Nghiên cứ hệ phiên mã từ mô cơ của tôm sú penaeus monodon tại việt nam

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT oOo LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC NGHIÊN CỨU HỆ PHIÊN MÃ TỪ MÔ CƠ CỦA TÔM SÚ PENAEUS MONODON TẠI VIỆT NAM NGÀNH: SINH HỌC THỰC NGHIỆM MÃ NGÀNH: 60420114 Giáo viên hƣớng dẫn: PGS.TS Đinh Duy Kháng Học viên thực : Nguyễn Thị Minh Thƣ Khóa học : 2012 - 2014 LỜI CÁM ƠN Hà Nội, 2014 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn trước tiên tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới PGS.TS Đinh Duy Kháng Phòng vi sinh vật học phân tử, Viện công nghệ sinh học người ln tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tơi suốt thời gian thực luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Đồng Văn Quyền, Trưởng Phòng vi sinh vật học phân tử, Phó viện trưởng Viện công nghệ sinh học tạo điều kiện tốt cho nghiên cứu thực luận văn phòng Qua tơi xin cảm ơn TS Nguyễn Thị Tuyết Nhung, ThS Hà Thị Thu, ThS Nguyễn Thị Hoa, cô chú, anh chị cơng tác phòng Vi sinh vật học phân tử, người ln tận tình bảo giúp đỡ lĩnh vực chuyên môn với tinh thần làm việc khoa học nghiêm túc Trong thời gian thực tập, lãnh đạo phòng chú, anh chị phòng giúp tơi trưởng thành nhiều Tôi xin chân thành cảm ơn thầy, cô giáo Trường Đại Học Thái Nguyên, Viện Sinh Thái Tài Nguyên Sinh Vật, Viện Công Nghệ Sinh Học hướng dẫn truyền thụ kiến thức cho thời gian học tập nghiên cứu Cuối xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới người than gia đinh tôi, bạn bè đồng nghiệp tạo điều kiện, động viên giúp đỡ suốt thời gian làm luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn tất giúp đỡ quý báu đó./ Hà nội, ngày 21 tháng 12 năm 2014 Học viên: Nguyễn Thị Minh Thư Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tên đầy đủ cDNA Complementary ddNTP Dideoxyribonucleotide DNA Deoxyribonucleotide axit dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate EST Expressed sequence tag FC Flow Cell GO Gene Ontology Kb Kilo base KEGG Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes mRNA RNA thông tin NGS Next Generation Sequencing PCR Polymerase Chain Reaction RFLP Restriction Fragement Length Polymorphism RNA Ribonucleotide axit SBL Sequencing By Ligation SBS Sequencing By Synthesis TF Transcription factor Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn MỤC LỤC CHƢƠNG I: MỞ ĐẦU 1.1 1.2 Đặt vấn đề Mục tiêu đề tài CHƢƠNG II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Đại cƣơng Tôm Sú 2.1.1 Đặc điểm sinh học Tôm Sú 2.1.2 Khả thích ứng với điều kiện mơi trƣờng 2.1.3 Đặc điểm sinh trƣởng Tôm Sú 2.2 Tầm quan trọng việc lập đồ giải mã hệ gen Tôm Sú 10 2.3 Các cơng trình nghiên cứu Tơm Sú 12 2.3.1 Tình hình nghiên cứu Thế giới 13 2.3.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 14 2.4 Khái quát hệ phiên mã 16 2.5 Giới thiệu công nghệ giải trình tự hệ 18 CHƢƠNG III: VẬT LIỆU, NỘI DUNG, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 3.1 Vật liệu 27 3.1.1 Đối tƣợng 27 3.1.2 Trang thiết bị 27 3.1.3 Sinh phẩm 27 3.2 Nội dung nghiên cứu 28 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 29 3.3.1 Phƣơng pháp tách chiết tinh chế mRNA tổng số từ mô Cơ 29 3.3.3 Gắn Adaptor 32 3.3.4 Khuếch đại đoạn DNA gắn Adaptor 32 CHƢƠNG IV : KẾT LUẬN VÀ THẢO LUẬN KẾT LUẬN KIẾN NGHỊ 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn DANH MỤC HÌNH Hình Hình ảnh tôm sú Hình 2: Vòng đời Tơm sú Hình 3: Tơm sú thu từ vùng biển Nghệ An 27 Hình FC chứa kênh (A), kênh FC (B) đƣợc gắn hàng triệu primer xuôi (F) ngƣợc (R) liên kết cộng hóa trị Các mồi bắt cặp bổ sung với đầu gắn adaptor đoạn cDNA tổng hợp từ phân đoạn mRNA tôm sú 34 Hình Tổng hợp sợi DNA nhờ Taq DNA polymerase, primer gắn FC khuôn cDNA sợi đơn gắn adaptor tổng hợp từ mRNA mô tôm sú 35 Hình Sợi DNA tổng hợp gắn với vị trí định FC 35 Hình Đầu 3’ sợi tổng hợp bắt cặp bổ sung với primer xi (F) gắn FC q trình kéo dài chuỗi nhờ Taq lại xảy 36 Hình Quá trình hình thành cụm (Cluster) DNA đồng vị trí FC nhờ hình thành cầu nối (A) khuếch đại cầu nối (B), biến tính tạo mạch thẳng (C) cắt bỏ sợi nghĩa khỏi FC (D) 36 Hình Giải trình tự việc bổ sung primer giải trình tự bắt cặp bổ sung với adaptor đầu 3’ sợi gắn FC (A) kéo dài chuỗi nhờ Taq DNA polymerase với bazơ gắn chất màu khác theo nguyên lý kết thúc hồi tính (Reversible Terminator, B) 37 Hình 10 Các bƣớc tách chiết, tinh chế phân cắt tổng hợp cDNA 39 Hinh 11 Các bƣớc gắn adaptor, khuếch đại PCR chọn đoạn gen có độ dài thích hợp để giải trình tự 41 Hình 15 Chất lƣợng trình tự theo vị trí trình tự đọc mơ sau tiền xử lý 45 Hình 16 Chất lƣợng trình tự theo vị trí trình tự đọc mơ sau tiền xử lý 45 Hình 17 Thống kê độ dài tồn trình tự đọc mơ sau tiền xử lý 45 Hình 18 Phân bố Contigs theo độ dài lắp ráp 46 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn CHƢƠNG I: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Nuôi trồng thuỷ sản ngành kinh tế quan trọng đóng góp phần đáng kể thị phần xuất Việt Nam nhƣ nhiều quốc gia khu vực Trong đó, ngành ni tơm ngành mũi nhọn mang lại nguồn ngoại tệ lớn Chiến lƣợc phát triển ngành nuôi trồng tôm sú Việt Nam nhƣ nƣớc khu vực để có đƣợc ngành sản xuất tôm sú bền vững, hạn chế đƣợc tối thiểu tác động tiêu cực đến môi trƣờng, sinh thái Nền tảng cho chiến lƣợc phát triển phát triển nguồn tơm địa với chƣơng trình nhân giống khoa học để nâng cao tỷ lệ sống tăng trƣởng Để đạt đƣợc mục đích này, việc nghiên cứu cấu trúc chức toàn hệ gen (genome) tôm sú vấn đề khoa học có định hƣớng ứng dụng quan trọng Tơm sú (Penaeus monodon) lồi thủy sản đƣợc nuôi trồng mang lại lợi nhuận lớn nhờ xuất cho nhiều quốc gia châu Á - Thái Bình Dƣơng (Thái Lan, Việt Nam, Hàn Quốc, Đài Loan, Malaysia, Indonesia, Ấn Độ, Autralia v.v ) Năm 2008, tổng sản lƣợng tơm tồn giới đạt triệu tấn, đạt giá trị thƣơng mại 10 tỷ USD, chiếm 16% tổng kim ngạch xuất hải sản (Leu cs, 2010) Riêng Việt Nam, theo Hội nghị tổng kết xuất tôm năm 2012 VASEP tổ chức vào ngày 28/12/2012 thành phố Hồ Chí Minh kim ngạch xuất tơm năm 2012 đạt khoảng 2,25 tỷ USD Ngày 2/11/2014, hội nghị tổng kết nuôi tôm nƣớc lợ 2014 cho biế t: tháng đầu năm 2014 xuấ t khẩ u tôm của Viê ̣t Nam đa ̣t gầ n 2,94 tỷ USD , tăng 42% so với cùng kỳ Đến cuối năm dự báo xuất tôm đạt mức 3,8 tỷ USD Xuất tôm nhiều năm liền độc chiếm đầu, chiếm 50% tỷ trọng xuất thuỷ sản nƣớc Ở nƣớc ta nghề nuôi tôm sú Penaeus monodon phát triển mạnh năm gần Thống kê cho thấy, năm 2012 tổng diện tích ni tơm nƣớc 530000 héc ta (ha) Dự kiến năm 2014, số tăng lên Số hoá Trung tâm Học liệu – 1ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn đến 600000 sản lƣợng dự kiến 270000 Sản lƣợng nuôi tôm sú qua năm tăng mạnh kéo theo giá trị xuất tôm sú tăng nhanh tạo nguồn lợi đáng kể cho kinh tế nƣớc ta.Việt Nam xuất tơm vào 92 thị trƣờng, tơm sú chiếm 50% giá trị xuất mặt hàng tôm Tuy nhiên, nghề nuôi tôm nƣớc ta hàng năm chịu thiệt hại lớn dịch bệnh, dịch bệnh virus đóng vai trò chủ yếu Vì vậy, việc kiểm tra, phát kịp thời tác nhân gây bệnh để đề biện pháp phòng chống, giảm thiểu thiệt hại tới mức thấp cho ngành nuôi tôm vấn đề đƣợc nhiều sở nghiên cứu quan tâm Cho đến nay, hiểu biết sinh sản, hệ miễn dịch đặc biệt điều khiển sinh trƣởng tơm sú hạn chế thiếu sót thơng tin genome biểu gen chúng Kích thƣớc genome tôm sú lớn (khoảng tỉ cặp base = 2/3 gen ngƣời), nên việc giải mã tồn genome tơm sú đòi hỏi nhiều thời gian chi phí lớn, ƣớc tính hàng chục triệu la Vì hƣớng nghiên cứu đƣợc lựa chọn lập đồ di truyền liên kết genome tôm sú, lập đồ di truyền từ DNA vi vệ tinh hay lập đồ gen tôm sú từ giải mã EST/cDNA, việc lựa chọn gen ứng viên dự báo phù hợp với mục đích nghiên cứu, ta xây dựng đƣợc thị phân tử phục vụ cho công tác chọn giống, nghiên cứu cấu trúc chức gen liên quan Việc nghiên cứu giải mã lập đồ gen thƣờng tập trung vào đối tƣợng có giá trị kinh tế cao Nhƣ trình bày trên, tơm sú đối tƣợng ni trồng có giá trị kinh tế mang tính chiến lƣợc Chính việc phối hợp quốc gia nhằm giải mã lập đồ gen tôm sú mang lại lợi ích chung cho cộng đồng cho quốc gia Nghiên cứu hệ gen phiên mã (transcriptome) hƣớng nghiên cứu quan trọng, tập chung nghiên cứu gen mã hóa protein mức độ biểu chúng loại mô quan, giai đoạn trình phát triển hay điều kiện mơi trƣờng khác Số hố Trung tâm Học liệu – 2ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Trong khuôn khổ đề tài tiến hành nghiên cứu mô Cơ Tôm Sú Hiện nay, kết nghiên cứu từ mô Cơ Tôm Sú liệu quan trọng phục vụ cho việc giải trình tự hệ phiên mã Chính chúng tơi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu hệ phiên mã từ mô Cơ Tôm Sú (penaues monodon) Việt Nam” 1.2 Mục tiêu đề tài - Tách chiết tinh đƣợc ARN thông tin (mRNA) từ mô Tôm Sú - Đánh giá đƣợc chất lƣợng mRNA đủ tiêu chuẩn cho việc giải trình tự hệ phiên mã Tơm Sú máy xác định trình tự gen hệ - Chuẩn bị đƣợc mẫu, cho giải trình tự gen máy xác định trình tự gen hệ - Phân tích hệ phiên mã mơ Tơm Sú Số hố Trung tâm Học liệu – 3ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn CHƢƠNG II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Đại cƣơng Tôm Sú 2.1.1 Đặc điểm sinh học Tơm Sú Cơ thể tơm sú có màu xanh đậm, có vân sắc tố trắng đen đốt bụng Phần lại thân biến đổi từ màu nâu sang màu xanh đỏ Trong loài tơm ni, tơm sú lồi có kích thƣớc lớn (có thể lên đến 330 mm lớn chiều dài thể) lồi tơm thƣơng mại quan trọng Hình Hình ảnh tơm sú 2.1.1.1 Phân loại Tơm sú có tên tiếng Anh Black tiger shrimp Chúng thuộc ngành Arthropoda; phân ngành Crustacea; lớp Malacostraca; Decapoda; phân Dendrobranchiata; họ Penaeidea; giống Penaeus; loài Penaeus Monodon 2.1.1.2 Cấu tạo Phần đầu tôm sú Penaeus Monodon có chủy cứng với cƣa Phía chủy có từ đến phía dƣới chủy có Ở tơm sú, mũi khứu giác râu quan nhận biết giữ thăng cho tơm Trong cặp chân hàm tơm có tác dụng lấy thức ăn và giúp cho việc bơi lội cặp chân ngực tác dụng để lấy thức ăn chúng đƣợc tơm sử dụng Số hố Trung tâm Học liệu – 4ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn chúng bò Ngồi cặp chân bụng khác đƣợc dùng để bơi Phần tơm sú có cặp chân để tơm nhảy xa điều chỉnh lên cao hay xuống thấp bơi Bộ phận sinh dục tơm sú nằm dƣới bụng Tơm sú thuộc loại dị hình Tơm có kích thƣớc to tôm đực Khi tôm trƣởng thành, khác biệt tôm đực tôm rõ rang thông qua khác biệt quan sinh dục bên ngồi.Ở đực, quan sinh dục nẳm phía phần đầu ngực Bên ngồi có quan giao phối phụ nằm nhánh ngồi đơi chân ngực thứ Lỗ sinh dục đực mở hốc hang đơi chân ngực thứ Tinh trùng lồi thƣợng đƣợc chứa túi Ở tôm cái, buồng trứng nằm dọc theo mặt lƣng phía với hai ống dẫn trứng mở khớp hang đôi chân ngực thứ Bộ phận chứa túi tinh gồm phồng lên đôi chân ngực thứ thứ dƣới bụng tôm 2.1.1.3 Phân bố Tôm sú có phạm vi phân bố rộng, từ ấn Độ Dƣơng qua hƣớng Nhật Bản, Đài Loan, phía Đơng Tahiti, phía Nam châu Úc phía Tây châu Phi (Racek - 1955, Holthuis Rosa - 1965, Motoh - 1981, 1985) Nhìn chung, tơm sú phân bố từ kinh độ 30E đến 155E từ vĩ độ 35N tới 35S xung quanh nƣớc vùng xích đạo, đặc biệt Indonesia, Malaixia, Philippines Việt Nam Riêng Việt Nam Tôm Sú phân bố rộng từ Bắc tới Nam, từ ven bờ đến vùng có độ sâu 40m Tròn vùng phân bố vùng biển miền Trung Tơm bột , tơm giống (Juvenile) tơm gần trƣởng thành có tập tính sống gần bờ biển rừng ngập mặn ven bờ Tuy nhiên, tôm trƣởng thành di chuyển xa bờ vùng nƣớc sâu nơi sống ƣa thích chúng Sự phân bố Tơm Sú phụ thuộc vào giai đoạn phát triển 2.1.1.4 Chu kỳ sống Tôm Sú Ấu trùng tôm sú (Nauplli) đƣợc biến đổi theo giai đoạn vòng từ 36 đến 51 Các ấu trùng tôm thƣờng bơi đoạn ngắn nghỉ Đối với giai đoạn này, ngƣời ta khơng cần cung cấp thức ăn chúng tự sống nỗn hồng Chúng lột vỏ lần, lần khoảng Về kích thƣớc, nauplli dài Số hoá Trung tâm Học liệu – 5ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Bảng 4.1 Kết tách chiết RNA mô 10 mẫu tôm sú thu nhận từ vùng biển Nghệ An Hàm Mẫu A260 A260/A280 lƣợng (ng) NA1 58.057 1.31 2322.3 NA2 58.62 1.33 2344.8 NA3 53.801 1.05 2152.1 NA4 60.257 1.76 2410.3 NA5 59.645 1.86 2350.3 NA6 56.242 1.32 2249.7 NA7 55.39 1.13 2215.6 NA8 57.395 1.94 2295.8 NA9 59.645 1.82 2385.8 NA10 60.649 1.71 2425.9 Kết từ bảng 4.1 cho thấy RNA tổng số thu đƣợc từ mô 10 mẫu tôm thu nhận từ vùng biển Nghệ An tƣơng đối đồng đều, giao động từ 2152,1 ng đến 2425,9 ng Hàm lƣợng RNA tổng số đạt từ 1000 ng cho phép thực bƣớc tinh chế mRNA để phục vụ cho việc tổng hợp cDNA Chúng tơi chọn hai mẫu có nồng độ RNA tổng số cao NA9 với hàm lƣợng RNA tổng số 2385,8 ng NA10 với hàm lƣợng RNA tổng số 2425,9 ng để thực việc tinh chế mRNA phục vụ cho bƣớc tổng hợp cDNA Sử dụng Kit tinh chế mRNA theo nguyên lý gắn hạt từ tính Dynabeads mRNA DIRECT TM Micro Kit Chúng thu đƣợc mẫu mRNA từ tơm NA9 NA10 có đủ hàm lƣợng độ để tiến hành bƣớc Kết tinh chế mRNA đƣợc phản ánh bảng 4.2 Số hoá Trung tâm Học liệu –40 ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Bảng 4.2 Kết tinh chế mRNA từ 10 RNA tổng số Mẫu Hàm lƣợng A260 A260/A280 (ng/l) NA9 0.576 1.82 23 NA10 0.715 1.88 28.6 Để tổng hợp cDNA tiến hành bƣớc cho việc giải mã hệ phiên mã hàm lƣợng mRNA phải đạt >20 ng/l A260/A280 phải đạt tối thiểu 1,8 nhƣ mẫu NA9 NA10 đạt yêu cầu cho việc tổng hợp cDNA 4.2 Kết tổng hợp cDNA, gắn adaptor khuếch đại đoạn gen gắn adaptor PCR Sau có kết tinh chế mRNA, mRNA đƣợc phân cắt, tổng hợp cDNA khuếch đại PCR, sau điện di gel agarose để chọn phân đoạn thích hợp cho giải trình tự gen Quá trình thực đƣợc mơ tả hình 11 Hinh 11 Các bƣớc gắn adaptor, khuếch đại PCR chọn đoạn gen có độ dài thích hợp để giải trình tự Số hố Trung tâm Học liệu –41 ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Chúng kiểm tra thƣ viện cDNA sau làm giàu PCR nhờ máy phân tích Bioanalyzer sử dụng chip DNA Kết kiểm tra đƣợc phản ánh hình 12 Hình 12 Kiểm tra thƣ viện cDNA nhờ máy phân tích Bioanalyzer mRNA đƣợc tinh chế từ mơ tôm sú, cắt thành phân đoạn cDNA đƣợc tổng hợp từ phân đoạn mRNA, gắn adaptor làm giàu PCR Số hoá Trung tâm Học liệu –42 ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Hình 13 Kiểm tra thƣ viện cDNA nhờ máy phân tích Bioanalyzer Số hố Trung tâm Học liệu –43 ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 4.3 Lắp ráp de novo hệ phiên mã Dữ liệu trình tự sau giải mã đƣợc tiền xử lý để loại bỏ adaptor trình tự xấu lỗi máy giải trình tự Những trình tự đọc có chất lƣợng base thấp (chất lƣợng nhỏ 20) nhƣ số base nhiễu nhiều (mỗi trình tự đọc có >2% N base) đƣợc chỉnh sửa công cụ cutadapt (https://code.google.com/p/cutadapt/) Những trình tự đọc chất lƣợng cao từ mơ đƣợc lắp ráp để tạo nên hệ phiên mã bao gồm transcript tôm sú phần mềm Trinity (http://trinityrnaseq.sourceforge.net/) (Grabherr et al., 2011) với tham số mặc định Tiếp theo phần mềm TGICL (Pertea et al., 2003) làm giảm dƣ thừa liệu transcript để lại nhƣng transcript ƣu tú nhất, hay gọi unigene Kết chất lƣợng giải trình tự mơ đƣợc phản ánh hình 14 Hình 14 Tổng quan file liệu mô sau tiền xử lý Số hoá Trung tâm Học liệu –44 ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Hình 15 Chất lƣợng trình tự theo vị trí trình tự đọc mơ sau tiền xử lý Hình 16 Chất lƣợng trình tự theo vị trí trình tự đọc mơ sau tiền xử lý Hình 17 Thống kê độ dài tồn trình tự đọc mơ sau tiền xử lý Số hoá Trung tâm Học liệu –45 ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Hình 18 Phân bố Contigs theo độ dài lắp ráp 4.4 Chú giải phân loại unigene hệ phiên mã Chú giải chức cho unigene hệ phiên mã đòi hỏi phải sử dụng thuật tốn tìm kiếm tƣơng đồng sở liệu protein quan trọng Trong nghiên cứu này, sử dụng công cụ BLAST với chế độ BLASTx để so sánh toàn unigene lên sở liệu NCBI non-redundant protein Swiss-Prot (http://www.expasy.ch/sprot) Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG; http://www.genome.jp/kegg/) với tham số E-value 1e-6 Trong trƣờng hợp kết giải sở liệu khác thứ tự ƣu tiên kết giải vùng mã hóa protein Nr, Swiss-Prot KEGG Trong với unigene không đƣợc giải sở liệu, phần mềm ESTScan (Iseli et al., 1999) dự đốn vùng mã hóa tiềm chuỗi trình tự unigene Kết giải từ ngân hàng Nr sau đƣợc phần mềm Blast2GO (Conesa et al., 2005) sử dụng để lấy mã Gene Ontology (GO) riêng biệt cho unigene Toàn unigene hệ phiên mã đƣợc Số hoá Trung tâm Học liệu –46 ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ánh xạ vào mã GO phân loại dựa vào hạng mục: trình sinh học, thành phần tế bào phân tử chức Kết phân tích đƣợc nêu bảng 4.3 Bảng 4.3 Thông tin transcriptome mô tôm sú Mô Số Contigs lắp ráp 167.907 Số contigs bắt cặp đạt ≥ 97% với trình tự 265 GenBank Tổng số Blast hit 10.970 Các SNPs 26.160 Các Microsatellites 104.815 Kết bảng 4.3 cho thấy, sau giải mã phân tích transcriptome mơ tơm sú chúng tơi thu đƣợc 167.907 contig Có 265 contig bắt cặp đạt tới 97% với trình tự GenBank Các contig có thuộc gen tơm sú đƣợc nghiên cứu công bố GenBank Tổng số Blast hit đạt 10.970 Số thuộc gen chƣa đƣợc công bố tôm sú Hệ gen tôm sú chƣa đƣợc giải mã công bố GenBank việc tìm hiểu hệ phiên mã mô tôm sú cung cấp thông tin quan trọng để giải gen hệ gen khai thác marker để phục vụ cho nghiên cứu lập đò gen tơm sú Khai thác hệ phiên mã mơ tơm sú giải trình tự, thu đƣợc 26.160 SNPs 104.815 microsatellites Chúng tiếp tục khai thác marker kết hợp với hệ phiên mã mô khác tôm sú để tạo sơ sở liệu phục vụ cho nghiên cứu ứng dụng cơng tác chọn giống tơm sú Số hố Trung tâm Học liệu –47 ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu trình bày trên, chúng tơi có số kết luận nhƣ sau Đã giải mã thành công hệ phiên mã mô tơm sú máy xác định trình tự gen hệ Illumina MiSeq Đã phân tích lắp ráp đƣợc 167.907 contig từ kết giải trình tự hệ phiên mã mô tôm sú Đã xác định đƣợc 265 contig có độ tƣơng đồng ≥ 97% so với trình tự GenBank Tổng số contig có Blast hit đạt 10.970 Đã tìm đƣợc 26.160 SNPs 104.815 microsatellites từ contig thu đƣợc từ thƣ viện cDNA transcriptome mô tôm sú Số hoá Trung tâm Học liệu –48 ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu định tên gen biểu từ hệ phiên mã mô tôm sú Nghiên cứu khả ứng dụng marker thu đƣợc để ứng dụng lập đồ gen tơm sú Số hố Trung tâm Học liệu –49 ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn TÀI LIỆU THAM KHẢO Lehnert SA, Wilson KJ, Byrne K, Moore SS (1999) Tissue-specific expressed sequence tags from the black tiger shrimp Penaeus monodon Mar Biotechnol 1(5):465–476 Sritunyalucksana K, Söderhäll K (2000) The proPO and clotting system in crustaceans Aquaculture 191:53–69 Briggs, H 2001 "Dispute Over Number of Human Genes," BBC News Online Gross PS, Bartlett TC, Browdy CL, Chapman RW, Warr GW (2001) Immune gene discovery by expressed sequence tag analysis of hemocytes and hepatopancreas in the pacific white shrimp, Litopenaeus vannamei, and the Atlantic white shrimp, L setiferus Dev Comp Immunol 25(7):565–577 Wright, F., et al 2001 "A Draft Annotation and Overview of the Human Genome," Genome Biology 2, 1-18 Iwanaga S (2002) The molecular basis of innate immunity in the horseshoe crab Curr Opin Immunol 14:87–95 Supungul P, Klinbunga S, Pichyangkura R, Jitrapakdee S, Hirono I, Aoki T, Tassanakajon A (2002) Identification of immune-related genes in hemocytes of black tiger shrimp (Penaeus monodon) Mar Biotechnol 4(5):487–494 Pennisi, E 2003 "A Low Number Wins the GeneSweep Pool," Science 300, 1484 Smith VJ, Brown JH, Hauton C (2003) Immunostimulation in crustaceans: does it really protect against infection? Fish Shellfish Immunol 15:71–90 10 Leelatanawit R, Klinbunga S, Puanglarp N, Tassanakajon A, Jarayabhand P, Hirono I, Aoki T, Menasveta P Isolation and characterization of differentially Số hoá Trung tâm Học liệu –50 ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn expressed genes in ovaries and testes of the giant tiger shrimp (Penaeus monodon) Mar Biotechnol 2004; 6:S506-S510 11 Tonganunt M, Phongdara A, Chotigeat W, Fujise K Identification and characterization of syntenin binding protein in the black tiger shrimp Penaeus monodon J Biotechnol 2005; 120(2):135-45 12 Klinbunga S, Preechaphol R, Thumrungtanakit S, Leelatanawit R, Aoki T, Jarayabhand P, Menasveta P Genetic diversity of the giant tiger shrimp (Penaeus monodon) in Thailand revealed by PCR-SSCP of polymorphic ESTderived markers Biochem Genet 2006; 44(5-6):222-36 13 Maneeruttanarungroj C, Pongsomboon S, Wuthisuthimethavee S, Klinbunga S, Wilson KJ, Swan J, Li Y, Whan V, Chu KH, Li CP, Tong J, Glenn K, Rothschild M, Jerry D, Tassanakajon A Development of polymorphic expressed sequence tag-derived microsatellites for the extension of the genetic linkage map of the black tiger shrimp (Penaeus monodon) Anim Genet 2006; 37(4):363-8 14 O'Leary NA, Trent HF III, Robalino J, Peck MET, Mckillen DJ, Gross PS (2006) Analysis of multiple tissue-specific cDNA libraries from the Pacific whiteleg shrimp, Litopenaeus vannamei Integrative and Comparative Biology 46:931–939 15 Alcivar-Warren A, Meehan-Meola D, Wang Y, Guo X, Zhou L, Xiang J, Moss S, Arce S, Warren W, Xu Z, Bell K Isolation and mapping of telomeric pentanucleotide (TAACC)n repeats of the Pacific whiteleg shrimp, Penaeus vannamei, using fluorescence in situ hybridization Mar Biotechnol (NY) 2006; 8(5):467-80 16 Tassanakajon A, Klinbunga S, Paunglarp N, Rimphanitchayakit V, Udomkit A, Jitrapakdee S, Sritunyalucksana K, Phongdara A, Pongsomboon S, Supungul P, Tang S, Kuphanumart K, Pichyangkura R, Lursinsap C Penaeus monodon Số hoá Trung tâm Học liệu –51 ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn gene discovery project: the generation of an EST collection and establishment of a database Gene 2006; 384:104-12 17 Phongdara A, Laoong-U-Thai Y, Wanna W Cloning of eIF5A from shrimp Penaeus monodon, a highly expressed protein involved in the survival of WSSV-infected shrimp Aquaculture 2007; 265(1-4):16-26 18 Leu JH, Chang CC, Wu JL, Hsu CW, Hirono I, Aoki T, Juan HF, Lo CF, Kou GH, Huang HC Comparative analysis of differentially expressed genes in normal and white spot syndrome virus infected Penaeus monodon BMC Genomics 2007 May 16;8:120 19 Preechaphol R, Leelatanawit R, Sittikankeaw K, Klinbunga S, Khamnamtong B, Puanglarp N, Menasveta P Expressed sequence tag analysis for identification and characterization of sex-related genes in the giant tiger shrimp Penaeus monodon J Biochem Mol Biol 2007; 40(4):501-10 20 Robalino J, Almeida JS, McKillen D, Colglazier J, Trent HF 3rd, Chen YA, Peck ME, Browdy CL, Chapman RW, Warr GW, Gross PS (2007) Insights into the immune transcriptome of the shrimp Litopenaeus vannamei: tissue-specific expression profiles and transcriptomic responses to immune challenge Physiol Genomics 29:44–56 21 Amparyup P, Jitvaropas R, Pulsook N, Tassanakajon A Molecular cloning, characterization and expression of a masquerade-like serine proteinase homologue from black tiger shrimp Penaeus monodon Fish Shellfish Immunol 2007; 22(5):535-546 22 Wang HC, Wang HC, Kou GH, Lo CF, Huang WP Identification of icp11, the most highly expressed gene of shrimp white spot syndrome virus (WSSV).Dis Aquat Organ 2007 Mar 13;74(3):179-89 Số hoá Trung tâm Học liệu –52 ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 23 Wang HC, Wang HC, Leu JH, Kou GH, Wang AH, Lo CF Protein expression profiling of the shrimp cellular response to white spot syndrome virus infection Dev Comp Immunol 2007;31(7):672-86 24 Wongpanya R, Aoki T, Hirono I, Yasuike M, Tassanakajon A Analysis of gene expression in haemocytes of shrimp Penaeus monodon challenged with white spot syndrome virus by cDNA microarray ScienceAsia 2007; 33:165174 25 Zhang L, Yang C, Zhang Y, Li L, Zhang X, Zhang Q, Xiang J A genetic linkage map of Pacific white shrimp (Litopenaeus vannamei): sex-linked microsatellite markers and high recombination rates Genetica 2007, 1(1):37-49 26 Huang PY, Kang ST, Chen WY, Hsu TC, Lo CF, Liu KF, Chen LL Identification of the small heat shock protein, HSP21, of shrimp Penaeus monodon and the gene expression of HSP21 is inactivated after white spot syndrome virus (WSSV) infection.Fish Shellfish Immunol 2008 Sep;25(3):2507 27 Supungul P, Tang S, Maneeruttanarungroj C, Rimphanitchayakit V, Hirono I, Aoki T, Tassanakajon A Cloning, expression and antimicrobial activity of crustin Pm1, a major isoform of crustin, from the black tiger shrimp Penaeus monodon Dev Comp Immunol 2008; 32:61-70 28 Tharntada S, Somboonwiwat K, Rimphanichayakit V, Tassanakajon, A Antilipopolysaccharide factors from the black tiger shrimp, Penaeus monodon, are encoded by two genomic loci Fish Shellfish Immunol 2008; 24: 46-54 29 Du ZQ, Ciobanu DC, Onteru SK, Gorbach D, Mileham AJ, Jaramillo G, Rothschild MF A gene-based SNP linkage map for pacific white shrimp, Litopenaeus vannamei Anim Genet 2010, (3):2 30 Leu JH, Chen SH, Wang YB, Chen YC, Su SY, Lin CY, Ho JM, Lo CF A Review of the Major Penaeid Shrimp EST Studies and the Construction of a Số hoá Trung tâm Học liệu –53 ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Shrimp Transcriptome Database Based on the ESTs from Four Penaeid Shrimp Mar Biotechnol (NY) 2010: DOI 10.1007/s10126-010-9286-y 31 You EM, Liu KF, Huang SW, Chen M, Groumellec ML, Fann SJ, Yu HT Construction of integrated genetic linkage maps of the tiger shrimp (Penaeus monodon) using microsatellite and AFLP markers Anim Genet 2010, 41(4):365-76 Số hoá Trung tâm Học liệu –54 ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ... kết nghiên cứu từ mô Cơ Tôm Sú liệu quan trọng phục vụ cho việc giải trình tự hệ phiên mã Chính chúng tơi tiến hành đề tài: Nghiên cứu hệ phiên mã từ mô Cơ Tôm Sú (penaues monodon) Việt Nam ... mã hệ gen Tơm Sú 10 2.3 Các cơng trình nghiên cứu Tôm Sú 12 2.3.1 Tình hình nghiên cứu Thế giới 13 2.3.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 14 2.4 Khái quát hệ phiên mã 16... cơng trình nghiên cứu Tơm Sú Cơng trình nghiên cứu EST Tôm Sú đƣợc Lehnert SA cs cơng bố vào năm 1999 Trong cơng trình nghiên cứu này, thƣ viện cDNA đƣợc thiết lập từ mô khác Tôm Sú, bao gồm chân