Chiết xuất và phân lập các isoflavonoid từ diếp cá

Từ thời xa xưa ông cha ta đã biết sử dụng và bào chế ra những phương thuốc y học cổ truyền từ những dược liệu có nguồn gốc tự nhiên. Ngày nay cùng với sự phát triển của kỹ thuật hiện đại và tiên tiến, nhiều loại thuốc đã được ra đời. Nhờ sự phát triển của hóa học và dược học, một số hoạt chất có trong dược liệu thảo mộc được phân lập, tinh chế, xác định cấu trúc hóa học, tác dụng dược lý và sử dụng dưới dạng tinh khiết. Tuy nhiên, đối với thuốc có nguồn gốc hóa dược, ngoài những ưu điểm nổi bật như hiệu quả điều trị cao, dễ sản xuất, dễ sử dụng và bảo quản, thì vấn đề hạn chế lớn nhất cần phải quan tâm chính là những tác dụng phụ và độc tính kèm theo, đặc biệt trong trường hợp điều trị lâu dài đối với các bệnh mãn tính. Vì vậy ngày nay người ta có xu hướng trở về với tự nhiên. Đất nước Việt Nam ta với nguồn tài nguyên dược liệu dồi dào, phong phú là một thuận lợi trong việc nghiên cứu và điều chế ra những loại thuốc có nguồn gốc tự nhiên để phục vụ cho nhu cầu chăm sóc sức khỏe con người. Với điều kiện khí hậu nhiệt đới gió mùa, nước ta được xem là mảnh đất màu mỡ cho sự phát triển của các chủng loại cây cỏ, trong đó có không ít loại cây được sử dụng làm thuốc rất hiệu quả. Có những loại dược liệu thảo mộc hết sức thông dụng trong dân gian, nhưng lại được các nhà khoa học chứng minh là có tác dụng trị liệu không thua kém gì so với các loại thuốc tân dược hiện nay. Điển hình là Diếp cá, được công nhận là có khả năng trị ho, mụn nhọt, áp xe phổi, giải độc gan, chống oxy hóa, đặc biệt là chữa bệnh trĩ rất hiệu quả [9]. Chính vì vậy, bài báo cáo này sẽ đưa ra những thông tin về cây Diếp cá, kỹ thuật chiết xuất và phân lập flavonoid từ cây Diếp cá trong phạm vi mà chúng em đã tìm hiểu được, để làm sáng tỏ hơn thông tin về dược liệu này

MỤC LỤC i

CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

2.1 TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT HỌC 2

2.1.1 Mô tả thực vật 3

2.1.2 Phân bố, sinh thái 3

2.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC 3

2.3 CÔNG DỤNG 8

2.4 TÁC DỤNG DƯỢC LÝ VÀ CÁC NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG 8

2.6 CÁC CHẾ PHẨM CÓ CHỨA DIẾP CÁ TRÊN THỊ TRƯỜNG 11

2.7 CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ TRONG PHÂN TÍCH FLAVONOID 11

2.7.1 Sắc ký lớp mỏng 11

2.7.2 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) trong phân tích flavonoid 13

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM 14

3.1 QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT CAO DIẾP CÁ 14

3.2 QUY TRÌNH PHÂN LẬP FLAVONOID TRONG CAO DIẾP CÁ 14

3.2.1 Phương pháp sắc ký cột 14

3.2.1.1 Phân tách các phân đoạn bằng phân bố lỏng-lỏng 14

3.2.1.2 Phân lập flavonoid từ cao A2 bằng SKC chân không 16

3.2.2 Phương pháp HPLC điều chế 22

3.2.2.1 Lựa chọn pha tĩnh 22

3.2.2.2 Lựa chọn phương pháp 22

3.2.2.3 Sự lựa chọn dung môi 23

3.2.2.4 Điều kiện HPLC điều chế quercetin 24

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ NHẬN ĐỊNH 25

4.1 KẾT LUẬN 25

4.2 NHẬN ĐỊNH 25

TÀI LIỆU THAM KHẢO 26

CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Từ thời xa xưa ông cha ta đã biết sử dụng và bào chế ra những phương thuốc y học

cổ truyền từ những dược liệu có nguồn gốc tự nhiên Ngày nay cùng với sự pháttriển của kỹ thuật hiện đại và tiên tiến, nhiều loại thuốc đã được ra đời Nhờ sự pháttriển của hóa học và dược học, một số hoạt chất có trong dược liệu thảo mộc đượcphân lập, tinh chế, xác định cấu trúc hóa học, tác dụng dược lý và sử dụng dướidạng tinh khiết Tuy nhiên, đối với thuốc có nguồn gốc hóa dược, ngoài những ưuđiểm nổi bật như hiệu quả điều trị cao, dễ sản xuất, dễ sử dụng và bảo quản, thì vấn

đề hạn chế lớn nhất cần phải quan tâm chính là những tác dụng phụ và độc tính kèmtheo, đặc biệt trong trường hợp điều trị lâu dài đối với các bệnh mãn tính Vì vậyngày nay người ta có xu hướng trở về với tự nhiên

Đất nước Việt Nam ta với nguồn tài nguyên dược liệu dồi dào, phong phú là mộtthuận lợi trong việc nghiên cứu và điều chế ra những loại thuốc có nguồn gốc tựnhiên để phục vụ cho nhu cầu chăm sóc sức khỏe con người Với điều kiện khí hậunhiệt đới gió mùa, nước ta được xem là mảnh đất màu mỡ cho sự phát triển của cácchủng loại cây cỏ, trong đó có không ít loại cây được sử dụng làm thuốc rất hiệuquả Có những loại dược liệu thảo mộc hết sức thông dụng trong dân gian, nhưnglại được các nhà khoa học chứng minh là có tác dụng trị liệu không thua kém gì sovới các loại thuốc tân dược hiện nay Điển hình là Diếp cá, được công nhận là cókhả năng trị ho, mụn nhọt, áp xe phổi, giải độc gan, chống oxy hóa, đặc biệt là chữabệnh trĩ rất hiệu quả [9]

Chính vì vậy, bài báo cáo này sẽ đưa ra những thông tin về cây Diếp cá, kỹ thuật chiếtxuất và phân lập flavonoid từ cây Diếp cá trong phạm vi mà chúng em đã tìm hiểu được,

để làm sáng tỏ hơn thông tin về dược liệu này

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT HỌC

Cây Diếp cá còn có tên là cây Giấp cá, Lá giấp, Ngư tinh thảo Tên khoa học là

Houttuynia cordata Thunb Saururaceae, để tôn vinh Marteen Houttuyn là thầy

thuốc nhà thực vật học Hà Lan, chuyên về Rêu và Quyết thực vật Tên tiếng Anh

của nó là heartleaf (lá hình tim) hay lizardtail (đuôi thằn lằn) [4], [9], [15].

Sơ đồ 2.1 Phân loại khoa học cây Diếp cá

Chi Diếp cá (Houttuynia Thunb.)

Diếp cá (Houttuynia cordata Thunb.)

Phân lớp Ngọc lan (Magnoliidae)

2.1.1 Mô tả thực vật

Diếp cá là một loại cây thảo, sống lâu năm, có thân rễ mọc ngầm dưới đất Phầnthân trên mặt đất cao 15-50 cm, màu lục hoặc tím đỏ Lá mọc so le Cuống lá dài.Phiến lá hình tim dài 4-6 cm, rộng 3-4 cm, có 5-7 gân gốc [2], [6], [11]

Hoa nở vào tháng 5 – 8 Cụm hoa hình bông dài 2,5 cm bao bởi 4 lá bắc màu trắng, trongchứa nhiều hoa nhỏ màu vàng nhạt Trông toàn bộ bề ngoài của cụm hoa và lá bắc giốngnhư một cái hoa đơn độc Quả nang mở ở đỉnh; hạt hình trái xoan, nhẵn [4]

2.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC

Thành phần hóa học của Diếp cá gồm có: flavonoid, tinh dầu, alkaloid và một sốthành phần khác [1], [13]

*Flavonoid

Diếp cá có chứa thành phần flavonoid hết sức phong phú Các flavonoid đáng chú ýtrong Diếp cá có thể kể đến như quercetin, quercitrin, isoquercitrin [1], [10], [12],[32] Ngoài ra, còn có một số flavonoid khác cũng không kém phần quan trọng:

O

OO

H

OH

O O

O O O

O

O O

H

H H

H

O O

quercitrin isoquercitrin

O O

O

O O

H

H H

O O

O O O

O

O O

H

H

H

O H

O O O O

O H

O H

H

H H

Một số công bố gần đây cho thấy thành phần và hàm lượng tinh dầu Diếp cá khác nhautuỳ theo nguồn gốc và quá trình phơi sấy khô:

- Tinh dầu Diếp cá khô mọc tại miền Bắc Việt Nam có 31 hợp chất, trong đó có 4hợp chất chiếm thành phần chủ yếu gồm β-pinen (3,15%), 2-undecanon (15,15%),propen 1-methoxy-2 methyl (12,12%), 1R-α-pinen (11,03%) Tinh dầu Diếp cá tươi

có 34 thành phần, và hàm lượng tinh dầu trong Diếp cá tươi gấp 4,3 lần hàm lượngtinh dầu trong Diếp cá khô [7]

- Tinh dầu Diếp cá mọc tại miền Nam có 19 hợp chất trong đó thành phần chủ yếu

là 2(10) – pinen, (1S, 5S)-(-) (82,84%); ocimen (6,15%); keton methyl nonyl(6,44%) [5]

- Diếp cá tươi mọc tại Trung Quốc có 38 thành phần, trong khi đó thành phần tinhdầu trong Diếp cá khô chỉ có 22 hợp chất: β-mycen (3,47%), L-nonanol (6,21%), α-terpineol (13,24%), methyl nonyl keton (35,2%), bornyl acetat (5,52%), n-decanoicacid (10,58%), caryophyllen (3,41%), docosanoic acid ethyl ester (5,34%) [13]

*Alkaloid

Một số alkaloid có hoạt tính sinh học được tìm thấy trong cây Diếp cá là:aristolactam A, aristolactam B, piperolactam A, norcepharadion B, cepharadion A,cepharadion B, splendidin [15]

piperolactam A norcepharadion B

N O

*Các thành phần khác

Trong cây Diếp cá còn có nhiều các thành phần như là: nước 91,5%, protid 2,9%,lipid 0,5%, cellulose 1,8%, dẫn xuất không protein 2,2%, khoáng chất toàn phần1,1% (trong đó có calcium, kali, caroten và vitamin C) [7], [8]

Người ta còn tìm thấy trong thành phần Diếp cá có chứa Fe, Mg, Mn, đây là nhữngkhoáng chất rất cần thiết cho cơ thể [13]

2.3 CÔNG DỤNG

Rau Diếp cá là một loại rau rất quen thuộc trong bữa ăn hàng ngày của người ViệtNam Ngoài công dụng được xem như một vị rau ngon, Diếp cá còn có rất nhiềunhững công dụng khác

Theo Đông y, Diếp cá có vị đắng, tính ôn, tác dụng vào các kinh mạch Đại tràng vàPhế, vì vậy có tác dụng:

- Giải nhiệt và giải độc, làm giảm sưng viêm, trị ung nhọt trong các trường hợp ungnơi phổi, do hỏa vượng tại Phế với đờm dày đặc màu vàng xanh, trị ho ra máu

- Giải độc ung nhọt ngoài da, chữa vết thương do rắn cắn hay côn trùng cắn

- Làm thông thoát khí ứ đọng, giúp tiêu hóa tốt và lợi tiểu

- Đặc biệt tác dụng chữa bệnh trĩ rất hiệu quả, do có khả năng bảo vệ làm bền thànhmao mạch [13]

2.4 TÁC DỤNG DƯỢC LÝ VÀ CÁC NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG

*Tác dụng kháng khuẩn

Diếp cá có khả năng chống lại Herpes type I và II Trong đó khả năng chống lại

Herpes type II mạnh hơn so với type I.

Ngoài ra Diếp cá còn có tác dụng ngăn cản sự sinh sản của các vi khuẩn

Streptococcus pneumonia (gây sưng phổi) và Staphylococcus aureus (gây mụn nhọt

có mủ)

Tác dụng trên các vi khuẩn Shigella, Salmonella và E.coli (gây kiết lỵ, tiêu chảy) thì

yếu hơn

Diếp cá còn có khả năng diệt được Gonococcus (gây bệnh lậu mủ) và ngăn cản sự

phát triển của các siêu vi trùng cảm cúm [13]

*Tác dụng kháng viêm

Hoạt chất trong Diếp cá có khả năng chống sưng viêm và làm hạ sốt Là do các acidbéo trong lá khô có khả năng ngăn chặn sự tổng hợp prostaglandin-thủ phạm gây raphản ứng sưng viêm (do phản ứng loại ức chế cyclooxygenase) [13]

Diếp cá còn được dùng để điều trị hen suyễn, viêm mũi dị ứng do tác dụng ức chếphản ứng quá mẫn qua trung gian tế bào Mast

*Tác dụng trên hệ miễn nhiễm

Chất decanoyl acetaldehyde trong Diếp cá có khả năng làm tăng tính thực bào củacác tế bào bạch cầu, đồng thời cũng tăng tỷ lệ properdin nên giúp tăng khả năng của

hệ miễn nhiễm chống lại các bệnh tật, tăng sức đề kháng để ngăn ngừa các bệnh dosiêu vi trùng [13]

*Tác dụng lợi tiểu

Tác dụng này có được có thể là do liên quan đến các chất quercitrin, isoquercitrin

và muối kali trong cây Diếp cá

Khi dùng dịch chiết nước Diếp cá để ngâm tưới trên thận của cóc và chân của ếchthì nhận thấy các vi mạch máu giãn nở, làm gia tăng sự lưu thông của máu và tạo ra

sự tăng bài tiết nước tiểu Chất isoquercitrin còn có tác dụng làm tăng sự bền chắccủa các vi mạch máu

Vì vậy các bệnh nhân cao huyết áp nên ăn thêm Diếp cá để giúp lợi tiểu, hạ huyết

áp, đồng thời giúp mạch máu vững chắc hơn [13]

*Tác dụng trên hệ hô hấp

Khi chích dung dịch nước Diếp cá qua màng phúc mô thỏ tác dụng hạ ho được nhậnthấy rõ rệt Khả năng trị bệnh nhiễm trùng đường hô hấp của Diếp cá cũng đã đượcchứng minh rõ ràng:

-Khi dùng liều cao (60 g) để trị bệnh sưng phổi có ung nhọt, kết quả rất tốt, ungnhọt biến mất và không để lại di chứng sau 2 tuần điều trị

-Dịch chiết nước Diếp cá cũng rất hữu hiệu khi trị các bệnh ho do phổi bị tắc nghẽnkinh niên [13]

*Tác dụng chống oxy hoá

Diếp cá có tác dụng kháng bleomycin (chất gây ra sự xơ hoá phổi ở chuột) Mặc dùdịch chiết nước Diếp cá có tác dụng dọn sạch gốc tự do và tác dụng ức chế oxy hoáxanthin yếu hơn vitamin E nhưng hoạt tính ức chế sự peroxid hoá lipid tế bào gan ởchuột tương đương với vitamin E

Diếp cá có chứa các hợp chất flavonoid như phloretin-2’-0-β-D-glucopyranosid,quercetin-3-0-β-D-galactopyranosid có tác dụng đối với sự peroxy hóa lipidmàng tế bào gan bằng cách hạn chế quá trình peroxy góp phần bảo vệ tế bào vàduy trì sự hoạt động bình thường của tế bào [9]

*Tác dụng kháng tế bào ung thư

Dịch chiết nước Diếp cá có tác dụng chống lại quá trình oxy hóa và đột biến gen.Nồng độ polyphenol trong dịch chiết nước cao hơn dịch chiết methanol, và khảnăng kháng đột biến gen của dịch chiết nước cao hơn dịch chiết methanol

Dịch chiết aceton 70% trong nước của cây Diếp cá có chứa các hợp chất flavonoidnhư phloretin-2’-0-β-D-glucopyranosid, quercetin-3-0-β-D-galactopyranosid có khả

năng kháng ung thư ở các dòng tế bào ung thư Sarcoma-180 trong thử nghiệm in

vitro và in vivo gây ung thư trên chuột.

Các alkaloid được tìm thấy trong dịch chiết methanol của cây Diếp cá có tác dụngchống lại 5 dòng tế bào u ở người (A-549, SK-OV-3, SK-MEL-2, XF-498 và HCT-15)

2.6 CÁC CHẾ PHẨM CÓ CHỨA DIẾP CÁ TRÊN THỊ TRƯỜNG

- HELAF (viên nang mềm), sản phẩm của Công ty cổ phần Dược Hậu Giang.

Thành phần gồm cao khô Diếp cá, cao khô Rau má Tác dụng hỗ trợ điều trị trĩ, táobón và kiết lỵ

- CENDITAN (viên nang mềm), sản phẩm của Công ty cổ phần dược phẩm 3/2.

Thành phần gồm cao Diếp cá, bột Rau má Tác dụng trị trĩ, táo bón

- RUTON (trà túi lọc), sản phẩm của Công ty cổ phần dược phẩm OPC Thành

phần gồm rau Diếp cá, nụ Hòe Tác dụng thanh nhiệt, giải độc, lợi tiểu

- TROXITON (viên bao phim), sản phẩm của Công ty cổ phần Dược Danapha.

Thành phần gồm Bạch truật, Đương quy, Trần bì, Cam thảo, Diếp cá, Đảng sâm,Hoàng kỳ Tác dụng chữa bệnh trĩ, bồi bổ cơ thể, giúp lưu thông máu huyết, trợ tiêuhóa, kháng khuẩn kháng viêm

- TRISELAN (viên nang), sản phẩm của Công ty cổ phần dược phẩm Đông Dược

5 Thành phần gồm Diếp cá, Hòe hoa, Kim ngân hoa, Sinh địa, Hoàng liên, Đươngquy, Thăng ma, Chỉ xác, Trắc bách diệp, Cam thảo Tác dụng bồi bổ cơ thể, thanhnhiệt, an thần, hạ huyết áp

- TRĨ LINH ĐƠN (hoàn cứng), sản phẩm của Công ty cổ phần Dược Danapha.

Thành phần gồm Bạch truật, Đương quy, Trần bì, Cam thảo, Diếp cá, Đảng sâm,Hoàng kỳ Tác dụng chữa bệnh trĩ, bồi bổ cơ thể, giúp lưu thông máu huyết, trợ tiêuhóa, kháng khuẩn kháng viêm

2.7 CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ TRONG PHÂN TÍCH FLAVONOID

2.7.1 Sắc ký lớp mỏng

Các chất hấp phụ thường dùng phân tích flavonoid là polyamid, silica gel, cellulose.Polyamid: tách flavonoid theo 2 cơ chế vừa hấp phụ vừa phân bố tùy theo hệ dung môidùng

Acid acetic 15% (v/v) trong nước.

Hai hệ này được sử dụng cho sắc ký 2 chiều; chiều 1: TBA, chiều 2: acid acetic 15%.Silicagel: Các glycosid nhất là glycosid của flavon, flavanol không thích hợp đốivới silicagel, nhưng nếu dùng thì chọn hệ dung môi phân cực như EtOAc-BuOH-

CH3COOH-H2O (5:3:1:1) hoặc n-BuOH-HCl 2N (1:1, lớp trên)

Flavon, flavonol và biflavonoid nếu có nhiều nhóm methoxy hoặc acetyl dùng hệdung môi kém phân cực

Bezen-EtOAc (3:1)

CH3Cl-MeOH (15:1)Benzen-aceton (9:1)Toluen-aceton (19:1)Các flavon, flavonol phân cực hơn như apigenin (5,7,4’-OH), luteolin (5,7,3’,4’-OH), kaempferol (3,5,7,4’-OH), quercetin (3,5,7,3’,4’-OH), myricetin (3,5,7,4’,5’-OH) thì dùng các hệ dung môi phân cực hơn như:

Toluen-CHCl3-aceton (8:5:7)CHCl3-EtOAc-acid formic (5:4:1)

♦ Thuốc thử phát hiện

H2SO4 đặcSắt (III) clorid trong MeOH.

Sắt (III) clorid + Fericyanua K (1:1) dung dịch nước

NaOH trong MeOH 1% phát hiện hầu hết các flavonoid

2.7.2 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) trong phân tích flavonoid

Các điều kiện thường dùng trong phân tích hợp chất flavonoid

Flavonoid là những hợp chất phân cực do đó khi áp dung kỹ thuật HPLC phân tíchcác flavonoid người ta thường dùng cột pha đảo C18 và các dung môi phân cực làmpha động, phát hiện với các detector DAD, UV-vis

Các loại cột C18 thường dùng trong phân tích flavonoid:

Các pha động thường dùng trong phân tích flavonoid:

Acid citric 0,6%/H2O-acetonitril-isopropanol (100:47:5)Isopropanol-THF (65:25) (A)-acetonitril (B)-H3PO4 0,5%/H2O (C)Acetonitril-H2O tỷ lệ thay đổi

MeOH-acid acetic-H2O (30:1:70)MeOH-acetonitril-đệm phosphat pH = 3,0 (20:10:70)Với detector DAD thường phát hiện flavonoid ở các bước sóng từ 250-370 nm

Bột Diếp cá (6 kg) được làm ẩm với cồn 96% trong 2 giờ, nạp vào bình ngấm kiệt,thêm cồn vào bình chiết, ngâm trong 12 giờ Rút dịch chiết ở tốc độ 10 – 12giọt/phút cho đến khi dịch chiết nhạt màu, gộp toàn bộ dịch chiết cồn, cô thu hồi dung

môi dưới áp suất giảm được dịch chiết đậm đặc (ký hiệu A)

3.2 QUY TRÌNH PHÂN LẬP FLAVONOID TRONG CAO DIẾP CÁ 3.2.1 Phương pháp sắc ký cột

3.2.1.1 Phân tách các phân đoạn bằng phân bố lỏng-lỏng

Dịch A (mục 3.1.1.) được pha loãng với 1 lít nước, lắc phân bố với CHCl3 đến khidịch CHCl3 không còn cho màu xanh nhạt với TT FeCl3 5%, dịch CHCl3 được rửanước nhiều lần, gộp các dịch CHCl3, cô thu hồi dung môi được cao A1 (12 g).

Dịch A còn lại được lắc phân bố với ethyl acetat đến khi dịch ethyl acetat khôngcòn cho màu xanh rêu đậm với TT FeCl3 5%, rửa dịch ethyl acetat với 100 ml nước

cất, gộp các dịch ethyl acetat, cô thu hồi dung môi được cao lỏng A2 (54 g) A2

được dùng làm mẫu để phân lập các flavonoid bằng sắc ký cột nhanh (VLC)

Dịch A còn lại tiếp tục được lắc phân bố với n-butanol đến khi dịch n-butanolkhông còn cho màu xanh đen với TT FeCl3 5% Dịch n-butanol thu được, rửa nước

nhiều lần, gộp các dịch n-butanol, cô thu hồi dung môi được cao A3 (7 g).

Định tính flavonoid trong các cao A1, A2, A3 bằng phản ứng cyanidin và sắc ký lớp mỏng Kết quả: phân đoạn 2 - cao A2 giàu flavonoid nhất so với phân đoạn 1 và phân đoạn 3, do đó A2 được dùng để phân lập các flavonoid bằng sắc ký cột.

Khảo sát một số hệ dung môi, tiến hành thăm dò trên sắc ký lớp mỏng tráng sẵn(silica gel F254), phát hiện bằng TT FeCl3 5%, TT vanilin-sulfuric, soi UV 254 nm,

UV 365 nm và thu được kết quả như sau:

để các vết tách gọn hơn

b Phân lập flavonoid bằng sắc ký cột chân không (Cột 1)

Điều kiện sắc ký

Cột thủy tinh xốp 5 x 30 cm, đã xử lí bằng sulfocromic, rửa sạch, sấy khô.

Pha tĩnh: Silica gel 60, cỡ hạt 0,015-0,04 mm, khối lượng 150 g, được tẩm với 7 mlacid formic, lắc đều, sấy ở 120oC/2 giờ trong hộp kín