Tạo chủng vi khuẩn e coli có khả năng sản xuất lycopene ứng dụng trong công nghệ thực phẩm

1 MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Lycopene sắc tố màu đỏ cam thuộc nhóm carotenoid sử dụng rộng rãi công nghiệp thực phẩm, dược phẩm mỹ phẩm Trong tự nhiên lycopene có loại cà chua, cà rốt, gấc Sắc tố có khả bảo vệ tế bào khỏi oxi hóa làm chậm trình phát triển số bệnh ung thư tiền liệt tuyến, ruột kết, thực quản ngăn ngừa bệnh tim mạch [27] Cơ thể người khả tự tổng hợp lycopene mà hấp thu chất từ thực phẩm dược phẩm chứa lycopene Nghiên cứu mối tương quan tiêu thụ cà chua mà có chứa lycopene với ung thư, nghiên cứu cho thấy nhóm người sử dụng phần ăn nhiều cà chua có tỷ lệ mắc ung thư thấp [59] Lycopene sản xuất thương mại tổng hợp hóa học, lên men tách từ nguồn có sẵn tự nhiên [33] Tuy nhiên phương pháp có nhược điểm định tạo nhiều chất thải gây ô nhiễm môi trường, phụ thuộc thời vụ, hiệu kinh tế thấp Vì việc sử dụng vi sinh vật để tổng hợp lycopene thân thiện với môi trường đem lại hiệu kinh tế cao quan tâm nghiên cứu [39] Lycopene tổng hợp từ tiền chất isoprenoid IPP đồng phân DMAPP [11] Con đường sinh tổng hợp lycopene từ tiền chất DMAPP trải qua bước chuyển hóa xúc tác enzyme isopentenyl diphosphate isomerase, geranylgeranyl pyrophosphate synthetase, phytoene synthase, phytoene dehydrogenase mã hóa gen tương ứng idi, crtE, crtB, crtI [66] E coli vật chủ thích hợp cho trình sản xuất lycopene có hệ thống công cụ di truyền mạnh cho trình trao đổi chất [52] E coli không chứa gen tham gia trực tiếp vào trình sinh tổng hợp carotenoid mà chứa gen mã hóa cho enzyme tham gia sinh tổng hợp nên tiền chất IPP, DMAPP FPP đóng vai trò trọng tâm đường sinh tổng hợp carotenoid [39] Do để tạo chủng E coli có khả sản xuất lycopene cần thiết phải đưa gen crtE, crtB, crtI vào tế bào vật chủ E coli Một vi khuẩn cung cấp gen carotenoid Pantoea ananatis [65] E coli tự nhiên tổng hợp đủ lượng IPP cho hoạt động tế bào, trình tổng hợp lycopene E coli tiêu tốn IPP Với mục tiêu giữ cân IPP cho vật chủ, gen idi mã hóa IPP đưa vào [22] Từ sở thực đề tài “Tạo chủng vi khuẩn E coli có khả sản xuất lycopene ứng dụng công nghệ thực phẩm”, nhằm tạo nguồn sản xuất lycopene tạo sở để sản xuất carotenoid khác Mục tiêu nghiên cứu - Tách dòng xác định trình tự gen carotenoid từ vi khuẩn Pantoea ananatis gen idi từ vi khuẩn E coli Thiết kế vector biểu pR-iEIB chứa gen idi, crtE, crtI, crtB dựa tảng pRSET-A - Thiết kế vector biểu pR-iEIB chứa gen idi, crtE, crtI, crtB dựa tảng pRSET-A - Biến nạp vector pR-iEIB vào chủng vi khuẩn E coli BL21, biểu gen idi, crtE, crtI, crtB tạo lycopene Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: Tách dòng xác định trình tự gen crtE, crtI, crtB từ vi khuẩn P.ananatis gen idi từ vi khuẩn E.coli - Nhân dòng gen idi sử dụng cặp mồi đặc hiệu phản ứng PCR từ vi khuẩn E coli Nhân dòng gen carotenoid crtE, crtI, crtB sử dụng cặp mồi đặc hiệu phản ứng PCR từ vi khuẩn P ananatis - Tạo dòng gen: Gắn gen vào vector tách dòng pLUG enzyme T4 DNA ligase, biến nạp vector tái tổ hợp vào chủng E coli DH5α khả biến Chọn lọc dòng phương pháp cắt enzyme giới hạn Xác định trình tự gen phương pháp giải trình tự Nội dung 2: Thiết kế vector biểu pRSET-iEIB chứa gen idi, crtE, crtI, crtB Dựa sở phân tử đường sinh tổng hợp lycopene vi khuẩn E coli tảng vector pRSET-A với gen tách dòng trên, thiết kế vector pRSETA-iEIB Nội dung 3: Biến nạp vector pR-iEIB vào E coli BL21(DE3) Cảm ứng biểu gen idi, crtE, crtI, crtB tạo lycopene màu hồng đỏ Nội dung 4: Định tính định lượng lycopene thu phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nhóm chất carotenoid 1.1.1 Cấu trúc tính chất carotenoid Carotenoid nhóm sắc tố tự nhiên tạo màu vàng, da cam đỏ, tổng hợp từ vi khuẩn, nấm, tảo đến thực vật bậc cao [34] Chúng cấu tạo từ nhiều phân tử isoprenoid, gọi polyprenoid Carotenoid tạo thành với kết hợp hai phân tử geranylgeranyl diphosphate (20 cacbon) tạo khung gồm 40 phân tử cacbon Khung cacbon biến đổi tạo nhiều carotenoid khác cách: vòng hóa hai đầu phân tử tạo nhóm kết thúc hai đầu phân tử khác nhau; thêm nhóm chứa oxy vào phân tử; thay đổi mức hydro hóa Cấu trúc phân tử carotenoid chứa liên kết đơn đôi xen kẽ, tính chất quy định hình dạng phân tử, phản ứng hóa học, hấp thụ ánh sáng tạo màu carotenoid Liên kết đôi chuỗi polyene carotenoid tồn hai dạng đồng phân -trans –cis [12] Căn vào cấu trúc hóa học, carotenoid chia làm hai nhóm Nhóm thứ gồm hợp chất hydrocacbon mạch thẳng bị vòng hóa hai đầu phân tử (β-carotene, α-carotene, γ-carotene, lycopene…) Nhóm thứ hai bao gồm dẫn xuất hydrocarbon carotenoid (xanthophyll, lutein, αcryptoxanthin β-cryptoxanthin, zeaxanthin, canthaxanthin astaxanthin) [10] Carotenoid có cấu trúc phân tử dạng chuỗi polyene liên hợp, chuỗi polyene liên hợp hệ thống giàu electron, nhạy cảm với công chất hóa học có lực với điện tử Do đó, carotenoid có khả phản ứng mạnh với oxi gốc tự [9] 1.1.2 Vai trò carotenoid thực tiễn Carotenoid chứng minh nhóm chất chống oxy hóa hiệu quả(Zaripheh and Erdman), mang lại lợi ích cho sức khỏe người ngăn ngừa hay trì hoãn bệnh mãn tính ung thư, xơ cứng động mạch, đục thủy tinh thể, ngăn ngừa thoái hóa điểm vàng Trong công nghiệp, carotenoid sử dụng làm chất màu thực phẩm, chất bổ sung vào thức ăn chăn nuôi, gần sử dụng ngành công nghiệp sản xuất mỹ phẩm dược phẩm [59] Một số carotenoid sử dụng làm phụ gia thực phẩm thức ăn chăn nuôi (bảng 2.2) Bảng 1.1: Một số carotenoid sử dụng làm phụ gia thực phẩm thức ăn chăn nuôi [45] Nguồn thu nhận Carotenoids Vai trò Động thực vật Vi sinh vật β-carotene Cΰ rốt Blakeslea trispora Dunaliella salina Lycopene Cà chua Blakeslea trispora Streptomyces Tạo màu chrestomyceticus thựcphẩm Lutein Ngô, cỏ ba lá, ngũ Spongiococcum excentricum cốc Chlorella pyrenoidosa Thức ăn gia cầm Zeaxanthin Ngô, cỏ ba lá, ngũ Flavobacterium sp cốc Thức ăn gia cầm Canthaxanthin Các loài giáp xác Cantharellus cinnabarinus Lông gia cầm Brevibacterium KY-4313 Corynebacterium michiganense Astaxanthin Vỏ tôm, tổng hợp Mycobacterium lacticola nhân tạo Brevibacterium 103 Tạo màu thựcphẩm Thức ăn gia cầm Thức ăn cho cá Vì vai trò carotenoid sức khỏe người, nhu cầu hợp chất ngày cao Theo báo cáo, năm 1999, thị trường carotenoid toàn cầu 786 triệu USD; năm 2004 887 triệu USD Năm 2008 766 triệu USD, dự tính đến năm 2015 tăng lên 919 triệu USD, tỷ lệ tăng trưởng hàng năm 2,3% Đặc biệt thị trường β-carotene năm 2007 247 triệu USD dự tính đến 2015 đạt 285 triệu USD (BCC, 2008) Hình 1.1: Biểu đồ đánh giá thị trường carotenoid toàn cầu năm 2007 2015 (BCC, 2008) 1.2 Sắc tố lycopene 1.2.1 Cấu trúc tính chất lycopene Lycopene sắc tố màu đỏ thuộc lớp hydrocarbon carotene nhóm carotenoid, tetreterpene hydrocarbon có chứa 40 nguyên tử carbon 56 nguyên tử hydro, công thức phân tử C40H56, phân tử lượng 536 [47] Lycopene hydrocarbon béo, dạng rắn có màu đỏ đậm, không tan methanol, ethanol, nước tan chloroform, benzen ete, nhiệt độ nóng chảy 172-1730C Trong phân tử lycopene có chứa 11 liên kết đôi liên hợp liên kết đôi không liên hợp (hình 1.1) Do có cấu trúc mạch hở vòng βion mà lycopene hoạt tính tiền vitamin A α, β-carotene Sắc tố có khả hấp thu ánh sáng cực đại 444,47 502nm, có khả nhận lượng từ điện tử trạng thái kích thích [42] Hình 1.2: Cấu trúc tất dạng đồng phân trans-lycopene số đồng phân –cis [62] Lycopene phân hủy mạnh gốc tự gốc –OH gốc hydrogen peroxide, sở hoạt tính chống oxi hóa lycopene Lycopene tác dụng với oxy nguyên tử tạo oxy phân tử ba trạng thái kích thích khác tiếp nhận dạng lượng điện tử kích thích [38] Trong tự nhiên lycopene tồn chủ yếu dạng đồng phân –trans [14], đun nóng xảy phản ứng hóa học liên kết đôi, tạo đồng phân mono- poly-cis lycopene [25], [60] Vì tồn thể thực vật dạng rắn lycopene tương đối bền, tách chiết khỏi khối mô hòa tan dung môi không phân cực, lycopene lại trở nên bền [21], [25], [30] Lycopene sau vào dày gặp dịch vị chuyển hóa thành dạng – cis, dạng thể hấp dễ dàng hiệu sử dụng cao Do huyết người mô, quan, lycopene chủ yếu tồn dạng đồng phân – cis Lycopene liên kết chặt chẽ với đại phân tử thực vật, thực phẩm sống giá trị sinh học phát huy tác dụng Những thực phẩm nấu lên lycopene giải phóng khỏi phức hợp protein tăng cường giá trị sinh học Nước xốt cà chua sản phẩm thực phẩm chế biến từ cà chua có hàm lượng lycopene cao gấp lần so với chưa chế biến [60] 1.2.2 Vai trò sắc tố lycopene với người 1.2.2.1 Vai trò lycopene sức khỏe người Lycopene chất dinh dưỡng, thường tìm thấy chế độ ăn uống, chủ yếu ăn chế biến từ cà chua Trong thể người lycopene hấp thụ qua thức ăn, đến ruột non lycopene hòa tan nhờ muối mật mixen lipid tạo thành vi nang, sau hấp thu qua chế vận chuyển thụ động [48] Lycopene chủ yếu tích tụ gan, túi tinh dịch tuyến tiền liệt [68], (bảng 1.2) tích lũy lycopene thể Bảng 1.2: Phân phối lycopene thể người [61] Phân phối lycopene thể Mô nmol/g trọng lượng ướt Gan 1,28-5,72 Thận 0,15-0,62 Thượng thận 1,9-21,6 Tinh hoàn 4,34-21,4 Buồng trứng 0,25-0,28 Vú 0,78 Da 0,42 Lycopene có khả chống oxy hóa mạnh gấp hai lần β-caroten, gấp 100 lần vitamin E [19], chúng biết đến với số vai trò sau Vai trò ngăn ngừa lão hóa: Trong thể người, nguyên nhân lão hóa công gốc tự sinh trình hoạt động thể Các gốc tự gây nên rối loạn chuỗi phản ứng hóa học, phá hủy màng tế bào dẫn đến tổn thương tế bào Do đó, để ngăn ngừa lão hóa cần thiết phải loại bỏ gốc tự thể Với khả chống oxi hóa mạnh lycopene chống lại trình lão [29] Vai trò ngăn ngừa nguy ung thư tuyến tiền liệt: Chức chống oxi hóa lycopene có khả làm giảm nguy mắc bệnh tuyến tiền liệt cách hiệu Hàm lượng lycopene tuyến tiền liệt tỷ lệ nghịch với nguy mắc bệnh tuyến [24] Sự tăng trưởng khác thường tế bào biểu bì tuyến tiền liệt nguyên nhân dẫn đến phì đại tuyến tiền liệt Lycopene có khả kiềm chế tăng trưởng tế bào biểu bì tuyến tiền liệt, giảm nguy mắc bệnh [28] Vai trò ngăn ngừa bệnh tim mạch: Bệnh tim mạch nguyên nhân dẫn tới tử vong người, mà nguyên nhân mỡ máu bị oxi hóa Lycopene có chức điều tiết cholesterol có tác dụng phòng ngừa chứng xơ cứng động mạch Hàm lượng lycopene thể cao nguy mắc bệnh tim mạch giảm, ngày dùng 60mg lycopene làm giảm 14% cholesterol huyết tương [7], [26], [37] Vai trò tăng cường khả miễn dịch: Chức chống oxi hóa lycopene có khả điều tiết hệ miễn dịch bảo vệ thực bào khỏi tự oxi hóa, kích thích khả đáp ứng miễn dịch, làm tăng cường đại thực bào tế bào tiêu độc, nâng cao khả miễn dịch thể [31], [49], [64] Vai trò giảm nguy bị khối u: Tác dụng chống oxi hóa lycopene giúp giảm đột biến DNA, từ dẫn đến giảm nguy mắc bệnh khối u Hàm lượng lycopene huyết người mắc khối u thấp so với người bình thường [23], [50] Trong nhóm carotenoid, lycopene nhân tố việc ngăn ngừa ung thư tiêu diệt khối u [27] 1.2.2.2 Vai trò lycopene công nghiệp Trong công nghiệp lycopene sử dụng rộng rãi, mức độ bổ sung lycopene số loại thực phẩm thể bảng 1.3 10 Bảng 1.3: Mức độ sử dụng lycopene công nghiệp thực phẩm (Theo thống kê Công ty sản phẩm dinh dưỡng DSM) [15] Thực phẩm Mức độ sử dụng lycopene (mg/kg) Hương liệu sữa sữa uống 30 Đồ uống lên men sữa 30 Sữa bột 30 Sữa đậu nành 30 Sữa chua uống 20-40 Sữa chua đông lạnh 20-40 Kẹo cứng 20-70 Đồ ăn sẵn làm từ ngũ cốc 30-130 Bánh mỳ khô 60 Bánh 30 Súp 30 Salad trộn 30 Nước xốt cà chua 30 Nước ép trái 4-20 1.2.3 Con đường sinh tổng hợp lycopene tự nhiên Lycopene tất carotenoid tạo thành từ tiền chất gọi isoprenoid (isopentenyl hay terpenoid) Đến nay, có hai đường sinh tổng tiền chất là: Con đường mevalonate (MVA) đường C-methyl-Derythritol 4-phosphate (MEP) Hai đường tạo tiền chất isopentenyl diphosphate (IPP) đồng phân dimethylallyl diphosphate (DMAPP), trung tâm trình sinh tổng hợp tất carotenoid isopentenyl diphosphate (IPP) đồng phân dimethylallyl diphosphate (DMAPP), (hình 1.3) 56 Trên hình 3.16 cho thấy: đường chạy 1, 2, xuất băng khoảng 4,3kb tương ứng kích thước vector pR-iE mở vòng, đường chạy số có băng mờ phía Trong số enzyme sử dụng phản ứng này, NdeI enzyme có hiệu cắt thấp (500 u) so với enzyme: BamHI (4000 u) XhoI (2000 u) đó, băng mờ phía enzyme NdeI chưa cắt hết Đường chạy số xuất băng kích thước khoảng 1kb 3,4kb tương ứng kích thước gen crtE (936bp) vector pR-i Đường chạy số xuất băng: băng khoảng 1,5kb tương ứng kích thước gen idi cộng crtE băng 2,9kp tương ứng vector pRSET-A Trên vector pR-iE enzyme hai đầu gen idi crtE NdeI Xhol cắt pR-iE NdeI Xhol tạo băng kích thước gen idi crtE chứng tỏ crtE gắn xuôi chiều Vậy gắn thành công gen crtE vào vector pRi crtE gắn xuôi chiều Ngoài để chắn chiều gắn gen crtE, tiến hành xác định chiều giống gen idi 3.2.3 Kết thiết kế vector pR-iEI Sản phẩm biến nạp crtI vào vector pR-iE thu dòng khuẩn lạc, kết tách chiết plasmid dòng khuẩn lạc thể hình 3.17 Hình 3.17: Kết điện di sàng lọc plasmid dòng khuẩn lạc sản phẩm biến nạp crtI pR-iE Đường chạy ĐC: đối chứng pRSETA-iE; đường chạy 1, 2, 3, 4: plasmid dòng khuẩn lạc 57 Hình 3.17 cho thấy, dòng khuẩn lạc thu có dòng số cho băng điện di kích thước cao so với đối chứng Nghi ngờ dòng mang vector pR-iEI Cắt kiểm tra dòng plasmid số với enzyme Xhol, KpnI, kết thể hình 3.18 Theo lý thuyết, vector pR-iEI cắt mở vòng với KpnI, Xhol tạo băng kích thước khoảng 5,8kb Hình 3.18: Kết cắt kiểm plasmid pR-iEI Đường chạy M: Thang DNA chuẩn 1kb; đường chạy 1: dòng plasmid số cắt với Xhol; đường chạy 2: dòng plasmid số cắt với KpnI Trên hình 3.18 cho thấy: đường chạy số tạo băng kích thước xấp xỉ 6kb tương ứng với kích thước vector pR-iEI theo lý thuyết (5772 bp) Vậy gắn thành công gen crtI vào pR-iE tạo vector pR-iEI 3.2.4 Kết thiết kế vector pR-iEIB Sản phẩm biến nạp trình gắn nối crtB vào pR-iEI thu dòng khuẩn lạc Tách chiết plasmid dòng khuẩn lạc này, điện di kiểm tra dòng plasmid so sánh kích thước với đối chứng pR-iEI Kết tách chiết plasmid hình 3.19 58 Hình 3.19: Kết điện di plasmid sản phẩm biến nạp crtB pR-iEI Đường chạy ĐC: đối chứng pR-iEI; đường chạy 1, 2, 3, 4,5,6: plasmid dòng khuẩn lạc Hình 3.19 cho thấy, dòng khuẩn lạc thu có dòng số cho băng điện di kích thước cao so với đối chứng Nghi ngờ dòng mang vector pR-iEIB Cắt kiểm tra dòng plasmid số với enzyme EcoRI Kết thể hình 3.20 Theo lý thuyết, vector pR-iEIB cắt mở vòng với EcoRI tạo băng kích thước khoảng 6,7kb Hình 3.20: Kết cắt pR-iEIB với EcoRI Đường chạy M: Thang DNA chuẩn kb; 1: dòng plasmid số cắt với EcoRI 59 Trên hình 3.20 cho thấy, dòng plasmid số cắt mở vòng tạo băng kích thước khoảng 6,7 kb tương ứng với kích thước vector pR-iEIB (7613bp) Vậy gắn thành công gen crtB vào pR-iEI, tạo pR-iEIB Trong nghiên cứu này, thay đổi trình tự mã ba mở đầu TTG gen crtB P ananatis thành ba ATG Theo nghiên cứu Schneider năm 1986, E coli thường sử dụng ATG làm mã ba mở đầu cho trình dịch mã, E coli sử dụng mã ba khác GTG TTG để làm mã mở đầu Tuy nhiên, chúng ưu tiên sử dụng ATG với tần số 90%, lớn nhiều so với GTG (8%) TTG (1%) [46], [56] Do vậy, thay đổi trình tự mã ba mở đầu TTG thành ba ATG để tăng mức độ biểu gen E coli 3.3 Kết biểu pR-iEIB E coli BL21 (DE3) Sau biến nạp vector pR-iEIB vào chủng vi khuẩn E coli BL21 (DE3) cảm ứng IPTG thu dòng khuẩn lạc màu hồng Cặn khuẩn thu thể hình 3.21 Hình 3.21: Biểu sản xuất lycopene dòng tế bào E coli BL21 (DE3) mang vector pR-iEIB Ống 1: cặn khuẩn dòng tế bào E coli BL21 (DE3) mang pR-iEIB; ống 2: đối chứng (cặn tế bào E coli BL21 (DE3) mang pR-iEI) Trên hình 3.21 cho thấy tế bào biểu màu hồng (màu sắc tố lycopene) Để khẳng định cặn khuẩn màu hồng lycopene tiến hành phân tích dịch khuẩn cảm ứng phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao 60 3.4 Kết phân tích lycopene dịch cảm ứng Phân tích dịch cảm ứng thu phương pháp HPLC Các sắc ký đồ mẫu chuẩn, mẫu cảm ứng 12 24 thể hình 3.22, 3.23, 3.24 50 50 9.920 Lycopen 150 100 100 mAU 200 150 10 12 14 16 18 20 Minutes Hình 3.22: Sắc ký đồ dung dịch mẫu chuẩn 10.037 Lycopen 15 5 0 -5 -5 -10 10 -10 -15 mAU 10 Retention Time Name mAU 15 1: 450 nm, nm Lycopen VS12H-200ml-2ml.dat -15 10 12 14 16 18 20 Minutes 9.963 Lycopen Hình 3.23: Sắc ký đồ mẫu 12h 5 0 -5 -5 -10 10 -10 -15 10 15 -15 10 12 14 Minutes Hình 3.24: Sắc ký đồ mẫu 24h 16 18 20 mAU 15 1: 450 nm, nm Lycopen VS24H-200ml-2ml.dat Retention Time Name mAU mAU 200 1: 450 nm, nm Lycopen Std-Lycopen-50ppm.dat Retention Time Name 61 Từ hình 3.22, 3.23, 3.24 cho thấy thời gian lưu sắc ký đồ tương đối ổn định 9,930 phút; 10,037 phút; 9,963 phút Vậy khẳng định cặn dịch khuẩn màu hồng lycopene Khi phân tích mẫu chuẩn lycopen nồng độ khác hệ thống HPLC, kết phương trình đường chuẩn sau Bảng 3.1:Khoảng tuyến tính đường chuẩn Nồng Diện tích 3000000 độ peak 2500000 y = 49209x + 12200 50 ppm 2470220 2000000 R = 0.9999 20 ppm 1005641 1500000 ppm 243188 1000000 ppm 115183 500000 ppm 65103 0.5 ppm 37707 10 20 30 40 50 60 0.2 ppm 21640 Đường chuẩn biểu thị mối tương quan diện tích peak với nồng độ chất chuẩn, y diện tích peak, x nồng độ tương ứng Mối tương quan tuyến tính nồng độ chuẩn diện tích peak thu có hệ số R2 = 0.9999 Dựa vào phương trình đường chuẩn y = 49209x + 12200 công thức tính hàm lượng lycopene mục 2.4.4, ta có kết hàm lượng lycopene bảng 3.2 Bảng 3.2: Kết phân tích lycopene Mẫu Diện tích peak Nồng độ (mg/l) Mẫu 12h 12627 0.868 Mẫu 24h 12786 1.15 Vậy hàm lượng lycopene thu mẫu cảm ứng 12h 0.868mg/l, mẫu cảm ứng 24h 1,15mg/l Theo Matthews (2000), nghiên cứu tăng cường biểu lycopene cách đưa gen crtE, crtI, crtB P ananatis vào vi khuẩn E coli với gen idi để tăng cường biểu tiền chất IPP, hàm lượng lycopene thu 1,33 mg/l [41] Từ kết khẳng định gắn thành công gen idi, crtE, crtI, crtB vào vector biểu Tất gen gắn không bị lỗi, đảm bảo trình dịch mã diễn bình thường tạo protein đích cuối lycopene Như tạo chủng vi khuẩn E coli biểu sản xuất lycopene thành công 62 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận - Đã tách dòng xác định trình tự gen crtE, crtI, crtB từ vi khuẩn P annanatis gen idi từ vi khuẩn E coli, thu gen crtE, crtI, crtB, idi có chiều dài tương ứng 936 bp, 1479bp, 930 bp, 549bp Kết giải trình tự so sánh, gen idi có trình tự tương đồng 100% với trình tự gen idi phân lập từ E coli chủng UMNK 88 công bố ngân hàng gen NCBI mã số CP002729.1 Gen crtE, crtI có trình tự tương đồng 100% với trình tự gen crtE, crtI, crtB có trình tự tương đồng 99,91% với trình tự gen crtB phân lập từ vi khuẩn P ananatis chủng chủng LGM 20103 công bố ngân hàng gen NCBI mã số tương ứng NC013956.1 (4608461 4609396), NC-013956.1 (4611845 4613323), NC-013956.1 (4613320 4614249) - Đã tạo tổ hợp gen pR-iEIB có kích thước 6713 bp dựa sở gen idi, crtE, crtI, crtB tách dòng với hệ thống vector biểu pRSET-A - Tổ hợp gen biểu chủng vi khuẩn E coli BL21(DE3) tạo màu hồng đỏ đặc trưng lycopene định tính định lượng phương pháp HPLC Đề nghị - Nghiên cứu tiếp tạo carotenoid khác β-carotene, zeaxanthin - Tiếp tục nghiên cứu phương pháp nhằm nâng cao mức độ biểu lycopene E coli cảm ứng tế bào E coli BL21 (DE3) nhiệt; đưa gen đường mevalonate (mvaK1, mvaK2, mvaD); Đưa gen dxs, dxr, gps, vào E coli để tăng cường tổng hợp tiền chất IPP, nhằm mục đích sản xuất lycopene quy mô công nghiệp 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bùi Minh Giao Longhttp://tcyh.yds.edu.vn/2010/Duoc_RHM_YTCC/@@@/DUOC/S%C3%80N G L%E1%BB%8CC CH%E1%BB%A6NG VI KHU%E1%BA%A8N SINH CAROTENOID T%E1%BB%AA BI%E1%BB%82N V%C3%80 C%C3%81C H%E1%BB%92 T%C3%94M %E1%BB%9E VI%E1%BB%86T NAM.htm _ftn1, Vũ Thanh Thảo, Trần Cát Đông (2010), “Sàng lọc chủng vi khuẩn sinh carotenoid từ biển hồ nuôi tôm Việt Nam”, Tạp chí Y Học TP Hồ Chí Minh, 14(1), tr.1-5 Nguyễn Thị Lý, Trần Thị Hồng Vân (2010), “Tách tinh dầu carotenoid từ trầu” (Piper betle L.), Hội Nghị Khoa Học & Công Nghệ lần 9, Phân ban Công nghệ Hóa học, Trường Đại học Bách khoa - Tp.HCM Nguyễn Văn Mùi, Nguyễn Thị Hải Thanh, Hà Thị Bích Ngọc, Trần Thị Huyền Nga (2006), Nghiên cứu chiết xuất tinh chế xác định chất hóa học, hoạt tính sinh học vài Carotenoid từ số cỏ Việt Nam dùng sản xuất thuốc thực phẩm thuốc Đề tài NCKH QG.05.25 Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Quốc Gia, Hà Nội, 2007 Hà Thị Bích Ngọc, Trần Thị Huyền Nga, Nguyễn Văn Mùi (2007), “Điều tra hợp chất carotenoit số thực vật Việt Nam”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, 23(2) tr.130-134 Tiếng Anh Alper, H., Miyaoku, K &Stephanopoulos, G (2005), "Construction of lycopeneoverproducing E coli strains by combining systematic and combinatorial gen knockout targets’’, Nat Biotechnol, 23(5), pp 612-616 Alper, H., Miyaoku, K &Stephanopoulos, G (2006), “Characterization of lycopene-overproducing E coli strains in high cell density fermentations’’,, Appl Microbiol Biotechnol, 72(5), pp 968-974 Arab, L &Steck, S (2000), “Lycopene and cardiovascular disease’’, Am J Clin Nutr, 71(6 Suppl), 1691S-1695S; discussion 1696S-1697S 64 Ausich, R L (1997) , “Commercial opportunities for carotenoid production by biotechnolog’’, Pure &App Chem, 69(10), pp.2169-2173 Bartley, G E., Viitanen, P V., Bacot, K O &Scolnik, P A (1992), “A tomato gen expressed during fruit ripening encodes an enzyme of the carotenoid biosynthesis pathway’’, J Biol Chem , 67(8), pp.5036-5039 10 Bartley, G E., Viitanen, P V., Pecker, I., Chamovitz, D., Hirschberg, J &Scolnik, P A (1991), “Molecular cloning and expression in photosynthetic bacteria of a soybean cDNA coding for phytoene desaturase, an enzyme of the carotenoid biosynthesis pathway’’, Proc Natl Acad Sci U S A , 88(15), pp.6532-6536 11 Campos, N., Rodriguez-Concepcion, M., Sauret-Gueto, S., Gallego, F., Lois, L M &Boronat, A (2001, “Escherichia coli engineered to synthesize isopentenyl diphosphate and dimethylallyl diphosphate from mevalonate: a novel system for the gentic analysis of the 2-C-methyl-d-erythritol 4phosphate pathway for isoprenoid biosynthesis’’, Biochem J, 353(Pt 1), pp.59-67 12 Carattoli, A., Romano, N., Ballario, P., Morelli, G &Macino, G (1991), “ The Neurospora crassa carotenoid biosynthetic gen (albino 3) reveals highly conserved regions among prenyltransferases’’, J Biol Chem, 266(9), pp.5854-5859 13 Choi, H S., Lee, S Y., Kim, T Y &Woo, H M (2010), “In silico identification of gen amplification targets for improvement of lycopene production’’, Appl Environ Microbiol, 76(10), pp.3097-3105 14 Clinton, S K (1998), “Lycopene: chemistry, biology, and implications for human health and disease’’, Nutr Rev, 56(2 Pt 1), pp.35-51 15 Codex (2005), Report of the Thirty-seventh Session of the Codex Committee on Food Additives and Contaminants The Hague, The Netherlands, 25–29 April 2005 16 Cunningham, F X., Jr., Chamovitz, D., Misawa, N., Gantt, E &Hirschberg, J (1993), “Cloning and functional expression in Escherichia coli of a cyanobacterial gen for lycopene cyclase, the enzyme that catalyzes the biosynthesis of beta-caroten’’, FEBS Lett,328(1-2), pp.130-138 65 17 Das, A., Yoon, S H., Lee, S H., Kim, J Y., Oh, D K &Kim, S W (2007), “An update on microbial carotenoid production: application of recent metabolic engineering tools’’, Appl Microbiol Biotechnol, 77(3), pp.505512 18 De Maayer, P., Chan, W Y., Venter, S N., Toth, I K., Birch, P R., Joubert, F &Coutinho, T A (2010), “Genome sequence of Pantoea ananatis LMG20103, the causative agent of Eucalyptus blight and dieback’’, J.Bacteriol, 192(11), pp.2936-2937 19 Di Mascio, P., Kaiser, S &Sies, H (1989), “Lycopene as the most efficient biological carotenoid singlet oxygen quencher’’, Archives of Biochemistry and Biophysics, 274(2), pp.532-538 20 Ernst, H (1997), Recent Advances in Industrial Carotenoid Synthesis 21 Fang, L., Pajkovic, N., Wang, Y., Gu, C &van Breemen, R B (2003), “Quantitative Analysis of Lycopene Isomers in Human Plasma Using High“Performance Liquid Chromatography−Tandem Mass Spectrometry’’, Analytical Chemistry, 75(4), pp.812-817 22 Farmer, W R &Liao, J C (2000), “Improving lycopene production in Escherichia coli by engineering metabolic control’’, Nat Biotechnol, 18(5), pp.533-537 23 Franceschi, S., Bidoli, E., La Vecchia, C., Talamini, R., D'Avanzo, B &Negri, E (1994), “Tomatoes and risk of digestive-tract cancer’’, Int J Cancer, 59(2), pp.181-184 24 Gann, P H., Ma, J., Giovannucci, E., Willett, W., Sacks, F M., Hennekens, C H &Stampfer, M J (1999), “Lower prostate cancer risk in men with elevated plasma lycopene levels: results of a prospective analysis’’, Cancer Res, 59(6), pp.1225-1230 25 Gartner, C., Stahl, W &Sies, H (1997), “Lycopene is more bioavailable from tomato paste than from fresh tomatoes’’, The American Journal of Clinical Nutrition, 66(1), pp.116-122 26 Gaziano, J M., Manson, J E., Branch, L G., Colditz, G A., Willett, W C &Buring, J E (1995), “A prospective study of consumption of carotenoids 66 in fruits and vegetables and decreased cardiovascular mortality in the elderly’’, Ann Epidemiol, 5(4), pp.255-260 27 Giovannucci, E (1999), “Tomatoes, tomato-based products, lycopene, and cancer: review of the epidemiologic literature’’, J Natl Cancer Inst, 91(4), pp.317-331 28 Giovannucci, E., Ascherio, A., Rimm, E B., Stampfer, M J., Colditz, G A &Willett, W C (1995), “Intake of carotenoids and retinol in relation to risk of prostate cancer’’, J Natl Cancer Inst, 87(23), pp.1767-1776 29 Harman, D (1956), “Aging: a theory based on free radical and radiation chemistry’’, J Gerontol, 11(3), pp.298-300 30 Henry, L K., Puspitasari-Nienaber, N L., Jaren-Galan, M., van Breemen, R B., Catignani, G L &Schwartz, S J (2000) , “Effects of ozone and oxygen on the degradation of carotenoids in an aqueous model system’’, J Agric Food Chem, 48(10), pp.5008-5013 31 Hughes, D A (1999) Effects of carotenoids on human immune function Proc Nutr Soc 58(3): 713-718 32 Jin, Y S &Stephanopoulos, G (2007), “Multi-dimensional gen target search for improving lycopene biosynthesis in Escherichia coli’’, Metab Eng, 9(4), pp.337-347 33 Johnson, E A &Schroeder, W A (1996), Microbial carotenoids, Adv Biochem Eng Biotechnol, 53, pp.119-178 34 Jurat-Fuentes, J L., Gould, F L &Adang, M J (2003), “Dual resistance to Bacillus thuringiensis Cry1Ac and Cry2Aa toxins in Heliothis virescens suggests multiple mechanisms of resistance’’, Appl Environ Microbiol 69(10), pp.5898-5906 35 Kang, M J., Lee, Y M., Yoon, S H., Kim, J H., Ock, S W., Jung, K H., Shin, Y C., Keasling, J D &Kim, S W (2005), “Identification of gens affecting lycopene accumulation in Escherichia coli using a shot-gun method’’, Biotechnol Bioeng, 91(5), pp.636-642 36 Kim, S W &Keasling, J D (2001), “Metabolic engineering of the nonmevalonate isopentenyl diphosphate synthesis pathway in Escherichia coli enhances lycopene production’’, Biotechnol Bioeng, 72(4), pp 408-415 67 37 Kohlmeier, L., Kark, J D., Gomez-Gracia, E., Martin, B C., Steck, S E., Kardinaal, A F., Ringstad, J., Thamm, M., Masaev, V., Riemersma, R., Martin-Moreno, J M., Huttunen, J K &Kok, F J, (1997), “Lycopene and myocardial infarction risk in the EURAMIC Study’’, Am J Epidemiol, 146(8), pp.618-626 38 Krinsky, N I (1998), The antioxidant and biological properties of the carotenoids, Ann N Y Acad Sci ,854, pp.443-447 39 Lee, P C &Schmidt-Dannert, C (2002), “Metabolic engineering towards biotechnological production of carotenoids in microorganisms’’, Appl Microbiol Biotechnol, 60(1-2), pp.1-11 40 Lu, C H., Engelmann, N J., Lila, M A &Erdman, J W., Jr (2008), “Optimization of lycopene extraction from tomato cell suspension culture by response surface methodology’’, J Agric Food Chem, 56(17), pp.7710-7714 41 Matthews, P D &Wurtzel, E T (2000), “Metabolic engineering of carotenoid accumulation in Escherichia coli by modulation of the isoprenoid precursor pool with expression of deoxyxylulose phosphate synthase’’, Appl Microbiol Biotechnol ,53(4), pp.396-400 42 Misawa, N., Nakagawa, M., Kobayashi, K., Yamano, S., Izawa, Y., Nakamura, K &Harashima, K (1990), “Elucidation of the Erwinia uredovora carotenoid biosynthetic pathway by functional analysis of gen products expressed in Escherichia coli’’, J Bacteriol, 172(12), pp.6704-6712 43 Misawa, N &Shimada, H (1997), “Metabolic engineering for the production of carotenoids in non-carotenogenic bacteria and yeasts’’, J Biotechnol, 59(3), pp.169-181 44 Miura, Y., Kondo, K., Saito, T., Shimada, H., Fraser, P D &Misawa, N (1998), “Production of the carotenoids lycopene, beta-carotene, and astaxanthin in the food yeast Candida utilis’’, Appl Environ Microbiol, 64(4), pp.1226-1229 45 Nelis, H &J D L., A P (1998), “Microbial sources of carotenoid pigments used in foods and feeds’’, Journal of Applied Microbiology, 70(3), pp.181191 68 46 O'Donnell, S M &Janssen, G R (2001), “The initiation codon affects ribosome binding and translational efficiency in Escherichia coli of cI mRNA with or without the 5' untranslated leader’’, J Bacteriol, 183(4), pp.1277-1283 47 Olson, J A &Krinsky, N I (1995), “Introduction: the colorful, fascinating world of the carotenoids: important physiologic modulators’’, FASEB J, 9(15), pp.1547-1550 48 Parker, R S (1996), “Absorption, metabolism, and transport of carotenoids’’, FASEB J, 10(5), pp.542-551 49 Porrini, M &Riso, P (2000), “Lymphocyte lycopene concentration and DNA protection from oxidative damage is increased in women after a short period of tomato consumption’’, J Nutr 130(2), pp.189-192 50 Potischman, N., McCulloch, C E., Byers, T., Nemoto, T., Stubbe, N., Milch, R., Parker, R., Rasmussen, K M., Root, M., Graham, S &et al (1990), “Breast cancer and dietary and plasma concentrations of carotenoids and vitamin A’’, Am J Clin Nutr 52(5), 909-915 51 Rao, A V &Rao, L G (2007), “Carotenoids and human health Pharmacological Research 55(3), pp.207-216 52 Ruther, A., Misawa, N., Boger, P &Sandmann, G (1997), “Production of zeaxanthin in Escherichia coli transformed with different carotenogenic plasmids’’, Appl Microbiol Biotechnol, 48(2), pp.162-167 53 Sandmann, G (2001), “Carotenoid biosynthesis and biotechnological application’’, Arch Biochem Biophys, 385(1), pp.4-12 54 Sandmann, G., Albrecht, M., Schnurr, G., Knorzer, O &Boger, P (1999), “The biotechnological potential and design of novel carotenoids by gen combination in Escherichia coli’’, Trends Biotechnol, 17(6), pp.233-237 55 Schmidt-Dannert, C., Umeno, D &Arnold, F H (2000) “Molecular breeding of carotenoid biosynthetic pathways’’, Nat Biotechnol, 18(7), pp.750-753 56 Schneider, T D., Stormo, G D., Gold, L &Ehrenfeucht, A (1986), “Information content of binding sites on nucleotide sequences’’, J Mol Biol, 188(3), pp.415-431 69 57 Schwarz, S., Obermuller-Jevic, U C., Hellmis, E., Koch, W., Jacobi, G &Biesalski, H K (2008), “Lycopene inhibits disease progression in patients with benign prostate hyperplasia’’, J Nutr, 138(1), pp.49-53 58 Shimada, H., Kondo, K., Fraser, P D., Miura, Y., Saito, T &Misawa, N (1998), “Increased Carotenoid Production by the Food Yeast Candida utilis through Metabolic Engineering of the Isoprenoid Pathway’’, Appl Environ Microbiol, 64(7), pp.2676-2680 59 Sies, H &Stahl, W (1998), “Lycopene: antioxidant and biological effects and its bioavailability in the human’’, Proc Soc Exp Biol Med, 218(2), pp.121124 60 Stahl, W., Schwarz, W., Sundquist, A R &Sies, H (1992), “cis-trans isomers of lycopene and beta-carotene in human serum and tissues’’, Arch Biochem Biophys, 294(1), pp.173-177 61 Stahl, W &Sies, H (1996), “Lycopene: A Biologically Important Carotenoid for Humans’’, Archives of Biochemistry and Biophysics, 336(1), tr1-9 62 van Breemen, R B &Pajkovic, N (2008), “Multitargeted therapy of cancer by lycopen’’, Cancer Lett 269(2), pp.339-351 63 Wang, C., Oh, M K &Liao, J C (2000), “Directed evolution of metabolically engineered Escherichia coli for carotenoid production’’, Biotechnol Prog 16(6), pp.922-926 64 Watzl, B., Bub, A., Brandstetter, B R &Rechkemmer, G (1999), “Modulation of human T-lymphocyte functions by the consumption of carotenoid-rich vegetable’’, Br J Nutr 82(5), pp.383-389 65 Yamano, S., Ishii, T., Nakagawa, M., Ikenaga, H &Misawa, N (1994), “Metabolic engineering for production of beta-carotene and lycopene in Saccharomyces cerevisiae’’, Biosci Biotechnol Biochem, 58(6), pp.11121114 66 Yoon, S H., Kim, J E., Lee, S H., Park, H M., Choi, M S., Kim, J Y., Shin, Y C., Keasling, J D &Kim, S W (2007), “Engineering the lycopene synthetic pathway in E coli by comparison of the carotenoid gens of Pantoea agglomerans and Pantoea ananatis’’, Appl Microbiol Biotechnol, 74(1), tr131-139 70 67 Yoon, S H., Lee, Y M., Kim, J E., Lee, S H., Lee, J H., Kim, J Y., Jung, K H., Shin, Y C., Keasling, J D &Kim, S W (2006), “Enhanced lycopene production in Escherichia coli engineered to synthesize isopentenyl diphosphate and dimethylallyl diphosphate from mevalonate’’, Biotechnol Bioeng 94(6), pp.1025-1032 68 Zaripheh, S &Erdman, J W., Jr (2005), “The biodistribution of a single oral dose of [14C]-lycopene in rats prefed either a control or lycopene-enriched diet’’, J Nutr 135(9), pp.2212-2218 69 Sambrook J., Russell D (2001), “Molecular Cloning: A Laboratory Manual'', Cold Spring Harbor Laboratory Press, Third edition, New York 70 Yoon, S.-H., Park, H.-M., Kim, J.-E., Lee, S.-H., Choi, M.-S., Kim, J.-Y., Oh, D.-K., Keasling, J D &Kim, S.-W (2007), "Increased β-Carotene Production in Recombinant Escherichia coli Harboring an Engineered Isoprenoid Precursor Pathway with Mevalonate Addition", Biotechnology Progress, 23(3), pp.599-605 ... Các gen crt vi khuẩn P ananatis chức tương ứng Gen Enzyme tương ứng Sản phẩm CrtE GGPP synthase Geranylgeranyl pyrophosphate CrtB Phytoene synthase Phytoene CrtI Phytoene desaturase Lycopene CrtY... lycopene E coli tiêu tốn IPP Với mục tiêu giữ cân IPP cho vật chủ, gen idi mã hóa IPP đưa vào [22] Từ sở thực đề tài Tạo chủng vi khuẩn E coli có khả sản xuất lycopene ứng dụng công nghệ thực phẩm ,... CrtY Lycopene cyclase β-carotene CrtZ β-carotene hydroxylase zeaxanthin CrtX Zeaxanthin glucosyltransferase Zeaxanthin-β-diglucoside Thứ tự gen tổng hợp carotenoid đường sinh tổng hợp lycopene vi