ENZYME Vi sinh vật thực nhiều phản ứng hóa học khác Tất phản ứng diễn nhờ có chất xúc tác hữu gọi enzyme Enzyme hình thành tế bào sống ENZYME LÀ CHẤT XÚC TÁC SINH HỌC Vai trò enzyme làm cho phản ứng hóa học diễn thể nhanh chóng, làm tăng tốc độ thủy phân hợp chất hữu phức tạp tốc độ ơxy hóa hợp chất đơn giản Trong đó, enzyme khơng bị tiêu hao không nằm thành phần sản phẩm cuối Nói cách khác, enzyme chất xúc tác điển hình, tổng hợp tế bào sống - ðể phân tử hai chất phản ứng với nhau, ñầu tiên chúng phải gặp Vì thế, tất yếu tố làm tăng tần số va chạm phân tử làm tăng tốc độ phản ứng hóa học Các yếu tố là: tăng nồng chất phản ứng nhiệt độ Tuy nhiên, khơng phải tất phân tử gặp phản ứng với ðể phản ứng diễn ra, phân tử phải trạng thái hoạt tính, nghĩa chúng phải có lượng ñịnh cho phép chúng tham gia phản ứng Lượng lượng bổ sung gọi lượng hoạt hóa Tốc độ phản ứng hợp chất hóa học tùy thuộc tỉ lệ tương quan phân tử trạng thái hoạt tính khơng hoạt tính - Chất xúc tác khơng mang lượng bổ sung vào phản ứng, khơng làm tăng nhiệt độ, lại làm tăng nhiệt độ chất phản ứng hệ xúc tác dị thể Bản chất tác động chất xúc tác làm giảm lượng hoạt hóa cần để thực phản ứng Bởi chất tạo sản phẩm trung gian đòi hỏi lượng hướng phản ứng theo ñường khác Những enzyme làm giảm lượng hoạt hóa có hiệu Ví dụ: để thủy phân saccaro khơng có chất xúc tác, đòi hỏi lượng hoạt hóa 730 KJ/mol; có chất xúc tác ion hydro đòi hỏi lượng hoạt hóa 107,5 KJ/mol; xúc tác enzyme saccharaza cần 39,5 KJ/mol - ðặc điểm chất xúc tác sinh học hoạt tính xúc tác chúng cao Từ thí dụ ta thấy: enzyme làm giảm lượng hoạt hóa hiệu nhiều so với chất xúc tác vô Nói cách khác cần lượng enzyme nhỏ chuyển hóa lượng lớn chất Chẳng hạn 1,6g amylaza nước bọt chuyển hóa 175kg tinh bột; 1g pepxin chuyển hóa 50kg protein trứng luộc sau hai - Tính đặc hiệu enzyme cao: Mỗi loại enzyme tác ñộng vào hay vài chất định mà thơi Chẳng hạn: enzyme amilaza phân giải tinh bột, enzyme maltaza phân giải maltoza, enzyme xenlulaza phân giải xenluloza CẤU TẠO VÀ NHỮNG TÍNH CHẤT CỦA ENZYME Enzyme protein phức hợp bao gồm phần là: Apoenzim, Coenzim phần hoạt hóa kim loại 2.1 Apoenzim Là protein có cấu trúc hóa học xác định • Nó định vị trí diễn phản ứng hóa học • Mỗi enzyme có apoenzim khác • Apoenzim có trách nhiệm tính đặc hiệu phản ứng enzyme Những enzyme phản ứng với hợp chất hay nhóm hợp chất hóa học đặc hiệu ðơi khơng phản ứng Vì lí mà vi sinh vật phải có khả tạo tất apoenzim với cấu trúc hóa học khác Tính đặc hiệu apoenzim định xếp vật lý axit amin tạo nên protein cấu trúc hóa học chất tham gia phản ứng • Phần protein hay apoenzim có phân tử lượng lớn chịu nhiệt yếu • 2.2 Coenzim • Là phần phi protein enzyme • Coenzim xác định loại phản ứng hóa học diễn ðây phần phản ứng (reactive) enzyme • Giống apoenzim, coenzim có cấu trúc hóa học ñịnh • Nhưng khác apoenzim chỗ nhiều coenzim người ta biết cấu trúc hóa học chúng Ví dụ: DPN, ADP CoA Diphosphopyridin nucleotide (DPN) có nhiệm vụ vận chuyển hydro Adenosine diphosphonucleotide (ADP) quan trọng phản ứng chuyển hóa lượng Coenzim A (CoA) chìa khóa để phá vỡ phân tử • Apoenzim có tính đặc hiệu cao phản ứng chúng, coenzim khơng có Một coenzim liên kết với Apoenzim khác để thực phản ứng hóa học hợp chất hóa học khác Tính đa dạng Apoenzim đóng vai trò quan trọng hoạt động sống vi sinh vật Do nhiều enzyme có coenzim khác apoenzim • Apoenzim có phân tử lượng lớn chịu nhiệt, coenzim ngược lại Phần hoạt hóa kim loại: Là cation kim loại, tác động mạch nối enzyme chất để hồn thành phá vỡ chúng (cơ chất) Những cation kim loại hoạt hóa kali (K), canxi (Ca) magiê (Mg), coban (Co), sắt (Fe) kẽm (Zn) mangan (Mn), môlipden (Mo) Phần hoạt hóa kim loại thường nằm thành phần coenzim Ngồi thành phần coenzim có nhiều loại vitamin Sắt đóng vai trò quan trọng q trình ơxi hóa khử Do Enzyme mang chất protit nên người ta phân biệt hai loại: - Enzyme hợp phần hay enzyme protein ðó enzyme thủy phân ñơn axit amin phần lớn enzyme tiêu hóa amylaza, pepxin, trypxin - Enzyme hai hợp phần hay enzyme proteit: Gồm protein (apoenzim) phi protein (coenzim) 3.PHÂN LOẠI ENZYME 3.1 Danh pháp Về cách gọi tên enzyme: trừ số enzyme có tên gọi thơng thường từ lâu quen dùng pepxin, trypxin…, ña số enzyme có tên gọi với –aza 3.2 Phân loại Có nhiều cách phân loại enzyme a Theo kiểu phản ứng mà enzyme xúc tác: chia enzyme thành nhóm lớn + Enzyme nhóm ơxy hóa khử (oxydo- reductaza): Chủ yếu enzyme hai hợp phần, xúc tác cho phản ứng ơxy hóa khử Chúng đóng vai trò vận chuyển hyrdro điện tử q trình hơ hấp lên men Thuộc loại khử hydro có coenzim NAD, NADP, FAD… + Enzyme nhóm chuyển (Transferraza): Gồm enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển vị nhóm ngun tử mà khơng làm thay ñổi hóa trị chất, chẳng hạn chuyển nhóm axit phơtphoric hay nhóm axit amin… từ hợp chất sang hợp chất khác Các phản ứng mà enzyme xúc tác có ý nghĩa quan trọng việc ñảm bảo chuyển vận lượng từ hệ sang hệ khác dạng liên kết phôtphat cao + Enzyme nhóm thủy phân (Hydrolaza): xúc tác cho phản ứng thủy phân, tức phản ứng phân giải tổng hợp liên kết phức protit, lipit…, với tham gia nước Thuộc nhóm có enzyme amylaza, lipaza… + Enzyme nhóm liaza: Xúc tác cho phản ứng phân giải chất, loại nước, tạo thành nối đơi, hay cộng nước vào nối đơi phân tử Enzyme có ý nghĩa quan trọng trao ñổi chất tế bào + Enzyme nhóm đồng phân (Izomeraza): Xúc tác cho chuyển hóa liên kết hữu đồng phân chúng Enzyme nhóm đóng vai trò quan trọng hàng loạt q trình trao đổi chất Thuộc nhóm có triphơtphat – izomeraza, glucophotphat – izomeraza… + Enzyme nhóm tổng hợp (Ligaza hay synthetaza): Xúc tác cho tổng hợp liên kết hữu phức tạp từ liên kết đơn giản mà cần có lượng ATP, NTP,… b Theo chất phản ứng hay chất bị phân hủy Thí dụ: Sucraza: enzyme thủy phân ñường sucroza Lipaza: Thủy phân lipit, chất béo Amylaza: Thủy phân tinh bột c Theo vị trí xúc tác - Enzyme ngoại bào: Là enzyme bề mặt tế bào Chúng gồm dạng có tổ chức cao Những phản ứng diễn ñiểm ñịnh bề mặt tế bào ðó phản ứng thủy phân – nước ñược thêm vào phân tử chất hữu phân giải thành chất có cấu tạo đơn giản Thuộc nhóm chủ yếu enzyme thủy phân - Enzyme nội bào: Nằm bên tế bào, enzyme tham gia vào q trình trao đổi chất Thuộc loại có enzyme thủy phân ơxy hóa Tất phản ứng ơxy hóa diễn bên tế bào mà thơi ðó phản ứng có kèm theo giải phóng lượng cần thiết cho tế bào d Theo cấu tạo: Như nói người ta phân biệt enzyme ñơn giản hợp phần enzyme phức tạp hai hợp phần e Theo ñiều kiện tạo enzyme hay nguồn tạo enzyme: - Enzyme chủ ñộng loại enzyme thường trực, lúc có sẵn tế bào khơng phụ thuộc điều kiện môi trường (chủ yếu enzyme tổng hợp enzyme lượng) - Enzyme thụ ñộng: Tùy thuộc ñiều kiện môi trường tế bào rơi vào môi trường dinh dưỡng khơng bình thường sinh trưởng phát triển chúng hệ thống enzyme phải tạo enzyme để tế bào thích nghi với chất dinh dưỡng ðó enzyme tạm thời Nếu tế bào khơng thể tạo loại enzyme trình tế bào bị ngừng trệ 4.CƠ CHẾ CỦA PHẢN ỨNG ENZYME 4.1 Cơ chế xúc tác Những phản ứng enzyme phản ứng hóa học thuận nghịch, kèm theo giảm lượng Khơng có phản ứng enzyme lại tăng lượng Vì phản ứng thuận nghịch nên phản ứng enzyme phụ thuộc vào nồng ñộ enzyme, nồng ñộ chất phản ứng ban ñầu nồng ñộ sản phẩm cuối Phản ứng enzyme có dạng tổng quát là: Chất phản ứng + enzyme = Chất phản ứng enzyme (dạng phức) = enzyme + Sản phẩm cuối Enzyme hồn ngun trở lại, chất phản ứng chuyển hóa thành sản phẩm cuối Nếu khơng có hồn ngun vi sinh vật phải sức tạo enzyme Vai trò tác dụng enzyme khơng phải tồn phân tử mà hay vài trung tâm hoạt ñộng ñảm nhiệm Thường trung tâm chứa axit amin có nhánh bên hoạt động (Sêrin, hixtidin, xixtedin…) phản ứng qua lại với chất Những nhánh amin khác khơng tham gia vào trung tâm hoạt động bị cải biến, chí bị bỏ mà khơng ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học enzyme R1 + E1 (E1-R1) + E2 (E2- R2) + E3 En + ( Rn- E1a) Rn + E1a (En- Rn1) + En1 Hình Sơ đồ minh họa phản ứng enzyme theo hai dãy nối tiếp Cơ chất hữu (R1) tác ñộng enzyme ban ñầu (E1) ñể tạo phức chất enzyme (R1E1) Enzyme (E1) thực phản ứng hóa học tạo sản phẩm (R2) Nhưng sản phẩm (R2) khơng giải phóng dạng hợp chất tự mà ñược chuyển vận trực tiếp từ phức (R1-E1) sang enzyme (E2) ñể tạo phức (R2-E2) Thực tế enzyme ban ñầu từ bỏ đạt từ chất enzyme ban đầu khơng hồn ngun trực tiếp ñược giữ trạng thái biến tướng (E1a) Tất yếu (E1a) phải hồn ngun trở lại thành (E1) phản ứng hóa học tiếp diễn Như (E1a) từ bỏ chuyển từ chất phản ứng khác kiểu trên, từ loạt chất phản khác lấy phần phân tử mà u cầu để tạo thành (E1) tinh, ñể thực phản ứng Cứ thế, phản ứng diễn tạo sản phẩm cuối giải phóng khỏi vi sinh vật Theo thuyết khác, enzyme có tác dụng giảm lượng hoạt hóa phản ứng Do ảnh hưởng enzyme, phân tử chất biến dạng phân cực Các ñiện tử ñược xếp lại, dẫn đến thay đổi phân bố điện tích, lượng hoạt hóa chất bị giảm ðể minh họa, ta lấy ví dụ trình thủy phân hợp chất A-B Hai phần phân tử A B nối với liên kết hình sóng Trên bề mặt phân tử enzyme có hai vị trí gắn chất (hai điểm lõm) cho hai phần A B Liên kết A B căng ra, yếu ñi, ñiện tử bị chuyển chỗ cuối bị ñứt Hydro nước gắn vào phần (B), nhóm hydroxin nước gắn vào phần (A) chất AB + H2O = HOA + BH Các sản phẩm cuối (BH AOH) tách (Hình 5.2) A B Proâtein A B Proâtein H H A B Proâtein H H O B B Prôtein Hình Sơ đồ hình thành phức chất enzyme–cơ chất theo thuyết biến dạng chất 4.2 Các yếu tố ảnh hưởng ñến phản ứng enzyme Các phản ứng enzyme tùy thuộc nồng độ chất hóa học chất (R1), nồng ñộ ban ñầu enzyme (E1), phức (R1-E1), nồng ñộ enzyme ñã biến tướng (E1a), nồng ñộ chất sản phẩm tạo thành sau phản ứng (R1) yếu tố môi trường pH, nhiệt ñộ… a Tốc ñộ phản ứng enzyme Tốc ñộ phản ứng tăng lên tăng nồng ñộ chất R1 nồng ñộ enzyme E1 giới hạn ñịnh Thực tế, nồng ñộ chất R1 tăng vượt ñiểm tới hạn hình 5.3, tốc độ phản ứng khơng tăng theo tỉ lệ thuận Nồng ñộ enzyme (E1) ñó yếu tố giới hạn Khi tăng nồng ñộ enzyme thứ hai (E2) nồng ñộ chất tạo thành (RI) làm tăng tốc độ phản ứng nhờ việc tách sản phẩm phản ứng ñầu (E1-RI) nhờ hoàn nguyên enzyme (E1a-E1) Ngược lại, (E1-R1) E1a tích lại làm giảm tốc độ phản ứng chúng tạo áp ngược lại ñối với phản ứng Trong hàng loạt chuỗi phản ứng enzyme nối tiếp diễn vi sinh vật tốc độ tồn phần phản ứng bị giới hạn tốc ñộ phản ứng chậm chuỗi Chẳng hạn chuỗi oxy hóa methanol (CH3OH) → Formaldehyde (HCHO) → axit formic (HCOOH) → CO2 + H2O tốc độ phản ứng cuối chậm nhất, axit formic tích lại chuyển từ vi sinh vật vào môi trường Tốc độ phản ứng Nồng độ chất Hình Ảnh hưởng nồng ñộ chất ñối với tốc độ phản ứng enzyme Tốc độ phản ứng 10 20 30 40 50 Nhiệt độ (oC) Hình Ảnh hưởng nhiệt ñộ ñối với tốc ñộ phản ứng enzyme b Ảnh hưởng nhiệt ñộ Ảnh hưởng nhiệt độ đa dạng Nhiệt độ tăng kích thích việc kết hợp enzyme với chất, kích thích tốc độ phản ứng phức hợp enzyme – chất thành sản phẩm phản ứng, nâng cao lực apoenzim với coenzim với chất hoạt hóa (nếu có) việc ion hóa pH… Hình 5.4 cho thấy nhiệt độ tăng 10oC khoảng tới 35oC tốc độ phản ứng tăng lên gấp đơi Có số enzyme khơng ưa nhiệt ñộ 35– 40oC mà thích hợp nhiệt ñộ tới 60- 70oC ðó enzyme vi sinh vật ưa nóng c Ảnh hưởng pH Nồng độ ion hydro, pH ảnh hưởng rõ ñối với phản ứng enzyme (Hình 5.5) ða số enzyme thể hoạt tính xúc tác giới hạn pH định mà thơi Giá trị tối ưu pH số enzyme thấp, ñối với số enzyme khác lại cao Hoạt tính enzyme bị giảm giá trị pH thấp hay cao hai yếu tố: nhóm định chức bị phân ly phần protein bị phân hủy + Phân ly nhóm định chức: Phần protein enzyme bao gồm axit amin Những axit amin có hai nhóm định chức chủ yếu amin (-NH2) cacboxyl (-COOH) Ở dung dịch trung tính, điện tích dương nhóm amin điện tích âm nhóm cacboxyl tổng điện tích phân tử Khi pH giảm, nồng ñộ ion hydro tăng lên, có xu hướng làm tăng dần điện tích dương nhóm amin (-NH+3) Phân tử có điện tích dương giá trị pH thấp Khi tăng pH vượt qua giá trị trung tính làm cho nhiều nhóm cacboxyl bị phân ly thành ion (-COOH = -COO- + H+) ðiện tích chung phân tử enzyme trở nên âm Như vậy, pH thay ñổi làm thay đổi điện tích enzyme làm cho enzyme có xu hướng hút đẩy phân tử khác Tốc độ phản ứng Hydrolaza Deaminaza Decarboxylaza pH Hình Ảnh hưởng pH ñối với tốc ñộ phản ứng enzyme Ở giá trị pH cao, phản ứng enzyme hoạt ñộng nhóm amin enzyme có điện tích âm hút amin có điện tích dương Ở giá trị pH thấp ngược lại + Bản chất enzyme bị khử: Khi nồng ñộ ion hydro ion hydroxyl cao làm cho chất protein enzyme bị khử ða số enzyme bị khử pH = 3-4 Nhưng vi khuẩn oxy hóa lưu huỳnh lại có enzyme chịu đựng pH thấp tới Tảo lại có enzyme hoạt động pH cao khoảng 10-11 ða số vi sinh vật hoạt ñộng giá trị pH tối ưu 5-8 Enzyme tiêu hóa Pepxin có pH tối ưu 1,5 - 2,5, Tripxin - 11 d Những muối kim loại nặng Những muối trung tính clorua amơn, clorua natri, sunphat natri… thường làm cho protein kết tủa từ dung dịch, thay đổi độ hòa tan protein Thường yêu cầu nồng ñộ muối cao (tới 20 – 30%) cho phản ứng kết tủa Những kim loại nặng Cu, Zn, Ca, Mg, Fe… làm kết tủa protein Sử dụng kim loại nặng để kìm hãm hoạt tính enzyme việc quan trọng ngành vi sinh học vệ sinh e Bản chất keo enzyme Enzyme chất cao phân tử tan mà thường keo Hoạt tính bề mặt keo cao làm cho enzyme có tính chất riêng Enzyme vi sinh vật tồn dạng keo lơ lửng nên ngăn ngừa ñược tượng khuếch tán từ tế bào môi trường Vi khuẩn nấm phải thủy phân nhiều hợp chất hữu bên ngồi trước chuyển chất vào tế bào Việc thủy phân hợp chất hữu ngồi tế bào thực nhờ enzyme nằm bề mặt tế bào Khi tế bào già, bề mặt bị phân hủy enzyme phải hình thành Kết giải phóng enzyme thủy phân vào dung dịch người ta gọi thải enzyme vào dung dịch ỨNG DỤNG CỦA ENZYME Những enzyme từ vi sinh vật ñược sử dụng rộng rãi đời sống, cơng nghiệp, nơng nghiệp, y học ðặc biệt enzyme ñược sử dụng kỹ thuật vệ sinh bảo vệ môi trường Những enzyme thường dùng amylaza, proteinaza, xenlulaza, pectinaza • Trong cơng nghiệp thực phẩm, sản xuất rượu bia người ta sử dụng chế phẩm enzyme từ nấm mốc; sản xuất bánh mì, sử dụng amylaza từ Aspergillus oryzae Enzyme proteinaza ñược dùng ñể nâng cao chất lượng thịt, sản xuất nước chấm… • Trong cơng nghiệp dệt enzyme amylaza dùng để khử hồ tinh bột • Trong nơng nghiệp, đặc biệt chăn ni chế biến thức ăn gia súc, loại enzyme xenlulaza, proteinaza, amylaza… ñược sử dụng phổ biến có kết • Trong kỹ thuật môi trường: chế phẩm vi sinh ngày ñược ứng dụng phổ biến xử lý nước, khí, mùi, chất thải rắn ... enzyme vi c quan trọng ñối với ngành vi sinh học vệ sinh e Bản chất keo enzyme Enzyme chất cao phân tử tan mà thường keo Hoạt tính bề mặt keo cao làm cho enzyme có tính chất riêng Enzyme vi sinh. .. ða số enzyme bị khử pH = 3-4 Nhưng vi khuẩn oxy hóa lưu huỳnh lại có enzyme chịu đựng pH thấp tới Tảo lại có enzyme hoạt động pH cao khoảng 10-11 ða số vi sinh vật hoạt ñộng giá trị pH tối ưu... dịch ỨNG DỤNG CỦA ENZYME Những enzyme từ vi sinh vật ñược sử dụng rộng rãi ñời sống, công nghiệp, nông nghiệp, y học ðặc biệt enzyme ñược sử dụng kỹ thuật vệ sinh bảo vệ môi trường Những enzyme thường