KHẢO SÁT TÌNH HÌNH NHIỄM LEPTOSPIRA TRÊN BÒ SỮA Ở MỘT SỐ QUẬN HUYỆN THUỘC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NĂM 2007

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH . KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT TÌNH HÌNH NHIỄM LEPTOSPIRA TRÊN BÒ SỮA Ở MỘT SỐ QUẬN HUYỆN THUỘC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NĂM 2007 Họ và tên sinh viên: ĐOÀN LÊ VI UYÊN Ngành: THÚ Y Niên khóa: 20022007 Tháng 102007 i KHẢO SÁT TÌNH HÌNH NHIỄM LEPTOSPIRA TRÊN BÒ SỮA Ở MỘT SỐ QUẬN, HUYỆN THUỘC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NĂM 2007 Tác giả ĐOÀN LÊ VI UYÊN Khóa luận được đề trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng (Bác sỹ) ngành Thú y Giáo viên hướng dẫn: TS. LÊ ANH PHỤNG BSTY. HUỲNH THỊ THU HƯƠNG Tháng 10 năm 2007 ii XÁC NHẬN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN Họ và tên sinh viên thực tập: Đoàn Lê Vi Uyên Tên luận văn: “Khảo sát tình hình nhiễm Leptospira trên bò sữa ở một số quận, huyện thuộc Thành Phố Hồ Chí Minh năm 2007”. Đã hoàn thành luận văn theo yêu cầu của giáo viên hướng dẫn và các ý kiến nhận xét, đóng góp của hội đồng thi tốt nghiệp ngày 30112007. Giáo viên hướng dẫn Tiến Sĩ Lê Anh Phụng iii LỜI CẢM TẠ Gởi đến Cha Mẹ và gia đình Ông Bà, Cha Mẹ suốt đời hy sinh vất vả, để yêu thương dạy dỗ lo lắng cho con chấp cánh vào đời. Các Cô, Bác, Dì Dượng, Anh Chị đã hết lòng động viên, giúp đỡ cho con được như ngày hôm nay. Chân thành cám ơn Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Quý Thầy Cô Khoa Chăn Nuôi Thú Y Đã tận tình dạy dỗ, truyền đạt kiến thức quý báu, kinh nghiệm thực tiễn cho chúng tôi trong suốt quãng đời sinh viên để làm hành trang vào đời. Chân thành biết ơn Tiến Sĩ Lê Anh Phụng Đã hết lòng dạy bảo giúp đỡ và hướng dẫn chúng tôi trong suốt thời gian học tập và hoàn thành đề tài. BSTY Huỳnh Thị Thu Hương, ThS Đặng Thị Thu Hường, BSTY Nguyễn Thị Thu Thảo, BSTY Nguyễn Phúc Bảo Phương. Đã tận tình giúp đỡ chỉ dẫn chúng tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp và hoàn thành luận văn này. Chân thành cảm ơn Ban Lãnh Đạo Chi Cục Thú Y Thành Phố Hồ Chí Minh Các Anh Chị Phòng Chẩn Đoán Xét Nghiệm và Điều Trị Đã tạo điều kiện thuận lợi và tận tình giúp đỡ cho chúng tôi trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp. Cám ơn các bạn tập thể lớp Thú Y19, tất cả những người thân, người bạn của tôi, đã giúp đỡ chia sẽ những khó khăn và động viên tôi trong quá trình học tập và hoàn thành tốt nghiệp. ĐOÀN LÊ VI UYÊN iv TÓM TẮT Đề tài nghiên cứu: “Khảo sát tình hình nhiễm Leptospira trên bò sữa ở một số quận, huyện thuộc Tp. Hồ Chí Minh năm 2007” được tiến hành tại Trạm Chẩn Đoán Xét Nghiệm và Điều Trị Chi Cục Thú Y Tp. Hồ Chí Minh, thời gian từ 042007 đến 082007. Xét nghiệm 528 mẫu huyết thanh bò sữa bằng phản ứng vi ngưng kết (MAT), với bộ kháng nguyên gồm 23 serovar do viện Pasteur Tp. Hồ Chí Minh cung cấp. Kết quả thu được: Tỷ lệ nhiễm Leptospira trên bò sữa ở 8 quận, huyện thuộc Tp. Hồ Chí Minh là 28,80%. Tỷ lệ nhiễm Leptospira trên bò sữa cao nhất là ở khu vực III (Quận 12, Quận 9, Thủ Đức) 32,82%, kế đến là khu vực I (Bình Chánh, Bình Tân) 27,17% và thấp nhất là khu vực II (Tân Bình, Tân Phú, Gò Vấp) 18,18%. Tỷ lệ nhiễm Leptospira trên bò sữa theo quy mô chăn nuôi cao nhất ở những hộ >20 conhộ (35,80%), kế đến là quy mô chăn nuôi 5 10 conhộ (29,65%), < 5 con (22,22%) và thấp nhất là 11 20 conhộ (20,80%). Qua phân tích thống kê cho thấy tỷ lệ nhiễm Leptospira theo nhóm máu lai của bò sữa F1, F2 và F3 khác biệt không có ý nghĩa. Tỷ lệ nhiễm Leptospira theo lứa đẻ: bò đẻ trên 3 lứa có tỷ lệ cao nhất (46,43%) và thấp nhất là bò tơ (19,12%). Đã phát hiện 8 serovar nhiễm trên bò sữa ở 8 quận, huyện thuộc Tp. Hồ Chí Minh với 2 serovar chiếm tỷ lệ cao nhất là hebdomadis (45,21%) và hadrjo hadrjo bovis (44,22%). Đã phát hiện 5 serovar nhiễm nhiều nhất trên một cá thể bò sữa, tập trung cao là nhóm 2 serovar trên cá thể (70,39%). Hiệu giá kháng thể ngưng kết với Leptospira tập trung ở mức 1100 1400 có tỷ lệ cao nhất (72,37%). v MỤC LỤC Trang Trang tựa ............................................................................................................................. i Xác nhận của giáo viên hướng dẫn ..................................................................................... ii Lời cảm tạ ........................................................................................................................... iii Tóm tắt ................................................................................................................................ iv Mục lục ................................................................................................................................ v Danh sách các chữ viết tắt .................................................................................................. iv Danh sách các hình và danh sách các biểu đồ .................................................................... vi Danh sách các bảng ........................................................................................................... vii Chương 1. MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1 Chương 2. TỔNG QUAN .................................................................................................. 3 2.1 ĐẶC ĐIỂM CHUNG VÀ LỊCH SỬ PHÁT HIỆN BỆNH ........................................... 3 2.1.1 Khái niệm ................................................................................................................... 3 2.1.2 Lịch sử phát hiện bệnh do Leptospira ........................................................................ 3 2.2 CĂN BỆNH HỌC ......................................................................................................... 4 2.2.1 Phân loại học .............................................................................................................. 4 2.2.2 Hình thái và cấu tạo .................................................................................................... 4 2.2.3 Sự chuyển động .......................................................................................................... 5 2.2.4 Đặc điểm nuôi cấy và đặc tính sinh hoá ..................................................................... 6 2.2.5 Sức đề kháng .............................................................................................................. 6 2.2.6 Cấu trúc kháng nguyên, tính sinh miễn dịch và độc lực của Leptospira ................... 7 2.3 DỊCH TỄ HỌC .............................................................................................................. 8 2.3.1 Tình hình bệnh và phân bố địa lý ............................................................................... 8 2.3.1.1 Thế giới.................................................................................................................... 8 2.3.1.2 Việt Nam.................................................................................................................. 8 2.3.2 Loài cảm thụ trong tự nhiên ....................................................................................... 9 2.3.3 Chất chứa mầm bệnh ................................................................................................ 10 2.3.4 Đường xâm nhập ...................................................................................................... 10 2.3.5 Phương thức truyền lây ............................................................................................ 11 2.3.6 Cách sinh bệnh ......................................................................................................... 11 vi 2.4 TRIỆU CHỨNG .......................................................................................................... 12 2.4.1 Thể quá cấp tính ....................................................................................................... 12 2.4.2 Thể cấp tính .............................................................................................................. 12 2.4.3 Thể mãn tính ............................................................................................................. 13 2.5 BỆNH TÍCH ................................................................................................................ 13 2.6 CHẨN ĐOÁN ............................................................................................................. 13 2.6.1 Chẩn đoán lâm sàng .................................................................................................. 13 2.6.2 Chẩn đoán ở phòng thí nghiệm................................................................................. 14 2.6.2.1 Tìm Leptospira ...................................................................................................... 14 2.6.2.2 Chẩn đoán huyết thanh học ................................................................................... 15 2.7 PHÒNG BỆNH VÀ ĐIỀU TRỊ ................................................................................... 17 2.7.1 Phòng bệnh ............................................................................................................... 17 2.7.2 Điều trị ...................................................................................................................... 18 2.8 LƯỢC DUYỆT MỘT SỐ CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN .......... 19 Chương 3. NỘI DUNG (VẬT LIỆU) VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............ 20 3.1 Bố trí thí nghiệm ......................................................................................................... 21 3.1.1 Địa điểm ................................................................................................................... 21 3.1.2 Thời gian ................................................................................................................... 21 3.2 Các chỉ tiêu theo dõi .................................................................................................... 27 Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................................... 30 4.1 Tỷ lệ nhiễm Leptospira trên bò sữa ở 8 quận, huyện thuộc Tp. Hồ Chí Minh ........... 30 4.2 Tỷ lệ nhiễm Leptospira trên bò sữa theo từng khu vực chăn nuôi .............................. 30 4.3 Tỷ lệ nhiễm Leptospira trên bò sữa theo quy mô hộ chăn nuôi .................................. 33 4.4 Tỷ lệ nhiễm Leptospira trên bò sữa theo nhóm máu lai bò sữa Hà Lan ..................... 34 4.5 Tỷ lệ nhiễm Leptospira trên bò sữa theo lứa đẻ ........................................................ 36 4.6 Các serovar phát hiện được ......................................................................................... 37 4.7 Số serovar nhiễm trên cá thể bò sữa ............................................................................ 39 4.8 Hiệu giá kháng thể ngưng kết với Leptospira ............................................................. 41 Chương 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................................... 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................................... 46 PHỤ LỤC ......................................................................................................................... 49 vii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ctv: Cộng tác viên ELISA: Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay EMJH: Ellinghausent McCuluogh Johnson Harris IFAT: Immunofluorescen Test MAT: Microscopic Agglutination Test OIE: Office International des Epizooties. PCR: Polymerase Chain Reaction PBS: Phosphate Butffer Saline viii DANH SÁCH CÁC HÌNH Trang Hình 2.1 Hình dạng của Leptospira dưới kính hiển vi điện tử ............................................ 5 Hình 2.2 Cấu tạo của xoắn trùng Leptospira ....................................................................... 5 Hình 2.3 Sơ đồ vòng truyền lây của Leptospira ................................................................ 11 Hình 3.1 Sơ đồ phản ứng MAT định tính .......................................................................... 24 Hình 3.2 Thao tác đọc phản ứng MAT .............................................................................. 25 Hình 3.3 Đọc kết quả phản ứng MAT dưới KHV nền đen ............................................... 26 Hình 3.4 Sơ đồ phản ứng định lượng ................................................................................ 28 Hình 3.5 Kết quả phản ứng vi ngưng kết (MAT) .............................................................. 29 DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ Trang Biểu đồ 4.1 Tỷ lệ nhiễm Leptospira trên bò sữa theo khu vực chăn nuôi ........................ 31 Biểu đồ 4.2 Tỷ lệ nhiễm Leptospira trên bò sữa theo quy mô chăn nuôi ......................... 33 Biểu đồ 4.3 Tỷ lệ nhiễm Leptospira trên bò sữa theo nhóm máu lai ................................ 35 Bảng 4.4 Tỷ lệ nhiễm Leptospira trên bò sữa theo lứa đẻ ................................................ 36 Bảng 4.5 Tỷ lệ ngưng kết của các serovar ......................................................................... 38 Bảng 4.6 Tỷ lệ các serovar trên cá thể bò sữa ................................................................... 40 Bảng 4.7 Tỷ lệ các mức hiệu giá kháng thể ngưng kết với Leptospira ............................. 42 ix DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1 Phân biệt các đặc điểm của hai loài Leptospira ................................................. 4 Bảng 3.1 Bộ kháng nguyên dùng trong chẩn đoán............................................................ 21 Bảng 3.2 Phân bố lấy mẫu huyết thanh bò sữa.................................................................. 22 Bảng 4.1 Tỷ lệ nhiễm Leptospira trên bò sữa ở 8 quận, huyện thuộc Tp. Hồ Chí Minh .. 29 Bảng 4.2 Tỷ lệ nhiễm Leptospira trên bò sữa theo khu vực ............................................ 31 Bảng 4.3 Tỷ lệ nhiễm Leptospira trên bò sữa theo quy mô chăn nuôi ............................. 33 Bảng 4.4 Tỷ lệ nhiễm Leptospira trên bò sữa theo nhóm máu lai ................................... 35 Bảng 4.5 Tỷ lệ nhiễm Leptospira trên bò sữa theo lứa đẻ ................................................ 36 Bảng 4.6 Tỷ lệ ngưng kết của các serovar được phát hiện ................................................ 38 Bảng 4.7 Tỷ lệ các serovar nhiễm trên cá thể.................................................................... 39 Bảng 4.8 Tỷ lệ các mức hiệu giá ngưng kết với Leptospira ............................................. 41 1 Chương 1 MỞ ĐẦU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ Trong những năm gần đây, hòa chung với sự phát triển của cả nước ngành chăn nuôi bò sữa ở Tp. Hồ Chí Minh đã đạt được những thành tựu đáng kể. Ngoài việc cung cấp sức kéo bò còn cung cấp các sản phẩm có giá trị như thịt, sữa, da…chiếm vị trí quan trọng đã tạo công ăn việc làm cho người lao động, qua đó góp phần xóa đói giảm nghèo, nâng cao chất lượng cuộc sống cho người chăn nuôi nhất là chăn nuôi bò sữa. Tuy nhiên song song những thành tựu đó vẫn còn nhiều khó khăn cần được giải quyết. Một trong những bệnh đã và đang được quan tâm nhiều nhất hiện nay trong chăn nuôi bò sữa là bệnh do xoắn trùng (Leptospirosis). Leptospirosis là một bệnh truyền nhiễm chung trên gia súc và người, bệnh có tính chất nguồn dịch thiên nhiên. Bệnh do Leptospira đã được phát hiện ở nhiều nơi trên thế giới, ở Việt Nam bệnh được phát hiện vào năm 1931 (Trần Thị Bích Liên và Lê Thị Hà, 2000). Bệnh xảy ra chủ yếu trên gia súc sinh sản, tuy không gây chết hàng loạt như bệnh truyền nhiễm khác nhưng bệnh này cũng góp phần quan trọng vào việc giảm năng xuất thịt, giảm sản lượng sữa cũng như gây rối loại sinh sản như: sẩy thai, đẻ non…và đặc biệt bệnh có thể lây sang người. Nhằm giảm bớt thiệt hại cho người chăn nuôi bò sữa, chúng ta cần có những thông tin kịp thời về tình hình nhiễm bệnh do Leptospira để làm cơ sở cho việc xây dựng chương trình phòng chống và kiểm soát bệnh một cách tốt nhất. Xuất phát từ những vấn đề trên, được sự đồng ý của Khoa CNTY Trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh và sự giúp đỡ của Trạm Chẩn Đoán Xét Nghiệm và Điều Trị Chi Cục Thú Y Tp. Hồ Chí Minh, với sự hướng dẫn của TS Lê Anh Phụng và BSTY Huỳnh Thị Thu Hương, chúng tôi thực hiện đề tài: 2 “Khảo sát tình hình nhiễm Leptospira trên bò sữa ở một số quận, huyện thuộc Thành Phố Hồ Chí Minh năm 2007”. 1.2 MỤC ĐÍCH VÀ YÊU CẦU 1.2.1 Mục đích Nhằm có được những thông tin chính xác và cập nhật về tỷ lệ nhiễm các bệnh do Leptospira trên đàn bò sữa ở 8 quận, huyện thuộc Tp. Hồ Chí Minh để làm cơ sở cho công tác phòng chống bệnh và phục vụ cho chương trình phát triển chăn nuôi bò sữa. 1.2.2 Yêu cầu Lấy mẫu huyết thanh bò sữa xét nghiệm tình hình nhiễm Leptospira bằng phản ứng vi ngưng kết MAT (Microscopic Agglutination Test). Khảo sát ảnh hưởng các yếu tố: lứa đẻ, tỷ lệ máu lai, quy mô chăn nuôi, khu vực phân bố đến tỷ lệ nhiễm Leptospira. Hạn chế: Phản ứng MAT chỉ làm xét nghiệm 1 lần nên độ chính xác chưa cao. 3 Chương 2 TỔNG QUAN 2.1 ĐẶC ĐIỂM CHUNG VÀ LỊCH SỬ PHÁT HIỆN BỆNH 2.1.1 Khái niệm: Leptospirosis là bệnh truyền nhiễm chung cho nhiều loài động vật, gia súc và cả ở người do Leptospira interrogans gây nên. Đặc điểm của bệnh: trong thể cấp tính có biểu hiện viêm dạ dày ruột xuất huyết, thường ói ra máu và phân sậm màu, nhiễm trùng huyết, sốt vàng da. Trong thể mãn tính thường viêm thận, nước tiểu vàng sậm, urê huyết (hơi thở có mùi urê), viêm màng mống mắt và có thể gây sẩy thai...(Trần Thanh Phong, 1996). 2.1.2 Lịch sử phát hiện bệnh do Leptospira Theo Nguyễn Vĩnh Phước (1978), Trần Hoàng Đức (2004) thì lịch sử phát hiện Leptospira được ghi nhận như sau: Bệnh được phát hiện đầu tiên trên chó vào năm 1850 ở Stuttgart (Đức), lúc đầu còn được gọi là bệnh thương hàn chó. Sau đó đến năm 1886, Matheus (Pháp) và Adolf Weil (Đức) đã mô tả lại sự tái phát của bệnh trên người với các triệu chứng như vàng da, vàng mắt và sốt lập lại nhiều ngày cùng các bệnh tích ở thận, nên sau này bệnh được gọi là bệnh Weil (Weil’s Disease). Năm 1915, Inada và Ido (Nhật) lấy máu của một bệnh nhân bị sốt, vàng da tiêm cho chuột lang và đã phân lập vi trùng và đặt tên là Spirochaeta icterohaemorrhagiae. Năm 1918, Noguchi đề nghị đặt tên lại cho căn bệnh là Leptospira icterohaemorrhagiae. Cũng trong thời gian này, Martin và Pettit (Pháp) đã đưa ra nguyên tắc phản ứng vi ngưng kết (MAT: Microscopic Agglutination Test) để chẩn đoán bệnh do Leptospira về mặt huyết thanh học. 4 2.2 CAÊN BEÄNH HOÏC 2.2.1 Phân loại học Theo Bergey (1994; trích dẫn Tô Minh Châu và Trần Thị Bích Liên, 2001) Leptospira thuộc: Lớp: Schizomycetes Bộ: Spirochaetales Họ: Leptospiraceae Giống: Leptospira Loài : L. interrogans (gây bệnh) L. biflexa (hoại sinh) Theo Trần Thị Bích Liên (1999), Leptospira interrogans hiện đã phân biệt được hơn 200 biến thể huyết thanh (serovar) được xếp vào 23 serogroup. Cách viết tên Leptospira như sau : Ví dụ : Leptospira interrrogans serovar pomona, hoặc Leptospira interrogans serogroup pomona, serovar pomona. Bảng 2.1.Phân biệt các đặc điểm của hai loài Leptospira Đặc điểm L. interrogans L. biflexa Khả năng gây bệnh + Phát triển ở 130C + Mọc khi ôû 8azaguanine (225μgml) + Biến thành dạng hình cầu khi có NaCl 1M + Hoạt tính lipase Thay đổi + (Nguồn: Tô Minh Châu và Trần Thị Bích Liên, 2001) 2.2.2 Hình thái và cấu tạo Hình thái Leptospira có dạng hình xoắn nên còn được gọi là xoắn trùng. Theo Trần Thanh Phong (1996), thì xoắn trùng Leptospira có kích thước 0,1 0,2 μm x 4 20 μm và có khoảng 15 20 vòng xoắn, các vòng xoắn nằm khít nhau, hai đầu cong, có vỏ bọc. 5 Hình 2.1 Hình dạng của Leptospira dưới KHV điện tử (Nguồn: http:pathmicro.med.sc.eduLeptospira.jpg) Cấu tạo Leptospira được bao bọc bởi một màng ngoài cấu tạo từ 3 5 lớp. Trục nguyên sinh chất hình xoắn bên trong được bao bọc bằng màng nguyên sinh chất có cấu tạo peptidoglycan. Hai sợi trục nằm giữa màng ngoài và màng nguyên sinh chất, đầu tự do vươn tới gần giữa thân của tế bào (Quinn và ctv, 1999; trích dẫn Nguyễn Văn Dũng, 2005). Hình 2.2 Cấu tạo của xoắn trùng Leptospira (Nguồn: http:gsbs. Utmb.edu microbook ch035. htm) 2.2.3 Sự chuyển động Theo Nguyễn Vĩnh Phước (1977), cơ chế chuyển động của Leptospira khá phức tạp. Trước tiên, đầu uốn cong như lưỡi câu và quay theo ba hướng: dọc, ngang và xoay tròn trong khi toàn bộ tế bào vẫn giữ nguyên. Hiện tượng này khởi đầu cho các sợi trục, quay xung quanh trục nguyên sinh chất và làm cho toàn bộ tế bào xoắn trùng di chuyển theo. 6 Hiện tượng di chuyển toàn thân cùng với hình dạng đặc biệt (dạng xoắn) và sự mềm dẻo cho phép các xoắn trùng dễ dàng chui qua màng lọc có đường kính từ 0,1 0,4 μm cũng như giúp chúng di động trong môi trường bán lỏng có 1% thạch. Chính vì vậy, Leptospira có khả năng làm tạp nhiễm các chất cần được thanh trùng bằng phương pháp lọc (Trần Thị Bích Liên, 1999). 2.2.4 Đặc điểm nuôi cấy và đặc tính sinh hóa Đặc điểm nuôi cấy Việc nuôi cấy xoắn trùng thường gặp nhiều khó khăn, môi trường nuôi cấy phải giàu chất dinh dưỡng. Nhiệt độ thích hợp cho xoắn trùng phát triển là 28 300C, Leptospira thường phát triển rất chậm (từ 4 5 ngày), đôi khi đến 3 tháng (Nguyễn Vĩnh Phước 1978). Leptospira là loại hiếu khí tuyệt đối, trong quá trình phát triển cần các vitamin B1, B2 và các yếu tố sắt. Xoắn trùng thích hợp với pH kiềm yếu (7,2 7,4). Môi trường nuôi cấy xoắn trùng phổ biến hiện nay được dùng là môi trường EMJH (Ellinghausent McCullough Johnson Harris), môi trường nuôi cấy được cho thêm một ít huyết thanh thì mọc rất tốt (5 10% huyết thanh thỏ, cừu, dê hoặc bò) (Tôn Thanh Thía, 2006). Ở môi trường phân lập đầu tiên có thể thêm 5fluorouracil, rifamipicine, amphotericin (Trần Thanh Phong 1996). Đặc tính sinh hóa Không lên men các loại đường. Phản ứng catalase (+), oxydase (+). 2.2.5 Sức đề kháng Leptospira có sức đề kháng yếu, dễ bị tiêu diệt ở nhiệt độ 560C trong vòng 5 phút. Nếu đun 500C thì nó chết trong 1 giờ, với nhiệt độ 00C hay nhiệt độ âm thì xoắn trùng cũng chết nhanh, nhiệt độ 300C là nhiệt độ tối thích của Leptospira. Trong điều kiện thông thường thì chúng tồn tại khoảng 1,5 tháng, ánh sáng mặt trời và sự khô hạn có thể giết chết Leptospira một cách nhanh chóng (Lê Anh Phụng, 2002). Okazaki và Ringen (1957; trích dẫn bởi Nguyễn Lương, 1997) đã cho canh trùng Leptospira vào đất khô, sau nửa giờ thì không tìm thấy mầm bệnh nữa, còn nếu điều kiện ẩm ướt thì sau 6 tháng vẫn còn mầm bệnh. 7 Leptospira dễ dàng bị tiêu diệt bởi các chất sát trùng thông thường như: acid phenic 0,5%, thuốc đỏ 11000, formol 0,25% diệt được trong 5 phút, NaOH 0,5% trong vòng 10 phút, với phenol 0,5% thì Leptospira chỉ sống trong 10 phút. Xoắn trùng còn nhạy cảm với các chất sát trùng thông thường như: xà phòng, chất tẩy, đặc biệt rất mẫn cảm với nước muối (dung dịch NaCl 2,8% giết chết xoắn trùng trong 15 phút). Ngoài ra, xoắn trùng còn nhạy cảm với nhiều loại kháng sinh như: streptomycin, penicillin, ampicillin, tetracyclin…(Trần Thanh Phong, 1996). 2.2.6 Cấu trúc kháng nguyên, tính sinh miễn dịch và độc lực của Leptospira. Cấu trúc kháng nguyên Theo Rothstein và Hatt (1956; trích dẫn Nguyễn Văn Đờ Ro, 2005), chia cấu trúc kháng nguyên Leptospira thành hai loại: Kháng nguyên vỏ (kháng nguyên P) có bản chất là protein, không chịu nhiệt, nó giữ vai trò thiết yếu trong phản ứng vi ngưng kết. Hầu hết các kháng nguyên này nằm trong lớp vỏ và một số mang điểm quyết định kháng nguyên (epitope), nhờ vậy người ta có thể xác định được serovar và serogroup. Các kháng nguyên nằm ở sợi trục thì có tính chuyên biệt kém hơn. Kháng nguyên thân (kháng nguyên S) là kháng nguyên chịu nhiệt, có cấu tạo chủ yếu bởi polysaccharide. Các kháng nguyên này nằm ở thành tế bào và một số có tính đặc trưng cho serogroup với các vị trí quyết định kháng nguyên đặc hiệu của serovar. Tính sinh miễn dịch Do đặc điểm da dạng về cấu trúc kháng nguyên cho nên miễn dịch đối với Leptospira khá phức tạp. Khả năng miễn dịch do Leptospira tạo ra thường không đồng nhất do dị biệt về kháng nguyên, vì vậy thường ít xảy ra phản ứng chéo giữa các serogroup (Nguyễn Văn Đờ Ro, 2005). 8 Độc lực Leptospira tiết ra dung huyết tố (hemolysin) phá hủy hồng cầu, góp phần quan trọng trong tính chất gây bệnh của Leptospira như: hoàng đản, tiểu ra huyết sắc tố, suy thận, suy nhược (Trần Thanh Phong, 1996). 2.3 DỊCH TỄ HỌC 2.3.1 Tình hình bệnh và phân bố địa lý Năm 1967, tổ chức FAO thông báo bệnh lan tràn khắp nơi trên thế giới, ở nhiều loại gia súc, gia cầm, kể cả thú hoang dã và người. Bệnh gây nhiều thiệt hại về kinh tế như là: giảm sản lượng thịt, sữa…và gây tốn kém rất nhiều cho công tác phòng chống bệnh. 2.3.1.1 Thế giới Theo Nguyễn Lương (1977), bệnh Leptospirosis trên bò có hầu hết ở các châu lục trên thế giới. Mỗi nước có các serovar chính gây bệnh cho bò là khác nhau: ở Nhật là serovar hebdomadis, ở Nga và Israel là serovar grippotyphosa… Ở các nước Châu Á: Ấn Độ (1990), bò nhiễm serovar autumnalis chiếm 48% tổng số bò bi nhiễm Leptospira. Ở Philippines (1979), có 65% bò bị nhiễm serovar hebdomadis. Ở Malaysia (1987), bò bị nhiễm serovar sejroe chiếm 40% tổng số các trường hợp nhiễm do Leptospira. Ở Châu Âu bò nhiễm nhiều nhất là các serovar: gryppotyphosa, icterohaemorrhagiae, tarassovi, pomona, canicola,…Trong khi đó ở Mỹ và Úc, bò nhiễm nhiều nhất là các serovar australis, sejroe. Ở Châu Mỹ, tại Argentina (1975), bò bị nhiễm serovar sejroe và hardjo chiếm 59% tổng số các ca nhiễm Leptospira; tại Bolivia, bò nhiễm serovar hebdomadis chiếm tỷ lệ 71% (1976) (Nguyễn Văn Tình, 2005). 2.3.1.2 Việt Nam Theo kết quả của viện Thú y cho thấy: bệnh do Leptospira có thể xảy ra ở tất cả các tỉnh thành từ Bắc đến Nam với tỷ lệ là 26,2% (Nguyễn Lương, 1997). Năm 1964, một trận dịch Leptospirosis xảy ra ở Lai Châu có 69 bò bị nhiễm (Trần Thanh Phong, 1996). Theo Bùi Đình Thi (1961; trích dẫn Nguyễn Văn Đờ Ro, 2005) ở khu vực phía Bắc có tỷ lệ dương tính với Leptospira trên bò là 38,2% 41,2%. 9 Theo Nguyễn Thị Ngân (2000; trích dẫn Phạm Sỹ Lăng và Lê Văn Tạo, 2002), điều tra ở các tỉnh phía Bắc cho thấy bò nhiễm Leptospira với tỷ lệ 42,79%, chủ yếu nhiễm các serovar: bataviae, icterohaemorrhagiae, pomona… Võ Thành Phương (2003), thăm dò tình hình nhiễm Leptospira trên đàn bò sữa tại Tp. Hồ Chí Minh với 601 mẫu cho tỷ lệ dương tính là 38,6%. Đinh Văn Hân (2005), khảo sát tình hình nhiễm Leptospira trên bò tại một số trại chăn nuôi tỉnh Bình Dương cho biết tỷ lệ dương tính chiếm 34,3%. Tôn Thanh Thía (2006), khảo sát tình hình nhiễm Leptospira trên bò sữa ở một số quận, huyện thuộc Tp. Hồ Chí Minh với 320 mẫu có 102 mẫu dương tính với tỷ lệ 31,88%. 2.3.2 Loài cảm thụ trong tự nhiên. Leptospira là bệnh có tính chất nguồn dịch thiên nhiên. Nhiều gia súc, gia cầm, động vật hoang dã, chuột, người, động vật máu lạnh (rắn, rùa, cá…) côn trùng tiết túc đều có thể mắc bệnh (Trần Thanh Phong, 1996). Tỷ lệ nhiễm thay đổi tùy theo vùng địa lý (vùng trũng, ẩm ướt tỷ lệ mắc bệnh thường cao hơn vùng cao, khô ráo), tùy serovar, tùy loài cảm thụ (một serovar có thể gây bệnh cho nhiều ký chủ và một ký chủ cũng có thể nhiễm từ một đến nhiều serovar) và điều kiện vệ sinh môi trường. Tỷ lệ nhiễm còn phụ thuộc vào lứa tuổi: thú non cảm nhiễm mạnh hơn thú già. Tuy nhiên thời gian sống càng lâu thì tỷ lệ nhiễm càng tăng lên (Nguyễn Lương, 1997). Ngoài ra mật độ nuôi càng cao thì tỷ lệ nhiễm càng lớn (Chu Thị Mỹ, 1995). Trong phòng thí nghiệm có thể gây bệnh được cho thú non: thỏ non, chuột lang, chuột nhắt, chuột xám, chó con, gà 2 ngày tuổi, phôi gà 17 ngày tuổi. Chỉ một số ít thú thí nghiệm phát bệnh và có thể chết, đa số trở thành thú mang trùng (Nguyễn Lương, 1997). Ở người sự nhiễm bệnh thường do tính chất công việc chứ không phụ thuộc vào giới tính, tuổi tác. Nhóm người có nguy cơ mắc bệnh cao: công nhân lò mổ, người chăn nuôi, thú y viên, những người làm ở phòng thí nghiệm, công nhân cầu cống, nông dân làm ruộng …(Nguyễn Thị Phước Ninh, 2004). 10 2.3.3 Chất chứa mầm bệnh. Gia súc bệnh, thú mang trùng, thú bệnh mãn tính và các thú hoang (đặc biệt là chuột) là nguồn bệnh lớn nhất. Ở thú bệnh, khi mới nhiễm sẽ có Leptospira trong máu và dịch não tủy. Sau 10 15 ngày do trong máu hình thành kháng thể nên Leptospira rút về tập trung chủ yếu ở thận, ống dẫn tiểu, bàng quang, nước tiểu, gan, trong thai bị sẩy và màng thai (Nguyễn Lương, 1997). Ở thú mang trùng và những con mắc bệnh mãn tính, Leptospira có nhiều ở trong nước tiểu. Theo Liubasenko (1961; trích dẫn bởi Nguyễn Lương, 1997) ở Nga đã thấy bò mang trùng trong 120 ngày, cừu, dê 180 ngày; chó 700 ngày, ngựa 120 ngày, heo 140 ngày, chồn 514 ngày và người 163 ngày. Ở ngoại cảnh, Leptospira có ở những nơi bị nhiễm trùng từ nước tiểu của động vật bệnh hoặc mang trùng. Ở những nơi đầm lầy, ruộng nước, đất bồi, vũng nước đọng có từ 2 chuột trở lên trên một hecta thì thường có nhiều Leptospira (Lê Anh Phụng, 2002). 2.3.4 Đường xâm nhập. Leptospira có thể xâm nhập vào cơ thể bằng nhiều con đường khác nhau: Leptospira chủ yếu qua đường tiêu hóa: qua thức ăn nước uống có nhiễm Leptospira. Trong chuồng trại nuôi gia súc, chuột mang trùng đến bài thải Leptospira theo nước tiểu vào thức ăn của vật nuôi (Trần Thị Bích Liên, 1999). Trong tự nhiên, xoắn trùng có thể qua da, niêm mạc bị tổn thương hoặc ngay cả da nguyên lành. Chỉ cần bôi canh trùng Leptospira vào đùi chuột thì sau 20 phút đã tìm thấy xoắn trùng trong máu. Trong thí nghiệm cho chuột bơi trong nước nhiễm khuẩn hoặc tiêm dưới da, phúc mạc, bắp thịt hay cho uống đều gây được bệnh (Trần Thanh Phong, 1996). Qua đường hô hấp (Nguyễn Lương, 1997). Qua vết đốt của côn trùng hay do ve hoặc các loài chân đốt (Nguyễn Lương, 1997). 11 2.3.5 Phương thức truyền lây. Lây trực tiếp: từ mẹ sang con, qua giao phối trực tiếp; từ thú bệnh sang thú khoẻ mạnh (do nhốt chung, chăn thả cùng đồng cỏ) (Trần Thanh Phong, 1996). Lây gián tiếp: ăn, uống phải thức ăn bị nhiễm mầm bệnh, tiếp xúc với chất thải, hay ngâm mình, làm việc ở những nguồn nước có chứa mầm bệnh thì cũng có thể bị nhiễm Leptospira (Nguyễn Lương, 1997). Sự truyền lây có thể biểu diễn qua sơ đồ 2.1 Sơ đồ 2.1: Vòng truyền lây của Leptospira (Trần Thanh Phong, 1996) 2.3.6 Cách sinh bệnh Theo Trần Thanh Phong (1996), bệnh do Leptospira được chia làm hai giai đoạn : Giai đoạn đầu (Leptospira huyết ): sau khi xâm nhập vào cơ thể, Leptospira sẽ đi vào máu, dịch não tủy rồi tăng sinh gây sốt. Xoắn trùng tiết ra hemolysin, phá hủy hồng cầu giải phóng nhiều hemoglobin và chất này được bài xuất qua nước tiểu nên nước tiểu có màu vàng sẫm. Leptospira phá hủy thành mao mạch gây vỡ hoặc tắc nghẽn mao mạch, hậu quả là hoại tử và xuất huyết niêm mạc. Ở giai đoạn này hồng cầu bị phá hủy nhiều làm cho gia súc thiếu máu gây vàng da và niêm mạc. Bệnh có thể gây chết thú non. THUÙ HOANG LOAØI GAÄM NHAÁM (Nöôùc tieåu) NÖÔÙC NHIEÃM ÑAÁT BUØN LAÀY GIA SUÙC NGÖÔØI 12 Giai đoạn định vị (Leptospira niệu): sau khoảng 1 2 tuần nhiễm bệnh, Leptospira sẽ đến cư trú ở các cơ quan nội tạng như: gan, tử cung, đặc biệt là thận, ống dẫn tiểu. Ở giai đoạn này dấu hiệu sốt không rõ, bệnh ít gây chết nhưng đã chuyển sang dạng mang trùng nên rất nguy hiểm cho người và động vật nuôi do xoắn trùng được bài thải ra ngoài qua nước tiểu (Lâm Thanh Tùng, 1994; trích dẫn bởi Trần Hoàng Đức, 2004). Khi xoắn trùng định vị ở các cơ quan nội tạng, gây ảnh hưởng làm tổn thương các mạch máu, nhau thai nên gây sẩy thai. Ở gan các mạch máu nhỏ cũng nhanh chóng bị bít, thu hẹp bởi các đám thâm nhiễm tế bào. Sự nhiễm độc kéo theo sự thủng lỗ ở các mạch máu nên tế bào gan bị phá vỡ và thoái hoá. Do đó bilirubin bị giữ lại trong tế bào gan và máu gây vàng da nhất là ở những thú non có sức đề kháng yếu. Sau khi khỏi bệnh con vật có miễn dịch với serovar bị nhiễm (Bùi Văn Quyền, 1995). 2.4 TRIỆU CHỨNG Thời gian nung bệnh trên bò từ 10 20 ngày hoặc lâu hơn nữa và có thể gặp ở 3 thể: thể quá cấp tính, thể cấp tính tính và thể mãn tính (Phạm Sỹ Lăng và Phan Địch Lân, 1997). 2.4.1 Thể quá cấp tính Thể này ít gặp. Bệnh phát ra đột ngột, con vật sốt cao, mệt mỏi, thích nằm, lờ đờ, ăn kém hoặc bỏ ăn, phân táo bón, giảm hoặc ngừng nhu động dạ cỏ. Đặc biệt niêm mạc và da vàng sẫm, nước tiểu có màu vàng hoặc nâu. Thể này thường phát ra ở bê, nghé và trâu bò cái mang thai. Con vật có thể chết sau 3 7 ngày (Phạm Sỹ Lăng và Phan Địch Lân, 1997). 2.4.2 Thể cấp tính Thể này thường gặp ở bê, con vật sốt cao 40 410C, ít ăn hoặc bỏ ăn, nhu động dạ cỏ giảm. Một số con vật táo bón và sau đó bị tiêu chảy. Da và niêm mạc vàng sẫm, nước tiểu có màu vàng hoặc nâu. Con vật bệnh gầy nhanh chóng do bị tiêu chảy mất nước, lông dựng đứng, thiếu máu nặng (lượng hồng cầu giảm chỉ còn 2 3 triệumm3. Bệnh kéo dài 5 10 ngày, tỷ lệ chết 50 70% (Phạm Sỹ Lăng và Phan Địch Lân, 1997). 13 2.4.3 Thể mãn tính Trâu bò nước ta thường mắc bệnh ở thể này. Con vật ít có triệu chứng lâm sàng mà chỉ sẩy thai, đẻ non, con đẻ ra yếu ớt, hoặc không thụ thai. Thận và đường sinh dục (kể cả thú đực và thú cái) là nơi mà xoắn trùng khu trú thường xuyên. Thú bệnh ở thể này có thể thành con mang trùng suốt đời (Lê Anh Phụng, 2002). 2.5 BỆNH TÍCH Theo Nguyễn Thị Phước Ninh (2005), bệnh tích thể cấp của bệnh do Leptospira được biểu hiện như sau: Xuất huyết dưới da và niêm mạc, vàng da và niêm mạc Niệu huyết sắc tố Mô liên kết dưới da vàng, keo nhầy, thuỷ thủng Máu loãng, gan sưng, nát, vàng, có hoại tử ở vùng trung tâm Xoang ngực, bụng có nước vàng Lách sưng, túi mật teo, viêm thận kẽ Loét và xuất huyết dạ múi khế Phôi lúc sẩy thai: Vàng da, phù Dịch trong xoang cơ thể nhuốm máu Viêm phổi, viêm gan có điểm hoại tử đường kính 1 4 mm Nhau, màng thai dày, phù màu nâu, hoại tử. Thú bệnh khi mổ khám, quan sát quầy thịt có mùi khét đặc trưng (Phạm Sỹ Lăng và Phan Địch Lân, 1997). Thể mãn tính: thông thường bệnh không rõ, nhiều khi chỉ có nước tiểu vàng (Đinh Văn Hân, 2005). 2.6 CHẨN ĐOÁN 2.6.1 Chẩn đoán lâm sàng Dựa vào các triệu chứng, kết hợp với đặc điểm dịch tễ của bệnh như bệnh có tính chất nguồn dịch thiên nhiên, xuất hiện nhiều vào mùa mưa, đặc biệt sau những trận lũ lụt, vùng đầm lầy ngập nước, gần sông hồ, cống rãnh, vùng có nhiều chuột, kém vệ sinh (Nguyễn Vĩnh Phước, 1978). 14 Chẩn đoán phân biệt lâm sàng Với biểu hiện hoàng đản cần phân biệt Hoàng đản do ngộ độc hóa chất (Arsenic, Cu,…) Hoàng đản do ngộ độc một số độc tố của nấm như: aflatoxin, ochratoxin. Hoàng đản do nhiễm vi trùng E. coli gây dung huyết. Hoàng đản do dinh dưỡng: ăn nhiều thức ăn có sắc tố vàng (chứa nhiều caroten). Với biểu hiện xáo trộn sinh sản, cần phân biệt Bệnh sẩy thai truyền nhiễm do Brucella (Brucellosis) Bệnh do Parvovirus Tóm lại các triệu chứng chỉ cho phép nghi ngờ có bệnh. Muốn biết chính xác phải tiến hành chẩn đoán ở phòng thí nghiệm (Nguyễn Vĩnh Phước, 1978) 2.6.2 Chẩn đoán ở phòng thí nghiệm 2.6.2.1 Tìm Leptospira Lấy bệnh phẩm Theo Trần Thanh Phong (1996), việc nuôi cấy phân lập Leptospira chủ yếu được tiến hành từ bệnh phẩm và tùy theo thời kỳ cảm nhiễm mà bệnh phẩm được thay đổi khác nhau: Trong tuần lễ đầu của bệnh, Leptospira có thể tìm thấy trong máu và dịch não tủy. Từ ngày thứ 12 trở đi có thể tìm thấy Leptospira trong nước tiểu, trong thận. Ở các ca sảy thai tìm thấy Leptospira trong thai hoặc nhau thai. Phát hiện Leptospira dưới kính hiển vi nền đen. Để phát hiện Leptospira trong nước tiểu, ta có thể lấy nước tiểu ở những thú nghi nhiễm bệnh, tiến hành ly tâm với tốc độ 3000 4000 vòng15 20 phút. Sau đó lấy cặn xem dưới kính hiển vi nền đen. Các bệnh phẩm như: gan, thận được nghiền nát pha với nước muối sinh lý, sau đó đem ly tâm hút lấy nước trong ở trên và xem dưới kính hiển vi nền đen (Trần Hoàng Đức, 2004). Không nên lấy máu ly tâm để xem vì trong máu có rất ít Leptospira (Trần Thanh Phong, 1996). 15 Nuôi cấy phân lập Leptospira. Việc phân lập các Leptospira gây bệnh thường không phải là phương pháp thông dụng thực tế. Lý do là Leptospira đòi hỏi môi trường nuôi cấy giàu dưỡng chất và mọc rất chậm (có thể đến 1 tháng) (Trần Thanh Phong, 1996). Gây bệnh cho động vật thí nghiệm Động vật thí nghiệm được dùng là thỏ con, chuột lang, chuột bạch, chó con… dùng 1 2 ml huyễn dịch bệnh phẩm (phủ tạng, nước tiểu …) tiêm vào tĩnh mạch hay phúc mạc và theo dõi thân nhiệt mỗi ngày (sáng và chiều). Khi thấy thú sốt, lấy máu, dịch phúc mạc xem tươi, rồi giết thú lấy phủ tạng để nuôi cấy. Nếu thú không có biểu hiện sốt thì sau 10 12 ngày lấy máu kiểm tra kháng thể và mổ khám sau 30 ngày (Bùi Văn Quyền, 1995). 2.6.2.2 Chẩn đoán huyết thanh học. Phản ứng vi ngưng kết MAT (Microscopic Agglutination Test). Đây là phản ứng kinh điển và tiêu biểu để chẩn đoán Leptospira được Martin và Pettit đề xuất năm 1918 (trích dẫn Nguyễn Văn Đờ Ro, 2005). Nguyên tắc của phản ứng: kháng thể đặc hiệu xuất hiện trong huyết thanh của con vật bị nhiễm Leptospira gây ngưng kết với xoắn trùng. Sự ngưng kết này sẽ được nhìn thấy qua kính hiển vi nền đen. Phản ứng được tiến hành với bộ kháng nguyên có thể gồm những serovar của xoắn trùng sống (live antigen) hoặc đã bị giết chết (Killed antigen). Nếu làm phản ứng MAT với kháng nguyên sống sẽ có nhiều thuận lợi hơn. Phản ứng nhạy hơn và ít có phản ứng chéo. Tuy nhiên, có những bất lợi là dễ bị tạp nhiễm và phải luôn duy trì bộ kháng nguyên sống nên chỉ có thể thực hiện được trong phòng thí nghiệm chuẩn mực về Leptospira. Đối với kháng nguyên chết thì có lợi điểm là dễ bảo quản, ít bị tạp nhiễm, nhưng độ nhạy kém hơn và dễ dàng có phản ứng chéo, hiệu giá có thể bị giảm (trích dẫn Trần Hoàng Đức, 2004). Phản ứng MAT rất nhạy đối với các trường hợp thú đã bị mắc bệnh trên 1 tuần lễ và chẩn đoán có giá trị chắc chắn hơn khi lấy huyết thanh 2 lần (cách nhau 3 tuần). Sự tăng hiệu giá kháng thể cho phép xác định bệnh do Leptospira đang tiến triển, còn sự giảm hiệu giá cho thấy là bệnh có khuynh hướng dừng tắt (Trần Thị Bích Liên, 1999; Phạm Sỹ Lăng và Lê Văn Tạo, 2002). 16 Đối với thú có hiệu giá kháng thể 1100 chỉ ra rằng con thú đang nhiễm hoặc đã nhiễm Leptospira, nhưng phải xem con vật đã tiêm phòng chưa. Trên cả đàn, MAT cung cấp thông tin về dịch tễ học của bệnh trên đàn đó. Sự có mặt của nhiều con dương tính cho phép kết luận là có nhiễm Leptospira mặc dù trong đàn không có dấu hiệu bệnh lý. Theo tổ chức dịch tễ thế giới OIE (Office International des Epizooties, 2004) kháng thể không được phát hiện có thể do những nguyên nhân sau: Việc lấy huyết thanh sớm ở những ngày đầu của bệnh thì do kháng thể chưa xuất hiện nên hiệu giá kháng thể sẽ thấp hoặc âm tính. Trong những trường hợp này lấy huyết thanh lần 2 (sau 3 tuần) sẽ cho kết quả chắc chắn hơn. Do thú đã điều trị kháng sinh (vì sử dụng kháng sinh ảnh hưởng sự hình thành kháng thể). Có thể thú bị nhiễm một số serovar khác không có trong bộ kháng nguyên để chẩn đoán. Kỹ thuật ELISA (Enzyme linked immuno sorbent assay) Đây là test rất nhạy (nhưng cần chẩn hóa các phương tiện, vật liệu để tiến hành) và rất chuyên biệt (Trần Thanh Phong, 1996). Nguyên tắc phản ứng: thông thường sự kết hợp kháng nguyên, kháng thể không thể phát hiện bằng mắt thường, kỹ thuật ELISA đã ứng dụng đặc tính hấp phụ tự nhiên của protein lên polyethylene để gắn kháng nguyên (hoặc kháng thể) lên giá rồi cho kháng thể (hoặc kháng nguyên) tương ứng có đánh dấu enzym làm giải phóng oxy nguyên tử 0 từ H2O2 để oxy hoá chất hiện màu làm thay đổi màu của hỗn dịch (Lê Văn Hùng, 2002). Phản ứng ELISA được ứng dụng trong chẩn đoán Leptospira dương tính nhờ vào việc xác định kháng thể IgM, xuất hiện khoảng 6 8 ngày sau khi bắt đầu có những những biểu hiện lâm sàng (Trần Thanh Phong, 1996). Do lợi điểm của phản ứng MAT cho nên hiện nay trong công tác chẩn đoán Leptospira người ta sử dụng phương pháp này là phổ biến. Ngoài ra, người ta còn sử dụng một số phản ứng khác để chẩn đoán như: IFT (Immuno Fluoresscence Test), PCR (Polymerase Chain Reaction)... Nhưng do phức tạp trong việc trang bị dụng cụ, mặt khác thiết bị rất đắt tiền, cho nên các phản ứng này chỉ sử dụng trong các phòng thí nghiệm dùng để nghiên cứu về bệnh do Leptospira. 17 2.7 PHÒNG BỆNH VÀ ĐIỀU TRỊ. 2.7.1 Phòng bệnh . Vệ sinh phòng bệnh Theo Nguyễn Lương (1997), việc vệ sinh phòng bệnh cần dựa vào nguyên tắc phòng chống dịch Cách ly triệt để thú mới nhập về (30 ngày) và tiến hành kiểm tra huyết thanh học, nếu âm tính mới cho nhập đàn. Định kỳ kiểm tra huyết thanh học để loại thải những con dương tính. Diệt động vật hoang dã, chuột, đặc biệt chuột là nguồn bệnh trong tự nhiên. Yếu tố trung gian truyền lây: tiến hành tiêu độc, sát trùng dụng cụ dùng trong chăn nuôi xung quanh chuồng trại khai thông cống rãnh, phát hoang bụi rậm cho thông thoáng. Đối với người chăn nuôi cần phải mang bảo hộ lao động khi làm việc và kiểm tra sức khoẻ định kỳ. Biện pháp đối với thú cảm thụ Thường xuyên tắm rửa thú sạch sẽ, khẩu phần cung cấp đủ dưỡng chất. Thực hiện tiêm phòng bằng vaccine Việc phòng bệnh bằng vaccine chưa đạt hiệu quả cao do Leptospira có quá nhiều serovar và serogroup khác nhau nên tiêm phòng bằng serovar này thì thú vẫn có thể bị nhiễm serovar khác. Do đó cần chú trọng đến việc vệ sinh phòng bệnh là chủ yếu. Ở nhiều nước tiên tiến như Anh, Pháp, Hoa Kỳ chú trọng đến biện pháp vệ sinh phòng bệnh mà không đặt vấn đề về tiêm phòng bằng vaccine (Trần Thanh Phong, 1996). Hiện nay trên thị trường nước ta có nhiều loại vaccine phòng bệnh do Leptospira gây ra cho trâu, bò do các hãng nước ngoài sản xuất như: Leptoferm5, có 5 serovar là: canicola, grippotyphosa,. icterohaemorrhagiae, hardjo và pomona do hãng Pfizer (Đinh Văn Hân, 2005). 18 Ở Việt Nam chế tạo vaccine phòng bệnh Leptospira gồm 6 serovar là: gripptyphosa, bataviae, pomona, icterohaemorrhagiae, hebdomadis, canicola (dùng cho bò), với bò tiêm 2 lần (mỗi lần 5mlcon ), cách nhau 1 2 tuần (Phạm Sỹ Lăng và Lê Văn Tạo). 2.7.2 Điều trị Với bệnh Leptospirosis cần phải điều trị sớm, triệt để, toàn diện. Việc tiêu diệt mầm bệnh phải kết hợp với nâng cao sức chống đỡ của gia súc. Điều trị thể cấp tính hiệu quả hơn thể mãn tính.Vi sinh vật này nhạy cảm với kháng sinh, các kháng sinh có hiệu lực đối với Leptospira là streptomycine (10 20 mgkgngày) kết hợp với penicilline (20.000 UI kg ngày) tiêm liên tục 3 5 ngày (Phạm Sỹ Lăng và Phan Địch Lân, 1997). Hiện nay chi cục thú y Tp. Hồ Chí Minh đang áp dụng liệu trình điều trị kéo dài 5 ngày gồm: Oxytetracycline (loại 10 mg1 ml) tiêm 1ml20 kg thể trọngngày; hoặc dihydrostreptomycine: 10 25 mgkg thể trọng (tiêm bắp), trong 3 5 ngày hoặc phối hợp streptomycin và penicilline. Ngoài ra bổ sung thêm vitamin C, B complex (Bùi Văn Quyền, 1995). 19 2.8 LƯỢC DUYỆT MỘT SỐ CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN Ngoài các nghiên cứu được đề cập trong phần lịch sử bệnh, còn có nhiều công trình ở Tp. Hồ Chí Minh được đề cập như: Võ Thành Phương (2003), điều tra và phát hiện được 14 serovar trong đó có 2 serovar chiếm tỷ lệ cao là hebdomadis (30,65%) và hardjo hardjo bovis (28,83%). Huỳnh Văn Đông (2004), điều tra hình nhiễm Leptospira trên bò sữa ở một số quận thuộc Tp. Hồ Chí Minh đã phát hiện 19 serovar trong đó 3 serovar chiếm t ỷ lệ cao là hardjo hardjo bovis (28,82%), kế đến là hebdomadis (25,30%), tarassovi (11,23%). Nguyễn Văn Dũng (2005), điều tra tình hình nhiễm Leptospira trên bò sữa ở một số quận, huyện thuộc Tp. Hồ Chí Minh đã phát hiện 17 serovar là: hardjo hardjo bovis, hebdomadis, tarassovi, saxkoebing, vughia, hardjo hardjoprajitno, canicola hondutrecht, canicola chiffon, bataviae, husbridge, castellonis, icterohaemorrhagiae, pyrogenes, tonkini, javanica, pomona, australis. Trong đó, bò nhiễm nặng nhất các serovar hardjo hardjo bovis (29,56%), herbdomadis (25,57%) và tarassovi (11,19%). Phan Chí Thông (2006), khảo sát bò sữa ở huyện Hóc Môn Tp. Hồ Chí Minh nhiễm 6 serovar là: hardjo hardjo bovis (44,23%), hebdomadis (42,31%), vughia (4,81%), hardjo hardjoprajitno (4,33%), saxkoebing (3,37%), tarassovi (0,96%). 20 Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM 3.1.1 Thời gian Thời gian thực hiện đề tài: từ tháng 04 2007 đến tháng 08 2007. 3.1.2 Địa điểm Địa điểm lấy mẫu tại các hộ chăn nuôi bò sữa ở 8 quận, huyện thuộc Tp. Hồ Chí Minh như: Bình Chánh, Quận 9, Quận 12, Gò Vấp, Tân Phú, Tân Bình, Bình Tân, Thủ Đức. Địa điểm xét nghiệm mẫu: Trạm Chẩn Đoán Xét Nghiệm và Điều Trị, Chi cục Thú Y Tp. Hồ Chí Minh. 3.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU: Lấy mẫu huyết thanh bò sữa xét nghiệm tình hình nhiễm Leptospira trên bò sữa tại các hộ chăn nuôi bò sữa ở 8 quận huyện thuộc TP Hồ Chí Minh. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố như: khu vực, lứa đẻ, nhóm máu lai của bò, quy mô chăn nuôi (duới 5 conhộ, 5 10 conhộ, 11 20 conhộ, hơn 20 conhộ). Khảo sát số lượng serovar trên bò sữa, số serovar nhiễm trên cá thể. Xác định hiệu giá kháng thể trên các mẫu dương tính. 3.3 VẬT LIỆU 3.3.1 Đối tượng khảo sát Mẫu huyết thanh bò sữa tại các hộ chăn nuôi ở 8 quận, huyện thuộc Tp. Hồ Chí Minh. Số lượng: 528 mẫu 3.3.2 Thiết bị dụng cụ và hóa chất Thiết bị: kính hiển vi nền đen, tủ ấm, tủ lạnh, máy lắc đĩa, máy ly tâm, nồi hấp ướt. 21 Dụng cụ: ống tiêm, lame, bông thấm nước, dây để cố định bò, kéo, dụng cụ giữ kim, bình trữ lạnh, khẩu trang, găng tay, micropippet, đầu type, chai, lọ, ống nghiệm, giá đựng ống nghiệm, vĩ 96 lỗ giếng, eppendorf, bông gòn, bình xịt cồn, phiến kính, giá đựng phiến kính, pipette chuẩn độ. Dụng cụ bảo hộ: găng tay, kính đeo mắt, khẩu trang… Hóa chất: Dung dịch đệm PBS, cồn sát trùng 700, chất tẩy rửa, xà phòng… 3.3.3 Bộ kít xét nghiệm Chúng tôi sử dụng bộ kháng nguyên gồm 23 serovar do Viện Pasteur Tp. Hồ Chí Minh cung cấp được trình bày qua bảng 3.1. Bảng 3.1 Bộ kháng nguyên dùng trong chẩn đoán STT Serogroup Serovar Strain 1 AUSTRALIS Australis Ballico 2 AUTUMNALIS Autumnalis Akiyami A 3 BATAVIAE Bataviae Van Tienen 4 CANICOLA Canicola HondUtrecht IV 5 BALLUM Castellonis Castello 3 6 PYROGENES Pyrogenes Salinem 7 ICTEROHAEMORRHAGIAE Tonkini LT 9668 8 ICTEROHAEMORRHAGIAE Icterohaemorrhagiae Verdun 9 CYNOPTERIE Cynopterie 3522 C 10 GRYPPOTYPHOSA Gryppotyphosa Moskva V 11 SEJROE Hardjo Hardjo bovis 12 HEBDOMADIS Hebdomadis Hebdomadis 13 JAVANICA Javanica Veldrat Bataviae 46 14 PANAMA Panama CZ 214K 15 SEMARANGA Patoc Patoc 1 16 POMONA Pomona Pomona 17 TARASSOVI Tarassovi Mitis Jonhson 18 TARASSOVI Vughia LT 0968 19 SEJROE Hardjo Hardjo Prajitno 20 SEJROE Saxkoebing Mus 24 21 CANICOLA Canicola Chiffon 22 LOUISIANA Louisiana LSU 1945 23 HUSTBRIDGE (Nguồn: Viện Pasteur Tp. HCM) 22 3.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.4.1 Phân bố mẫu và cách lấy mẫu 3.4.1.1 Phân bố mẫu Mẫu được lấy ngẫu nhiên và số mẫu được tính toán dựa trên phần mềm Winepiscope 2.0 với các thông số sau: tỷ lệ lưu hành là 30%, sai số là 5%, độ tin cậy 95%. Với tổng đàn bò sữa ở 8 quận, huyện thuộc Tp. Hồ Chí Minh là 14.546 con, chúng tôi lấy được là 528 mẫu huyết thanh. Mẫu huyết thanh được lấy ngẫu nhiên dựa trên danh sách từ những hộ chăn nuôi bò sữa ở 8 quận, huyện thuộc Tp. Hồ Chí Minh, ngoài ra các yếu tố khác cũng được chú ý như lứa tuổi, tỷ lệ máu lai của bò, quy mô chăn nuôi. Bảng 3.2 Phân bố lấy mẫu huyết thanh bò sữa STT Khu vực Quận, huyện Tổng đàn Số mẫu huyết thanh lấy 1 I Bình Chánh 1972 60 2 Bình Tân 1020 32 3 II Tân Bình 320 20 4 Tân Phú 616 30 5 Gò Vấp 1260 60 6 III Quận 12 8190 203 7 Quận 9 386 63 8 Thủ Đức 782 60 Tổng cộng 14546 528 (ghi chú: mỗi con lấy một mẫu huyết thanh) 3.4.1.2 Cách lấy mẫu huyết thanh Sau khi cầm cột thú ở mõm, chân và sát trùng vị trí lấy mẫu bằng cồn 700, ta dùng ống tiêm lấy mẫu máu tươi tĩnh mạch cổ hoặc tĩnh mạch đuôi (lấy máu từ 2 4 ml). Sau khi rút lấy máu, ống tiêm được đặt nghiêng để đông tự nhiên, nếu vận chuyển xa thì phải bảo quản lạnh và đem về phòng thí nghiệm. Sau đó, chiết lấy huyết thanh 23 cho vào eppendorf. Trên mỗi ống phải ghi rõ ký hiệu mẫu để tránh nhầm lẫn và khi di chuyển phải nhẹ nhàng, tránh va chạm dễ vỡ hồng cầu. Sau đó, đem ly tâm huyết thanh (3000 vòngphút) trong 5 phút để tách hết hồng cầu còn sót rồi chiết lấy huyết thanh lần nữa. 3.4.2 Phương pháp chẩn đoán Leptospira bằng phản ứng vi ngưng kết Nguyên tắc thực hiện phản ứng MAT (Microscopic Aggluntination Test): Phản ứng MAT là phản ứng ngưng kết xuất hiện giữa kháng nguyên chuẩn, sống Leptospira với kháng thể chống Leptospira trong huyết thanh bò. Kết quả cần đọc và đánh giá dưới kính hiển vi nền đen. 3.4.2.1 Kiểm tra kháng nguyên chuẩn Dùng 6 phiến kính, mỗi phiến kính chia làm 4 ô nhỏ, trên mỗi ô cho vào một giọt kháng nguyên với mỗi serovar (tất cả là 23 serovar) và cùng với 1 giọt dung dịch đệm PBS. Trộn đều rồi để nguyên 5 10 phút. Sau đó xem kính hiển vi nền đen, quan sát thấy Leptospira chuyển động nhanh trên vi trường và không tự ngưng kết thì kháng nguyên mới đạt yêu cầu. Trường hợp có hiện tượng ngưng kết thì kháng nguyên không được dùng. 24 50μl HT pha loãng150 3.4.2.2 Phản ứng MAT định tính Hình 3.1 Sơ đồ phản ứng MAT định tính Huyết thanh được pha loãng 150 trong dung dịch đệm PBS (pha 0,1 ml mẫu huyết thanh với 4,9 ml dung dịch PBS lắc đều. Thực hiện phản ứng MAT: trong vĩ 96 lổ giếng Cho lần lượt 50μl từng loại kháng nguyên (gồm 23 serovar) đã pha loãng vào mỗi giếng (từ giếng 1 đến giếng 23), ở 2 vĩ 96 lỗ giếng đặt kế tiếp nhau. Sau đó cho thêm 50 l từng mẫu huyết thanh vào mỗi lỗ giếng (từ giếng 1 đến lỗ giếng 23), 23 giếng tương ứng với 23 serovar và lắc đều. Như vậy, lúc này huyết thanh trên thực tế đã được pha 1100. 25 Ủ 280C trong 2 giờ. Sau đó cho lên phiến kính 10μl từ mỗi giếng và đọc kết quả dưới kính hiển vi nền đen (ở vật kính x10). Lưu ý: Mỗi kháng nguyên (serovar) dùng một đầu type riêng để tránh lẫn lộn các serovar khác. Mỗi mẫu huyết thanh dùng một đầu type để tránh nhầm lẫn các mẫu huyết thanh với nhau. Hình 3.2 Thao tác thực hiện phản ứng MAT Đánh giá kết quả ngưng kết Theo tài liệu hướng dẫn của Viện Pasteur Tp. Hồ Chí Minh, các mức ngưng kết được đánh giá như sau: (++++): Tất cả Leptospira liên kết thành cụm nhỏ hay cụm mạng nhện không còn xoắn trùng tự do trong vi trường. (+++): Có trên 75% Leptospira bị ngưng kết so với cụm đối chứng âm. (++): Có từ 50% đến 70% Leptospira bị ngưng kết. (+): Từ 25% đến 50% Leptospira bị ngưng kết, nhiều xoắn trùng còn tự do trong vi trường. Đánh giá phản ứng MAT Theo tổ chức dịch tễ thế giới OIE (2004) quy định: mẫu huyết thanh được xem là dương tính (bò có nhiễm Leptospira) nếu có ngưng kết từ mức ngưng kết (2+) trở lên ở độ pha loãng 1100. Ngược lại mẫu huyết thanh được xem là âm tính nếu còn nhiều hơn 50% Leptospira tự do trên vi trường. 26 Hình 3.3 Đọc kết quả phản ứng MAT dưới KHV nền đen 3.4.2.3 Phản ứng MAT định lượng Hình 3.4 Sơ đồ phản ứng MAT định lượng Huyết thanh ngưng kết với các loại kháng nguyên (serovar) nào thì tiến hành định lượng kháng thể với kháng nguyên đó. Pha loãng huyết thanh cần định lượng với dung dịch đệm PBS từ độ pha loãng 1100, 1200, 1400, 1800, 11600, 13200…Mỗi dãy tương ứng với mỗi serovar phát hiện. Cách thực hiện: Cho vào mỗi lỗ giếng 50μl huyết thanh với độ pha loãng giảm dần như trên. Mỗi lỗ giếng cho vào 50μl kháng nguyên (serovar) lắc đều. Trộn đều ủ ở 280C trong 2 giờ. 27 Đánh giá kết quả Nhỏ lên phiến kính 10l dung dịch từ mỗi giếng và đọc dưới kính hiển vi nền đen (vật kính x10). Hiệu giá kháng thể được tính là nồng độ pha loãng huyết thanh cao nhất còn gây ngưng kết ở mức (2+) (Theo quy định của OIE, 2004). A: âm tính B: dương tính 3.4.4 Các chỉ tiêu theo dõi Tỷ lệ nhiễm chung (%)= (Tổng số mẫu dương tính 100) Tổng số mẫu khảo sát. Tỷ lệ nhiễm theo từng khu vực chăn nuôi bò sữa Tỷ lệ nhiễm theo nhóm máu lai của bò sữa Hà Lan (F1, F2, F3). Tỷ lệ nhiễm theo lứa đẻ của bò (tơ, 1 lứa, 2 lứa, 3 lứa, trên 3 lứa). Tỷ lệ nhiễm theo quy mô chăn nuôi (20 con). Tỷ lệ nhiễm n serovar của cá thể = (A100)B A: số mẫu dương tính với n serovar B: tổng số mẫu dương tính (n: số serovar nhiễm trên cá thể được phát hiện) Hiệu giá kháng thể ở bò sữa ngưng kết với Leptospira. 28 3.4.5 Phương pháp xử lý số liệu Số liệu được sắp xếp và vẽ biểu đồ bằng phần mềm Excel Các tỷ lệ được so sánh bằng trắc nghiệm 2 (Chi Square Test), theo phần mềm MINITAB 12.0. 29 Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 TỶ LỆ NHIỄM LEPTOSPIRA TRÊN BÒ SỮA Ở 8 QUẬN, HUYỆN THUỘC TP. HỒ CHÍ MINH Qua khảo sát 528 mẫu huyết thanh bò sữa được lấy từ các hộ chăn nuôi bò sữa ở 8 quận, huyện thuộc Tp. Hồ Chí Minh, bằng phản ứng vi ngưng kết (MAT) với hiệu giá ngưng kết 1100 trở lên được trình bày qua bảng 4.1. Bảng 4.1 Tỷ lệ mẫu dương tính với Leptospira Số mẫu khảo sát Số mẫu dương tính Tỷ lệ dương tính (%) 528 152 28,80% Qua kết quả ở bảng 4.1 chúng tôi nhận thấy trong 528 mẫu huyết thanh được khảo sát trên bò sữa ở các quận, huyện thuộc Tp. Hồ Chí Minh có 152 mẫu dương tính (chiếm tỷ lệ là 28,80%). Điều này cho thấy bò sữa đã tiếp xúc với kháng nguyên nên cơ thể sản sinh ra kháng thể đặc hiệu để đáp ứng miễn dịch. Do tình hình hiện nay ở Tp. Hồ Chí Minh chưa có triển khai tiêm phòng đối với bệnh do Leptospira cho bò (kể cả bò sữa). Nên từ đó chúng ta có thể kết luận là bò sữa đã nhiễm Leptospira với tỷ lệ là 28,80%. Kết quả của chúng tôi cao hơn so với một số tác giả đã khảo sát trước đây: Vũ Đình Hưng (1978), sơ khởi điều tra 98 mẫu huyết thanh bò sữa ở miền Nam cho biết tỷ lệ nhiễm Leptospira là 20,06%. Lâm Thanh Tùng (1994), điều tra 567 mẫu huyết thanh bò sữa ở Thủ Đức, Hóc Môn và Gò Vấp thì tỷ lệ nhiễm Leptospira là 24,34%. Chu Thị Mỹ (1995), khảo sát tình hình nhiễm Leptospira trên bò sữa ở Tp. Hồ Chí Minh là 28,15%. 30 Huỳnh Văn Đông (2004), điều tra tình hình nhiễm Leptospira trên bò sữa ở 8 quận, huyện (Quận 12, Quận 9, Bình Tân, Thủ Đức, Tân Phú, Gò Vấp, Tân Bình và Bình Chánh), cho biết tỷ lệ nhiễm Leptospira là 21,3%. Tuy nhiên, kết quả của chúng tôi (năm 2007) lại thấp hơn kết quả của Võ Thành Phương (2003), thăm dò tình hình nhiễm Leptospira trên bò sữa ở Tp. Hồ Chí Minh cho biết tỷ lệ nhiễm Leptospira là 38,60%. Tôn Thanh Thía (2006), khảo sát 320 mẫu huyết thanh bò sữa ở 7 quận, huyện thuộc Tp. Hồ

Định dạng
Số trang	65
Dung lượng	790,38 KB