Sách thực hành môn miễn dịch

Tài liệu thực hành môn Miễn dịch dùng cho sinh viên hệ bác sĩ Bài MIỄN DỊCH KHÔNG ĐẶC HIỆU KỸ THUẬT THỰC BÀO HỒNG CẦU GÀ MỤC TIÊU Minh họa tượng thực bào mô hình thực bào hồng cầu gà đại thực bào chuột lang Làm số bước kỹ thuật: thu hoạch đại thực bào, làm tiêu nhuộm Biết đọc kết giải thích tượng quan sát NỘI DUNG 2.1 Chuẩn bị 2.1.1 Dụng cụ - Bông, cồn sát trùng 700 - Bơm kim tiêm, loại 5ml, 10ml - Ống nghiệm nhựa thủy tinh: 5ml, 10ml, 50 ml - Bàn mổ chuột lang - Bộ dụng cụ mổ chuột: dao, kéo, kẹp phẫu tích, pince - Pipet Pasteur (nhựa) - Lam kính sạch - Đèn cồn - Giá để ống nghiệm, - Giá nhuộm tiêu - Tủ ấm 370C - Máy ly tâm - Kính hiển vi có vật kính dầu 100x - Hệ thống camera hình nối với kính hiển vi Tài liệu thực hành môn Miễn dịch dùng cho sinh viên hệ bác sĩ 2.1.2 Hóa chất - Dung dịch NaCl 9‰ Chất chống đông Heparin Citrat natri 7% Dung dịch pepton 10% pha NaCl 9‰, bảo quản ở 40C Cồn tuyệt đối Thuốc gây mê (ete) Thuốc nhuộm Giêmsa Dầu đọc tiêu 2.1.3 Động vật thí nghiệm - Gà - Chuột lang Thực hiện kỹ thuật Ngày 1: Thu hút đại thực bào - Cắt bỏ lông chuột vùng bụng - Sát trùng vùng da cắt lông cồn 700 - Dùng bơm kim tiêm loại 10ml hút 8-10ml dung dịch pepton 1% tiêm vào khoang màng bụng chuột lang - Đánh dấu chuột tiêm tiếp tục nuôi chuột 24 Ngày Thực bào hồng cầu gà bởi đại thực bào đã tập trung a Chuẩn bị hồng cầu gà - Lấy 5ml máu gà cho vào ống nghiệm có sẵn chất chống đông (Heparin Citrat natri 7%) - Thêm 5ml NaCl 9‰, trộn ly tâm 2000 vòng/phút x phút - Hút bỏ phần huyết tương giữ lại phần hồng cầu - Pha loãng hồng cầu ở nồng độ 6-8% NaCl 9‰ - Để hồng cầu vào tủ ấm 370C ít 10 phút b Tiến hành - Cố định chuột lang bàn mổ - Tiêm 3ml hồng cầu gà vào khoang màng bụng, xoa bụng nhẹ nhàng để hồng cầu gà dàn khoang màng bụng - 15 phút sau tiêm, gây mê chuột tẩm ete đặt phễu (phương pháp gây mê hở) Tài liệu thực hành môn Miễn dịch dùng cho sinh viên hệ bác sĩ - Tiêm 5-10ml NaCl 9‰ vào ổ bụng chuột - Mở bụng theo đường giữa, chiều dài đường rạch khoảng 0,5cm - Dùng kẹp phẫu tích pince mấu để kẹp nâng cao miệng vết mổ - Hút dịch ổ bụng pipet Pasteur cho vào ống nghiệm nhỏ 5ml - Nhỏ vào lam kính sạch một giọt dịch ổ bụng thu dàn giống làm tiêu máu đàn - Sau 15 phút tính từ hút dịch ổ bụng lần thứ nhất, dịch ổ bụng lại hút lần làm tiêu lần thứ - Để tiêu khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng - Cố định tiêu cồn tuyệt đối - Pha loãng dung dịch Giêmsa 1:20 (1ml Giêmsa + 19ml H 20) nhỏ lên mặt tiêu máu đàn, để 10 phút ở nhiệt độ phòng sau rửa nước máy để khô tự nhiên Đọc kết giải thích hiện tượng - Nhỏ một giọt dầu lên mặt tiêu đọc kết kính hiển vi vật kính dầu 100x Yêu cầu: Xác định được: - Hồng cầu gà, đại thực bào chuột lang - Các giai đoạn trình thực bào: tiếp cận, nuốt tiêu hồng cầu gà Số lượng bạch cầu đơn nhân thực bào Phầm trăm thực bào = Tổng số bạch cầu đọc ( 50 bạch cầu) Chỉ số thực bào = Tổng số hồng cầu gà bị thực bào đếm Tổng số bạch cầu thực bào Tài liệu thực hành môn Miễn dịch dùng cho sinh viên hệ bác sĩ Bài MIỄN DỊCH ĐẶC HIỆU i Mục tiêu Chứng minh kết hợp kháng nguyên kháng thể Trình bày nguyên lý, bước cách nhận định kết kỹ thuật đánh dấu enzym (ELISA) để xác định kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B (HBsAg) Làm số kỹ thuật miễn dịch nhóm kỹ thuật ngưng kết: xác định nhóm máu, hay phát kháng thể kháng giang mai ii Nội dung 2.1 Kỹ thuật ELISA 2.1.1 Nguyên lý chung ELISA (Enzym Linked Immuno-Sorbent Assay) kỹ thuật hấp phụ miễn dịch gắn enzym dựa vào tính hấp phụ tự nhiên protein một số chất polystyren Các kháng nguyên kháng thể gắn lên nhựa trên, sau cho kháng thể kháng nguyên đặc hiệu tương ứng vào để tạo nên phản ứng kết hợp kháng nguyên-kháng thể Các kháng thể kháng nguyên biết trước gắn với enzym Enzym phân hủy chất không màu thành một sản phẩm có màu đặc trưng Mật độ màu nhận định sơ bộ mắt thường đọc chính xác quang phổ kế Tài liệu thực hành môn Miễn dịch dùng cho sinh viên hệ bác sĩ 2.1.2 Một số loại kỹ thuật ELISA thường dùng Dựa nguyên lý phản ứng kết hợp kháng nguyên-kháng thể Nếu muốn tìm kháng nguyên hỗn dịch phải có kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên biết ngược lại 2.1.2.1.Kỹ thuật ELISA gián tiếp Nguyên lý: Kháng nguyên cần tìm mẫu thử hấp phụ vào giếng nhựa Sau ủ rửa, cho kháng thể biết rồi lại ủ một thời gian để phản ứng KN-KT diễn Rửa kháng thể thừa cho kháng-kháng thể gắn enzym Cuối cùng, rửa KT gắn enzym thừa cho chất TMB Đo mật độ quang màu quang phổ kế mắt thường (xem sơ đồ 1) Sơ đồ Sinh màu Cơ KN ELISA KTsandwich Kháng 2.1.2.2.Kỹ thuật chất cần KT gắn tìmkhôngbiết Nguyên lý: KT đánh dấu enzym (đã biết) gắn lên chất mang (các giếng nhựa), sau cho mẫu thử có mang KN cần tìm ủ Rửa bỏ KN thừa cho KT có gắn enzym Như vậy, có KN bị kẹp KT (xem sơ đồ 2) Sau rửa lần để loại bỏ KT gắn enzym thừa cho dung dịch chất vào Enzym phân hủy chất sinh màu đặc trưng mật độ quang học đo quang phổ kế ở bước sóng 450nm Sơ đồ KT biết KN cần tìm KT gắn enzym Sinh màu Cơ chất 2.1.3 ứng dụng để phát HBsAg huyết (Sử dụng chế phẩm PHARMATECH- HBsAg EIA) Tài liệu thực hành môn Miễn dịch dùng cho sinh viên hệ bác sĩ 2.1.3.1 Nguyên lý (dựa nguyên lý kỹ thuật ELISA-sandwich pha): KT đơn dòng kháng HBsAg không đánh dấu enzym gắn vào giếng nhựa, đồng thời KT kháng HBsAg có gắn enzym peroxidase cho sẵn giếng (hạt màu xanh) Cho huyết nghi ngờ có HBsAg vào ủ Rửa bỏ huyết KT gắn enzym thừa, sau cho chất TMB (tetramethyl benzidin) Nếu huyết thử có HBsAg peroxidase phân hủy TMB không màu thành dung dịch có màu xanh Sơ đồ Sinh màu KT Kháng HBsAg biết KN HBsAg cần tỡm KT gắn peroxidase Cơ chất TMB 2.1.3.2 Các chất liệu cần cho phản ứng - Huyết huyết tương máu người không cần nhịn đói Chuẩn bị dung dịch đệm để rửa theo chỉ dẫn kèm bộ chế phẩm Một số dụng cụ cần thiết: Găng tay cao su, micropipet, đầu côn, giấy thấm Máy quang phổ kế để đọc kết 2.1.3.3 Các bước tiến hành - Tính toán lấy số giếng thử cần thiết - Cho vào giếng thử 100µl huyết bệnh nhân hay mẫu chứng gồm chứng âm (không có HBsAg) chứng dương (chắc chắn có HBsAg) hãng sản xuất - Nhỏ 50µl dung dịch kháng thể gắn enzym giếng thử - ủ giếng ở 370C 90 phút - Rửa giếng lần đệm phosphat Sau rửa ý loại bỏ hết đệm (dùng máy hút chân không hay đập mạnh giấy thấm) - Nhỏ 100 µl dung dịch TMB cho giếng thử - ủ ở nhiệt độ phòng 15 phút Tài liệu thực hành môn Miễn dịch dùng cho sinh viên hệ bác sĩ - Ngừng phản ứng cách cho thêm 100µl H2SO4 1nmol/l giếng, gõ nhẹ lên phiến nhựa để trộn - Kết đọc khoảng thời gian 15 phút sau dừng phản ứng mắt thường hay máy đo quang phổ kế ở bước sóng 450 nm 2.1.3.4 Đọc kết - Chứng âm: Giếng thử không đổi màu - Chứng dương: Giếng thử có màu xanh - Kết mẫu thử âm tính: Màu giống màu chứng âm  huyết thử HBsAg - Kết mẫu thử dương tính: Màu giống màu chứng dương trong huyết thử có HBsAg (độ đậm nhạt phụ thuộc nồng độ HBsAg có mẫu thử) 2.2 Kỹ thuật ngưng kết 2.1.1 Chuẩn bị dụng cụ và hóa chất - Bộ dụng cụ lấy máu đầu ngón tay bộ dụng cụ lấy máu tĩnh mạch Lam kính 2,5 & 7,5cm Bông thấm nước, cồn sát trùng 70 độ Bộ huyết mẫu để xác định nhóm máu ABO bộ kit phát kháng thể kháng giang mai RPR-Nosticon ( Biomerieux) 2.1.2 Tiến hành kỹ thuật 2.1.2.1 Kỹ thuật xác định nhóm máu ABO * Nguyên lý : Kháng nguyên bề mặt hồng cầu gặp kháng thể tương ứng (đã biết) tạo nên mạng lưới ngưng kết Hồng cầu vón lại thành mảng hay hạt lớn nhìn thấy mắt thường so với mẫu chứng * Tiến hành : - Nhỏ giọt máu lên lam kính Sau nhỏ giọt huyết mẫu antiA, antiB, antiAB lên cạnh giọt máu Dùng đũa thủy tinh trộn ( sau lần trộn lau sạch đũa thủy tinh) Để nhiệt độ phòng đọc kết sau 10 phút Tài liệu thực hành môn Miễn dịch dùng cho sinh viên hệ bác sĩ * Đọc kết quả: Dựa vào vị trí ngưng kết hay không ngưng kết tên huyết biết, suy nhóm máu tương ứng 2.1.2.2 Kỹ thuật phát kháng thể giang mai: * Nguyên lý: Người ta tổng hợp một số chất có cấu trúc giống kháng nguyên giang mai (VDRL) gắn lên chất mang cacbon với mục đích kháng nguyên kết hợp với kháng thể phát mắt thường mẩu cacbon màu đen bị ngưng kết thành dạng chấm tròn màu đen * Tiến hành - Nhỏ giọt huyết lên vòng tròn giấy - Dùng que nhựa dàn huyết - Nhỏ giọt kháng nguyên ( trước nhỏ lắc đều) - Sau lắc tròn lam giấy một lúc để kháng nguyên tiếp xúc tốt với kháng thể - Đọc kết sau phút * Kết quả: - Chứng âm: chấm tròn màu đen - Chứng dương: nhiều chấm tròn màu đen - Mẫu huyết dương tính: Khi thấy xuất chấm tròn màu đen, huyết bệnh nhân có kháng thể kháng trực khuẩn giang mai Tài liệu thực hành môn Miễn dịch dùng cho sinh viên hệ bác sĩ Bài 3: MÔ HÌNH THỰC NGHIỆM SỐC TRUYỀN MÁU KHÁC LOÀI I MỤC TIÊU Mô tả giải thích thay đổi sốc truyền máu khác loài Phân tích chế bệnh sinh sốc truyền máu II MÔ HÌNH SỐC TRUYỀN MÁU 2.1 Trang bị, hoá chất động vật thí nghiệm 2.1.1 Động vật thí nghiệm: - Chó khoẻ có trọng lượng từ 8-10 kg - Thỏ khoẻ trọng lượng 2-2,5 kg 2.1.2 Dụng cụ thí nghiệm: - Bàn cố định chó, thỏ - Bộ dụng cụ mổ - Hệ thống ghi huyết áp hô hấp Tài liệu thực hành môn Miễn dịch dùng cho sinh viên hệ bác sĩ - Bộ dụng cụ đếm hồng cầu, bạch cầu: ống hút hồng cầu, ống hút bạch cầu, buồng đếm Thoma - Kính hiển vi quang học - Bộ dụng cụ truyền máu - Máy ly tâm - Đồng hồ bấm giây - Ống đo hematorit - Ống nghiệm, lam kính, lamen - Pipette, cốc đong - Bông, gạc, chỉ 2.1.3 Hoá chất: - Dung dịch chống đông: Citrat natri 7%, Heparin 5000 UI/ml - Dung dịch muối đẳng trương NaCl 9‰ - Dung dịch đếm bạch cầu: acid acetic 3-5% - Thuốc tê Novocain 2.2 Chuẩn bị thí nghiệm: 2.2.1 Lấy hồng cầu thỏ: - Thỏ cố định bàn mổ Cắt lông vùng cổ - Gây tê tại chỗ Novocain Bộc lộ động mạch cảnh - Luồn canuyl vào động mạch cảnh - Dẫn lưu toàn bộ máu thỏ lọ thuỷ tinh có chứa sẵn 20 ml dung dịch chống đông Citrat Natri 7% - Máu chống đông ly tâm tách riêng hồng cầu bỏ huyết tương lọc loại trừ cục máu đông - Tái hoà tan hồng cầu thể tích huyết tương loại bỏ với dung dịch NaCl 9‰ 2.2.2 Chuẩn bị chó: - Chó cố định bàn mổ - Cắt lông cổ - Gây tê tại chỗ Novocain ở vùng cổ vùng bẹn chân sau - Bộc lộ động mạch cảnh luồn canuyn vào để đo huyết áp trực tiếp lòng mạch huyết áp kế thuỷ ngân - Bộc lộ khí quản, luồn kim đo hô hấp vào khí quản, kim nối thông với trống Marey (có gắn kim ghi biên độ băng giấy) - Bộc lộ tĩnh mạch đùi phải để lấy máu kiểm tra chỉ số trước sau sốc - Bộc lộ tĩnh mạch đùi trái để truyền hồng cầu thỏ 2.3 Tiến hành thí nghiệm: 2.3.1 Xác định số ở thời điểm trước truyền: Tài liệu thực hành môn Miễn dịch dùng cho sinh viên hệ bác sĩ * Các chỉ số huyết động: - Huyết áp động mạch: xác định qua huyết áp kế thuỷ ngân Đo giá trị huyết áp động mạch trực tiếp lòng mạch, giá trị huyết áp thu giá trị huyết áp lấy điểm khoảng cách dao động cột thuỷ ngân - Tần số mạch: xác định qua số lần mạch nảy một phút tại động mạch đùi bên phải * Các chỉ số hô hấp: - Tần số hô hấp: đếm số lần lên xuống trống Marey một phút - Biên độ hô hấp: ghi độ dao động kim ghi băng giấy gắn mặt trống Marey * Các chỉ số huyết học: - Số lượng hồng cầu: Đếm buồng đếm Thoma Dùng ống hút hồng cầu hút máu (ngay sau lấy máu khỏi lòng mạch) Sau pha loãng 200 lần với dung dịch nước muối đẳng trương (NaCl 9‰) Lắc đều, bỏ vài giọt đầu, nhỏ lên buồng đếm đếm số lượng kính hiển vi quang học - Số lượng bạch cầu: Cũng xác định buồng đếm Thoma Dùng ống hút bạch cầu để hút máu, sau pha loãng với dung dịch bạch cầu để phá vỡ hồng cầu với độ pha loãng 20 lần Lắc bỏ vài giọt đầu, nhỏ lên buồng đếm đưa lên kính hiển vi quang học xác định số lượng - Hematocrit: Theo phương pháp microhematocrit xác định cột hồng cầu Lấy máu cho vào ống đo có tráng Heparin, sau bịt một đầu sáp Tiến hành ly tâm với tốc độ 10.000 vòng/phút x phút, sau xác định tỷ lệ chiều cao cột hồng cầu so với máu toàn phần * Các chỉ số khác: - Thời gian đông máu: Xác định khoảng thời gian từ lấy máu khỏi lòng mạch tới nghiêng lam kính biến dạng cục máu Nhỏ một giọt máu lên lam kính sạch với điều kiện giọt máu tròn, có độ vồng, đường kính 0,7-1,0cm - Hiện tượng dung huyết: Lấy 2ml máu chống đông, cho vào ống nghiệm Ly tâm tách riêng hồng cầu huyết tương với tốc độ 5000 vòng/ phút, quan sát mầu huyết tương thu - Phản ứng chéo hồng cầu thỏ huyết chó: Nhỏ một giọt hồng cầu thỏ một giọt huyết chó lên lam kính, dùng que thuỷ tinh trộn Lam kính đưa lên kính hiển vi quang học quan sát tượng ngưng kết lam kính (cũng quan sát mắt thường) Tài liệu thực hành môn Miễn dịch dùng cho sinh viên hệ bác sĩ - Chứng minh vai trò bổ thể: Huyết chó chia ống: 01 ống để ở nhiệt độ phòng, ống lại để ở 56°C 30 phút sau cho một giọt hồng cầu thỏ vào ống ủ ở 37 0Cx10phút Ly tâm 2000 vòng/phút x phút nhận xét khác ống - Tình trạng toàn thân chó 2.3.2 Tiến hành truyền dịch hồng cầu thỏ cho chó qua đường tĩnh mạch đùi với tốc độ - 25-30 giọt/ phút Theo dõi biến đổi huyết áp, mạch hô hấp tình trạng toàn thân chó toàn bộ trình truyền - Khi huyết áp 50- 60 mmHg ngừng truyền lấy lại toàn bộ chỉ tiêu giống trước truyền, ghi vào biên Bảng kết thí nghiệm sốc truyền máu khác loài: Các số Trước sốc Sau sốc Mạch Huyết áp Hô hấp Phản ứng chéo Vai trò bổ thể Số lượng bạch cầu Hematocrit Thời gian đông máu Hiện tượng tan máu Tình trạng toàn thân 2.3.3 Nhận xét và giải thích kết thu được, sở phân tích chế bệnh sinh sốc truyền máu khác loài  ... Chỉ số thực bào = Tổng số hồng cầu gà bị thực bào đếm Tổng số bạch cầu thực bào Tài liệu thực hành môn Miễn dịch dùng cho sinh viên hệ bác sĩ Bài MIỄN DỊCH ĐẶC...Tài liệu thực hành môn Miễn dịch dùng cho sinh viên hệ bác sĩ 2.1.2 Hóa chất - Dung dịch NaCl 9‰ Chất chống đông Heparin Citrat natri 7% Dung dịch pepton 10% pha NaCl 9‰,... Enzym phân hủy chất không màu thành một sản phẩm có màu đặc trưng Mật độ màu nhận định sơ bộ mắt thường đọc chính xác quang phổ kế Tài liệu thực hành môn Miễn dịch dùng cho sinh viên hệ bác