Công nghệ vi sinh cơ bản

IV. Phân lập vi sinh vật 1. Mục đích Tách rời các tế bào vi sinh vật Nuôi cấy các tế bào trên trong môi trường dinh dưỡng để tạo khuẩn lạc 2. Phương pháp Mẫu được pha loãng theo nồng độ cần thiết (105, 106, 107, 108) Hút 0,1 ml dịch mẫu đã pha loãng cho vào đĩa petri có môi trường thích hợp Dùng que trang trải đều mẫu khắp mặt thạch Hộp petri được đề ngày phân lập, đề mẫu phân lập, nồng độ pha loãng và được gói bằng giấy Ủ các đĩa trên ở nhiệt độ thích hợp trong một khoảng thời gian nhất định ta sẽ thu được các khuẩn lạc riêng rẽ Vi khuẩn: 32 – 350C  Thời gian 1 – 2 ngày đêm Nấm, xạ khuẩn 26 – 280C  Nấm men, mốc: 3 – 4 ngày Xạ khuẩn: 5 – 7 ngày

BÀI 1: PHÂN LẬP VI SINH VẬT I Mục đích yêu cầu Sinh viên nắm thao tác trình phân lập nuôi cấy vi sinh vật II Hóa chất, nguyên liệu dụng cụ Nguyên liệu, hóa chất Môi trường thạch đĩa petri (môi trường Pikovskaya, Hansen, Czapek – Dox) Môi trường Pikovskaya (pH = 7) Hansen pH = – 6,5 Czapek – Dox pH = 5,0 – 5,5 Thành phần Glucose Cao nấm men (NH4)2SO4 MgSO4.7H2O Ca3(PO4)2 KCl MnSO4 2H2O FeSO4.7H2O Agar Glucose (Saccharose) Pepton KH2PO4 MgSO4.7H2O Agar Số lượng (g/l) 10 0,5 0,5 0,1 0,2 0,002 0,002 20 50 10 20 Saccharose 30 NaNO3 3,5 KCl 0,5 FeSO4 0,01 MgSO4 0,5 K2HPO4 1,5 Agar 20 - Nguồn mẫu để phân lập: Đất, nước dưa chua, bánh men… Dụng cụ - Que trang, pipet (hút lượng 1ml, 100 µm) - Ống nghiệm, giá để ống nghiệm, đĩa petri - Đèn cồn, đèn ga III Cách thức pha loãng mẫu Mục đích Mẫu pha loãng nồng độ thích hợp giúp ích trình định lượng phân tích vi sinh vật Phương pháp - Đối với mẫu chất lỏng (nước dưa, dịch quả, …): Dùng pipet hút ml mẫu cho vào ống nghiệm chứa ml dung dịch pha loãng →ta thu nồng độ pha loãng 10-1 - Tiếp tục từ ống nghiệm 10 -1 hút tiếp ml cho vào ống nghiệm chứa ml dung dịch pha loãng →ta độ pha loãng 10-2 - Tiếp tục nồng độ cần thiết - Đối với mẫu chất rắn (đất, nem chua, bánh men, …): Nghiền nhỏ mẫu, lấy g chất rắn cho vào 10 ml nước vô trùng, lắc Lấy ml huyền phù cho vào ml nước vô trùng →ta có độ pha loãng 10-1 - Tiếp tục từ ống nghiệm 10 -1 hút tiếp ml cho vào ống nghiệm chứa ml dung dịch pha loãng →ta độ pha loãng 10-2 - Tiếp tục nồng độ cần thiết IV Phân lập vi sinh vật Mục đích - Tách rời tế bào vi sinh vật - Nuôi cấy tế bào môi trường dinh dưỡng để tạo khuẩn lạc Phương pháp - Mẫu pha loãng theo nồng độ cần thiết (10-5, 10-6, 10-7, 10-8) - Hút 0,1 ml dịch mẫu pha loãng cho vào đĩa petri có môi trường thích hợp - Dùng que trang trải mẫu khắp mặt thạch - Hộp petri đề ngày phân lập, đề mẫu phân lập, nồng độ pha loãng gói giấy - Ủ đĩa nhiệt độ thích hợp khoảng thời gian định ta thu khuẩn lạc riêng rẽ - Vi khuẩn: 32 – 350C ⇒Thời gian – ngày đêm - Nấm, xạ khuẩn 26 – 280C ⇒Nấm men, mốc: – ngày Xạ khuẩn: – ngày Yêu cầu - Xác định số lượng mô tả đặc điểm khuẩn lạc (màu sắc, kích thước, mép khuẩn lạc…) chủng vi sinh vật phân lập BÀI 2: NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA VI SINH VẬT DƯỚI KÍNH HIỂN VI I Mục đích yêu cầu - Sinh viên biết cách sử dụng kính hiển vi quang học; cách làm tiêu tạm thời, tiêu cố định - Nắm cách nhuộm màu tiêu II Hóa chất, nguyên liệu, dụng cụ Hóa chất - Dung dịch Fucxin, xanh metylen, tím gentian - Dung dịch Lugol (dung dịch giữ lọ thủy tinh màu tối; dùng iốt vòng 30 ngày): 1g iot tinh thể; 2g KI; 300 ml nước cất - Cồn 700 Nguyên liệu - Ống thạch nghiêng đĩa petri có loài vi sinh vật cần nghiên cứu (vi khuẩn, nấm men, nấm mốc) Dụng cụ - Lamen, lam kính - Que cấy, đèn cồn, giấy lọc, bình tia - Kính hiển vi, dầu soi III Các cách làm tiêu Tiêu tạm thời a/ Đặc điểm -Thao tác làm tiêu đơn giản, tiến hành nhanh -Quan sát trạng thái sống tế bào: Hình dạng, kích thước, xếp tế bào - Chỉ sử dụng lần bỏ Cách tiến hành: -Trên phiến kính khô sạch, nhỏ giọt nước vô trùng, dùng que cấy lấy vi sinh vật mọc môi trường đặc; đặt nhẹ vào phiến kính chỗ có nước , hòa - Nếu vi sinh vật cần xem sống canh trường dùng que cấy vòng đưa giọt canh trường lên phiến kính - Đặt lamen lên giọt canh trường khéo léo cho không tạo thành bọt khí nhỏ tiêu bản, làm cản trở xem tiêu kính hiển vi - Nếu giọt dịch nhiều, tràn lamen dùng giấy thấm bớt nước - Quan sát kính hiển vi (nấm men, nấm mốc): Vật kính x10; x40 Làm tiêu tạm thời có nhuộm màu + Nhỏ giọt thuốc nhuộm xanh mêtylen lên lam kính + Nhỏ giọt canh trường vi sinh vật với thuốc nhuộm + Đậy lamen + Quan sát tiêu vật kính x10; x40 Làm tiêu cố định nhuộm màu * Làm vết bôi: - Chọn lam kính khô (cho nước cất lên lam kính) - Lấy sinh khối vi sinh vật dàn giọt nước cất - Để vết bôi khô tự nhiên không khí Chú ý: Lượng vi sinh vật lấy vừa phải, vết bôi tròn, gọn thật mỏng * Cố định vết bôi: - Dùng kẹp gắp giữ phiến kính cho vết dịch có vi sinh vật phía trên, - Hơ mặt lam kính lửa đèn cồn, tránh không để nóng * Nhuộm màu tiêu cố định: + Nhuộm tiêu thuốc nhuộm tím gentian (trong – phút); rửa nước + Nhuộm Lugol (1 phút); rửa nước + Tẩy cồn 30 giây (nhỏ từ từ giọt cồn tan hết màu); rửa nước + Nhuộm bổ sung Fucshin safranin 10 – 30 giây + Rửa nước làm khô tiêu soi với vật kính dầu (x10; x100) Yêu cầu - Biết hình dạng tế bào, cách xếp tế bào, vị trí bào tử tế bào - Cấu tạo sợi nấm (có vách ngăn hay không) - Cấu tạo quan sinh sản: Cách xếp phận quan sinh sản; - Bào tử: Hình dạng, cách xếp bào tử BÀI 3: NGHIÊN CỨU MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỨC NỞ CỦA BỘT MỲ I Mục đích yêu cầu - Sinh viên biết quy trình làm bánh mỳ, nhân tố ảnh hưởng tới trình làm bánh - Nắm vai trò nấm men sản xuất bánh mỳ II Hóa chất, nguyên liệu, dụng cụ - kg bột mỳ, men - Đường, muối - Nước cất, dầu ăn - Ống đong V= 250 ml, 500 ml; - Bể ổn nhiệt III.Cơ sở lý thuyết Dựa vào hoạt động nấm men Saccharomyces cerevisiae chuyển hóa đường có bột mỳ thành C2H5OH CO2 Chính CO2 tác nhân làm bánh mì nở CO2 giữ lại mạng gluten (là loại protein đặc biệt, tạo thành glutenin (glutelin) liên kết với gliadin (prolamin), có tính chất đàn hồi tạo mạng) bột mỳ Khả lên men mạnh, độ xốp bánh nhiều, bánh nở Trong trình lên men xảy lên men acid tạo độ acid cho bột; phản ứng hóa sinh tạo sản phẩm ester, aldehyde nhằm tích tụ hương thơm mùi vị đặc trưng cho bánh mỳ Quy trình làm bánh mỳ: Nguyên liệu Nhào bột khô Nhào ướt Tạo hình Lên men Khía bánh Nướng Làm nguội, Bảo quản IV.Các bước tiến hành 1.Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng nồng độ men đến sức nở bột mì CT1: 100g bột mì + 1g men + 5g đường + 1g muối + 60ml nước CT2: 100 g bột mì + 2g men + 5g đường + 1g muối + 60ml nước CT3: 100 g bột mì + 3g men + g đường + 1g muối + 60 ml nước - Thứ tự bổ sung thành phần: Bột-> men->Đường->muối-> trộn đều-> nước - Cho bột nhào chuẩn bị vào ống đong đo thời gian để khối bột tăng thể tích gấp 2.Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng nhiệt độ ủ khác đến sức nở bột mì Công thức trộn: 100 g bột mì + 1g men + g đường + 1g muối + 60 ml nước - Thứ tự bổ sung thành phần: Bột-> men->Đường->muối-> trộn đều-> nước - Cho bột nhào chuẩn bị vào ống đong để nhiệt độ khác 30 0C, 400C, 500C ; đo thời gian để khối bột tăng thể tích gấp 3.Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng độ ẩm ủ khác đến sức nở bột mì: CT1: 100g bột mì + 1g men + 5g đường + 1g muối + 50 ml nước CT2: 100 g bột mì + 1g men + 5g đường + 1g muối + 60 ml nước CT3: 100 g bột mì + 1g men + g đường + 1g muối + 70 ml nước - Thứ tự bổ sung thành phần: Bột-> men->Đường->muối-> trộn đều-> nước -Cho bột nhào chuẩn bị vào ống đong đo thời gian để khối bột tăng thể tích gấp Yêu cầu - Xác định thời gian để khối bột tăng thể tích gấp thí nghiệm đưa nhận xét BÀI 4: LÊN MEN SỮA CHUA I.Mục tiêu: - Sinh viên trình bày chế trình lên men sữa chua, quy trình làm sữa chua, yêu cầu chất lượng sữa chua - Biết cách chuẩn độ, quan sát đánh giá cảm quan sản phẩm sữa chua II.Nguyên vật liệu, thiết bị dụng cụ 2.1 Nguyên vật liệu - Sữa đặc: 1hộp - Sữa chua Vinamilk: 1hộp - NaOH 0,1N - Phenolphtalein 1% 2.2 Dụng cụ - thiết bị - Bình lớn, bể điều nhiệt - Nhiệt kế, máy đo pH - Buret, bình tam giác - Đũa, thìa, bát, cốc nhựa III Các bước tiến hành 3.1 Chuẩn bị sữa - Hòa tan thìa sữa đặc 200 ml nước ấm (40oC) 3.2 Cấy giống Cấy giống từ hộp sữa chua Vinamilk (5 thìa) 3.3 Lên men - Dịch lên men chia làm phần; - Lên men nhiệt độ 40oC, nhiệt độ phòng (25oC) 2-3h 3.4 Làm lạnh - Làm lạnh nhanh bể nước đá 3.5 Yêu cầu 3.5.1 Xác định độ chua tính theo acid lactic - Dùng dung dịch kiềm chuẩn (NaOH KOH) để trung hoà hết acid thực phẩm, với phenolphtalein làm thị màu - Xác định độ chua sữa sau 30 phút, 60 phút, 90 phút, 120 phút lên men - Kết tính theo công thức: X % = V* K* 100/P Trong đó: X: hàm lượng acid lactic sinh (%) K: hệ số sử dụng cho loại acid (K = 0,009) V: thể tích NaOH 0,1N P: khối lượng thể tích mẫu 3.5.2 Xác định tiêu cảm quan sữa chua (màu sắc, mùi vị, trạng thái) BÀI 5: LÊN MEN CƠM RƯỢU I Mục tiêu -Sinh viên nắm sở khoa học trình sản xuất cơm rượu, vi sinh vật tham gia trình sản xuất - Biết quy trình lên men rượu; quan sát, đánh giá sản phẩm tạo thành II Nguyên vật liệu, thiết bị dụng cụ 2.1 Nguyên vật liệu 1kg nếp thường Bánh men Muối, nước sôi để nguội 2.2 Thiết bị dụng cụ - Khay (mâm), bình (lọ) nhựa rộng miệng, có nắp đậy (5 cái) - Chày, cối - III Các bước tiến hành - 1kg nếp ngon, đãi vo nấu chín thành xôi - 50 g bánh men giã nhuyễn (lọ 1); 25 g bánh men giã nhuyễn (lọ 2) - Pha loãng muỗng cà phê muối + 200 ml nước - Trải mỏng xôi khay (mâm) cho mau hơi, rắc men lên mặt xôi, trộn đều, cho vào lọ khoảng 3/5 dung tích, đậy kín 4- ngày IV Yêu cầu -Sinh viên báo cáo kết thí nghiệm (đánh giá cảm quan chất lượng cơm rượu, màu sắc, mùi vị…), giải thích chế trình lên men, quy trình công nghệ - Cơm rượu đạt có nước rượu ứa đọng lại từ từ, mùi rượu ngào ngạt  ... mép khuẩn lạc…) chủng vi sinh vật phân lập BÀI 2: NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA VI SINH VẬT DƯỚI KÍNH HIỂN VI I Mục đích yêu cầu - Sinh vi n biết cách sử dụng kính hiển vi quang học; cách làm... quan sữa chua (màu sắc, mùi vị, trạng thái) BÀI 5: LÊN MEN CƠM RƯỢU I Mục tiêu -Sinh vi n nắm sở khoa học trình sản xuất cơm rượu, vi sinh vật tham gia trình sản xuất - Biết quy trình lên men... kín 4- ngày IV Yêu cầu -Sinh vi n báo cáo kết thí nghiệm (đánh giá cảm quan chất lượng cơm rượu, màu sắc, mùi vị…), giải thích chế trình lên men, quy trình công nghệ - Cơm rượu đạt có nước rượu