Kỹ thuật tách chiết nucleic acid

Môn: SINH HỌC PHÂN TỬ Đề tài: Kỹ Thuật Tách Chiết Nucleic Acid LỚP : ĐHSH07LT NHÓM : 10 GVHD : Trần Hồng Bảo Quyên Các bước phương pháp tách chiết nucleic acid  Các bước tách chiết DNA, RNA, mRNA So sánh tách chiết DNA/ RNA/ mRNA So sánh tách chiết DNA từ thực vật, động vật vi khuẩn Các bước – phương pháp tách chiết ACID NUCLEIC Các bước tách chiết DNA Phương pháp tách chiết DNA gồm bước BƯỚC 1: Phá vỡ màng tế bào màng nhân: − Nghiền tế bào mô hỗn hợp tẩy : SDS, protease thủy phân protein, enzym lysozym, EDTA, Hỗn hợp phá vỡ màng tế bào màng nhân, phóng thích DNA mơi trường đồng thời protein liên kết với DNA tự bị phân hủy Phá vỡ màng tế bào màng nhân Phá vỡ màng tế bào màng nhân Các bước tách chiết DNA BƯỚC 2: Loại bỏ thành phần không DNA, chủ yếu protein  Gây tủa protein dd chloroform: phenol enzym protein K Sau ly tâm ống nghiệm gồm lớp dd: lớp phenol nằm đáy ống nghiệm, protein, dịch lỏng chứa DNA Các tách chiết DNA BƯỚC 3: Làm kết tủa acid nucleic cách thông dụng: − Dùng ethanol nồng độ cao (ethanol: mẫu 2,5: 1) nhiệt độ thấp, mơi trường có lực ion cao (nồng độ muối cao) − Dùng isopropanol (isopropanol:mẫu 1:1), không cần diện muối DNA trọng lượng phân tử thấp không bị kết tủa, loại bỏ khỏi dịch chiết cách Các bước tách chiết DNA  Tủa thu nhận cách thu nhận ly tâm Sau đó, rửa kết tủa vài lần ethanol 70% để loại bỏ muối vết isopropanol dính mẫu, sau xử lý RNase để loại bỏ RNA Thu DNA  Làm khơ hòa tan dd TE nước khử ion để tiếp tục nghiên cứu Sơ đồ tách chiết DNA tổng số 10 Các bước tách chiết mRNA 20 Kỹ thuật siêu ly tâm Phương Pháp ly tâm đẳng tỷ trọng 23 Phương pháp ly tâm đẳng tỷ trọng 25 Phương pháp ly tâm  Ly tâm phân đoạn 26 Phương pháp sắc ký Sắc ký lực polyU - sepharose hay oligodT - cellulose để tinh mRNA  Sắc ký lọc gel phân tách nucleic acid khỏi nucleic tự sau trình đánh dấu DNA RNA  Sắc ký trao đổi ion vi cột để thu hồi lượng nhỏ DNA Sắc ký lỏng cao áp Phương pháp có độ phân giải cao dùng tinh oligonucleotide tổng hợp (độ phân giải nucleotide), plasmid, phân tách đoạn DNA 27 Phương pháp sắc ký Sắc ký lực: poly U-Sepharose hay oligodT-cellulose, dùng để tinh mRNA Sắc ký lỏng hiệu suất cao (high performance liquid chromatography) kỹ thuật có độ phân giải cao dùng tinh oligonucleotide có độ phân gỉai nucleotide, plasmid hay đoạn DNA So sánh tách chiết DNA, RNA mRNA Sự giống nhau: - Các bước tách chiết giống 30 So sánh tách chiết DNA, RNA mRNA DNA RNA mRNA Phá màng tế bào, màng nhân Chất tẩy (SDS) + siêu âm, Thiocyanate guanidinium LiCl, Urea, + học, Thực môi trường vô trùng Loại protein Phenol pH8 Chloroform:IAA Khác Phenol pH4 : Chloroform:IAA Khác Phenol pH4 Thu hồi nucleic acid: Tủa Ethanol tuyệt đối Boom Isopropanol, Lọc Hấp phụ silica Thu màng lọc Ethanol tuyệt đối Isopropanol, Hấp phụ silica Thu màng lọc 31 So sánh tách chiết DNA từ thực vật, động vật vi khuẩn Giống Hầu hết tách chiết loại tế bào động vật, thực vật, vsv theo nguyên lý gồm bước: phá vỡ màng tế bào, làm biến tính loại ngồi DNA (protein, RNA, ) để thu dịch có chứa DNA, kết tủa thu nhận DNA 32 So sánh tách chiết DNA từ thực vật, động vật vi khuẩn Mẫu Thực vật Động vật Lá, rễ, thân,… Tế bào gan, cơ, tim,… Plasmid, E coli Trước tách chiết phải nghiền, thêm vào tác dụng hóa chất để phá hủy thành tế bào cellulose   Trước tách chiết phải nghiền sơ,thêm vào tác dụng hóa chất để phá hủy màng tế bào Thường cho thêm Proteinase K để bất Thường cho thêm hoạt DNase Proteinase K để bất RNase hoạt DNase RNase tế bào động vật giàu protein nên thường cho thêm enzyme xúc tác Vi khuẩn Chỉ cần dùng hóa chất để phá vỡ màng tế bào Phải thêm công đoạn ly tâm đầu trình để thu nhận tế bào vsv Tế bào vsv không cần cho thêm chất bất hoạt DNase RNase 33 34 ... tách chiết nucleic acid  Các bước tách chiết DNA, RNA, mRNA So sánh tách chiết DNA/ RNA/ mRNA So sánh tách chiết DNA từ thực vật, động vật vi khuẩn Các bước – phương pháp tách chiết ACID NUCLEIC. .. nhận lại qua ly tâm mRNA tách khỏi viên bi giữ lại Kĩ thuật cho phép thu nhận mRNA từ mẫu có khối lượng nhỏ 18 Các bước tách chiết mRNA 19 Các bước tách chiết mRNA 20 Kỹ thuật siêu ly tâm Phương... độ phân gỉai nucleotide, plasmid hay đoạn DNA So sánh tách chiết DNA, RNA mRNA Sự giống nhau: - Các bước tách chiết giống 30 So sánh tách chiết DNA, RNA mRNA DNA RNA mRNA Phá màng tế bào, màng