Nghiên cứu bào chế tiểu phân nano paclitaxel sử dụng poly (acid lactic co glycolic) và chitosan

Công nghệ bào chế hệ đưa thuốc dạng tiểu phân nano có thể khắc phục được các hạn chế của DC và các dạng thuốc truyền thống như giảm độc tính, tăng sinh khả dụng, tăng liều sử du ̣ng m

CHITOSAN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2017

1 Viê ̣n Công Nghê ̣ Dươ ̣c Phẩm Quốc Gia

2 Bô ̣ môn Bào Chế

HÀ NỘI 2017

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, tôi xin tỏ lòng biết ơn chân thành nhất đối với thầy PGS.TS Nguyễn Ngọc Chiến, người thầy giàu kinh nghiệm và đầy nhiệt huyết đã định hướng và ta ̣o

mo ̣i điều kiê ̣n thuâ ̣n lợi giúp đỡ tôi thực hiện khóa luận này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên thuộc Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc Gia, Bộ môn Công nghiệp Dược, Bộ môn Bào chế đã tạo điều kiện về thiết bị, máy móc, hóa chất, giúp đỡ tôi trong quá trình làm thực nghiê ̣m

Tôi xin phép cảm ơn Ban giám Hiệu nhà trường, Phòng Đào tạo và các Phòng ban khác, các thầy cô và cán bộ nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội đã đào ta ̣o và giúp đỡ tôi hoàn thành khóa ho ̣c ta ̣i trường

Cuối cùng, tôi xin được cảm ơn đặc biê ̣t đến gia đình và bạn bè tôi, những người luôn ủng hô ̣, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quãng thời gian ho ̣c tâ ̣p và nghiên cứu vừa qua

Hà nội, ngày tháng năm 2017 Sinh viên

Nguyễn Thi ̣ Thu Hương

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

-  -

NGUYỄN THI ̣ THU HƯƠNG MÃ SINH VIÊN: 1201278 NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ TIỂU PHÂN NANO PACLITAXEL SỬ DỤNG POLY (ACID LACTIC-CO -GLYCOLIC) VÀ CHITOSAN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Ngo ̣c Chiến Nơi thực hiện: 1 Viện Công Nghê ̣ Dươ ̣c Phẩm Quốc Gia 2 Bô ̣ môn Bào Chế HÀ NỘI 2017 HÀ NỘI - 2017 HÀ NỘI- 2013 HÀ NỘI, NĂM 2012 MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THI ̣ ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về paclitaxel 2

1.1.1 Công thức cấu tạo 2

1.1.2 Tính chất hóa lý 2

1.1.3 Định tính, đi ̣nh lượng 3

1.1.4 Dược động học 3

1.1.5 Cơ chế tác dụng 3

1.1.6 Chỉ định 3

1.1.7 Liều dùng, cách dùng 4

1.1.8 Chống chỉ định 4

1.1.9 Thận trọng 4

1.1.10 Tác dụng không mong muốn 4

1.2 Tổng quan về PLGA 5

1.2.1 Cấu trúc, tính chất, ứng dụng 5

1.2.2 Nhược điểm của PLGA khi sử dụng làm chất mang thuốc 6

1.3 Tổng quan về chitosan 7

1.3.1 Nguồn gốc và cấu trúc của chitosan 7

1.3.2 Tính chất của chitosan 8

1.4 Phương pháp bao CS lên tiểu phân nano PLGA 9

1.5 Mô ̣t số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình bao CS lên tiểu phân nano PLGA 10

1.5.1 Ảnh hưởng của pH và lực ion 10

1.5.2 Ảnh hưởng của tỷ lê ̣ CS/PLGA 10

1.6 Mô ̣t số nghiên cứu bào chế hê ̣ tiểu phân nano liên quan 10

1.6.1 Nghiên cứu trong nước 10

1.6.2 Nghiên cứu trên thế giới 11

1.7 Tổng quan về tiểu phân nano polyme 12

1.7.1 Khái niê ̣m 12

1.7.2 Phân loa ̣i 13

1.7.3 Phương pháp bào chế tiểu phân nano polyme 13

1.7.4 Cải biến bề mă ̣t tiểu phân nano polyme khi sử du ̣ng đường tiêm tĩnh ma ̣ch 15

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Nguyên vâ ̣t liê ̣u, thiết bi ̣ 16

2.1.1 Nguyên liệu 16

2.1.2 Thiết bị 17

2.2 Nội dung nghiên cứu 17

2.3 Phương pháp nghiên cứu 17

2.3.1 Phương pháp bào chế 17

2.3.2 Các phương pháp đánh giá 19

2.3.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm và tối ưu hóa công thức 22

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23

3.1 Kết quả khảo sát phương pháp đi ̣nh lượng Paclitaxel 23

3.1.1 Lựa cho ̣n tỷ lê ̣ pha đô ̣ng 23

3.1.2 Thẩm định mô ̣t số chỉ tiêu của phương pháp định lượng PTX 23

3.2 Kết quả bào chế hê ̣ tiểu phân nano PTX-PLGA/CS 28

3.2.1 Khảo sát sơ bô ̣ quá trình bao CS lên hê ̣ tiểu phân nano PTX-PLGA/CS.28 3.2.2 Tối ưu hóa công thức bào chế tiểu phân nano PTX-PLGA/CS 31

3.2.3 Đô ̣ ổn đi ̣nh của hê ̣ tiểu phân nano trong điều kiê ̣n khắc nghiê ̣t 38

3.3 Đề xuất mô ̣t số chỉ tiêu lý hóa của hê ̣ tiểu phân nano PTX-PLGA/CS 39

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHI ̣ 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

EE Hiệu suất mang thuốc (Encapsulation efficiency)

EMA Cơ quan quản lý thuốc châu Âu (European Medicines Agency)

EPR Tăng tính thấm và thời gian lưu (Enhanced Permeation and Retention) FDA Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (Food and Drug

Administration)

FT-IR Phổ hồng ngoa ̣i chuyển da ̣ng Fourier

(Fourier transform infrared spectroscopy)

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High-performance liquid chromatography) kl/kl Khối lương/khối lượng

KLPT Khối lượng phân tử

KT Kích thước

KTTP Kích thước tiểu phân

kl/tt Khối lượng/thể tích

LC Khả năng nạp thuốc của hệ (Loading capacity)

MPS Hê ̣ thống thực bào đơn nhân

PEG Poly (ethylen glycol)

PGA Poly (acid glycolic)

PhEur Dược điển châu Âu (Pharmacopoeia Europaea)

PLA Poly (acid lactic)

PLGA Poly (acid lactic-co-glycolic)

PNs Tiểu phân nano polyme (Polymeric nanoparticles) PTX Paclitaxel

PVA Polyvinyl alcohol

RES Hê ̣ thống lưới nô ̣i mô (Reticuloendothelial System) RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative standard deviation)

TB Trung bình

TCNSX Tiêu chuẩn nhà sản xuất

tt/tt Thể tích/thể tích

USP Dược điển Mỹ (The United States Pharmacopoeia)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Nguyên liệu sử dụng trong quá trình thực nghiê ̣m 16 Bảng 3.1 Kết quả khảo sát sắc ký đồ của PTX với tỷ lệ pha động khác

Bảng 3.6 Ảnh hưở ng của pH dung di ̣ch CS đến đă ̣c tính lý hóa của tiểu

phân nano PTX-PLGA/CS

30

Bảng 3.7 Ảnh hưở ng của nhiê ̣t đô ̣ giai đoa ̣n hấp phu ̣ CS đến đă ̣c tính lý

hóa tiểu phân nano PTX-PLGA/CS

31

Bảng 3.10 Ảnh hưở ng của các biến đô ̣c lâ ̣p đến biến phu ̣ thuô ̣c

Bảng 3.11 Công thức tối ưu và mô ̣t số đă ̣c tính tiểu phân nano

PTX-PLGA/CS theo dự đoán và thực tế

Bảng 3.12 Đă ̣c tính tiểu phân nano PTX-PLGA/CS trong các môi trường

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THI ̣

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học và sự thủy phân của PLGA 5

Hình 1.4 Hình ảnh siêu vi nang và siêu vi cầu 12 Hình 2.1 Sơ đồ quy trình bào chế tiểu phân nano PTX-PLGA/CS 18

Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ

PTX trong pha động

26

Hình 3.5 Mă ̣t đáp biểu diễn sự ảnh hưởng của pH dung di ̣ch CS và tỷ lê ̣

CS/PLGA đến KTTP nano PTX-PLGA/CS

34

Hình 3.6 Mă ̣t đáp biểu diễn sự ảnh hưởng của tỷ lê ̣ CS/PLGA và nhiê ̣t đô ̣

hấp phu ̣ CS đến PDI của hê ̣ tiểu phân nano PTX-PLGA/CS

34

Hình 3.7 Mă ̣t đáp biểu diễn sự ảnh hưởng của tỷ lê ̣ CS/PLGA và pH dung

di ̣ch CS đến thế Zeta của tiểu phân nano trong môi trường nước cất

35

Hình 3.8 Mă ̣t đáp biểu diễn sự ảnh hưởng của tỷ lê ̣ CS/PLGA và pH dung

di ̣ch CS đến hiê ̣u suất mang thuốc của tiểu phân nano

Hình 3.10 Ảnh hưởng của các tá dược ta ̣o khung đến đô ̣ ổn đi ̣nh kích thước

tiểu phân nano trong thử nghiê ̣m đông đá - rã đông

38

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Năm 2016, theo thống kê của Hô ̣i Ung Thư Viê ̣t Nam, mỗi năm có khoảng 1.200 phụ nữ mắc ung thư buồng trứng - căn bê ̣nh có tỷ lê ̣ tử vong cao nhất trong các loa ̣i ung thư phu ̣ khoa Viê ̣c gia tăng tỷ lê ̣ mắc ung thư hiê ̣n nay đă ̣t ra yêu cầu tiếp

tu ̣c nghiên cứu các da ̣ng bào chế mới với mu ̣c đích cải thiê ̣n hiê ̣u quả điều tri ̣ và nâng cao chất lượng cuô ̣c sống của bê ̣nh nhân

Paclitaxel là một hoạt chất thu được từ dịch chiết của cây thông đỏ (tên khoa

học Taxus brevifolia), nó có tác dụng độc tế bào Năm 1992, sau quá trình thử nghiệm lâm sàng, paclitaxel được FDA phê duyệt để điều trị ung thư buồng trứng [12] Paclitaxel là DC được xếp vào nhóm IV, nhóm có độ tan thấp và tính thấm thấp [51], tác du ̣ng bất lợi của thuốc gây ra rất nhiều [2] PTX dùng điều tri ̣ ung thư chủ yếu qua đường hít da ̣ng khí dung và đường tiêm truyền tĩnh ma ̣ch Với đường dùng này, yêu cầu các tiểu phân hoa ̣t chất phải có đường kính < 15 µm [1] Mô ̣t vài nghiên cứu cho thấy, khi phân tử có đường kính > 5 µm sẽ dễ gây hiê ̣n tượng tắc ma ̣ch và không sử du ̣ng được liều cao [50] Công nghệ bào chế hệ đưa thuốc dạng tiểu phân nano có thể khắc phục được các hạn chế của DC và các dạng thuốc truyền thống như giảm độc tính, tăng sinh khả dụng, tăng liều sử du ̣ng mà ít đô ̣c với tế bào lành… [5]

Poly (acid lactic-co-glycolic) (PLGA) là polyme mang thuốc có khả năng phân hủy sinh học, giúp bảo vệ DC khỏi tác động của enzym, kéo dài thời gian giải phóng

DC Tuy nhiên, nano polyme PLGA có khả năng bám dính màng nhầy kém và dễ bị nhận diện bởi hệ thống miễn dịch của cơ thể [32] Chitosan (CS) được sử dụng để cải biến bề mặt tiểu phân nano PLGA, tăng khả năng bám dính tế bào, tăng tính hướng đích, kéo dài thời gian bán thải, hạn chế sự giải phóng ồ ạt DC ở giai đoạn đầu

Chính vì vâ ̣y, chúng tôi tiến hành thực hiê ̣n đề tài “Nghiên cứu bào chế tiểu

phân nano paclitaxel sử du ̣ng Poly (acid lactic-co-glycolic) và chitosan” với các

mục tiêu sau:

1 Xây dựng công thức bào chế hê ̣ tiểu phân nano PTX-PLGA/CS

2 Đề xuất một số chỉ tiêu lý hóa của hê ̣ tiểu phân nano bào chế được

2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về paclitaxel

1.1.1 Công thức cấu tạo

- Công thức cấu tạo

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của Paclitaxel

- Tên khoa học: (2aR,4S,4aS,6R,9S,11S,12S,12aR,12bS)-1,2a,3,4,4a,6,9,10,11,12,

12a,12b-dodecahydro-4,6,9,11,12,12b-hexahydroxy-4a,8,13,13-tetramethyl-7,11-methano-5H-cyclodeca[3,4]-benz[1,2-b]oxet-5-on-6,12b-diacetat,12-benzoat,9-ester with (2R,3S)-N-benzoyl-3-phenylisoserin

- Hoặc 5b,20-Epoxy-1,7b-dihydroxy-9-oxotax-11-en-2a,4,10b,13a-tetrayl diacetat 2-benzoat 13-[(2R,3S)-3-(benzoylamino)-2-hydroxy-3-phenylpropa noat]

4,10 Công thức phân tử: C47H51NO14

- Khối lượng phân tử: 853,91 g/mol [44]

- Nguồn gốc: di ̣ch chiết cây thông đỏ - tên khoa ho ̣c Taxus brevifolia

1.1.2 Tính chất hóa lý

Lý tính: Dạng tinh thể, màu trắng hoặc gần như trắng, thực tế không tan trong

nước, tan trong methanol, ethanol, dicloromethan và dễ tan trong methylen clorid [19] Góc quay cực: Dung dịch 10 mg/ml trong methanol có góc quay cực từ -49,00

đến -55,00 ở dạng khan [19]

Hóa tính: có tính kiềm, pKa =10,36 [22]

3

1.1.3 Đi ̣nh tính, đi ̣nh lượng

Đi ̣nh tính: Đo góc quay cực của paclitaxel, phương pháp đo quang - phổ hồng

ngoại IR [19], phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [44]

Đi ̣nh lượng: Phương pháp đo quang UV-Vis ta ̣i bước sóng 230 nm Phương

pháp HPLC với detector UV bước sóng 227 nm [44]

1.1.4 Dược động học

Nồng độ thuốc trong huyết tương tỷ lệ thuận với liều được truyền vào tĩnh

mạch và giảm theo đồ thị 2 pha Tỷ lệ gắn với protein là 89% (in vitro) và không bị

thay đổi khi dùng cùng với cimetidin, ranitidin, dexamethason, hoặc diphenhydramin

Ở giai đoạn ổn định, thể tích phân bố là 5 - 6 lít/kg thể trọng (68 - 162 ml/m2), cho thấy thuốc khuếch tán nhiều ra ngoài mạch và/hoặc gắn nhiều với các thành phần của

mô Thời gian bán thải là 6 - 13 giờ Sau khi truyền tĩnh mạch, có khoảng 2 - 13% lượng thuốc được thải qua nước tiểu dưới dạng ban đầu, như vậy ngoài thận còn có những đường đào thải khác Trên động vật thí nghiệm, PTX được chuyển hóa tại gan

Ðộ thanh thải dao động từ 0,3 đến 0,8 lít/giờ/kg (hay 6,0 - 15,6 lít/giờ/m2) [2]

1.1.5 Cơ chế tác dụng

Paclitaxel là một thuốc chống ung thư Paclitaxel làm tăng quá trình trùng hợp

các dime tubulin tạo thành các vi quản và làm ổn định các vi quản do ức chế quá trình giải trùng hợp Điều này dẫn đến ức chế sự tái tổ chức của mạng vi quản – đóng vai trò rất quan trọng ở gian kỳ của quá trình phân bào giảm nhiễm và cả với hoạt động của ty lạp thể Paclitaxel ức chế hình thành các cấu trúc bất thường trong các vi quản trong quá trình phân bào [2]

4

1.1.7 Liều dùng, cách dùng

Truyền tĩnh mạch với liều 175 mg/m2 trong 3 giờ Có thể lặp lại sau một khoảng thời gian ít nhất là 3 tuần Chỉ dùng liều mới khi số lượng bạch cầu hạt trung tính > 1,5 x 109/lít (1.500/mm3) và số lượng tiểu cầu > 100 x 109/lít (100.000/mm3)

Ở người bệnh có số lượng bạch cầu hạt bị giảm nặng (< 0,5 x 109/lít) (500/mm3) trong quá trình điều trị dài hơn bằng paclitaxel thì nên giảm 20% liều dùng

Dung môi để pha loãng thuốc có thể là: dung dịch Natri clorid 0,9%, dung dịch glucose 5%, hỗn hợp dung dịch Natri clorid 0,9 % và dung dịch glucose 5%, hoặc hỗn hợp dung dịch glucose 5% và dung dịch Ringer

Thông thường thuốc được pha vào một trong các dung dịch trên sao cho dịch truyền có nồng độ paclitaxel là 0,3 - 1,2 mg/ml [2]

1.1.8 Chống chỉ định

Không dùng cho người bệnh quá mẫn với paclitaxel hay với bất kỳ thành phần nào của chế phẩm, đặc biệt là quá mẫn với dầu cremophor EL

Không dùng cho người bệnh có số lượng bạch cầu trung tính < 1500/mm3 (1,5

x 109/lít) hoặc có biểu hiện rõ bệnh lý thần kinh vận động [2]

1.1.9 Thận trọng

Ở người bệnh có rối loạn hoặc suy chức năng gan

Ở người bệnh có bệnh tim [2]

1.1.10 Tác dụng không mong muốn

Tất cả các người bệnh dùng paclitaxel đều bị rụng tóc Gần 90% bị suy tủy

Tuần hoàn: Hạ huyết áp không biểu hiện triệu chứng (22%), giảm nhịp tim không biểu hiện triệu chứng (3%)

5

Tiêu hóa: Buồn nôn, nôn (44%), ỉa chảy (25%), đa tiết chất nhờn (20%), táo bón (18%), tắc ruột (4%)

Da: Rụng tóc (> 90%), kích ứng tại nơi truyền thuốc (4%)

Gan: Tăng transaminase huyết thanh lên tới hơn 5 lần so với bình thường (5%), tăng phosphatase kiềm lên hơn 5 lần (5%) và tăng mạnh bilirubin huyết thanh (1%)

Cơ - xương: Ðau cơ, đau khớp (54%) trong đó 12% là rất nặng

có số lượng tiểu cầu dưới 50.000/mm3 ít nhất là 1 lần trong quá trình điều trị

Thần kinh: Bệnh thần kinh có thể xuất hiện tùy theo liều dùng và có liên quan tới tích lũy thuốc [2]

1.2 Tổng quan về PLGA

1.2.1 Cấu trúc, tính chất, ứng dụng

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học và sự thủy phân của PLGA

PLGA là một trong những polyme phân hủy sinh ho ̣c được sử du ̣ng thành công nhất để bào chế hê ̣ tiểu phân nano polyme PLGA hòa tan trong mô ̣t số dung môi như dung di ̣ch aceton, dicloromethan hoă ̣c ethyl acetat Trong nước, PLGA thủy phân liên kết este giải phóng acid lactic và acid glycolic, cả hai monome này được chuyển hóa thông qua chu trình Kreps, rồi đào thải dễ dàng sau khi chuyển đổi thành CO2 và nước, do đó các hê ̣ đưa thuốc sử du ̣ng PLGA có đô ̣c tính hê ̣ thống tối thiểu [28]

6

PLGA đã được FDA và EMA cho phép sử du ̣ng trong nhiều da ̣ng bào chế dược phẩm PLGA thương ma ̣i có nhiều loa ̣i khác nhau về tro ̣ng lượng phân tử và tỷ lê ̣ thành phần các monome

Acid lactic thân dầu hơn acid glycolic, do đó các PLGA giàu thành phần acid

lactic kém thân nước hơn và phân hủy châ ̣m hơn Quá trình phân hủy polyme in vitro

và in vivo bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như phương pháp tổng hợp, sự có mặt của

các thành phần phân tử lượng thấp (monome, oligome, chất xúc tác), KT, hình dạng

và hình thái bề mặt, các đặc tính vốn có của polyme (KLPT, cấu trúc hóa học, tính sơ nước, trạng thái kết tinh, nhiệt độ chuyển hóa thủy tinh, các thông số lý hóa (pH, nhiệt

độ, lực ion của môi trường), đích sử dụng và cơ chế thủy phân) [9]

Mô ̣t số loa ̣i PLGA hay được sử du ̣ng trong bào chế: PLGA 50:50, PLGA 65:35 và PLGA 75:25 NC sử du ̣ng PLGA 50:50 là loa ̣i có tỷ lê ̣ hai monome acid lactic: acid glycolic = 50:50

1.2.2 Nhược điểm của PLGA khi sử dụng làm chất mang thuốc

Một trong những khó khăn chính của các hệ nano dựa trên PLGA liên quan đến khả năng nạp thuốc (drug loading cabacity) thường thấp (khoảng dưới 20%) mặc

dù hiệu suất bẫy thuốc (encapsulation efficiency) thân dầu cao

Dễ bi ̣ nhâ ̣n diê ̣n và tiêu diê ̣t bởi hê ̣ thống miễn di ̣ch: Các tiểu phân nano PLGA có bề mă ̣t sơ nước, do đó dễ bi ̣ hê ̣ miễn di ̣ch nhâ ̣n diê ̣n là chất ngoa ̣i lai, hê ̣ thống lưới

nô ̣i mô (RES) sẽ đào thải chúng ra khỏi máu để đưa đến gan và lách Sau khi được tiêm vào cơ thể, các tiểu phân nano PLGA sẽ gắn với các protein opsonin tồn ta ̣i trong huyết tương và các tiểu phân opsonin hóa dễ bi ̣ bắt giữ bởi đa ̣i thực bào [11] Quá trình này là mô ̣t trong những rào cản sinh ho ̣c lớn nhất đối với hê ̣ tiểu phân nano [28] Ngoài ra, viê ̣c tương tác không đă ̣c hiê ̣u với protein và tế bào dẫn đến sự tích lũy thuốc ta ̣i các mô không bê ̣nh lý làm giảm hiê ̣u quả điều tri ̣, tăng tác du ̣ng phu ̣ của

DC, đă ̣c biê ̣t là các thuốc kháng ung thư như paclitaxel

Các tiểu phân nano PLGA có đô ̣ng ho ̣c giải phóng gồm 2 pha, trong đó pha I thường là pha giải phóng ồ a ̣t (burst release), pha II là pha giải phóng châ ̣m [20] Sự

1.3 Tổng quan về chitosan

1.3.1 Nguồn gốc và cấu trúc của chitosan

Chitosan (poly 1,4-β-D-glucosamin) là sản phẩm deacetyl hóa (DA) của chitin, một polyme tự nhiên chuỗi dài của N– acetylglucosamin và dẫn xuất đường glucose Chitin là thành phần chính của thành tế bào nấm, xương ngoài của động vật chân đốt như tôm cua, côn trùng, hay lưỡi bào ở động vật thân mềm CS có độ DA > 50% hay thực tế là một polyme chitin/chitosan, với mức độ DA và KLPT có thể thay đổi Độ

DA của CS dùng trong sản xuất thường từ 60-100%

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của chitosan

8

1.3.2 Tính chất của chitosan

1.3.2.1 Tính chất vật lý - sinh học

CS có tính base yếu, pKa khoảng 6,3-7,0 [10], không tan trong các dung di ̣ch

pH trung tính và kiềm, tan trong hầu hết các dung dịch acid hữu cơ ở pH < 6,5 như acid formic, acid acetic, acid tartric và acid citric, nhưng không tan trong acid sulfuric

và acid phosphoric… Các muối của CS đều tan trong nước, đô ̣ tan phu ̣ thuô ̣c vào mức đô ̣ DA và pH dung di ̣ch Sự có mă ̣t của các muối trong dung di ̣ch cũng ảnh hưởng đến đô ̣ tan của CS Lực ion càng lớn, đô ̣ tan càng giảm do các ion ca ̣nh tranh

đô ̣ tan dẫn đến sự kết tủa CS trong dung di ̣ch [37]

Trong môi trường acid, nhóm amin của CS nhâ ̣n proton, làm cho phân tử tích điê ̣n dương với mâ ̣t đô ̣ điê ̣n tích cao Tính chất tích điện dương giúp cho CS hoạt động như một chất bám dính sinh học, có khả năng bám vào các bề mặt tích điện âm như màng nhầy CS tăng vận chuyển các thuốc phân cực qua bề mặt biểu mô, có tính tương thích sinh học và khả năng phân hủy sinh học [5]

Ngoài ra, nó còn nhiều tác du ̣ng sinh ho ̣c như ức chế vi khuẩn và vi nấm, giảm lipid máu, kháng ung thư và kích thích miễn di ̣ch

1.3.2.2 Tính chất hóa học

Trong phân tử CS có các nhóm chức: -OH, -NH2, -NHCOCH3 nên có thể xem chúng vừa là alcol, vừa là amin, vừa là amid Phản ứng hóa học có thể xảy ra ở vị trí nhóm chức tạo ra dẫn xuất thế O-, dẫn xuất thế N-…

Do các monome của CS được nối với nhau bởi các liên kết β-(1-4)-glycosid nên dễ bị cắt mạch bởi các chất hóa học như: acid, base, tác nhân oxy hóa và các enzym thủy phân [33]

1.3.2.3 Ưu điểm của CS trong bào chế tiểu phân nano polyme

Nhờ tính thân nước, CS ta ̣o lớp áo thân nước bao ngoài tiểu phân nano có bề

mă ̣t sơ nước (PLGA, PLA, PGA, PACA…) làm tăng thời gian lưu giữ thuốc trong máu Nguyên nhân có thể là tính thân nước giúp giảm tương tác với protein huyết tương, giảm quá trình opsonin hóa, làm châ ̣m quá trình thực bào nên tăng thời gian

9

lưu của hê ̣ nano trong máu [27], [32] Tiểu phân nano PLGA bao CS làm chất mang thuốc PTX có thời gian tuần hoàn lâu hơn tiểu phân nano PLGA không bao CS [32] Tiểu phân nano có bề mă ̣t thân nước và KT < 200 nm cũng cho thấy khả năng tích lũy ở khối u rắn cao hơn thông qua hiê ̣u ứng EPR, đây cũng là hê ̣ quả của viê ̣c tiểu phân thân nước có thời gian tuần hoàn kéo dài hơn tiểu phân có bề mă ̣t sơ nước [6]

Tính chất mang điê ̣n dương và khả năng bám dính sinh ho ̣c của CS giúp các

hê ̣ nano bao CS có ái lực cao với màng tế bào [14], [16], [30] Vì màng tế bào, đă ̣c biê ̣t là màng tế bào ung thư có điê ̣n âm [8], [49], do đó tiểu phân nano cation được cho là được hấp thu cho ̣n lo ̣c bởi các tế bào nô ̣i mô ma ̣ch máu của khối u Điê ̣n tích dương bề mă ̣t sẽ thuâ ̣n lợi cho sự nhâ ̣p bào của tiểu phân nano vào tế bào ung thư [8]

Các nhóm amin tự do trong cấu trúc CS dễ dàng phản ứng với các tác nhân hóa

ho ̣c do đó tiểu phân nano bao CS có bề mă ̣t linh đô ̣ng, dễ dàng gắn kết các phân tử

mu ̣c tiêu như các phối tử hướng đích, các khớp nối sinh ho ̣c [14], [16]

Tiểu phân nano PLGA bao CS cho thấy nhiều ưu điểm về giải phóng in vitro

như giúp ha ̣n chế sự giải phóng ồ a ̣t trong giai đoa ̣n đầu và kéo dài thời gian giải phóng thuốc [14], [16], [17]

1.4 Phương pháp bao CS lên tiểu phân nano PLGA

Phương pháp vật lý: Trong môi trường có pH thích hợp, nhóm –NH2 của CS

và –COOH của PLGA điê ̣n ly thành các ion trái dấu –NH3+ và ̶ COO ̶ Lực tương tác tĩnh điê ̣n giữa chúng làm cho CS được hấp phu ̣ lên bề mă ̣t tiểu phân nano PLGA Màng bao CS ta ̣o thành tương đối ổn đi ̣nh, phu ̣ thuô ̣c vào đô ̣ bền của tương tác tĩnh điê ̣n [14] CS có thể phối hợp ngay trong quá trình bào chế tiểu phân nano PLGA hoă ̣c được hấp phu ̣ lên bề mă ̣t tiểu phân nano PLGA đã hình thành từ trước

Phương pháp hóa học: Phương pháp này dựa trên phản ứng ta ̣o liên kết

carbodiimid giữa nhóm –NH2 của CS và nhóm –COOH của PLGA Liên kết hóa ho ̣c giữa CS và PLGA bền vững hơn lực tương tác tĩnh điê ̣n, tuy nhiên quá trình phản ứng rất phức ta ̣p và thời gian phản ứng kéo dài có thể ảnh hưởng đến cấu trúc và hiê ̣u suất mang thuốc của tiểu phân nano PLGA [47]

10

1.5 Mô ̣t số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình bao CS lên tiểu phân nano PLGA

1.5.1 Ảnh hưởng của pH và lực ion

Nhiều NC về ảnh hưởng của pH đến sự hấp phu ̣ đa lớp cho thấy pH ảnh hưởng đến đô ̣ dày của lớp [34] Trong môi trường acid, nhóm NH2 của CS nhâ ̣n proton chuyển thành NH3+, pH càng giảm càng có nhiều nhóm NH2 chuyển thành NH3+, khi đó lực đẩy tĩnh điê ̣n lớn, làm cho phân tử CS tồn ta ̣i ở da ̣ng chuỗi mở rô ̣ng Ngược

la ̣i, pH tăng, lực đẩy nhỏ, phân tử có xu hướng cuô ̣n la ̣i thành da ̣ng cầu [37] Sự khác nhau về cấu trúc không gian của CS trong các môi trường pH khác nhau ảnh hưởng đến KTTP sau khi bao CS Khi tăng pH, thế Zeta giảm do nồng đô ̣ ion H+ giảm, ha ̣n chế quá trình proton hóa nhóm –NH2 của CS dẫn đến giảm mâ ̣t đô ̣ điê ̣n tích dương trên phân tử CS [13]

Sự có mă ̣t của các ion cũng ảnh hưởng đến KTTP và thế zeta của dung di ̣ch

CS Khi tăng nồng đô ̣ ion, KTTP và thế zeta giảm, có thể do tương tác của nhóm

NH3+ và các anion Do đó, khi điều chỉnh pH bằng đê ̣m, các ion trong đê ̣m có thể ảnh hưởng đến KTTP và thế zeta của tiểu phân nano

1.5.2 Ảnh hưởng của tỷ lê ̣ CS/PLGA

Nhiều NC về bào chế tiểu phân nano PLGA cải biến bề mă ̣t bằng CS đã đánh giá ảnh hưởng của tỷ lê ̣ CS/PLGA tới đă ̣c tính tiểu phân ta ̣o thành Wang và cô ̣ng sự (2013) đã bao thành công CS lên bề mă ̣t tiểu phân nano PLGA theo 2 phương pháp

vâ ̣t lý và hóa ho ̣c, chứng minh bởi thế zeta, phổ FT-IR và phổ nhiễu xa ̣ tia X Khi tăng tỷ lê ̣ CS/PLGA, KTTP và thế Zeta tăng, tuy nhiên đến mô ̣t giá tri ̣ tới ha ̣n, tiếp

tu ̣c tăng tỷ lê ̣ CS/PLGA thì thế Zeta không thay đổi nhiều, do đó lượng CS có thể bao lên bề mă ̣t PLGA có mô ̣t giá tri ̣ bão hòa

1.6 Mô ̣t số nghiên cứu bào chế hê ̣ tiểu phân nano liên quan

1.6.1 Nghiên cứu trong nước

Trịnh Văn Lương và nhóm nghiên cứu (2016) đã bào chế tiểu phân nano Paclitaxel và Artesunat sử dụng polyme mang thuốc Poly (acid lactic-co-glycolic) Nghiên cứu đã chỉ ra năng lượng siêu âm 200 W, tần số 20000 Hz, nhiệt độ thấp, tốc

độ phối hợp 2 pha 2,5 ml/phút và thời gian siêu âm 5 phút là tối ưu Các mẫu nano

5000 vòng/phút trong 30 phút ở 100C Kết quả tạo được tiểu phân nano Artesunat PLGA/CS với thế zeta dương so với các tiểu phân Artesunat-PLGA có thế zeta âm Ngoài ra, nghiên cứu cũng chỉ ra rằng việc kết hợp CS ngay trong pha nước của pha tạo nhũ tương sẽ gây lắng cặn, màu đen do CS da ̣ng base không tan trong nước nên sử du ̣ng acid acetic làm dung môi pha nước Tuy nhiên dược chất và PLGA lại kém bền trong môi trường acid [3] Vì vâ ̣y, trong NC này, không lựa cho ̣n phối hợp CS vào pha nước trước giai đoa ̣n nhũ hóa ta ̣o nano PTX-PLGA/CS

-1.6.2 Nghiên cứu trên thế giới

Yang và cô ̣ng sự (2009) sử du ̣ng phương pháp bốc hơi dung môi từ nhũ tương bào chế tiểu phân nano PLGA chứa Paclitaxel, sau đó ha ̣t nano được thay đổi đă ̣c tính bề mă ̣t bằng cách hấp phu ̣ vâ ̣t lý CS KTTP khoảng 200-300 nm trong môi trường nước cất và tăng đáng kể trong môi trường huyết tương chuô ̣t (CDF1) nhưng dễ dàng phân tán về KT ban đầu sau 5 phút lắc nhe ̣ Thế zeta của tiểu phân nano PLGA chuyển từ âm sang dương khi có mă ̣t CS và tăng khi pH môi trường acid hơn Đă ̣c biê ̣t, tiểu phân nano PLGA gắn CS tăng vâ ̣n chuyển đă ̣c hiê ̣u paclitaxel đến đích tác du ̣ng nguyên nhân là do tương tác tĩnh điê ̣n của tiểu phân nano cation với tế bào khối u trong vi môi trường acid xung quanh khối u [49]

Fabienne Danhier và cộng sự (2008) đã nghiên cứu bào chế tiểu phân nano Paclitaxel sử du ̣ng PCL-PEG, PLGA, PLGA-PEG và PLGA-FITC làm polyme mang thuốc Tiểu phân nano được bào chế bằng phương pháp nhũ hóa bốc hơi dung môi,

tỷ lệ pha hữu cơ/pha nước là 10 ml/20 ml, quá trình bốc hơi dung môi được diễn ra qua đêm Sau đó hỗn dịch nano được lọc qua màng 1,2 micormet sau đó ly tâm ở

12

22000 g trong 1h ở 40C Cắn nano thu được đem phân tán lại trong 10 ml nước tinh khiết Paclitaxel được định lượng bằng HPLC với điều kiện acetonitril/nước = 70/30 (tt/tt), cô ̣t C18, detector UV 227 nm [21]

Cristiba Fonseca và cô ̣ng sự (2002) đã nghiên cứu bào chế tiểu phân nano Paclitaxel sử du ̣ng PLGA làm chất mang thuốc Trong nghiên cứu, tiểu phân nano được bào chế bằng phương pháp nhũ hóa bốc hơi dung môi Pha hữu cơ gồm PLGA

và paclitaxel trong aceton, pha nước chứa chất diện hoạt poloxamer 188 Sau đó nhỏ dần pha hữu cơ vào pha nước kèm khuấy từ ở nhiệt độ phòng Sau đó khuấy tiếp 15 phút ở điều kiện áp suất giảm để bay hơi aceton Để loại bỏ dược chất tự do và chất diện hoạt dư, nhóm NC sử dụng màng lọc 1 micromet sau đó ly tâm 2 lần 61 700 g trong vòng 1h ở 40C Sản phẩm cuối cùng được đông khô trong 24 h [23]

1.7 Tổng quan về tiểu phân nano polyme

1.7.1 Khái niê ̣m

Nano polyme (PNs) được bào chế từ các polyme tương thích sinh ho ̣c và phân hủy sinh ho ̣c, có KT khoảng 10-1000 nm, trong đó DC được hòa tan, bao gói, liên kết hóa ho ̣c hoă ̣c hấp phu ̣ lên bề mă ̣t tiểu phân nano Tùy thuô ̣c vào phương pháp bào chế, có thể ta ̣o thành siêu vi nang (nanocapsules) hoă ̣c siêu vi cầu (nanosheres) Trong siêu vi nang, DC được giữ trong mô ̣t khoảng không gian bao quanh bởi lớp màng polyme, còn siêu vi cầu là hê ̣ cốt trong đó DC phân tán đồng đều [29], [42] PNs là chất mang đầy triển vo ̣ng cho các hê ̣ đưa thuốc do dễ dàng thay đổi bề mă ̣t chất mang nhằm mu ̣c đích nâng cao sinh khả du ̣ng, kéo dài tác du ̣ng và đưa thuốc tới đích

A Siêu vi cầu B Siêu vi nang

Hình 1.4 Hình ảnh siêu vi nang và siêu vi cầu

13

1.7.2 Phân loa ̣i

Dựa trên những kết quả NC về tương tác giữa hê ̣ nano và hê ̣ sinh ho ̣c có thể phân loa ̣i thành 3 thế hê ̣ tiểu phân nano như sau [8], [15]

Bảng 1.1 Các thế hê ̣ tiểu phân nano polyme

Thế hê ̣ 1 Nano cổ điển

Thế hê ̣ 2 Nano ổn đi ̣nh

Thế hê ̣ 3 Nano thông minh

Đă ̣c điểm

- Không cải biến đă ̣c tính bề mă ̣t

- Không có khả

năng tránh thực bào

- Thời gian tuần hoàn ngắn

- Bề mă ̣t được cải biến, có

tính chất lẩn tránh thực bào và hướng đích chủ

đô ̣ng, nhằm cải thiê ̣n đô ̣ ổn đi ̣nh, tăng thời gian tuần hoàn và tăng tính hướng đích trong các hê ̣ sinh ho ̣c

- Sử du ̣ng các tín hiê ̣u sinh ho ̣c, vâ ̣t lý, hóa ho ̣c (pH, O2, enzym) trong môi trường đích để kích hoa ̣t giải phóng thuốc, nhằm đa ̣t được tác du ̣ng

ta ̣i đích tối ưu

- Tối đa hóa vâ ̣n chuyển thuốc

- Hướ ng đích cả thu ̣ đô ̣ng và chủ đô ̣ng Trong đó

hướng đích thu ̣ đô ̣ng là

Ha ̣n chế

- Không ổn

đi ̣nh

- Bi ̣ thanh thải bởi MPS

- Quá phu ̣ thuô ̣c vào hiê ̣u ứng EPR; Không có

kháng nguyên chung;

Tính hướng đích chủ

đô ̣ng không tối đa; < 10%

liều đưa thuốc đến khối u

Chưa rõ

1.7.3 Phương pháp bào chế tiểu phân nano polyme

Có hai nhóm phương pháp chính được sử du ̣ng để bào chế tiểu phân nano polyme: polyme hóa từ monome và sử du ̣ng polyme có sẵn [36] Các polyme ta ̣o thành từ phản ứng polyme hóa thường ít phân hủy sinh ho ̣c, monome tồn dư và chất

14

diê ̣n hoa ̣t dùng với lượng lớn có thể gây đô ̣c và đòi hỏi quá trình tinh chế phức ta ̣p [45] Do đó, các NC hiê ̣n nay hướng tới sử du ̣ng các polyme tự nhiên hoă ̣c tổng hợp có sẵn, đă ̣c biê ̣t là polyme phân hủy sinh ho ̣c Các phương pháp chủ yếu để bào chế tiểu phân nano từ các polyme này gồm [5], [45]:

- Phương pháp nhũ hóa bốc hơi dung môi

Nguyên tắc: ta ̣o ra nhũ tương nano (thường là dầu/nước), sau đó bốc hơi dung môi hữu cơ ta ̣o tiểu phân nano (thường là siêu vi cầu)

Cách làm như sau: hòa tan chất mang (PLGA, PLA, Eudragit…) và dược chất vào dung môi hữu cơ (dicloromethan, cyclohexan…) rồi nhũ hóa vào pha nước chứa chất nhũ hóa (PVA, Tween 80, poloxame…) Tiến hành đồng nhất hóa rồi bốc hơi dung môi hữu cơ, lo ̣c và rửa tiểu phân nano Các yếu tố ảnh hưởng đến KTTP là cường đô ̣ và thời gian đồng nhất hóa, loa ̣i và lượng chất nhũ hóa, polyme, DC và cách bốc hơi dung môi

- Phương pháp thay đổi dung môi/kết lắng bề mă ̣t

Polyme và DC được hòa tan vào trong dung môi đồng tan với nước (aceton, methanol…) Sau đó pha dung môi hữa cơ được chia thành từng gio ̣t và phối hợp với pha ngoa ̣i chứa chất ổn đi ̣nh Polyme sẽ kết lắng trên bề mă ̣t phân cách pha do sự khuếch tán nhanh của dung môi Phương pháp này thường áp du ̣ng cho DC thân dầu vì hê ̣ nano ta ̣o ra có hiê ̣u suất bao gói DC thân nước thấp

- Phương pháp nhũ hóa khuếch tán dung môi

Pha dung môi hữu cơ (dung di ̣ch DC và polyme trong dung môi hữu cơ tan

mô ̣t phần trong nước như ethyl acetat, alcol benzylic bão hòa nước) được nhũ hóa vào pha nước (dung di ̣ch chất ổn đi ̣nh trong nước bão hòa dung môi hữu cơ) Sau đó nhũ tương ta ̣o thành được phối hợp với mô ̣t thể tích lớn nước, dung môi sẽ khuếch tán từ gio ̣t pha dầu vào pha nước, hình thành các tiểu phân nano polyme

- Phương pháp hóa muối

Dung di ̣ch polyme và DC trong dung môi đồng tan với nước (aceton) được nhũ hóa vào pha ngoa ̣i chứa nồng đô ̣ cao các chất hóa muối (Magnesi clorid, Calci clorid,Magnesi acetat) Hiê ̣u ứng hóa muối giúp ổn đi ̣nh gio ̣t pha dầu khi tác đô ̣ng lực cơ

15

ho ̣c Nhũ tương được phối hợp với mô ̣t lượng nước đủ lớn, khi đó nồng đô ̣ chất hóa muối giảm, dung môi khuếch tán vào môi trường và hình thành tiểu phân nano

1.7.4 Cải biến bề mặt tiểu phân nano polyme khi sử dụng đường tiêm tĩnh mạch

Sau khi tiêm tĩnh ma ̣ch, hê ̣ thống thực bào đơn nhân (MPS) trong tuần hoàn coi tiểu phân như mô ̣t vâ ̣t thể la ̣ và tiến hành đào thải Để lưu giữ tiểu phân trong tuần hoàn lâu hơn, giúp tăng khả năng phân bố tiểu phân đến đích tác du ̣ng, cần phải có các giải pháp để tránh thực bào như [5]:

- “Ngụy trang” tiểu phân nhằm tránh sự nhâ ̣n biết của tế bào lympho: bao bên ngoài với các polyme thân nước và tương thích sinh ho ̣c như PEG, poloxame và poloxamin, chitosan [26], [35] giú p bảo vê ̣ tiểu phân nano khỏi sự bắt giữ của MPS và tăng đô ̣ ổn đi ̣nh

- Biến tính bề mă ̣t tiểu phân để ngăn cản quá trình thực bào: tiểu phân nano polyethylen oxyd tạo ra cấu trúc không gian cồng kềnh, ngăn cản sự đi ̣nh vi ̣ protein opsonin hóa trên bề mă ̣t, làm giảm thực bào Tiểu phân bao chất diê ̣n hoa ̣t cũng ha ̣n chế tỷ lê ̣ thực bào

- Bao tiểu phân bằng tác nhân phân giải màng lysosom

Ngoài ra, để tăng nồng đô ̣ dược chất ta ̣i đích tác du ̣ng, có thể gắn lên bề mă ̣t tiểu phân các phân tử hướng đích Biến đổi bề mă ̣t tiểu phân cũng ảnh hưởng đến sự giải phóng dược chất

16

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vâ ̣t liê ̣u, thiết bi ̣

2.1.1 Nguyên liệu

Bảng 2.1 Nguyên liệu sử dụng trong qua ́ trình thực nghiê ̣m

7 Kali dihydrophosphat Merk (Đức) Tinh khiết phân tích

8 Acid phosphoric đặc Merk (Đứ c) Tinh khiết phân tích

10 Natri hydroxyd Trung Quốc Tinh khiết hóa ho ̣c

17

2.1.2 Thiết bị

- Máy đo thế Zeta và xác định phân bố KTTP Zetasizer NanoZS90 (Anh)

- Máy khuấy từ Ika Labortechnik (Đức)

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Agilent 1260 (Mỹ)

- Máy ly tâm lạnh HERMLE Larbotechnik GmbH – Z326k (Đức)

- Máy siêu âm đầu dò Vibra Cell, Sonics & Materials, INC (Mỹ), công suất tối đa 130 W, tần số 20 kHz

- Máy lọc nước PURELAB classic UV, ELGA (Anh)

- Máy đo pH Eutech instrument pH 510

- Cân kỹ thuật, cân phân tích, các dụng cụ thủy tinh khác

- Ống ly tâm chứa màng siêu lọc 10000Da, Millipore, Billerica, MA (USA)

- Tủ lạnh sâu Unicryo (Mỹ)

- Bể siêu âm WUC- A06H, Daihan (Hàn Quốc)

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố công thức như tỷ lê ̣ CS/PLGA, pH

dung di ̣ch CS, nhiê ̣t đô ̣ hấp phu ̣ CS tới đă ̣c tính tiểu phân nano PTX-PLGA/CS

- Sử dụng thuật toán để thiết kế thí nghiệm, phân tích sự ảnh hưởng của các

thành phần trong công thức và một số thông số quy trình, lựa chọn công thức tối ưu

- Xác đi ̣nh một số đặc tính tiểu phân nano bào chế được từ công thức tối ưu

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp bào chế

2.3.1.1 Phương pháp bào chế hê ̣ tiểu phân nano PTX-PLGA

Tham khảo tài liê ̣u [49], kết hợp với điều kiê ̣n thực nghiê ̣m, tiến hành bào chế

tiểu phân nano PTX-PLGA theo phương pháp bốc hơi dung môi từ nhũ tương D/N

- Pha dầu: Hòa tan 10 mg PTX và 40 mg PLGA vào 5 ml DCM

- Pha nướ c: Dung di ̣ch Tween 80 nồng đô ̣ 2% (kl/tt) trong 50 ml nước cất

- Giai đoạn nhũ hóa: Nhỏ pha dầu vào pha nước (tốc độ khoảng 2,5 ml/phút)

Nhũ tương D/N được đồng nhất sử dụng đầu siêu âm (tần số 20 kHz, công suất 100%

18

- 130 W), thời gian siêu âm 5 phút Trong quá trình đồng nhất duy trì nhiệt độ 4-100C

bằng nước đá kết hợp khuấy từ

- Bốc hơi dung môi: Nhũ tương thu được tiếp tục được khuấy từ nhẹ nhàng

trong 4 giờ ở nhiệt độ phòng để loại dung môi hữu cơ

2.3.1.2 Phương pháp bao CS lên hê ̣ tiểu phân nano PTX-PLGA

- Chuẩn bi ̣ dung di ̣ch CS: Hòa tan CS (lượng CS thay đổi) trong 50 ml dung dịch acid acetic 1% (tt/tt), siêu âm cho tan hết, điều chỉnh pH dung dịch CS (pH thay

đổi) bằng dung dịch NaOH 3N

- Giai đoạn hấp phụ CS: Phối hợp dung dịch CS vào hỗn dịch nano thu được, khuấy từ nhẹ nhàng trong điều kiện nhiệt độ khảo sát

- Tinh chế và thu hồi sản phẩm: ly tâm hỗn dịch nano thu được, sử du ̣ng ống

ly tâm có màng siêu lo ̣c (10000 Da) ở 5000 vòng/phút trong 30 phút, 100C Phần cắn

thu được đem phân tán vào khoảng 10 ml nước cất, sử dụng bể siêu âm Sơ đồ quy

trình bào chế được tóm tắt ở hình 2.1

19

2.3.2 Các phương pháp đánh giá

2.3.2.1 Đánh giá kích thước, phân bố kích thước tiểu phân và thế zeta

a Đánh giá KTTP và PDI

Kích thước tiểu phân được xác định bằng phương pháp tán xạ lazer Nguyên

lý chung của phương pháp là khi chiếu chùm tia lazer vào các hạt có kích thước khác nhau sẽ thu được mức độ tán xạ ánh sáng khác nhau Bằng cách đo cường độ ánh sáng tán xạ có thể xác định được kích thước hạt

Sử sụng máy phân tích kích thước tiểu phân Zetasizer Nano ZS90 đo KT trong khoảng 0,01-10000 nm, sử du ̣ng cuvet nhựa Trước khi đo, tiến hành pha loãng chế

phẩm nhiều lần bằng nước cất sao cho chỉ số “Count Rate” phải nằm trong khoảng

200-400 kcps để kết quả mẫu đo thu được là chính xác nhất Mẫu pha loãng được đo

ở điều kiện hệ số khúc xạ ánh sáng; nhiệt độ đo 250C Phân bố kích thước tiểu phân cũng được dùng để đánh giá hệ tiểu phân nano thông qua chỉ số đa phân tán (PDI), chỉ số PDI càng gần bằng 0 thì các tiểu phân trong hệ có kích thước càng đồng đều

b Đánh giá thế Zeta của tiểu phân nano

Nguyên tắc xác đi ̣nh thế Zeta: Khi đă ̣t 1 điê ̣n trường lên hê ̣, tiểu phân sẽ di chuyển về phía điê ̣n cực trái dấu với vâ ̣n tốc tỷ lê ̣ với thế Zeta Tốc đô ̣ này được xác

đi ̣nh bằng viê ̣c phân tích chuyển đô ̣ng của tiểu phân thông qua ánh sáng tán xa ̣ Thế Zeta được xác đi ̣nh dựa vào đô ̣ nhớt môi trường và đi ̣nh luâ ̣t Smoluchowski-Huckel

Tiến hành tương tự như phương pháp xác đi ̣nh KTTP nhưng sử du ̣ng cuvet nhựa có 2 lá điê ̣n cực bằng đồng

2.3.2.2 Phương pha ́ p đi ̣nh lượng PTX và xác đi ̣nh hiệu suất mang thuốc, khả năng

na ̣p thuốc

Tham khảo tài liê ̣u [4] và điều kiê ̣n thực nghiê ̣m, tiến hành đi ̣nh lượng PTX trong các mẫu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiê ̣u năng cao với điều kiê ̣n sắc ký:

- Cột sắc ký: Poroshell 120 SB-C18 3,0 x 150 mm 2,7-Micron

- Đệm phosphat: 1,36 g kali dihydrophosphat trong 1 lít nước cất, điều chỉnh tới pH 3,0 bằng acid phosphoric đă ̣c Lo ̣c qua màng lo ̣c kích thước lỗ lo ̣c 0,45 µm

- Pha động: ACN - đê ̣m phosphat pH 3,0 (55:45, tt/tt)

20

- Detector UV 227 nm [19]

- Tốc đô ̣ dòng: 0,32 ml/phút

- Thể tích tiêm mẫu: 20 µl, tiêm mẫu tự đô ̣ng

* Mẫu chuẩn:

- Dung môi pha mẫu (mẫu trắng): ACN : H2O = 55 : 45 (*)

- Cân chính xác 10,0 mg nguyên liê ̣u PTX, cho vào bình đi ̣nh mức 100 ml Thêm 55 ml ACN, lắc kỹ, đâ ̣y kín và siêu âm trong 15 phút cho tan hết Bổ sung nước vừa đủ thể tích, lắc đều Từ dung di ̣ch chuẩn gốc này (nồng đô ̣ chính xác khoảng 100,0 µg/ml), pha loãng bằng dung môi pha mẫu (*) thành các dung di ̣ch chuẩn có nồng đô ̣ nằm trong khoảng 0,5 đến 100,0 µg/ml, lo ̣c dung di ̣ch chuẩn qua màng lo ̣c kích thước lỗ lo ̣c 0,45 µm Di ̣ch lo ̣c được tiêm sắc ký để xác đi ̣nh nồng đô ̣ PTX trong dung di ̣ch chuẩn

* Mâ ̃u thử:

- Mẫu PTX tự do: Lấy chính xác 2 ml hỗn dịch chứa tiểu phân nano PLGA/CS cho vào ống ly tâm có màng siêu lọc 10000 Da Tiến hành ly tâm 5000 vòng/phút trong thời gian 30 phút ở nhiệt độ 100C, lấy phần dịch lọc trong phía dưới màng siêu lọc tiêm vào hệ sắc ký lỏng hiệu năng cao để xác đi ̣nh nồng đô ̣ PTX tự do

PTX Mẫu PTX toàn phần: Lấy chính xác 2 ml hỗn di ̣ch nano sau giai đoa ̣n hấp phu ̣ CS cho vào bình đi ̣nh mức 10 ml Thêm 6 ml ACN, lắc kỹ, đâ ̣y kín và siêu âm trong 15 phút Bổ sung ACN vừa đủ đến va ̣ch, lắc đều Lo ̣c qua màng lo ̣c kích thước lỗ lo ̣c 0,45 µm Di ̣ch lo ̣c được tiêm sắc ký để xác đi ̣nh nồng đô ̣ PTX toàn phần

* Ti ́nh toán kết quả:

- Công thứ c tính lượng thuốc tự do:

PTX tự do (µg) = Std

Sc × Cc × Vt

Trong đó: Std, Sc là diê ̣n tích pic của mẫu PTX tự do và mẫu chuẩn (mAu.s)

Cc là nồng đô ̣ của mẫu chuẩn (µg/ml)

Vt là thể tích của mẫu thử (hỗn di ̣ch nano) (ml)