Định lượng protein theo phương pháp Bradford Giới thiệu Phương pháp Bradford dựa kết hợp thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue G-250 (CBB G250) (hình 2) với protein thành hợp chất màu xanh dương Thuốc nhuộm kết hợp với protein qua axid amin lysine arginine Mức độ màu phụ thuộc vào nồng độ protein dung dịch Trong môi trường axit, cation thuốc nhuộm tự mang màu đỏ màu xanh hấp thụ bước Hình Cơng thức hóa học CBB G-250 sóng tương ứng 470 nm 650 nm Ngược lại, anion mang màu xanh dương (liên kết với protein) có mức độ hấp thụ cực đại bước sóng 595 nm Vì người ta định lượng protein dựa việc đo thuốc nhuộm dạng ion màu xanh dương bước sóng 595 nm Hàm lượng protein mẫu xác định dựa theo đồ thị chuẩn nồng độ chất chuẩn (thường albumin huyết bò, bovine serum albumin_BSA) so với độ hấp thụ bước sóng 595 nm Vật liệu, hóa chất dụng cụ Thiết bị dùng chung Máy quang phổ Vật liệu dụng cụ thí nghiệm TT TT Vật liệu Dung dịch BSA 0,1 mg/mL Dung dịch mẫu X Dung dịch mẫu Y H2O Thuốc thử Bradford Dụng cụ Micropipette P100 (20 – 200 µL) P1000 (100 – 1000 µL) Đầu típ cho micropipette P200 (màu vàng) P1000 (màu xanh) Khay 96 giếng Cốc 250 mL để đựng rác Quy trình thao tác Số lượng ống eppendorf ống eppendorf ống eppendorf lọ lọ Số lượng chiếc/loại hộp/loại 1 Bước Lấy ống eppendorf đánh dấu bút ghi kính Sử dụng micropipette để pha dãy dung dịch chuẩn tích 200 µL với nồng độ: 0; 0,02; 0,04; 0,06; 0,08 mg/mL từ dung dịch gốc BSA 0,1 mg/mL vào ống eppendorf Bước Dùng micropipette lấy 20 µL dung dịch từ ống eppendorf cho vào giếng tương ứng A1 đến A5 khay 96 giếng (như minh hoạ hình 2) Tiến hành lặp lại giếng B1 đến B6 C1 đến C6 Sau đó, cho 200 µL dung dịch thuốc thử Bradford vào giếng A1 Hình Khay 96 giếng Bước Tiến hành tương tự bước với mẫu X Y ống eppendorf có sẵn, sử dụng giếng từ D1 đến D3 X E1 đến E3 Y Bước Khi chuẩn bị xong, báo cho kỹ thuật viên giúp đo độ hấp thụ quang mẫu bước sóng 595 nm in bảng kết đo máy vi tính Trả lời câu hỏi Câu hỏi Hãy điền vào bảng phần tính toán để pha dung dịch BSA chuẩn Nồng độ BSA (mg/mL) Nguyên liệu 0,02 0,04 0,06 0,08 BSA 0,1 mg/mL (µL) H2O (µL) Câu hỏi Từ kết đo, xây dựng đồ thị chuẩn khung giấy vẽ đồ thị Đồ thị có trục tung kết trung bình độ hấp thụ dung dịch BSA trục hoành dãy nồng độ BSA chuẩn Câu hỏi Từ đồ thị chuẩn kết đo độ hấp thụ dung dịch X, Y, xác định khoảng giá trị trung bình nồng độ dung dịch X Y điền kết vào bảng Dung dịch X Y Độ hấp thụ Nồng độ (mg/mL) Câu hỏi Liên kết đóng vai trò quan trọng gắn kết thuốc nhuộm CBB G-250 protein? A Liên kết cộng hóa trị B Liên kết ion C Tương tác kỵ nước C Lực Van der waals Điền dấu √ vào trống thích hợp hàng Liên kết A B Trả lời C D Câu hỏi Bên cạnh phương pháp Bradford, xác định nồng độ dung dịch protein cách dùng ánh sáng tia cực tím Đó do: A Phenylalanine hấp thụ bước sóng 260 nm B Tất amino acid hấp thụ ánh sáng tia cực tím C Các amino acid vòng thơm hấp thụ bước sóng 280 nm D Tryptophan tyrosine hấp thụ bước sóng 280 nm Điền dấu √ vào trống thích hợp hàng Lý A B Trả lời C D ... dấu √ vào trống thích hợp hàng Liên kết A B Trả lời C D Câu hỏi Bên cạnh phương pháp Bradford, xác định nồng độ dung dịch protein cách dùng ánh sáng tia cực tím Đó do: A Phenylalanine hấp thụ bước... xác định khoảng giá trị trung bình nồng độ dung dịch X Y điền kết vào bảng Dung dịch X Y Độ hấp thụ Nồng độ (mg/mL) Câu hỏi Liên kết đóng vai trò quan trọng gắn kết thuốc nhuộm CBB G-250 protein? ... hoạ hình 2) Tiến hành lặp lại giếng B1 đến B6 C1 đến C6 Sau đó, cho 200 µL dung dịch thuốc thử Bradford vào giếng A1 Hình Khay 96 giếng Bước Tiến hành tương tự bước với mẫu X Y ống eppendorf