Định lượng protein theo phương pháp bradford

Giới thiệu Phương pháp Bradford dựa trên sự kết hợp của thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue 250 CBB G-250 hình 2 với protein thành hợp chất màu xanh dương.. Mức độ màu phụ thuộc vào nồn

Định lượng protein theo phương pháp Bradford

1 Giới thiệu

Phương pháp Bradford dựa trên sự kết hợp của

thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue 250 (CBB

G-250) (hình 2) với protein thành hợp chất màu xanh

dương Thuốc nhuộm kết hợp với protein qua các axid

amin lysine và arginine Mức độ màu phụ thuộc vào

nồng độ protein trong dung dịch

Trong môi trường axit, các cation thuốc nhuộm

tự do mang màu đỏ và màu xanh lá cây hấp thụ ở bước

sóng tương ứng 470 nm và 650 nm Ngược lại, các

anion mang màu xanh dương (liên kết với protein) có mức độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 595 nm Vì vậy người ta định lượng protein dựa trên việc đo thuốc nhuộm dạng ion màu xanh dương ở bước sóng 595 nm Hàm lượng protein trong mẫu được xác định dựa theo đồ thị chuẩn của nồng độ chất chuẩn (thường là albumin huyết thanh bò, bovine serum albumin_BSA) so với độ hấp thụ ở bước sóng 595 nm

2 Vật liệu, hóa chất và dụng cụ

Thiết bị dùng chung

Máy quang phổ

Vật liệu và dụng cụ thí nghiệm

1 Micropipette P100 (20 – 200 µL) và P1000 (100 – 1000 µL) 1 chiếc/loại

2 Đầu típ cho micropipette P200 (màu vàng) và P1000 (màu xanh) 1 hộp/loại

3 Quy trình thao tác

Hình 1 Công thức hóa học của

CBB G-250

Bước 1 Lấy 6 ống eppendorf và đánh dấu bằng bút ghi kính Sử dụng micropipette

để pha dãy dung dịch chuẩn có thể tích 200 µL với các nồng độ: 0; 0,02; 0,04; 0,06; 0,08 mg/mL từ dung dịch gốc BSA 0,1 mg/mL vào các ống eppendorf đó

Bước 2 Dùng micropipette lần lượt lấy 20 µL dung dịch từ các ống eppendorf cho

vào các giếng tương ứng A1 đến A5 trong khay 96 giếng (như minh hoạ ở hình 2) Tiến

hành lặp lại ở các giếng B1 đến B6 và C1 đến C6 Sau đó, cho 200 µL dung dịch thuốc thử Bradford vào mỗi giếng trên

Hình 2 Khay 96 giếng

Bước 3 Tiến hành tương tự như bước 2 với 2 mẫu X và Y trong 2 ống eppendorf

có sẵn, sử dụng các giếng từ D1 đến D3 đối với X và E1 đến E3 đối với Y

Bước 4 Khi chuẩn bị xong, hãy báo cho kỹ thuật viên giúp đo độ hấp thụ quang

của các mẫu tại bước sóng 595 nm và in bảng kết quả đo trên máy vi tính

4 Trả lời các câu hỏi

Câu hỏi 1 Hãy điền vào bảng dưới đây phần đã tính toán để pha các dung dịch BSA

chuẩn

Nguyên liệu

Nồng độ BSA (mg/mL)

BSA 0,1 mg/mL (µL)

H2O (µL)

Câu hỏi 2 Từ các kết quả đo, hãy xây dựng đồ thị chuẩn trong khung giấy vẽ đồ thị dưới

đây Đồ thị có trục tung là kết quả trung bình của độ hấp thụ của các dung dịch BSA và trục hoành là dãy nồng độ BSA chuẩn

A1

Câu hỏi 3 Từ đồ thị chuẩn và kết quả đo độ hấp thụ của các dung dịch X, Y, hãy xác định

khoảng giá trị trung bình nồng độ của dung dịch X và Y rồi điền các kết quả vào bảng

Độ hấp thụ

Nồng độ (mg/mL)

Câu hỏi 4 Liên kết gì đóng vai trò quan trọng trong sự gắn kết giữa thuốc nhuộm CBB

G-250 và protein?

A Liên kết cộng hóa trị B Liên kết ion

C Tương tác kỵ nước C Lực Van der waals

Điền dấu √ vào ô trống thích hợp ở hàng dưới

Trả lời

Câu hỏi 5 Bên cạnh phương pháp Bradford, có thể xác định nồng độ của dung dịch

protein bằng cách dùng ánh sáng tia cực tím Đó là do:

A Phenylalanine hấp thụ ở bước sóng 260 nm

B Tất cả các amino acid đều hấp thụ ánh sáng tia cực tím

C Các amino acid vòng thơm hấp thụ ở bước sóng 280 nm

D Tryptophan và tyrosine hấp thụ ở bước sóng 280 nm

Điền dấu √ vào ô trống thích hợp ở hàng dưới

Trả lời