Invertase là một enzyme thủy phân sacharose thành glucose và fructose.Dựa vào tính chất Iod trong dung dịch kiềm có khả năng oxi hóa glucose để xác định lượng glucose sinh ra bằng cách định phân Iod dư với dung dịch Na2S2O3
1 Báo Cáo TH Hóa Sinh Thực Phẩm BÀI KHẢO SÁT HOẠT TÍNH INVERTASE I NGUYÊN TẮC Invertase enzyme thủy phân sacharose thành glucose fructose Dựa vào tính chất Iod dung dịch kiềm có khả oxi hóa glucose để xác định lượng glucose sinh cách định phân Iod dư với dung dịch Na2S2O3 II CÁCH TIẾN HÀNH Điều chế dung dịch invertase Cân 1.04g men bánh mì Cân Cho Lắc Dung men vào dịch bình vàInvertase hòa định 5'.tan Lắng, mức lọc 100ml, 50ml nước định mức cất tới vạch Thực ống sau: Số ống Dung dịch saccharose 10% (ml) Nước cất (ml) Dịch enzyme (ml) Dịch enzyme đun sôi (ml) Đểtừng Đun Ở cách ống ống ởthủy nhiệt húttrong 5ml độ cho phòng 2’, làm vàotrong bình lạnh 30’ tam giác vòi nước 250ml Nhóm : Hiếu,Hiền,Bắc,Thủy,Tuyền Page 1 10 10 10 10 10 0 10 Báo Cáo TH Hóa Sinh Thực Phẩm Xác định glucose Thêm Để Lấy Chuẩn yên ra,vào độ thêm mỗi2ml bóng erlen NaHtối10ml iod 20'0.1N, 15ml NaOH 0.1N * * Chú ý nhỏ chậm giọt NaOH cho thời gian nhỏ kéo dài khoảng 2’ III TÍNH KẾT QUẢ Kết chuẩn độ Ống Ống Ống Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần 24.1 24.75 24.5 5.8 5.5 5.6 23.05 23 22.9 Hoạt tính invertase biểu thị số mol saccharose thủy phân lượng enzyme có g men phút nhiệt độ phòng thí nghiệm Trong đó: V1: số ml dùng để định phân dung dịch ống nghiệm V2: số ml dùng để định phân dung dịch ống nghiệm A: thể tích tổng cộng ống nghiệm (ml) B: tổng thể tích dịch trích enzyme có từ m (g) men bánh mì (ml) a: thể tích dung dịch đem xác định đường glucose (ml) b: thể tích dịch trích enzyme cho vào ống nghiệm (ml) t: thời gian thủy phân (phút) Lần Lần Nhóm : Hiếu,Hiền,Bắc,Thủy,Tuyền Page Báo Cáo TH Hóa Sinh Thực Phẩm Lần Trung bình IV BIỆN LUẬN – GIẢI THÍCH • Ống khơng có chất dung dịch saccharose 10% nên không xảy phản ứng nên ống dùng để định lương Iod glucose khơng tạo • Ống có phản ứng xảy có chất ống dùng để định lương Iod dư Do ta xác định lượng glucose tạo • Ống dịch enzyme đun sơi nên hoạt tính phản ứng khơng xảy • Sau tiến hành khảo sát hoạt tính Enzyme Invertase ống nghiệm ta nhận thấy khơng có chất enzyme gia nhiệt (enzyme hoạt tính) khơng có phản ứng để tạo glucose V VI CHỨNG MINH CÔNG THỨC PHỤ LỤC Các phương pháp khác Phương pháp xác định hoạt tính enzyme invertase cố định gel alginate thời điểm xác định thiết bị phản ứng liên tục Do giá trị hoạt tính enzyme tỉ lệ thuận với lượng sản phẩm sinh ra, nên nghiên cứu này, hoạt tính invertase cố định thời điểm xác định hoạt động thiết bị phản ứng liên tục đánh giá gián tiếp thông qua hàm lượng đường khử dung dịch phản ứng thời điểm Chúng tơi qui ước lượng đường khử thời điểm bắt đần châm chất vào cột tương đương với 100% hoạt tính invertase cố định Từ đó, sau xác định hàm lượng đường khử mẫu thời điểm xác định, xác định phần trăm hoạt tính invertase cố định so với hoạt tính ban đầu (chính hoạt tính enzyme thời điểm bắt đầu châm chất) thời điểm Hàm lượng đường khử xác định phương pháp quang phổ so màu, sử dụng thuốc thử 3,5-dinitrosalicylic acid [14] Nhóm : Hiếu,Hiền,Bắc,Thủy,Tuyền Page Báo Cáo TH Hóa Sinh Thực Phẩm Cố định invertase gel alginate phương pháp nhốt enzyme mạng gel đặc Trong nghiên cứu này, enzyme invertase cố định gel alginate phương pháp nhốt theo quy trình sau: Trộn dung dịch alginate natri nồng độ 2,5% (w/v) với dung dịch enzyme invertase 1,33% (w/v) theo tỉ lệ 1:1 (v/v) Nhỏ hỗn hợp vào dung dịch CaCl2 2% (w/v) để tạo hạt enzyme cố định Tiếp tục ngâm hạt enzyme cố định dung dịch CaCl2 2% để làm tăng độ bền hạt Sau giờ, vớt hạt enzyme cố định khỏi dung dịch CaCl 2% rửa hạt lần nước cất Hạt enzyme cố định tạo thành có dạng hình cầu với đường kính trung bình 3-4 mm Hạt enzyme cố định ngâm vào dung dịch đệm acetate 0,1 M pH 4,5 trước đem sử dụng Khảo sát trình thủy phân liên tục saccharose enzyme invertase cố định gel alginate Quá trình thủy phân liên tục saccharose enzyme invertase cố định gel alginate tiến hành cột phản ứng liên tục hình trụ với đường kính 32 mm chiều cao 300 mm Thể tích dung dịch bình phản ứng 180 mL Lượng enzyme cố định cột phản ứng: 18 cm3 hạt enzyme cố định (tương đương với 0,095 g chế phẩm enzyme dạng bột) Nồng độ dung dịch saccharose bình phản ứng: 200 g/L Thí nghiệm tiến hành sau: Cho dung dịch saccharose enzyme cố định vào cột phản ứng Tiến hành lưu dung dịch chất cột đến hiệu suất thủy phân cột phản ứng không thấp 85% Sau đó, bắt đầu tiến hành châm chất vào cột từ phía đỉnh tháo sản phẩm khỏi cột từ phía đáy với lưu lượng Sau khoảng thời gian xác định, tiến hành lấy mẫu sản phẩm xác định hàm lượng đường khử mẫu BÀI KHẢO SÁT ĐỘNG HỌC VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME UREASE I NGUYÊN TẮC Urease enzyme thủy phân đặc hiệu urea theo phản ứng: Nhóm : Hiếu,Hiền,Bắc,Thủy,Tuyền Page Báo Cáo TH Hóa Sinh Thực Phẩm NH2 – C = O + H2O NH3 + CO2 NH2 Khi thêm formaldehyde vào mơi trường tạo thành hexamethylene tetramine giải phóng acid carbonic 2(NH4)2CO3 + 6HCHO ( CH2)6N4 + H2CO3 + 6H20 Dùng dung dịch kiềm chuẩn định phân lượng acid tạo thành tính lượng urea bị thủy phân II TIẾN HÀNH Điều chế dung dịch urease Cân 10 g đậu nành Cho vào bình định Cân Khuấy mức Lọc đậu250ml, nành với thu150ml định xaymức dịch nước thành tới lọc cấtbột vạch nước cất Khảo sát động học Chuẩn bị dãy ống nghiệm, dãy ống Ống nghiệm Ure M/3 (ml) Nước cất (ml) Dd urease (ml) Nhóm : Hiếu,Hiền,Bắc,Thủy,Tuyền Page 3 5 5 5 Báo Cáo TH Hóa Sinh Thực Phẩm Chuyển Sau 20' quacho erlen Thêm Định thêm Dãy 100ml, phân 5ml giọt vào formol phenolphthalein tráng với bể NaOH ổn ống trung nhiệt nghiệm 0.05N tính, 40 1% lắc nước 2' cất Xác định hoạt tính Ống nghiệm Ure 2% (ml) Nước cất (ml) Dd urease (ml) Dd urease đun sôi (ml) 5 5 0 Chuẩn độ SauCho NaOH Đổ 20',tất thêm Lắc 0.05N ống ống 5ml đềura nghiệm với formol erlen chỉ2'100ml thị để trung phenolphtalein 40 tính 1% III TÍNH KẾT QUẢ Tính số mol ure ban đầu [S] Khảo sát động học Kết chuẩn độ • Trong tủ ấm 300C Ống nghiệm Nhóm : Hiếu,Hiền,Bắc,Thủy,Tuyền Page 6 Báo Cáo TH Hóa Sinh Thực Phẩm NaOH dung chuẩn độ (ml) Y = số mol ure bị thủy phân (mol) [S] = số mol ure ban đầu • Trong bể ổn nhiệt 400C Ống nghiệm NaOH dung chuẩn độ (ml) Y = số mol ure bị thủy phân (mol) [S] = số mol ure ban đầu Xác định hoạt tính Kết chuẩn độ Ống Lần Lần Lần Lần Lần 0.3 2.4 1.8 0.3 2.1 Ống Lần 1.65 Hệ số hiệu chỉnh nồng độ NaOH 0.05N K tỷ số nồng độ thực tế nồng độ tính tốn NaOH K= => CTT C LT Chuẩn Dung Vài dịch giọt độ 10ml có phenolphatalein màu NaOH H hồng0.05N nhạt TÍNH TỐN ANH TÍNH LN Chuẩn độ: V1 = ml V2 = ml V3 = ml VTB = = ml Nhóm : Hiếu,Hiền,Bắc,Thủy,Tuyền Page Báo Cáo TH Hóa Sinh Thực Phẩm Hoạt tính urease biểu diễn số mol ure bị thủy phân lượng enzyme urease có 1g bột đậu nành thời gian phút 400C Trong đó: V1,V2: số ml NaOH 0.05N dung định phân dung dịch ống nghiệm 1,2 a: thể tích enzyme cho vào ống nghiệm A: tổng thể tích enzyme có từ m (g) bột đậu nành t: thời gian thủy phân (ml) m: khối lượng mẫu cân k: hệ số hiệu chỉnh nồng độ NaOH 0.05N TÍNH TỐN ANH TÍNH DÙM EM ĐI NHA IV BIỆN LUẬN – GIẢI THÍCH Khảo sát động học Hằng số Km - Do Km = [S] v = ½ V, trị số Km cũng biểu diễn đơn vị đo nồng độ chất: mol, gam, % - Km = 10-1 – 10-6 - Đối với phần lớn enzyme, vào Km để đánh giá lực enzyme chất - Ở điều kiện xác định (to, pH, ), Km enzyme chất số Khảo sát hoạt tính Kêt chuẩn độ lần ống sai sót trình thực hành nên cần phải dùng nhiều NaOH để chuẩn độ V CHỨNG MINH CÔNG THỨC Nồng độ mol (ký hiệu CM) dung dịch cho biết số mol chất tan có lít dung dịch VI PHỤ LỤC Các phương pháp khác Đặc hiệu enzyme urease Enzyme urease (trong bột đậu nành) xúc tác cho phản ứng thủy phân urea (CO(NH2)2) theo phương trình phản ứng sau: Nhóm : Hiếu,Hiền,Bắc,Thủy,Tuyền Page Báo Cáo TH Hóa Sinh Thực Phẩm Tiến hành thí nghiệm Bước 1: trích ly enzyme urease theo trình tự sau: Ngâm đậu nành 2-3 (sinh viên chuẩn bị sẵn) Cân 2g đậu nành ngâm Nghiền nhuyễn cối Thêm vào 20ml nước cất, cà Để lắng phút Gạn lấy dịch trong, dịch chiết enzyme urease Bước 2: chuẩn bị ống nghiệm, cho vào: Ống 1: 3ml dung dịch urea 5% Ống 2: 3ml dung dịch acetamide 5% Bước 3: thêm vào ống 3ml dịch chiết enzyme urease Bước 4: đặt giấy quỳ đỏ miệng thành ống nghiệm, đậy chặt ống nghiệm Bước 5: lắc Bước 6: quan sát đổi màu giấy quỳ BÀI Phần 1: XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ LIPASE I NGUYÊN TẮC Nhóm : Hiếu,Hiền,Bắc,Thủy,Tuyền Page 10 Báo Cáo TH Hóa Sinh Thực Phẩm Dưới tác dụng lipase, lipid bị thủy phân giải phóng acid béo Hàm lượng acid chuẩn độ kiềm Hoạt độ enzyme lượng kiềm cần để trung hòa acid hình thành Cơ chất tốt lipase lipid đối tượng enzyme II TIẾN HÀNH m1 = g m2 = g m3 = g Hạtấm Erlen, 1ml Trộn Tủ 25ml Chuẩn đậu dầu, cồn thêm 30 độnành 5ml hỗn 96 10ml đệm nghiền hợp NaOH nước acetate, nhỏ với cất giọt thị toluene phenolphthalein 1% Bình kiểm chứng mkiểm chứng = 5g Nhóm : Hiếu,Hiền,Bắc,Thủy,Tuyền Page 10 11 Báo Cáo TH Hóa Sinh Thực Phẩm Hạtấm Erlen, 1ml Trộn Tủ 25ml Chuẩn đậu dầu, cồn thêm 30 độnành 5ml hỗn 96 10ml đệm nghiền hợp, NaOH nước acetate, Đun nhỏ với cất sôichỉ 53giọt - thị 5' toluene phenolphthalein 1% III TÍNH KẾT QUẢ Kết chuẩn độ V1 : V2 : V3 : Vkiểm chứng : Hệ số hiệu chỉnh nồng độ NaOH 0.1N K tỷ số nồng độ thực tế nồng độ tính tốn NaOH => K= CTT C LT Nhóm : Hiếu,Hiền,Bắc,Thủy,Tuyền Page 11 12 Báo Cáo TH Hóa Sinh Thực Phẩm Dung Chuẩn Vài dịch giọt độ 10ml có phenolphatalein màu NaOH H hồng0.1N nhạt Chuẩn độ: VTB = V1 = V2 = V3 = ANH TÍNH TIẾP ĐI NHA Hoạt độ lipase biểu thị số ml NaOH 0.1N dùng để chuẩn độ lượng acid tự sinh lipase trích từ 10g hạt thủy phân Trong : a: số ml NaOH để chuẩn độ bình thí nghiệm b: số ml NaOH để chuẩn độ bình kiểm chứng k: hệ số hiệu chỉnh nồng độ NaOH 0.1N m: khối lượng hạt sử dụng ANH TÍNH TIẾP BIỆN LUẬN – GIẢI THÍCH Đệm acetate pH môi trường làm thay đổi cấu trúc không gian protein số amino acid có mạch nhánh phân ly (COO- NH4+ tạo liên kết ion) Họat động tối ưu protein phụ thuộc vào cấu trúc không gian định môi trường, nghĩa phụ thuộc vào tỉ lệ phân ly mạch nhánh thành ion, hay nói tóm lại phụ thuộc vào pH mơi trường Dung dịch đệm cho thêm vào nhằm làm dung dịch có pH khơng thay đổi nhiều lượng nhỏ acid (H+) base (OH-) thêm vào Như vậy, dung dịch đệm Nhóm : Hiếu,Hiền,Bắc,Thủy,Tuyền Page 12 13 Báo Cáo TH Hóa Sinh Thực Phẩm bao gồm cặp acid base liên hợp (acid yếu muối acid yếu base yếu muối base này) tỉ lệ chúng định pH dung dịch Về nguyên tắc phối hợp loại đệm có khoảng đệm khác thành dung dịch khơng có vấn đề Tuy nhiên sử dụng đệm tùy thuộc vào ứng dụng cho thành phần đệm không phản ứng với cấu tử hệ phản ứng khảo sát theo chiều hướng có hại Các phản ứng thường thấy phản ứng tạo kết tủa hay tạo phức oxy hóa khử Dung dịch đệm acetate (pH = 3,6 – 5,6) − Dung dịch acid acetic 0,2M (a): 11,55 ml CH 3COOH đặc định mức đến 1000 ml − Dung dịch natri acetate 0,2M (b): 16,4 g CH 3COONa 27,2 g CH3COONa.3H2O hòa tan định mức đến 1000 ml Dung dịch đệm có pH khác phụ thuộc vào X ml dung dịch (a) Y ml dung dịch (b) định mức đến 100 ml Toluen Toluen, hay gọi mêtylbenzen hay phenylmêtan, chất lỏng suốt, khơng hòa tan nước Toluen mộthyđrocacbon thơm sử dụng làm dung môi rộng rãi công nghiệp Toluen hyđrocacbon thơm, có khả tham gia phản ứng điện tử Nhờ có nhóm mêtyl mà độ hoạt động hóa học toluen phản ứng lớn gấp 25 lần so với benzen Vì vòng thơm bền nên cần áp suất cao tiến hành phản ứng hyđro hóa toluen thành mêtylcyclohexan Ứng dụng toluen xác định hoạt độ lipase chống vi sinh vật phát triển Bình kiểm chứng Ở bình kiểm chứng khơng xảy phản ứng thủy phân dịch enzyme đun sơi để làm hoạt tính IV PHỤ LỤC Các phương pháp khác Nhóm : Hiếu,Hiền,Bắc,Thủy,Tuyền Page 13 14 Báo Cáo TH Hóa Sinh Thực Phẩm Phương pháp pH-stat Được dùng để phát hoạt tính lipase dịch mơ đồng thể thực vật, có mặt deoxycholate,sử dụng triolein nhũ hóa với gum arabic chất Kỹ thuật pH-stat dùng để xác định hoạt tính lipase huyết thanh, plasma dịch tá tràng Phương pháp pH-stat phương pháp định lượng cho kết xác (nhạy) giới hạn 1mol axit béo giải phóng phút 2.Thu nhận enzyme lipase từ nội tạng cá basa Nội tạng cá basa sau rã đông, loại bỏ mỡ, cắt nhỏ đến kích thước mm x mm, xay nhuyễn phối trộn với dung mơi để trích ly điều kiện thích hợp Sau đó, dịch trích lọc xác định hoạt tính enzyme Kết cho thấy hiệu suất thu hồi 93%; độ tinh 6,08 lần Lipase loại enzyme ứng dụng rộng rãi nhiều ngành công nghiệp chế biến sữa, thực phẩm, chất tẩy rửa công nghiệp dầu sinh học Phương pháp xác định hoạt độ lipase phương pháp chuẩn độ Nguyên lý Dựa khả xúc tác thủy phân lipit lipase, xác định lượng acid béo tạo 15’ lượng NaOH cần bổ sung để trì pH cố định Hiệu số lượng NaOH sau trước bổ sung enzyme đặc trưng cho hoạt tính xúc tác lipase Tiến hành Lấy 10ml dầu ăn + 200ml nước cất + 1% Gum arabic, sau đánh tan máy xay sinh tố 5’ để tạo huyền phù Lấy 20ml dd huyền phù cho vào cốc thủy tinh đặt lên máy khuấy từ, điều chỉnh nhiệt độ tới 650C Thêm 470⑩L dd CaCl2 đo pH điều chỉnh pH tới 8.3 (chuẩn độ NaOH 10mM) Sau ổn định pH nhiệt độ, đo độ thủy phân dung dịch chất 15’ để giữ pH luôn 8.3 (lượng NaOH tiêu tốn a ml) Sau thêm 20⑩L dung dịch lipase vào hỗn hợp chất chuẩn độ NaOH 10mM để đạt pH = 8.3 bắt đầu tính lượng tiêu hao NaOH 15’ để giữ pH luôn = 8.3 (lượng NaOH tiêu tốn b ml) Đơn vị hoạt độ lipase Một đơn vị hoạt độ lipase (U) xác định lượng enzyme có khả chuyển hóa tạo micromol acid béo thời gian 1’ Hoạt độ lipase 1ml dịch tính theo cơng thức Nhóm : Hiếu,Hiền,Bắc,Thủy,Tuyền Page 14 15 Với Báo Cáo TH Hóa Sinh Thực Phẩm t: thời gian đo độ tự thủy phân v: thể tích enzyme a: lượng NaOH 10mM tiêu tốn chưa có enzyme b: lượng NaOH 10mM tiêu tốn có enzyme 0.01: hệ số chuyển độ nồng độ Phần 2: XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME AMYLASE THEO WOHLGEMUTH I NGUYÊN TẮC Phương pháp dựa vào tìm nồng độ enzyme thấp thủy phân tinh bột đến Dextrin Đơn vị Wohlgemuth lượng enzyme cần thiết để thủy phân 1mg tinh bột sau 30 phút 370C có Cl- làm chất hoạt hóa II TIẾN HÀNH Chuẩn bị dịch chiết amylase Dung Ngâm Định dịch Bình 10g mức 15', định malt Lọc tới thỉnh suốt mức 2xay vạch, lần thoảng chứa 100ml lắc vỏ enzyme kỹ lắc Tiến hành khảo sát hoạt tính amylase Nhóm : Hiếu,Hiền,Bắc,Thủy,Tuyền Page 15 16 Báo Cáo TH Hóa Sinh Thực Phẩm ml dung NaCl Tủ 10 dịch 0.5 điều ống %1ml 1ml hồ Lấy nhiệt nghiệm tinh H1ml ddởbột amilaza, 37 từ0.5% ống 1lắc cho vào ống 2, lắc lặp lại ống 10 hút ml bỏ • Ống 11 : ml nước cất + giọt Iod Kết thể bảng, đánh dấu xanh (X), đỏ (Đ), nâu (N), vàng (V) Ống nghiệm Độ pha loãng Nồng độ enzym Màu III 2 16 32 64 128 256 512 TÍNH KẾT QUẢ Lượng enzyme cho vào ống nghiệm Trong V1 : thể tích dịch chiết enzyme cho vào ống nghiệm ( 1ml ) Nhóm : Hiếu,Hiền,Bắc,Thủy,Tuyền Page 16 10 1024 17 Báo Cáo TH Hóa Sinh Thực Phẩm V2 : thể tích dịch chiết enzyme ( 100ml ) m : lượng mẫu cân vật phẩm chứa enzyme ( mg ) Một đơn vị Wohlgemuth ( W ) Trong F : độ pha lỗng ống nghiệm có nồng độ enzyme nhỏ thủy phân hoàn toàn tinh bột Số đơn vị Wohlgemuth có 1ml dịch chiết enzyme ( NW) IV BIỆN LUẬN – GIẢI THÍCH Ta thấy ống nghiệm (1,2,3,4,5) bị thủy phân hoàn toàn, ống thủy phân phân nữa, ống lại (7,8,9,10) hồn tồn khơng bị thủy phân Vì pha loãng dung dịch dịch enzyme amylase dung dịch lại pha lỗng qua 10 ống nghiệm đến ống số lượng tinh bột lại nên thủy phân phân đến ống lại lượng enzyme khơng nên khơng thủy thủy phân tinh bột C6 H10O5 + nH 2O to → nC H O6 12 amylase V CHỨNG MINH CƠNG THỨC n= m × V1 V2 V1: Thể tích dịch chiết enzym cho vào ống (1 ml) V2: Thể tích dịch chiết (100 ml) m: khối lượng malt n' = • Lượng malt có ml enzym: • Lượng malt có V1: W= n= m V2 m × V1 V2 n F ×5 Khối lượng enzym có ống 1: C% tinh bột 0.5% 100ml 0.5g m= Nhóm : Hiếu,Hiền,Bắc,Thủy,Tuyền n F (F độ pha loãng) Page 17 18 Báo Cáo TH Hóa Sinh Thực Phẩm 1ml × 0.5 = 0.005 g = 5mg 100 Khối lượng enzym phản ứng ml hồ tinh bột 0.5%: NW = W= n F ×5 n V1 × W Khối lượng enzym có ml: m = W × V1 NW = n V1 × W Số đơn vị có ml enzym: VI PHỤ LỤC Các phương pháp khác Xác định hoạt độ amylase theo phương pháp động học Nguyên lý : amylase thuỷ phân 2-chloro-4nitrophenyl-maltotrioside (CNPG3) thành 2-chloro-4Nitrophenyl (CNP), 2-Chloro-4Nitrophenyl-Maltodioside glucose (G), Theo phản ứng sau: Amylase CNPG3 3CNP+2CNPG2+3G3+2G Sự giải phóng CNP từ chất tăng hấp thụ tỷ lệ thuận với hoạt độ amylase huyết Hiện người ta dùng Kit để xác định hoạt độ amylase máu, nước tiểu Trị số bình thường phụ thuộc vào kỹ thuật thuốc thử (chủ yếu chất G3, G7) Các Hãng khác cho kết khác nhau, kết đơn vị tính U/l Trong G3 2-Chloro-4Nitrophenyl-Maltotriosid (CNPG3) G7 p-Nitrophenyl-Maltoheptaoside (EPS) Phương pháp vi lượng V.Y.Rodzevich, O.P.Korenbiakina Phương pháp dựa sở thủy phân tinh bột Enzyme glucoamylase có chế phẩm nghiên cứu Xác định lượng glucose tạo thành tính hoạt độ Enzyme Xác định hoạt độ Enzyme α-Amylase theo Rukhliadeva: Phương pháp dựa sở thủy phân tinh bột Enzyme có dịch chế phẩm nghiên cứu với dextrin có phân tử lượng khác Đo cường độ màu tạo thành tinh bột sản phẩm thủy phân với iodine máy so màu quang điện tính hoạt độ Enzyme Đơn vị hoạt độ Amylase lượng Enzyme chuyển hóa g tinh bột tan thành dextrin có phân tử lượng khác 30 0C thời gian ( pH cho Amylase malt 4,8 – 4,9; nấm 4,7; vi khuẩn 6,0 …) Nhóm : Hiếu,Hiền,Bắc,Thủy,Tuyền Page 18 19 Báo Cáo TH Hóa Sinh Thực Phẩm BÀI KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ENZYME BROMELIN THEO PHƯƠNG PHÁP ANSON CẢI TIẾN I NGUYÊN TẮC Phương pháp dựa thủy phân protein casein enzym Bromelin có dịch nghiên cứu, sau làm vô hoạt enzyme kết tủa protein chưa bị thủy phân dung dịch acid trichloracetic (TCA) Định lượng sản phẩm tạo thành phản ứng thủy phân phản ứng màu với thuốc thử Folin Dựa vào đồ thị đường chuẩn Tyrosin để tính lượng sản phẩm enzyme xúc tác tạo nên II TIẾN HÀNH Chiết enzyme : Chọn thơm xanh Nước thơm ly enzym tâm lắc 6000v/p 10' Địnhphần Lấy mứcđem dịch 100ml, phíatrong 10 trên,bỏ phút bã Cân Gọt 20g vỏ,mẫu cắt nhỏ, hòa tan xayvới nátnước thơmcất Nhóm : Hiếu,Hiền,Bắc,Thủy,Tuyền Page 19 20 Báo Cáo TH Hóa Sinh Thực Phẩm Chuẩn bị đường chuẩn Tyrosin Các bước dựng đường chuẩn Tyrosin Dung dịch hóa chất Nhóm : Hiếu,Hiền,Bắc,Thủy,Tuyền Ống nghiệm Page 20 21 Báo Cáo TH Hóa Sinh Thực Phẩm Dung dịch Tyrosin chuẩn (ml) 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Lượng Tyrosin tương ứng (µM) 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Dung dịch HCl 0,2N (ml) 5,0 4,8 4,6 4,4 4,2 4,0 Dung dịch NaOH 0,5N (ml) 10 10 10 10 10 10 Thuốc thử Folin (ml) 3 3 3 Lắc mạnh, sau 10 phút đo OD bước sóng 660nm Ống số ống thử khơng (TK), ống lại ống thí nghiệm (TN) Khảo sát hoạt tính Lấy ống nghiệm sạch,khô,tiến hành làm ống thử thật, ống thử không Ống nghiệm Thử thật Thử không Dung dịch Casein 1% (ml) 5 Dung dịch TCA 5% (ml) 10 Dung dịch enzym mẫu (ml) 1 o Lắc giữ 35,5 C 20 phút Dung dịch TCA 5% (ml) 10 Để yên 30 phút, lọc lấy dịch Dung dịch hóa chất Lấy ống nghiệm khác,cho vào ống thứ 5ml dịch lọc ống thử thật cho vào ống thứ hai 5ml dịch lọc ống thử khơng Nhóm : Hiếu,Hiền,Bắc,Thủy,Tuyền Page 21 22 Báo Cáo TH Hóa Sinh Thực Phẩm Tiếp tục thêm vào ống 10ml NaOH 0,5N 3ml thuốc thử Folin,lắc mạnh,sau 10 phút đo OD bước song 660nm Lặp lại thí nghiêm lần III TÍNH KẾT QUẢ Định nghĩa đơn vị Anson: đơn vị Anson lượng enzym tối thiểu điều kiện thí nghiệm (35,50C: pH 7,6 …) thủy phân Casein phút tạo thành sản phẩm hòa tan TCA, phản ứng với thuốc thử Folin cho ta độ hấp thu OD bước sóng 660nm tương ứng với 1µM Tyrosin đường chuẩn Trong : • X: hoạt độ enzyme bromelin (UI/g) • V: tổng thể tích hỗn hợp ống thử thật ống thử khơng (ml) • v: thể tích dịch lọc đem phân tích (ml) • t: thời gian thủy phân (phút) • m: khối lượng mẫu enzyme đem xác định hoạt tính (g) • L: độ pha lỗng enzyme • µmTyro sin: lượng µmTyro sin v(ml) suy từ đường chuẩn IV V CHỨNG MINH CÔNG THỨC PHỤ LỤC Các phương pháp khác Tách bromelin phương pháp kết tủa enzyme Nguyên tắc Phá vỡ nước liên kết xung quanh phân tử enzym cách bổ xung vàodungdịch protein enzym dung mơi hóa chất ưa nước có lực với nướcmạnh protein để lơi kéo nước khỏi phân tử protein đó, giúp cho protein tủaxuống.-Dùng acetone ethanol, muối trung tính, ammonium sunfate-Làm lạnh nước dứa ép đến 40 độ C acetone tinh khiết 20 Nhóm : Hiếu,Hiền,Bắc,Thủy,Tuyền Page 22 23 Báo Cáo TH Hóa Sinh Thực Phẩm độ C-Tủa bromelin phải rửa aceton làm khơ thật nhanh để bromelinkhơng bị biến tính.-Dùng ammonium sunfate với nồng độ bão hoà 0.7( 70% bão hòa) để làm tác nhân kết tủa bromelin (đặc biệt nhiệt độ thấp) Tủa dễ dàng hoà tan nướcvà muối loại bỏ khỏi protein phương pháp trầm tính Cách tạo tủa với muối ammonium sulfate (NH4)2SO4 D ù n g l í t d u n g d ị c h n c d ứ a l y t â m -Cho từ từ 532g a m m o n i u m s u n f a t e v o v k h u ấ y đ ề u - Để yên nhiệt độ phòng từ 10-15 phútLy tâm dung dịch với vận tốc 6.000 vòng/ phút phút để thu nhận tủa.-Thu tủachế phẩm bromelin sấy khơ tủa sau tinh enzyme Nhóm : Hiếu,Hiền,Bắc,Thủy,Tuyền Page 23 ... 2 16 32 64 12 8 256 512 TÍNH KẾT QUẢ Lượng enzyme cho vào ống nghiệm Trong V1 : thể tích dịch chiết enzyme cho vào ống nghiệm ( 1ml ) Nhóm : Hiếu,Hiền,Bắc,Thủy,Tuyền Page 16 10 10 24 17 Báo Cáo. .. chứa 10 0ml lắc vỏ enzyme kỹ lắc Tiến hành khảo sát hoạt tính amylase Nhóm : Hiếu,Hiền,Bắc,Thủy,Tuyền Page 15 16 Báo Cáo TH Hóa Sinh Thực Phẩm ml dung NaCl Tủ 10 dịch 0.5 điều ống %1ml 1ml hồ... lượng enzym có ống 1: C% tinh bột 0.5% 10 0ml 0.5g m= Nhóm : Hiếu,Hiền,Bắc,Thủy,Tuyền n F (F độ pha loãng) Page 17 18 Báo Cáo TH Hóa Sinh Thực Phẩm 1ml × 0.5 = 0.005 g = 5mg 10 0 Khối lượng enzym