi, Vietnam National Peadiatric Hospital, Hanoi, Vietnam Medical... dụng phương pháp nhiệt để tách ADN trực tiếp từ bệnh phẩm dịch tỵ hầu thay cho việc sử dụng kít thương mại, góp phần giảm giá thành thời gian chẩn đoán bệnh Việc sử dụng PCR cho chẩn đốn B pertussis. .. B .pertussis: chủng B .pertussis ATCC® 934 0 (nguồn MediMark® Europe, Pháp) nuôi cấy, tách ADN làm chứng dương cho phản ứng PCR 2 .3 Phân tích phòng thí nghiệm 2 .3. 1 Ni cấy Chủng B .pertussis ATCC® 934 0được