Xác định hoạt tính các enzyme amylase, protease, cellulase bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch Cơ sở lý thuyết của việc xác định hoạt tính (hoạt độ tương đối) của các enzyme bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch là quan sát sự chuyển hóa cơ chất của mỗi enzyme thông qua việc nhuộm màu cơ chất hoặc việc tạo màu của sản phẩm tạo thành. Nguồn enzyme gồm enzyme nội bào thu từ mô, tế bào động vật, thực vật, vi sinh vật, enzyme ngoại bào thu từ dịch enzym được tiết ra môi trường nuôi cấy vi sinh vật.
Bài Xác định hoạt tính enzyme amylase, protease, cellulase phương pháp khuếch tán đĩa thạch Cơ sở lý thuyết việc xác định hoạt tính (hoạt độ tương đối) enzyme phương pháp khuếch tán đĩa thạch quan sát chuyển hóa chất enzyme thông qua việc nhuộm màu chất việc tạo màu sản phẩm tạo thành Nguồn enzyme gồm enzyme nội bào thu từ mô, tế bào động vật, thực vật, vi sinh vật, enzyme ngoại bào thu từ dịch enzym tiết môi trường nuôi cấy vi sinh vật Enzyme thử hoạt tính - Enzyme protease thu từ dứa, đu đủ - Enzyme amylase thu từ nước bọt, giá đỗ - Enzyme cellulose thu từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Tách chiết enzyme - Từ dứa (protease) Bromelain loại protease có nhiều phế liệu dứa vỏ, lõi, chồi Phế liệu dứa -> nghiền nhỏ, thêm đệm phosphate 0,1M, pH 7,0 -> chiết lọc -> ly tâm -> thu enzyme thô - Từ đu đủ (protease) Dùng loại đu đủ non, đu đủ già (chưa chín), dùng khăn lau vỏ, lấy dao rạch đường không sâu, hứng nhựa vào cốc Hòa tan nhựa tươi đệm phosphate 0,1M pH 7,0 Thu dịch enzyme thô - Từ giá đỗ (amylase) Chọn phần hạt đậu chưa nảy mầm mang mầm ngắn giá đỗ -> nghiền mịn, thêm đệm phosphate 0,1M, pH 7,0 -> chiết lọc -> ly tâm -> thu enzyme thô - Từ nước bọt (amylase) Lấy 1.5 ml dung dịch nước bọt cho vào ống eppendorf, ly tâm 10.000 vòng/ phút 10 phút, loại bỏ cặn Lưu ý: Tất thao tác 40C - Từ dịch nuôi cấy vi khuẩn (cellulose) Lấy 1.5 ml dịch nuôi cấy vi khuẩn cho vào ống eppendorf, ly tâm 10.000 vòng/ phút 10 phút, loại bỏ cặn 3 Môi trường thử hoạt tính enzyme phương pháp khuếch tán đĩa thạch - Amylase 50 – 100 µl dịch chiết enzyme nhỏ vào giếng đục đĩa thạch với 2% agar % tinh bột (cơ chất) đệm phosphate 0,1M, pH Đĩa thạch nhỏ dịch chiết ủ 30ºC, 4h Thuốc nhuộm lugol (hòa 2g KI 5ml nước cất cho tan hết, sau cho thêm 1g I vào, sau cho nước cất đến đủ 300ml, lắc đều) - Protease 50 – 100 µl dịch chiết enzyme nhỏ vào giếng đục đĩa thạch với 2% agar 0,1% gelatin (cơ chất) đệm phosphate 0,1M, pH Đĩa thạch nhỏ dịch chiết ủ 30ºC, 4h Nhuộm amido đen 10B 0,1% dung dịch methanol, axit acetic, nước cất theo tỷ lệ 3: 1: Tẩy dung dịch pha amino đen - Cellulase 50 – 100 µl dịch chiết enzyme nhỏ vào giếng đục đĩa thạch với 2% agar 1% CMC (Carboxymethyl cellulose) đệm phosphate 0,1M, pH Đĩa thạch nhỏ dịch chiết ủ 30ºC, 4h Thuốc nhuộm lugol Nếu dịch chiết có hoạt tính amylase, protease, cellulase tạo vòng suốt quanh giếng thạch chứa dịch enzyme Vùng tinh bột chưa bị phân giải có màu nâu tím Vùng protein chưa bị phân giải có màu xanh Vùng cellulose chưa bị phân giải có màu nâu tím Hoạt độ tương đối enzyme xác định qua hệ số phân giải: D – d (mm) Trong đó: D đường kính vòng phân giải (mm), d đường kính lỗ thạch (mm) Bài Xác định hoạt độ amylase Xây dựng đồ thị chuẩn Maltose Cơ sở lý thuyết Enzyme amylase thủy phân tinh bột (amylose, amylopectin), glycogen cách thủy phân liên kết α 1,4 glycosid Sản phẩm sau phản ứng hỗn hợp đường triomaltose, maltose, glucose dextrin (tùy thuộc vào nguồn chất) Sơ đồ phản ứng xúc tác viết tóm tắt dạng Tinh bột (glycogen) Amylase Đường khử + dextrin 3,5-Dinitrosalicylic acid (DNS DNSA) có màu vàng, phản ứng với đường khử, DNS bị khử thành 3-amino-5-nitrosalicylic acid (màu nâu đỏ) có khả hấp thụ mạnh ánh sáng bước sóng 540 nm 3,5-dinitrosalicylic acid Khử 3-amino,5-nitrosalicylic acid Lượng 3-amino-5-nitrosalicylic tạo thành phụ thuộc vào hàm lượng đường khử có dung dịch Dựa vào mối tương quan người ta xác định hoạt độ enzyme amylase Yêu cầu: • Sinh viên giải thích nguyên lý phương pháp định hoạt độ amylase thông qua việc định lượng đường khử • Biết cách xây dựng đồ thị chuẩn maltose • Biết cách xác định hoạt độ amylase dựa vào đồ thị chuẩn Vật liệu • Dung dịch enzyme amylase (nước bọt, giá đỗ) • Maltose • Các dung dịch đệm Chuẩn bị a Dung dịch tinh bột hòa tan: 1% đệm PBS 0.05M pH 6,5 (hoặc đệm acetate) Cách chuẩn bị: Cân 0,5 g tinh bột hòa tan cho vào cốc thủy tinh 50 ml đệm PBS 0.05M pH 6,5 Hồ hóa lò vi sóng, để nguội, dẫn nước cất lại đến 50 ml Bảo quản 40C b Dung dịch maltose chuẩn 10mM Cân 36 mg maltose, hòa tan 10 ml nước cất c Thuốc thử DNSA (Dinitrosalicylic Acid Reagent Solution, 1%) Hòa tan hỗn hợp gồm có: 1g dinitrosalicylic acid, 200 mg phenol tinh thể, 50mg sodium sulphite , g Potassium sodium tartrate (Rochelle salt), g NaOH 100 ml nước d Mẫu phân tích: Enzyme amylase từ nước bọt: Lấy ml dung dịch nước bọt cho vào ống eppendorf, ly tâm 13.000 rpm 10 phút 4ºC, loại bỏ cặn Chọn phần hạt đậu chưa nảy mầm mang mầm ngắn giá đỗ -> nghiền mịn, thêm đệm phosphate 0,1M, pH 7,0 -> chiết lọc -> ly tâm -> thu enzyme thô Lập đường chuẩn Cho vào ống nghiệm Nước cất (ml) 1,95 1,75 1,5 1,0 0,5 Dung dịch Maltose (ml) 0,05 0,25 0,5 1,0 1,5 Dung dịch thuốc thử (ml) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 o Lắc ống nghiệm, đặt vào bể 100 C 10 phút, làm nguội đến t phòng Bổ sung nước cất (ml) 7,0 7,0 7,0 7,0 7,0 Tổng thể tích (ml) 10,0 10,0 10,0 10,0 10,0 Nồng độ Maltose ống nghiệm 0,05 0,25 0,5 1,5 ĐC 1,0 7,0 10,0 (mM) Đo quang phổ bước sóng 540 nm, cuvette ml, đường kính cuvette cm (Lưu ý phải pha loãng) Mẫu đối chứng tương tự thay dung dịch maltose chuẩn nước cất Giá trị OD540 mẫu tính OD 540 mẫu – OD540 đối chứng Xây dựng đường chuẩn dựa điểm thu được, trục tung giá trị OD 540, trục hoành hàm lượng maltose (mM) Xác định hoạt độ Cho vào ống nghiệm • Dung dịch tinh bột 0,5 ml • Dung dịch enzyme 0,02 ml • Đệm PBS 0,1 M pH 6,5 0,48 ml Ủ 37 C 10 phút (nếu thay đổi thời gian ủ cần ghi lại phản ứng đến tính toán sau này) • Bổ sung thuốc thử 1,0 ml Trộn đều, đặt bể nước sôi 10 phút, sau làm nguội đến nhiệt độ phòng • Bổ sung nước cất 8,0 ml • Tổng thể tích 10 ml Trộn đo quang phổ Mẫu đối chứng tương tự dung dịch enzyme bị làm bất hoạt nhiệt độ cao (95 oC 30 phút) Giá trị OD540 mẫu tính OD540 mẫu – OD540 đối chứng Cách tính hoạt độ 7.1 Định nghĩa hoạt độ enzyme amylase theo đơn vị quốc tế (IU) Unit (1U) hoạt độ enzyme (không phải lượng enzyme) tạo mg glucose/ maltose phút điều kiện tối ưu 1Unit (1U) hoạt độ enzyme (không phải lượng enzyme) tạo μM glucose/ maltose phút điều kiện tối ưu α-Amylase α-Amylase Glucose + Maltose −−−> Oligosaccharides −−−> Starch (polysaccharide) (mono/disaccharides) [Blue with iodine] [Red with iodine] [Yellow with iodine] 7.2 Cách tính Tính toán lượng đường khử tạo thành sau phản ứng enzyme dựa vào đường chuẩn Maltose làm bước Tính toán lượng đường khử tạo thành sau phản ứng enzyme dựa vào đường chuẩn Maltose làm bước Hoạt độ thể tích (Unit/ ml mẫu) = (µmol maltose x 50)/10 Hoạt độ riêng (Unit/ mg protein) = Hoạt độ thể tích/ hàm lượng protein Giải thích: Lượng Maltose (µmol) tương ứng với số Unit Tuy nhiên, thể tích enzyme lấy cho phản ứng 0,02 ml phải nhân với 50 Thời gian phản ứng enzyme 10 phút phải chia cho 10