Ứng dụng công nghệ sinh học trong công nghệ thực phẩm

Định nghĩa, nguồn gốc − Bacterial Cellulose là một hợp chất hữu cơ C6H10O5n được tạo thành từ một số loại vi khuẩn.. Cellulose là một chất liệu kết cấu cơ bản của hầu hết thực vật, nó cũ

BỘ CÔNG THƯƠNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM

TP.HCM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

ĐỀ TÀI:

Quy trình sản xuất Bacterial Cellulose

Giáo viên hướng dẫn: Nguyễn Thị Thu Sang

Tiểu Luận:

Ứng Dụng Công Nghệ Sinh Học Trong Công Nghệ Thực Phẩm

Mục Lục

Quy Trình Sản Xuất Bacterial Cellulose

I. Tổng quan:

1. Lịch sử phát triển

− Sự tổng hợp lớp màng cellulose ngoại bào của vi khuẩn A xylinum được nhà

bác học Brown báo cáo lần đầu tiên vào năm 1886 Tuy nhiên đến nửa sauthế kỉ XX, các nhà khoa học mới thực sự nghiên cứu rộng rãi về BacterialCellulose

− Năm 1943 – 1954, Hestrin và các cộng sự nghiên cứu về khả năng tổng hợp

Bacterial Cellulose của vi khuẩn Acetobacter xylinum, họ chứng minh rằng

A xylinum có thể sử dụng đường và O2 để tạo nên cellulose

− Năm 1957, Next và Colvin chứng minh rằng cellulose được A xylinum tổng

hợp trong môi trường có đường và ATP Càng ngày, cấu trúc của BacterialCellulose càng được hiểu rõ theo tiến bộ của khoa học kĩ thuật

− Năm 1989, nhóm I.M Saxena trường Đại học Texathu nhận được

enzyme cellulose synthase tinh sạch của A xylinum Enzyme này gồm 2

chuỗi polypeptid có trọng lượng phân tử là 83 và 93kD Trong đó, tiểu phần83kD liên quan đến quá trình sinh tổng hợp cellulose tinh khiết Năm 1990,

nhóm đã xác định được gen tổng hợp cellulose ở A xylinum (dòng hoá và

giải trình tự đoạn gen tổng hợp cellulose)

− Ngày nay đã có rất nhiều công trình nghiên cứu giúp hiểu rõ thêm về cấutrúc… Cơ chế tổng hợp và ứng dụng của Bacterial Cellulose

2. Định nghĩa, nguồn gốc

− Bacterial Cellulose là một hợp chất hữu cơ (C6H10O5)n được tạo thành từ một

số loại vi khuẩn Cellulose là một chất liệu kết cấu cơ bản của hầu hết thực

vật, nó cũng được tạo thành từ vi khuẩn, chủ yếu là các loại Acetobacter,

Sarcina ventriculi and Agrobacterium Cellulose của vi khuẩn, hoặc vi sinh

vật có những tính chất khác với cellulose thực vật và được đặc trưng bởi độtinh khiết cao, khả năng giữ nước Trong môi trường tự nhiên, đa số các vikhuẩn tổng hợp polysaccharides như là cellulose tạo nên màng bảo vệ xungquanh tế bào Ngoài Bacterial Cellulose được tạo ra trong tự nhiên, thì nhiềuphương pháp hiện đang được thí nghiệm để làm thúc đẩy tăng trưởngcellulose từ số lượng vi khuẩn cấy vào trong phòng thí nghiệm Bằng cáchkiểm soát các phương pháp tổng hợp, Kết quả là Bacterial Cellulose có thểđược thay đổi để có tính chất mong muốn cụ thể

3. Phân loại

− Hai dạng kết tinh phổ biến của cellulose trong tự nhiên là I và II, được phânbiệt bởi các kỹ thuật phân tích bằng tia X, quang phổ và tia hồng ngoại Tùythuộc vào điều kiện môi trường nuôi cấy và giống vi khuẩn mà cellulose

dạng nào chiếm ưu thế Cellulose I và II đều được tổng hợp trong tự nhiêntrong đó celulose I phổ biến hơn Cellulose I có thể được chuyển thànhcellulose II, nhưng cellulose II thì không thể chuyển thành cellulose I Rất ít

tế bào Eukaryote tổng hợp cellulose II A xylinum thì tổng hợp được cả 2 loại

cellulose I và II

+ Cellulose I: dài 0.05-0.1mm, được tổng hợp bởi đa số thực vật và

A xylinum ở môi trường tĩnh Các chuỗi β-1,4-glucan được sắp

xếp song song với nhau theo một trục Năm 1984 Atalla và VanderHart đã xác định được cấu trúc cellulose I-α và cellulose I-β

+ Cellulose II: được tổng hợp ở một số nấm mốc và vi khuẩn như

Sarcinaventriculi và thường được tổng hợp trong môi trường nuôi

cấy lắc Các chuỗi β-1,4-glucan xếp một cách ngẫu nhiên, hầu nhưkhông song song và nối với nhau bởi một số lượng lớn nốihydrogen, làm cho cellulose II có độ bền về nhiệt Khi đó BacterialCellulose tạo ra ở dạng huyền phù phân tán, các sợi cellulosethường uốn cong, đường kính khoảng 0,1 – 0,2 mm

4. Cấu trúc Bacterial Cellulose

− Bacterial Cellulose có cấu trúc hóa học tương tự như cấu trúc của cellulosethực vật (Plant Cellulose - PC), là chuỗi polymer của các nhóm glucose liênkết với nhau qua cầu nối β - 1,4 – glucan Các chuỗi đơn phân tử glucan liênkết với nhau bằng liên kết Van der Waals Qua nối hydro, các lớp đơn phân tử

sẽ kết hợp với nhau tạo nên cấu trúc tiền sợi với chiều rộng 1,5 nm Các tiềnsợi này sẽ kết hợp với nhau tạo thành dải có kích thước từ 3 – 4 nm và chiềurộng 70 – 80 nm

− Theo Zaaz (1977) thì kích thước của dải là 3,2 x 133 nm; còn theo Brown và cộng sự (1976) thì là 4,1 x 177 nm So với PC thì Bacterial Cellulose có độpolymer hóa cao hơn và kích thước nhỏ hơn, Bacterial Cellulose có độpolymer hóa từ 2000 – 6000, có trường hợp lên đến 16000 hay 20000 Trongkhi đó, khả năng polymer hóa của PC chỉ từ 13000 – 14000

5. Đặc điểm Bacterial Cellulose

− A.J Brown (1986), đã nghiên cứu lớp màng đặc do vi khuẩn A.xylinum tạo

ra trên môi trường lên men và thấy có bản chất là hemicellulose.Hemicellulose là những polysaccharid không tan trong nước nhưng tan trongdung dịch kiềm tính

− Một số tính chất của Bacterial Cellulose:

+ Độ tinh sạch: độ tinh sạch tốt hơn rất nhiều so với các cellulosekhác, có thể phân hủy sinh học, tái chế hay phục hồi hoàn toàn

+ Độ bền cơ học: có độ bền tinh thể cao, sức căng lớn, trọng lượngthấp, ổn định về kích thước và hướng (đặc biệt là cellulose I)

+ Tính hút nước: có khả năng giữ nước đáng kể (lên đến 99%), cótính xốp, ẩm độ cao, có thể chịu được một thể tích đáng kể trên bềmặt (lực bền cơ học cao)

6. Cơ chế sinh tổng hợp Bacterial Cellulose từ A xylinum

− Khi nuôi cấy vi khuẩn A xylinum trong môi trường có nguồn dinh dưỡng

đầy đủ (chủ yếu là carbohydrate, vitamin B 1, B2, B12 và các chất kích thíchsinh trưởng), chúng sẽ thực hiện quá trình trao đổi chất của mình bằng cáchhấp thụ dinh dưỡng từ môi trường bên ngoài vào cơ thể, một phần để cơ thểsinh trưởng và phát triển, một phần để tổng hợp cellulose và thải ra môitrường Ta thấy các sợi tơ nhỏ phát triển ngày càng dài hướng từ đáy lên bềmặt trong môi trường nuôi cấy

− Thiaman (1962) đã giải thích cách tạo thành cellulose như sau: các tế bào A.

xylinum khi sống trong môi trường lỏng sẽ thực hiện quá trình trao đổi chất

của mình bằng cách hấp thụ đường glucose, kết hợp đường với acid béo đểtạo thành tiền chất nằm ở màng tế bào Tiền chất này được tiết ra ngoài nhờ

hệ thống lỗ nằm ở trên màng tế bào cùng với một enzyme có thể polymer hóaglucose thành cellulose

+ Sinh tổng hợp BC là một tiến trình bao gồm nhiều bước được điềuhòa một cách chuyên biệt và chính xác, liên quan đến một số lớnenzyme, các phức hợp xúc tác và các protein điều hòa

+ Cellulose được tổng hợp từ A.xylinum là sản phẩm cuối cùng của

sự biến dưỡng carbon, phụ thuộc vào trạng thái sinh lý của tế bàobao gồm cả chu trình pentose phosphate hoặc chu trình Krebs, kếthợp với quá trình tạo glucose Sự thủy phân glucose không hoạtđộng ở vi khuẩn acid acetic bởi vì chúng không tổng hợp đượcenzyme quan trọng của con đường này đó là phosphofructose

kinase Ở A.xylinum, sự tổng hợp cellulose liên hệ chặt chẽ với quá

trình dị hóa và tiêu thụ khoảng 10% năng lượng có nguồn gốc từnhững phản ứng dị hóa Sự tổng hợp BC không gây trở ngại chocác quá trình đồng hóa khác, bao gồm sự tổng hợp protein

+ A.xylinum biến đổi nhiều phức hợp carbon như: hexose, glycerol,

pyruvate, dihydroxyacetone và các dicarboxylic acid thànhcellulose với hiệu suất 50%

+ Ngày nay con đường tổng hợp cellulose ở A.xylinum đã được hiểu

rất rõ Đó là một quá trình tổng hợp gồm nhiều bước liên tiếp nhau,gồm hai giai đoạn chính: giai đoạn polymer hóa, giai đoạn kết tinh

− Giai đoạn polymer hóa: trong đó có sự tham gia của enzyme tổng hợp

cellulose xúc tác Đầu tiên enzyme glucokinase (GK) xúc tác phản ứngphosphoryl hóa glucose thành glucose-6-phosphate (Glc-6-P) Tiếp theo Glc-6-P bị isomer hóa tạo thành glucose-1-phosphate (Glc-1-P) nhờ enzymephosphoglucosemutase (PGM) Sau đó enzyme UDP-glucosepyrophosphorylase (UGP) xúc tác chuyển Glc-1-P thành UDPGlc, trong đó

có sự hiện diện của UTP Cuối cùng cellulose được tạo thành từ UDPGlc nhờenzyme cellulose synthase và cyclic-di-GMP là yếu tố giúp hoạt hóa enzymenày

− Giai đoạn kết tinh: các chuỗi bắt đầu được tổng hợp nối với nhau bằng liên

kết β-1,4-glucan Các chuỗi glucan kết hợp với nhau bằng liên kết Van derWaals tạo nên lớp các chuỗi glucan Lớp này chỉ tồn tại trong một thời gianngắn, sau đó các lớp này sẽ kết hợp với nhau bằng liên kết hydro tạo thànhcác sợi cơ bản thường gồm 16 chuỗi glucan Các sợi cơ bản tiếp tục kết hợpvới nhau tạo thành vi sợi, rồi sau đó tạo thành các bó và thành các sợi Kíchthước, hình dạng, độ trong suốt, tỷ lệ các dạng của cellulose tùy thuộc vào vịtrí xúc tác của phức chất enzyme

− UDPGlc pyrophosphorylase là enzyme quyết định sự tổng hợp cellulose vìvài kiểu hình đột biến không tổng hợp cellulose thiếu enzyme này

− Hơn nữa, hoạt tính pyrophosphorylase khác nhau giữa những loài A xylinum

khác nhau và hoạt tính cao nhất thì được phát hiện trong những loài sản xuất

cellulose hiệu quả nhất như là A xylinum ssp sucrofermentans BPR2001

1 Ngoài ra có vài loài thích sử dụng fructose như là nguồn cacbon và thể hiệnhoạt tính phosphoglucoisomerase cao và có hệ enzyme trao đổi phosphor vàphụ thuộc vào phosphoenolpyruvate Hệ này xúc tác biến đổi fructose thànhfructose-1-phosphate và thành fructose-1,6-biphosphate

Hình: Con đường dự đoán quá trình sinh tổng hợp cellulose trong tế bào vi

khuẩn Acetobacter xylinum

− Tương tự như các thực vật thượng đẳng, vi sinh vật có khả năng tổng hợpcác oligo và polysaccharid nội bào, lượng oligo và polysaccharid nội bào đạttới 60% khối lượng khô tế bào, còn polysaccharid ngoại bào có thể vượtnhiều lần khối lượng của vi sinh vật Thành tế bào cũng chứa một lượng lớnpolysaccharid Tất cả các oligo và polysaccharid được tổng hợp bằng cáchthêm một đơn vị monosaccharid vào chuỗi saccharid có trước Đơn vịmonosaccharid tham gia phản ứng dưới dạng nucleotid, monosaccharid đượchoạt hóa thường là dẫn xuất của uridin – diphosphat (UDP – X) nhưng đôikhi là các nucleotid purin và pyrimidin khác Sự tổng hợp diễn ra theo phản

+ Bước 1: XYXYXYXY + UDP-X = XYXYXYXYX + UDP

+ Bước 2: XYXYXYXYX + UDP-Y = XYXYXYXYXY + UDP

− Cơ chế của quá trình tổng hợp các loại polysaccharid phân nhánh hiện nayvẫn còn chưa rõ Người ta cho rằng thứ tự các gốc đường và tính đặc trưngtham gia của chúng vào chuỗi polysaccharid phụ thuộc vào các loại enzymetransferase

Hình 5.2: Cơ chế sinh tổng hợp cellulose của A.xylinum

1PFK: Fructose – 1 Phosphate Kinase

FDP: Fructose – 1,6 – Diphosphate Dehydrogenase

7. Giá trị dinh dưỡng

Giá trị dinh dưỡng trong 100g thạch dừa

8.1 Nước dừa già

− Nước dừa già là môi trường cổ điển để thu nhận Bacterial Cellulose từ A.

xylinum Đây là môi trường chứa nhiều chất dinh dưỡng và các chất kích

thích sinh trưởng: 1,3 diphenyllurea, hexitol, cytokinin, myo-inositol,sorbitol…

a. Nguồn gốc

− Nước dừa được thu mua chủ yếu từ các cơ sở sản xuất cơm dừa nạo sấy(nước dừa là phế liệu ở các cơ sở chế biến cơm dừa nạo sấy) Ở những vùng

có nhiều dừa thì sản xuất thạch dừa từ nguồn nguyên liệu nước dừa già cóhiệu quả kinh tế rất cao bởi nó rất tốt cho quá trình lên men vừa giải quyếtvấn đề môi trường Tuy nhiên ở những vùng không có dừa thì vấn đề nguyênliệu lại là một trong những điểm hạn chế dẫn đến khó ứng dụng trong sảnxuất ở quy mô công nghiệp

b. Phân loại

− Nước dừa trong sản xuất thạch dừa gồm 2 loại là nước dừa già và nước dừanon

Hình ảnh nước dừa

c. Thành phần hóa học của nước dừa

− Trung bình một trái dừa có chứa 300ml nước, chiếm 25% trọng lượng tráidừa Nước dừa là loại nước giải khát phổ biến vì chứa nhiều chất dinh dưỡngnhư: đường, protein, lipid, vitamin và khoáng nhưng với nồng độ rất thấp

− Bảng 1: Thành phần hóa học của nước dừa già và nước dừa non

+ Lượng đường khử có trong nước dừa tăng đều đặn từ 1,5% đến

5 – 5,5% trong những tháng đầu của quá trình chín và sau đógiảm chậm đến khoảng 2% ở giai đoạn quả chín hoàn toàn Khiquả chín hoàn toàn thì khoảng 90% đường tổng trong nước dừa

là sucrose

− Khoáng

− Nước dừa non chứa hầu hết các khoáng chất như: K, Na, Ca, P, Fe, Cu, S

và Cl Trong số đó thì K chiếm hơn phân nửa lượng khoáng chất, điều này

có thể giải thích là do ảnh hưởng của chế độ bón phân Kali

− Nước dừa non giàu K và một số khoáng chất khác giữ một vai trò quantrọng trong việc tăng sự bài tiết chất thải

Bảng 2: Các Vitamin có trong nước dừa

+ Nước dừa chứa một lượng rất nhỏ protein Hàm lượng alanine,arginine, cysteine và serine trong protein của nước dừa non caohơn hàm lượng có trong sữa bò.

+ Trong nước dừa không chứa protein phức tạp nên nguy cơ gây sốccho người bệnh được giảm thiểu

Bảng 3: Các acid amin có trong nước dừa

− Nước dừa non có chứa acid ascorbic (vitamin C) và các vitamin nhóm B

− Lượng vitamin C trong khoảng 2,2 – 3,7 mg/ml và lượng này giảm dần khicơm dừa cứng dần

Bảng 4: Các vitamin nhóm B trong nước dừa

Vitamin nhóm B trong nước dừa

Acid Pantothenic 0.52 microgram / ml

− Chất kích thích sinh trưởng:

+ Trong nước dừa có chứa nhiều chất kích thích sinh trưởng như:1,3-diphenieriea, hexitol, phylbcocosine, cytokininin, zeatin,ribosid, myoinositol, scyllo-inositol, sorbitol

+ Dừa sau khi thu hoạch thường được bảo quản từ 3 ngày rồi đem sửdụng làm môi trường lên men Nếu để lâu lượng đường trong nướcdừa giảm, chất lượng dinh dưỡng của nước dừa cũng không đảmbảo Môi trường nước dừa cần cung cấp thêm nguồn cacbon(sucrose, glucose hoặc nguồn cacbon khác), nguồn nitơ (SA,DAP)

8.2 Rỉ đường

− Là phần nước đường không thể kết tinh hết cũng như còn lẫn các tạp chất saukhi ly tâm nhiều lần nước mía để tách lấy đường kết tinh Rỉ đường là mộthỗn hợp khá phức tạp Ngoài lượng đường khá cao, rỉ đường còn chứa cáchợp chất nitrogen, vitamin và các hợp chất vô cơ khác

− Thành phần của rỉ đường có chứa 15 – 20% nước, 80 – 85% chất khô hòa tan

và nhiều loại vitamin như: thiamine, riboflavin, acid nicotinic, acid folic,biotin …

− Chất khô hòa tan trong rỉ đường gồm:

− Đường tổng số chiếm hơn 50%, trong đó saccharose chiếm 30–35%, đườngkhử chiếm 15 –20% (gồm glucose, fructose) Chất khử không lên menthường chiếm 1,7%

− Thành phần chất khô còn lại chiếm dưới 50%, trong đó có 30–32% chất hữu

cơ và chất vô cơ 18–20%

− Khi được bảo quản lâu ngày, chất lượng rỉ đường thường giảm Vì vậy cần cóchế độ bảo quản hợp ý để quá trình lên men đạt hiệu quả cao

− Ngoài ra, còn sử dụng nước mía và các nguyên liệu khác từ công nghiệp thựcphẩm để lên men thu Bacterial Cellulose

8.3 Nước dứa

Bảng: thành phần hóa học của nước dứa

Bảng: hàm lượng vitamin và khoáng chất trong nước dứa

Bảng hàm lượng acid amin trong nước dứa

9. Giống vi sinh vật

− Bacterial Cellulose đuợc tổng hợp bởi một số loài vi khuẩn Trong đó

Acetobacter xylinum sinh tổng hợp Bacterial Cellulose hiệu quả nhất và được

nghiên cứu nhiều nhất Cấu trúc của Bacterial Cellulose được tổng hợp khácnhau ở các loài vi khuẩn khác nhau

Bảng III.1: Cấu trúc cellulose của một số vi sinh vật

Giống Cấu trúc cellulose