Báo cáo khảo sát hoạt tính INVERTASE

Invertase là một enzyme thủy phân sacharose thành glucose và fructose.Dựa vào tính chất Iod trong dung dịch kiềm có khả năng oxi hóa glucose để xác định lượng glucose sinh ra bằng cách định phân Iod dư với dung dịch Na2S2O3

Trang 1

1 Báo Cáo TH Hóa Sinh Thực Phẩm

BÀI 1

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH INVERTASE

I NGUYÊN TẮC

Invertase là một enzyme thủy phân sacharose thành glucose và fructose Dựa vào

tính chất Iod trong dung dịch kiềm có khả năng oxi hóa glucose để xác định lượng

glucose sinh ra bằng cách định phân Iod dư với dung dịch Na2S2O3

Trang 2

Hoạt tính của invertase được biểu thị bằng số mol saccharose thủy phân bởi lượng

enzyme có trong 1 g men trong một phút ở nhiệt độ phòng thí nghiệm

(V1−V2)× A × B

1000× 20× 2× a × b× t × m

Trong đó:

V1: số ml dùng để định phân dung dịch ở ống nghiệm 1

V2: số ml dùng để định phân dung dịch ở ống nghiệm 2

A: thể tích tổng cộng trong mỗi ống nghiệm (ml)

B: tổng thể tích dịch trích enzyme có được từ m (g) men bánh mì (ml)

a: thể tích dung dịch đem xác định đường glucose (ml)

b: thể tích dịch trích enzyme cho vào mỗi ống nghiệm (ml)

t: thời gian thủy phân (phút)

Trang 3

IV BIỆN LUẬN – GIẢI THÍCH

 Ống 1 do không có cơ chất là dung dịch saccharose 10% nên không xảy ra phảnứng nên ống 1 dùng để định lương Iod khi glucose không được tạo ra

 Ống 2 có phản ứng xảy ra vì có cơ chất và ống 2 dùng để định lương Iod dư Do

đó ta sẽ xác định được lượng glucose được tạo ra

 Ống 3 do dịch enzyme đã đun sôi nên đã mất đi hoạt tính vì vậy phản ứng khôngxảy ra

 Sau khi tiến hành khảo sát hoạt tính Enzyme Invertase trong 3 ống nghiệm thì tanhận thấy nếu không có cơ chất hoặc enzyme đã gia nhiệt (enzyme mất hoạt tính)thì sẽ không có phản ứng để tạo ra glucose

Trang 4

thời điểm bắt đần châm cơ chất vào cột tương đương với 100% hoạt tính của invertase cốđịnh Từ đó, sau khi xác định được hàm lượng đường khử trong mẫu tại những thời điểmxác định, chúng tôi có thể xác định được phần trăm hoạt tính invertase cố định so vớihoạt tính ban đầu (chính là hoạt tính của enzyme tại thời điểm bắt đầu châm cơ chất) tạithời điểm đó

Hàm lượng đường khử được xác định bằng phương pháp quang phổ so màu, sử dụngthuốc thử 3,5-dinitrosalicylic acid [14]

2 Cố định invertase trong gel alginate bằng phương pháp nhốt enzyme trong mạnggel đặc

Trong nghiên cứu này, enzyme invertase được cố định trong gel alginate bằng phươngpháp nhốt theo quy trình như sau: Trộn đều dung dịch alginate natri nồng độ 2,5% (w/v)với dung dịch enzyme invertase 1,33% (w/v) theo tỉ lệ 1:1 (v/v) Nhỏ hỗn hợp trên vàodung dịch CaCl2 2% (w/v) để tạo hạt enzyme cố định Tiếp tục ngâm hạt enzyme cố địnhtrong dung dịch CaCl2 2% trong 2 giờ để làm tăng độ bền của hạt Sau 2 giờ, vớt hạtenzyme cố định ra khỏi dung dịch CaCl2 2% và rửa hạt 3 lần bằng nước cất Hạt enzyme

cố định tạo thành có dạng hình cầu với đường kính trung bình 3-4 mm Hạt enzyme cốđịnh được ngâm vào dung dịch đệm acetate 0,1 M pH 4,5 trước khi đem sử dụng

3 Khảo sát quá trình thủy phân liên tục saccharose bằng enzyme invertase cố địnhtrong gel alginate

Quá trình thủy phân liên tục saccharose bằng enzyme invertase cố định trong gel alginateđược tiến hành trong cột phản ứng liên tục hình trụ với đường kính 32 mm và chiều cao

300 mm Thể tích dung dịch trong bình phản ứng là 180 mL Lượng enzyme cố địnhtrong cột phản ứng: 18 cm3 hạt enzyme cố định (tương đương với 0,095 g chế phẩmenzyme dạng bột) Nồng độ dung dịch saccharose trong bình phản ứng: 200 g/L

Thí nghiệm được tiến hành như sau: Cho dung dịch saccharose và enzyme cố định vàocột phản ứng Tiến hành lưu dung dịch cơ chất trong cột đến khi hiệu suất thủy phântrong cột phản ứng không thấp hơn 85% Sau đó, bắt đầu tiến hành châm cơ chất vào cột

từ phía đỉnh và tháo sản phẩm ra khỏi cột từ phía đáy với lưu lượng như nhau Sau nhữngkhoảng thời gian xác định, chúng tôi tiến hành lấy mẫu sản phẩm và xác định hàm lượngđường khử trong mẫu

Nhóm 1 : Hiếu,Hiền,Bắc,Thủy,Tuyền Page 4

Trang 5

Trang 6

Trang 7

NaOH dung chuẩn độ (ml)

Y = số mol ure bị thủy phân (mol)

[S] = số mol ure ban đầu

 Trong bể ổn nhiệt 400C

NaOH dung chuẩn độ (ml)

Y = số mol ure bị thủy phân (mol)

[S] = số mol ure ban đầu

Trang 8

Hoạt tính urease được biểu diễn bằng số mol ure bị thủy phân bởi lượng enzymeurease có trong 1g bột đậu nành trong thời gian 1 phút ở 400C

(V2−V1)× A × k

20× 103× 2× t × a ×m

Trong đó:

V1,V2: số ml NaOH 0.05N dung định phân dung dịch trong ống nghiệm 1,2

a: thể tích enzyme cho vào ống nghiệm

A: tổng thể tích enzyme có được từ m (g) bột đậu nành

t: thời gian thủy phân (ml)

m: khối lượng mẫu cân

k: hệ số hiệu chỉnh nồng độ NaOH 0.05N

TÍNH TOÁN ANH TÍNH DÙM EM ĐI NHA

 Khảo sát động học

Hằng số Km

- Do Km = [S] khi v = ½ V, trị số của Km cũng được biểu diễn bằng đơn vị đo nồng

độ cơ chất: mol, gam, %

Đặc hiệu của enzyme urease

Enzyme urease (trong bột đậu nành) xúc tác cho phản ứng thủy phân urea(CO(NH2)2) theo phương trình phản ứng sau:

Trang 9

Tiến hành thí nghiệm

Bước 1: trích ly enzyme urease theo trình tự sau:

Ngâm đậu nành 2-3 giờ (sinh viên chuẩn bị sẵn)

Cân 2g đậu nành đã ngâm

Nghiền nhuyễn trong cối

Thêm vào 20ml nước cất, cà đều

Để lắng 5 phút

Gạn lấy dịch trong, đó chính là dịch chiết enzyme urease

Bước 2: chuẩn bị 2 ống nghiệm, cho vào:

Ống 1: 3ml dung dịch urea 5%

Ống 2: 3ml dung dịch acetamide 5%

Bước 3: thêm vào mỗi ống 3ml dịch chiết enzyme urease

Bước 4: đặt giấy quỳ đỏ ở miệng thành ống nghiệm, đậy chặt ống nghiệm bằng bông.Bước 5: lắc đều

Bước 6: quan sát sự đổi màu của giấy quỳ

Trang 10

BÀI 3

Phần 1: XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ LIPASE

I NGUYÊN TẮC

Dưới tác dụng của lipase, lipid bị thủy phân và giải phóng acid béo Hàm lượng acid

được chuẩn độ bằng kiềm Hoạt độ của enzyme là lượng kiềm cần để trung hòa acid mới

được hình thành Cơ chất tốt nhất đối với lipase chính là lipid của cùng một đối tượng

Trang 11

Trang 12

Chuẩn độ: V1 =

V2 =

V3 =

V TB=

ANH TÍNH TIẾP ĐI NHA

 Hoạt độ của lipase được biểu thị bằng số ml NaOH 0.1N dùng để chuẩn độ lượng

acid tự do sinh ra do lipase trích từ 10g hạt thủy phân

X = (a−b )× 10 ×k

m

Trong đó :

a: số ml NaOH để chuẩn độ trong bình thí nghiệm

b: số ml NaOH để chuẩn độ trong bình kiểm chứng

pH môi trường làm thay đổi cấu trúc không gian protein vì một số amino acid có

mạch nhánh phân ly (COO- và NH4+ tạo liên kết ion) Họat động tối ưu của protein phụ

thuộc vào cấu trúc không gian nhất định trong môi trường, nghĩa là phụ thuộc vào tỉ lệ

phân ly của mạch nhánh thành ion, hay nói tóm lại là phụ thuộc vào pH môi trường

Trang 13

Dung dịch đệm cho thêm vào nhằm làm dung dịch có pH không thay đổi nhiều lắmkhi một lượng nhỏ acid (H+) hoặc base (OH-) được thêm vào Như vậy, dung dịch đệmbao gồm một cặp acid base liên hợp (acid yếu và muối của acid yếu này hoặc base yếu vàmuối của base này) và tỉ lệ của chúng sẽ quyết định pH của dung dịch

Về nguyên tắc thì phối hợp các loại đệm có các khoảng đệm khác nhau thành 1dung dịch là không có vấn đề gì Tuy nhiên sử dụng các đệm nào còn tùy thuộc vào ứngdụng sao cho thành phần của đệm không phản ứng với các cấu tử trong hệ phản ứng khảosát theo chiều hướng có hại Các phản ứng thường thấy là phản ứng tạo kết tủa hay tạophức hoặc oxy hóa khử

Dung dịch đệm acetate (pH = 3,6 – 5,6)

 Dung dịch acid acetic 0,2M (a): 11,55 ml CH3COOH đặc và định mức đến 1000ml

 Dung dịch natri acetate 0,2M (b): 16,4 g CH3COONa hoặc 27,2 g

CH3COONa.3H2O được hòa tan và định mức đến 1000 ml

Dung dịch đệm có pH khác nhau phụ thuộc vào X ml dung dịch (a) và Y ml dungdịch (b) và định mức đến 100 ml

 Toluen

Toluen, hay còn gọi là mêtylbenzen hay phenylmêtan, là một chất lỏng trong suốt,không hòa tan trong nước Toluen là mộthyđrocacbon thơm được sử dụng làm dungmôi rộng rãi trong công nghiệp

Toluen là một hyđrocacbon thơm, có khả năng tham gia phản ứng thế ái điện tử Nhờ

có nhóm mêtyl mà độ hoạt động hóa học của toluen trong phản ứng này lớn gấp 25 lần sovới benzen

Vì vòng thơm khá bền nên cần áp suất cao khi tiến hành phản ứng hyđro hóa toluenthành mêtylcyclohexan

Ứng dụng của toluen trong bài xác định hoạt độ lipase là chống vi sinh vật pháttriển

Trang 14

Được dùng để phát hiện ra hoạt tính của lipase trong dịch mô đồng thể thực vật, cómặt của deoxycholate,sử dụng triolein được nhũ hóa với gum arabic như cơ chất Kỹthuật pH-stat đã được dùng để xác định những hoạt tính lipase trong huyết thanh, plasma

và dịch tá tràng Phương pháp pH-stat là một phương pháp định lượng cho kết quả kháchính xác (nhạy) trong giới hạn 1mol axit béo được giải phóng trong 1 phút

2.Thu nhận enzyme lipase từ nội tạng cá basa

Nội tạng cá basa sau khi được rã đông, loại bỏ mỡ, cắt nhỏ đến kích thước 2 mm x 2

mm, xay nhuyễn và phối trộn với dung môi để trích ly trong các điều kiện thích hợp Sau

đó, dịch trích được lọc và xác định hoạt tính các enzyme Kết quả cho thấy hiệu suất thuhồi là 93%; độ tinh sạch là 6,08 lần Lipase là loại enzyme được ứng dụng rộng rãi trongnhiều ngành công nghiệp như chế biến sữa, thực phẩm, chất tẩy rửa và công nghiệp dầusinh học

3 Phương pháp xác định hoạt độ lipase bằng phương pháp chuẩn độ

Dựa trên khả năng xúc tác thủy phân lipit của lipase, xác định lượng acid béo tạo ra trong 15’ bằng lượng NaOH cần bổ sung để duy trì pH cố định Hiệu số giữa lượng NaOH sau và trước khi bổ sung enzyme đặc trưng cho hoạt tính xúc tác của lipase

Sau đó thêm 20µL dung dịch lipase vào hỗn hợp cơ chất và chuẩn độ bằng NaOH 10mM để đạt pH = 8.3 và bắt đầu tính lượng tiêu hao NaOH trong 15’ để giữ pH luôn luôn = 8.3 (lượng NaOH tiêu tốn là b ml)

Đơn vị hoạt độ lipase

Một đơn vị hoạt độ lipase (U) được xác định như là lượng enzyme có khả năng chuyển hóa tạo 1 micromol acid béo trong thời gian 1’

Hoạt độ lipase trong 1ml dịch nổi được tính theo công thức

Ho ạ t đ ộ lipase= (b−a )× 0.01

t × v

Trang 15

Với t: thời gian đo độ tự thủy phân

v: thể tích enzyme

a: lượng NaOH 10mM tiêu tốn khi chưa có enzyme

b: lượng NaOH 10mM tiêu tốn khi có enzyme

 Chuẩn bị dịch chiết amylase

 Tiến hành khảo sát hoạt tính amylase

Trang 16

 Ống 11 : 3 ml nước cất + 2 giọt Iod

Kết quả được thể hiện trong bảng, đánh dấu xanh (X), đỏ (Đ), nâu (N), vàng (V)

Trang 17

Trong đó V1 : thể tích dịch chiết enzyme cho vào ống nghiệm ( 1ml )

Ta thấy 5 ống nghiệm (1,2,3,4,5) bị thủy phân hoàn toàn, ống 6 thủy phân được phân nữa, còn các ống còn lại (7,8,9,10) hoàn toàn không bị thủy phân

Vì khi chúng ta pha loãng dung dịch và dịch enzyme amylase trong dung dịch lại được pha loãng qua 10 ống nghiệm thì đến ống số 6 lượng tinh bột còn lại rất ít nên chỉ thủy phân được phân nữa và đến 4 ống còn lại lượng enzyme không còn nên không thủy thủy phân tinh bột

m: khối lượng malt

 Lượng malt có trong 1 ml enzym: n'=

Trang 18

Khối lượng enzym có trong ống 1: m=

3

N W= n

V1×W

Khối lượng enzym có trong 1 ml: m=W ×V1

Số đơn vị có trong 1 ml enzym:

N W= n

V1×W

VI PHỤ LỤC

 Các phương pháp khác

1 Xác định hoạt độ amylase theo phương pháp động học

Nguyên lý : amylase thuỷ phân 2-chloro-4nitrophenyl-maltotrioside (CNPG3)

thành 2-chloro-4Nitrophenyl (CNP), 2-Chloro-4Nitrophenyl-Maltodioside và glucose(G),

2 Phương pháp vi lượng của V.Y.Rodzevich, O.P.Korenbiakina

Phương pháp dựa trên cơ sở thủy phân tinh bột bởi Enzyme glucoamylase cótrong chế phẩm nghiên cứu Xác định lượng glucose tạo thành sẽ tính được hoạt độ Enzyme

3 Xác định hoạt độ Enzyme α-Amylase theo Rukhliadeva:

Phương pháp dựa trên cơ sở thủy phân tinh bột bởi Enzyme có trong dịch chế phẩmnghiên cứu với các dextrin có phân tử lượng khác nhau Đo cường độ màu tạo thành giữa tinh bột

và các sản phẩm thủy phân của nó với iodine bằng máy so màu quang điện sẽ tính đượchoạt độ Enzyme

Trang 19

Đơn vị hoạt độ Amylase là lượng Enzyme chuyển hóa được 1 g tinh bột tan thành

các dextrin có phân tử lượng khác nhau ở 300C trong thời gian 1 giờ ( pH

cho Amylase của malt là 4,8 – 4,9; của nấm là 4,7; của vi khuẩn là 6,0 …)

Phương pháp này dựa trên sự thủy phân protein casein bằng enzym Bromelin

có trong dịch nghiên cứu, sau đó làm vô hoạt enzyme và kết tủa protein chưa bị

thủy phân bằng dung dịch acid trichloracetic (TCA) Định lượng sản phẩm được

tạo thành trong phản ứng thủy phân bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin Dựa

vào đồ thị đường chuẩn của Tyrosin để tính lượng sản phẩm do enzyme xúc tác

tạo nên

II TIẾN HÀNH

 Chiết enzyme : Chọn thơm còn xanh

Trang 20

 Chuẩn bị đường chuẩn Tyrosin

Các bước dựng đường chuẩn Tyrosin

Dung dịch Tyrosin chuẩn (ml) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0Lượng Tyrosin tương ứng (µM) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0Dung dịch HCl 0,2N (ml) 5,0 4,8 4,6 4,4 4,2 4,0Dung dịch NaOH 0,5N (ml) 10 10 10 10 10 10

Lắc mạnh, sau 10 phút đo OD ở bước sóng 660nm

Ống số 1 là ống thử không (TK), các ống còn lại là ống thí nghiệm (TN)

 Khảo sát hoạt tính

Lấy 2 ống nghiệm sạch,khô,tiến hành làm 1 ống thử thật, 1 ống thử không

Dung dịch hóa chất Thử thậtỐng nghiệmThử không

Lắc đều và giữ ở 35,5 o C trong 20 phút

Để yên 30 phút, lọc lấy dịch trong

Lấy 2 ống nghiệm mới khác,cho vào ống thứ nhất 5ml dịch lọc của ống thửthật và cho vào ống thứ hai 5ml dịch lọc của ống thử không

Tiếp tục thêm vào mỗi ống 10ml NaOH 0,5N và 3ml thuốc thử Folin,lắcmạnh,sau 10 phút đo OD ở bước song 660nm

Lặp lại thí nghiêm 3 lần

Trang 21

III TÍNH KẾT QUẢ

Định nghĩa đơn vị Anson: một đơn vị Anson là lượng enzym tối thiểu trong điều kiện

thí nghiệm (35,50C: pH 7,6 …) thủy phân Casein trong 1 phút tạo thành sản phẩm hòatan trong TCA, phản ứng với thuốc thử Folin cho ta độ hấp thu OD ở bước sóng660nm tương ứng với 1µM Tyrosin trong đường chuẩn

X = µmTyro sin V L

t m v

Trong đó :

 X: hoạt độ enzyme bromelin (UI/g)

 V: tổng thể tích hỗn hợp trong ống thử thật hoặc ống thử không (ml)

 v: thể tích dịch lọc đem phân tích (ml)

 t: thời gian thủy phân (phút)

 m: khối lượng mẫu enzyme đem đi xác định hoạt tính (g)

 L: độ pha loãng enzyme

 µmTyro sin: lượng µmTyro sin trong v(ml) suy ra từ đường chuẩn

IV CHỨNG MINH CÔNG THỨC

độ C-Tủa bromelin phải được rửa bằng aceton và làm khô thật nhanh đểbromelinkhông bị biến tính.-Dùng ammonium sunfate với nồng độ bão hoà là0.7( 70% bão hòa) để làm tác nhân kết tủa bromelin (đặc biệt ở nhiệt độ thấp) Tủa

Trang 22

dễ dàng hoà tan bằng nướcvà muối có thể loại bỏ ra khỏi protein bằng phương pháp trầmtính

Cách tạo tủa với muối ammonium sulfate (NH4)2SO4

Định dạng
Số trang	22
Dung lượng	274,02 KB