Co lap ruot

1.1 Vài nét thực tập “Cô lập ruột” Bài thực tập “Nhu động đoạn ruột tách rời thử tác dụng số hoá chất, ion” thực 6, phần D – Tiêu hoá, giáo trình Thực tập Sinh lý năm 2005 Bộ môn Sinh lý học -Trường Đại học Y Hà Nội, trang 125-128, sách giáo khoa Sinh lý học thực hành – nd Edition (Textbook of Practical Physiology second edition by GK Pal Pravaty) trang 420-424 với nội dung cụ thể sau [1] 1.1.1 Đại cương Các lớp trơn ruột non thần kinh nội chi phối nên có khả tự hoạt động Đoạn ruột tách khỏi thể đặt môi trường nuôi dưỡng có thành phần tính chất lý hoá thích hợp tiếp tục hoạt động thể toàn vẹn, ghi cử động Đoạn ruột tách rời đáp ứng với tác dụng hoá chất thuộc loại giao cảm, phó giao cảm số dược liệu thể 1.1.2 Nguyên tắc: Cố định đầu đoạn ruột, đầu thứ hai nối với bút ghi Đoạn ruột môi trường dinh dưỡng co bóp làm bút ghi vẽ đồ thị hoạt động bình thường Lần lượt cho hoá chất vào dung dịch nuôi dưỡng, chất tác dụng lên trơn làm cho đoạn ruột thay đổi hoạt động, cho đồ thị tác dụng hoá chất 1.1.3 Phương tiện dụng cụ tiến hành làm thí nghiệm: - Dụng cụ mổ thỏ: Bàn mổ, khăn mổ, thấm nước, gạc mổ, kéo nhọn, kéo tù, kéo cong, pank to, pank nhỏ, pank pharabop, clam - Dụng cụ cô lập ruột: Kim khâu ruột, chỉ, đũa thuỷ tinh để cố định đoạn ruột, Đĩa petri to để bảo quản đoạn ruột cô lập - Dụng cụ nuôi ruột: + Bình nuôi ruột: chứa tyrod để đoạn ruột thỏ cô lập, nước cất để giữ nhiệt ổn định 370C + Bình giữ nhiệt ổn định suốt trình thí nghiệm (cũng chứa tyrode bão hoà 95% oxy 5% CO2, nước cất ngoài) + Hệ thống cung cấp oxy (bình oxy) đưa vào bình đựng tyrode để nuôi dưỡng đoạn ruột suốt trình làm thí nghiệm + Senso (bộ phận cảm ứng) trọng lực: Tín hiệu (lực co bóp) đoạn ruột đưa phận chuyển đổi tín hiệu (từ tín hiệu tương tương tự thành tín hiệu số) trước đưa vào máy tính - Hệ thống ADI phần mềm Powerlab: + Bằng phần mềm Powerlab hệ thống thiết bị ghi ADI ghi lại biến đổi nhu động ruột mức nhỏ + Hoạt động co bóp ruột sau số hoá ghi lại phần mềm Powerlab, hiển thị kết hình, lưu trữ lại ổ cứng truy xuất thiết bị ngoại vi + Cũng phần mềm Powerlab, tính toán xác lực co tần số co bóp biến đổi lực co tần số theo thời gian ghi lại cách ghi lại tệp (file) video + Hệ thống ghi nhu động ruột cho phép giữ nhiệt độ buồng ghi định, dịch nuôi bão hoà oxy (95% oxy 5% CO2) Do tiến hành thí nghiệm trường diễn thử tác dụng nhiều loại hoá chất ion cho kết ổn định, góp phần đánh giá tác dụng loại hoá chất ion + Hệ thống dẫn xếp đáy bình giúp cho việc thay dịch sau lần thử nghiệm với hoá chất, ion cách dễ dàng, không làm thay - đổi cấu hình thí nghiệm Pipet đầu col 1.1.4 Chuẩn bị động vật thí nghiệm: Sử dụng thỏ khoẻ mạnh > kg nuôi ổn định điều kiện phòng thí nghiệm ngày phải nhịn đói 24 để đảm bảo cho hoạt động ruột tốt 1.1.5 Chuẩn bị hoá chất: - Hoá chất để nuôi dưỡng đoạn ruột dung dịch tyrode: Chúng ta phải pha dung dịch tyrode mẹ để vào ngăn mát tủ lạnh, trước sử dụng lấy pha thành dung dịch tyrode đun ấm 370C CÔNG THỨC PHA DUNG DỊCH TYRODE DÙNG CHO THỎ [giáo trình Thực tập Sinh lý năm 2005] Pha dung dịch tyrode mẹ lít nước dùng pha thành 10 lít NaCl : KCl : CaCl2: MgCl2: Na2HPO4: NaHCO3: Glucose: 80 gram gram gram gram 0.5 gram gram 10 gram * Lưu ý pha dung dịch tyrode: + Dùng nước cất trung tính để pha + Các hoá chất hút nước phải rang, sấy, hút ẩm trước pha để tránh muối kim loại nặng làm tổn thương mô sống + Pha NaHCO3 Na2HPO4 sau để đảm bảo hoà tan + Đựng dung dịch vào lọ thuỷ tinh trung tính, sạch, đậy kín, không để lâu - Hoá chất (ion) cần thử: [giáo trình Thực tập Sinh lý năm 2005 sách giáo khoa Sinh lý học thực hành – nd Edition (Textbook of Practical Physiology second edition by GK Pal Pravaty)] DD Acetylcholin 1/106 DD Adrenalin 1/105 DD Atropin 0.01% DD BaCl2 2% DD CaCl2 1% DD KCl 1% DD NaOH 1% DD HCl 1% 1.1.6 Các bước tiến hành * Ghi đồ thị đoạn ruột cô lập Khởi động Powerlab trước tiến hành thí nghiệm 30 phút Lấy sẵn dung dịch tyrode vào khay đựng ruột thỏ Cố định thỏ lên bàn (lưu ý để không ảnh hưởng đến hoạt động ruột cần bất động thỏ hình thức cắt não - không gây mê) Cắt lông vùng bụng, rạch theo đường trắng từ mũi ức đến gần mu Tìm đoạn hỗng tràng – đầu ruột non (lưu ý bảo tồn động mạch, tĩnh mạch ruột cách: đục thủng mạc treo ruột cách đoạn ruột 4cm nơi mà mạch máu thần kinh chi phối ruột vào ra) dùng buộc lại sau cắt đoạn ruột mạc treo đặt vào đĩa petri chứa sẵn dung dịch tyrode (cắt khoảng -5cm) Làm đoạn ruột cách: dùng xilanh bơm thật nhẹ nhàng dung dịch tyrode vào đoạn ruột để rửa Đoạn ruột thỏ sau cô lập, tách khỏi thể, rửa lòng ruột nhanh chóng đưa vào buồng nuôi có chứa sẵn dung dịch tyrode 37oC Một đầu đoạn ruột cố định vào đũa thuỷ tinh đặt đáy buồng nuôi Đầu lại đoạn ruột nối vào sensor Mở van oxy kiểm tra hệ thống bóng khí Kiểm tra nhiệt độ trì nhiệt độ thường xuyên 370C 10 Cố định bút ghi ghi hoạt động bình thường đoạn ruột cô lập 11 Thử tác dụng hoá chất ion theo trình tự thử sau: (Lưu ý dùng pipet cho trực tiếp 1ml loại định thử vào dung dịch tyrode buồng chứa đoạn ruột trộn đều) *Thử tác dụng số hoá chất lên hoạt động nhu động ruột: Cho Acetylcholin : 1/106 vào buồng nuôi ruột – trộn Quan sát đường ghi - thấy đồ thị bút ghi lên, đồng thời đoạn ruột co ngắn lại Tháo khoá ống nuôi ruột chứa acetylcholin cho chảy hết thay dung dịch tyrode 370C đến hoạt động nhu động ruột trở bình thường Giải thích: Acetylcholin làm giảm điện màng tế bào trơn trở nên dễ bị kích thích, tăng hoạt động, làm tăng tần số biên độ, tăng trương lực làm cho đường ghi lên Tác dụng acetylcholin thông qua vai trò hoạt hoá phospholipase C làm tăng ion canxi [Ca++] nội bào tăng vận chuyển ion canxi [Ca++] từ túi nội bào vào bào tương tăng vận chuyển ion canxi [Ca++] từ bên vào tế bào Do tăng ion canxi [Ca + + ] dẫn đến tăng hoạt động tế bào trơn Cho Adrenalin : 1/105 vào buồng nuôi trộn lên Quan sát đường ghi quan sát đoạn ruột buồng nuôi thấy bị giãn dài làm cho đường ghi xuống Thay dung dịch nuôi có chứa adrenalin dung dịch tyrode 370C chờ cho đường ghi trở lại bình thường Giải thích: Khi cho adrenalin vào dịch buồng nuôi đoạn ruột cô lập làm giảm điện màng làm giảm tần số co bóp mà làm giãn đường ghi xuống Do Adrenalin có tác dụng ức chế thông qua hai loại receptor anpha beta màng tế bào - Tác động lên receptor (thụ thể) beta: làm giảm cAMP tăng gắn canxi [Ca++] nội bào, giảm ion canxi [Ca ++] có sẵn tế bào làm giảm khả đáp ứng tế bào trơn kích thích, - làm đồ thị bút ghi xuống Tác động lên thụ thể anpha: tăng ion canxi [Ca ++] từ tế bào làm giảm ion canxi [Ca++] nội bào kích thích tế bào trơn giảm co bóp dẫn đến giảm biên độ đường ghi Cho Atropin : 0.01% vào buồng nuôi có chứa tyrode 370C Quan sát đồ thị bút ghi thấy đường ghi xuống – lưu ý không rửa mà thực bước Cho tiếp Acetylcholin 1/106 vào buồng nuôi ruột vừa nhỏ atropin Quan sát tiếp đồ thị thấy đường ghi không lên bước chưa có atropin mà đồ thị bút ghi giữ nguyên không giảm Tiến hành rửa hết hoá chất buồng nuôi dung dịch tyrode 370C đồ thị trở bình thường lúc ban đầu Giải thích: Atropin chất ức chế receptor loại muscarinic acetylcholin màng tế bào trơn ống tiêu hoá Atropin làm giảm hoạt động tế bào trơn ống tiêu hoá ngăn cản “ức chế” tác dụng acetylcholin Do cho acetylcholin vào dịch nuôi đoạn ruột cô lập sau cho atropin tác dụng acetylcholin không xảy (nghĩa acetylcholin tác dụng lên hoạt động nhu động ruột nhỏ sau atropin) *Thử tác dụng số ion lên hoạt động nhu động ruột: Cho BaCl2 (Barichloride) 2% vào buồng nuôi đoạn ruột trộn Quan sát đường đồ thị bút ghi thấy lên đồng thời đoạn ruột co ngắn lại Thay dịch buồng nuôi có chứa barichloride dung dịch tyrode 370C chờ nhu động đoạn ruột hoạt động bình thường trở lại Giải thích: Barichloride cho vào buồng nuôi có tác dụng giống Acetylcholin Ion [Ba++] cho vào dịch nuôi đoạn ruột thỏ cô lập làm giảm điện màng tế bào trơn trở nên dễ bị kích thích tăng hoạt động, làm tăng tần số biên độ, tăng trương lực làm cho đường ghi lên Tác dụng ion [Ba++] tác dụng trực tiếp lên tế bào trơn ống tiêu hoá gây co bóp mạnh Cho CaCl2 (Calcium chloride): 1% vào buồng chứa đoạn ruột 37 oC trộn Quan sát đồ thị bút ghi thấy đường ghi lên giống cho acetylcholin Thay dịch buồng nuôi dung dịch tyrode 370C nhiều lần hoạt động đoạn ruột trở bình thường Giải thích: Khi cho CaCl2 (Calcium chloride) vào dịch nuôi đoạn ruột thỏ cô lập, lúc ion [Ca++] từ vào tế bào kích thích tế bào trơn ống tiêu hoá tăng hoạt động, kích thích gây co cơ, cho đường đồ thị bút ghi lên Cho KCl (Kali chloride) 1% vào buồng nuôi – trộn Quan sát đường ghi thấy đồ thị bút ghi lên đồng thời quan sát đoạn ruột thấy co ngắn lại Cho chảy hết dịch có chứa KCl bình nuôi thay dung dịch tyrode 370C để rửa, làm nhiều lần chờ cho hoạt động đoạn ruột trở bình thường Giải thích: Cho KCl vào buồng nuôi đoạn ruột thỏ cô lập, ion [K +] hoạt động giống acetylcholin làm tế bào trơn trở lên bị kích thích, làm tăng tần số, biên độ tăng trương lực có tác dụng làm tăng hoạt động nhu động ruột cho hình ảnh đường ghi lên *Thử tác dụng pH lên hoạt động nhu động ruột: Cho NaOH (Natri hidrocide) 1% vào dịch nuôi đoạn ruột trộn Quan sát đường ghi thấy đồ thị bút ghi lên Tháo buồng nuôi có chứa kiềm thay dung dịch tyrode 370C để rửa hết kiềm buồng nuôi đồng thời hoạt động nhu động ruột trở bình thường thể đường đồ thị bút ghi trở lại bình thường Giải thích: Khi cho kiềm vào buồng chứa dịch nuôi đoạn ruột thỏ cô lập làm kiềm hoá dịch nuôi lúc ion [OH -] từ vào tế bào kích thích tế bào trơn ống tiêu hoá tăng hoạt động, kích thích gây co thể đường ghi lên Cho HCl (acide chlohidric) 1% vào buồng chứa dịch nuôi đoạn ruột trộn Quan sát đường ghi thấy đồ thị bút ghi lên Tháo khoá buồng nuôi cho chảy hết dịch chứa acide cho dung dịch tyrode 370C vào nhiều lần để rửa hoạt động nhu động ruột trở lại lúc ban đầu Giải thích: Ion [H+] cho vào dịch nuôi đoạn ruột thỏ cô lập, làm giảm pH buồng nuôi, ion [H+] tăng vận chuyển từ vào tế bào kích thích tế bào trơn ống tiêu hoá tăng hoạt động, kích thích gây co cơ, đường ghi lên * Lưu ý: - Sử dụng mũi tên để đánh dấu ghi lại thời điểm cho hoá chất rửa hoá chất buồng cô lập - Mỗi lần kiểm chứng tác dụng hoá chất hay ion, dung dịch tyrode buồng chứa đoạn ruột phải thay dung dịch tyrode - Sử dụng riêng pipet (đầu col) tráng rửa thật kỹ sau cho loại hoá chất - Ghi cử động (co bóp) bình thường đoạn ruột trước sau lần sử dụng hóa chất ion 1.2 Hình thức thực thực tập Đây thực tập kiến tập nằm phần thực tập Sinh lý học phần hai chương tiêu hoá Bài thực tập thực kíp gồm kỹ thuật viên Thời gian thực kéo dài khoảng - 1,5giờ Kỹ thuật viên thực toàn bước thí nghiệm theo qui trình trình bày Cả giảng viên sinh viên theo dõi toàn quy trình thực Sinh viên ghi lại kết thí nghiệm phân tích kết theo giai đoạn sau kết thúc thí nghiệm 1.3 Ưu điểm hạn chế thực tập thực trực tiếp động vật thí nghiệm 1.3.1 Ưu điểm - Các thí nghiệm làm trực tiếp động vật thường sống động, ấn tượng, giúp sinh viên tiếp thu học nhanh nhớ lâu - Sinh viên áp dụng lý thuyết vào thực hành - Sinh viên tiếp xúc với dịch, máu, dụng cụ đặc thù nghề nghiệp - Sinh viên tham gia phần vào việc thí nghiệm 1.3.2 Hạn chế Nội dung thực tập Sinh lý Trường Y Dược nước nói chung làm động vật thể rõ điểm bất cập sau: * Chi phí tốn kém: - Liên quan đến động vật thí nghiệm: 10 ... co bóp ruột sau số hoá ghi lại phần mềm Powerlab, hiển thị kết hình, lưu trữ lại ổ cứng truy xuất thiết bị ngoại vi + Cũng phần mềm Powerlab, tính toán xác lực co tần số co bóp biến đổi lực co. .. oxy 5% CO2 , nước cất ngoài) + Hệ thống cung cấp oxy (bình oxy) đưa vào bình đựng tyrode để nuôi dưỡng đoạn ruột suốt trình làm thí nghiệm + Senso (bộ phận cảm ứng) trọng lực: Tín hiệu (lực co bóp)... Pha dung dịch tyrode mẹ lít nước dùng pha thành 10 lít NaCl : KCl : CaCl2: MgCl2: Na2HPO4: NaHCO3: Glucose: 80 gram gram gram gram 0.5 gram gram 10 gram * Lưu ý pha dung dịch tyrode: + Dùng nước