Đánh giá tính khả dụng của vắc xin bạch hầu đông khô RD6 dự tuyển mẫu chuẩn quốc gia

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - ĐỖ KHÁNH LINH ĐÁNH GIÁ TÍNH KHẢ DỤNG CỦA VẮC XIN BẠCH HẦU ĐÔNG KHÔ RD6 DỰ TUYỂN MẪU CHUẨN QUỐC GIA LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2016 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - ĐỖ KHÁNH LINH ĐÁNH GIÁ TÍNH KHẢ DỤNG CỦA VẮC XIN BẠCH HẦU ĐÔNG KHÔ RD6 DỰ TUYỂN MẪU CHUẨN QUỐC GIA Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60420107 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS PHẠM VĂN HÙNG TS TRẦN THỊ THANH HUYỀN Hà Nội – 2016 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, nhận giúp đỡ nhiệt tình nhiều người Lời đầu tiên, xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới TS Phạm Văn Hùng, Phó Viện trưởng Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin Sinh phẩm Y tế, TS Trần Thị Thanh Huyền, Bộ môn Vi sinh vật học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên ĐHQG Hà Nội, người thầy tận tình hướng dẫn suốt trình thực đề tài luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo, cán môn Vi sinh vật học khoa Sinh học trường Đại học Khoa học Tự nhiên Đại học Quốc gia Hà Nội có nhiều dẫn giúp đỡ suốt trình học tập Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin Sinh phẩm Y tế tài trợ kinh phí để thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn TS.Trần Văn Bé, Viện trưởng Viện vắc xin Sinh phẩm Y tế tạo điều kiện vềphòng thí nghiệm cung cấp lượng lớn động vật thí nghiệm giúp hoàn thành luận văn Để hoàn thành luận văn, nhận giúp đỡ quý báu bạn đồng nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn TS Trần Lan Phương, CN.Nguyễn Lan Anh, anh chị đồng nghiệp phòng QC,Viện vắc xin Sinh phẩm Y tếvà Ths Lê Thị Hoàng Yến, CN Nguyễn Phương Liên anh chị đồng nghiệp Khoa Vi khuẩn – Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin Sinh phẩm Y tế giúp đỡ suốt trình thực đề tài Cuối cùng, vô biết ơn gia đình, bạn bè giúp đỡ động viên suốt trình học tập thực đề tài Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Học Viên Đỗ Khánh Linh MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1.VI KHUẨN BẠCH HẦU VÀ BỆNH BẠCH HẦU 1.1.1 Những nét chung vi khuẩn bạch hầu 1.1.2Độc tố bạch hầu 1.1.3 Bệnh sinh .4 1.1.4 Dịch tễ học 1.2VẮC XIN BẠCH HẦU 1.3MẪU CHUẨN 1.3.1Về thuật ngữ 1.3.2 Về phƣơng pháp điều chế .9 1.3.3Tiêu chuẩn chất lƣợng 11 1.3.4Vắc xin bạch hầu mẫu chuẩn quốc tế 13 1.3.5Vắc xin bạch hầu mẫu chuẩn Quốc gia 14 1.4YÊU CẦU ĐỐI VỚI VIỆC CHUẨN ĐỊNH MẪU CHUẨN QUỐC GIA 16 1.5 ĐỘNG VẬT DÙNG TRONG KIỂM ĐỊNH VẮC XIN BẠCH HẦU 17 1.6PHƢƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ CÔNG HIỆU BẠCH HẦU .19 1.6.1Phƣơng pháp thử thách chuột lang 20 1.6.2 Phƣơng pháp chuẩn độ kháng thể chuột nhắt 21 1.7ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA VẮC XIN MẪU CHUẨN 23 1.7.1Đánh giá độ ổn định dài hạn (Long- term Stability Studies) .23 1.7.2Đánh giá độ ổn định cấp tốc (Accelerated Stability Testing) 23 1.7.2.1 Điều kiện tiến hành phƣơng pháp cấp tốc 23 1.7.3 Dự đoán tuổi thọ sản phẩm theo nguyên lý Vant-Hoff [1, 16] 23 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG,VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU .25 2.2.Vật liệu nghiên cứu – trang thiết bị sinh phẩm vật tƣ tiêu hao 25 2.2.1.Động vật thí nghiệm 25 2.2.2.Sinh phẩm –hóa chất 25 2.2.3.Vật tƣ trang thiết bị 25 2.3.THIẾT KẾ NGHIÊN CỨU .26 2.4.THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 26 2.5.CỠ MẪU NGHIÊN CỨU .26 2.6.PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.6.1 Đánh giá cảm quan 27 2.6.2Đánh giá vô trùng .27 2.6.3Đánh giá đô ̣ ẩ m tồ n dƣ .27 2.6.4Đánh giá đô ̣ chân không .28 2.6.5Đánh giá nhận dạng 28 2.6.6 Đánh giá tính đồng khối lƣợng .30 2.6.7Đánh giá công hiệu tính đồ ng nhấ t công hiệu 30 2.6.8Dƣ̣ đoán ̣n dùng của vắ c xin mẫu chuẩ n 32 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 ĐÁNH GIÁ CÁC CHỈ TIÊU SAU XUẤT XƢỞNG 34 3.1.1 Đánh giá cảm quan 34 3.1.2 Đánh giá tiêu vô trùng 35 3.1.3 Đánh giá độ chân không 36 3.1.4 Đánh giá độ ẩm tồn dƣ .36 3.1.5 Đánh giá nhận dạng 38 3.2 ĐÁNH GIÁ TÍNH ĐỒNG NHẤT 39 3.2.1 Đánh giá tính đồng trọng lƣợng khô 39 3.2.2 Đánh giá tính đồng công hiệu 40 3.3DỰ ĐOÁN TUỔI THỌ CỦA VẮC XIN MẪU CHUẨN .43 KẾT LUẬN 46 KIẾN NGHỊ .47 Tài Liệu Tham Khảo .48 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang 1.1 Hình ảnh vi khuẩn bạch hầu 1.2 Cấu trúc độc tố bạch hầu 1.3 Màng giả hầu họng độc tố bạch hầu 1.4 Nhãn vắc xin Bạch hầu mẫu chuẩn Quốc tế lần thứ tƣ 11 2.1 Sơ đồ nhỏ mẫu phƣơng pháp nhận dạng bạch hầu 29 3.1 Sự nguyên vẹn ống mẫu RD6 34 3.2 3.3 Đồ thị biểu diễn độ chụm kết độ ẩm tồn dƣ mẫu RD6 Kết nhận dạng thành phần bạch hầu mẫu RD6 37 38 Biểu đồ biểu thị trọng lƣợng khô mẫu RD6 thực NICVB 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 IVAC Đồ thị biểu diễn độ chụm kết trọng lƣợng khô mẫu RD6 Biểu đồ biểu thị kết công hiệu RD6 thực NICVB IVAC Đồ thị biểu diễn độ chụm kết công hiệu mẫu RD6 Đồ thị biểu diễn Sự phụ thuộc công hiệu bạch hầu RD6 bảo quản nhiệt độ 500C theo tháng 39 40 41 42 44 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên Bảng Trang 2.1 Công thức pha loãng vắc xin 31 2.2 Công thức pha mẫu RD6 pha loãng 34 3.1 Kết kiểm tra cảm quan mẫu chuẩn RD6 NICVB IVAC 35 3.2 Kết kiểm tra vô trùng NICVB IVAC 36 3.3 Kết kiểm tra chân không mẫu chuẩn RD6 36 3.4 Kết độ ẩm tồn dư thực NICVB IVAC 37 3.5 Kết công hiệu RD6 (trên chuột lang) thời điểm ủ mẫu nhiệt độ 500C/ độ ẩm 75% 43 DANH MỤC CHƢ̃ VIẾT TẮT STT Chƣ̃ viế t tắ t Chú giải ATCC American Type Culture Collection (Ngân hàng chủng chuẩn Hoa Kỳ) ĐTBH Độc tố bạch hầu DTP Diphtheria- Tetanus- Pertussis (Bạch hầu –Uốn ván – Ho gà ) ED50 Effective dose (Liều bảo vệ 50% động vật thí nghiệm) IU International Unit (Đơn vị quốc tế) KĐTBH Kháng độc tố bạch hầu LD50 Lethal dose 50 (Liều gây chết 50 % động vật thí nghiệm sau 96 giờ) Lf Limes flocculation: Đơn vị lên quốc tế MCQG Mẫu chuẩn quốc gia 10 MCQT Mẫu chuẩn quốc tế 11 NIBSC National Institute for Biological Standards and Control (Viện Quốc gia Sinh phẩm chuẩn chuẩn sinh học) 12 NICVB National Instistute for Control of Vaccines and Biologicals (Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin Sinh phẩm y tế) 13 NMSL Nƣớc muối sinh lý 14 SSI Staten Serum institiute (Viện huyết quốc gia Đan Mạch) 15 IVAC Institute of vaccine and biological (Viện vắc xin chế phẩm sinh học) MỞ ĐẦU Bạch hầu bệnh nhiễm khuẩn , nhiễm đô ̣c vi khuẩ n Gram (+) Corynebacterium diphtheriae gây Bê ̣nh ba ̣ch hầ u đã gây nhiề u vu ̣ dich ̣ lớn và nguy hiể m ở nhiề u quố c gia thế giới Và sử dụng vắc xin biện pháp quan tro ̣ng nh ất để phòng bệnh bạch hầu Chấ t lƣơ ̣ng vắ c xin ba ̣ch hầ u đƣ ợc đánh giá qua tiêu chí: an toàn hiệu Thƣ̉ nghiê ̣m kiể m tra công hiê ̣ u là thƣ̉ nghiê ̣m cầ n thiế t đ ể đánh giá hiệu vắc xin Thƣ̉ nghiê m ̣ này cầ n có mẫu chuẩ n công hiê ̣u của vắ c xin mẫu thƣ̉ đƣơ ̣c xác đinh ̣ qua so sánh tƣơng quan với vắ c xin mẫu chuẩ n đã biế t trƣớc giá tri ̣công hiê ̣u Để thống kết kiểm định vắc xin bạch hầu toàn giới, Tổ chƣ́c y tế thế giới (WHO) đã thiết lập mẫu chuẩ n ba ̣ch hầ u quố c tế , NIBSC sản xuất sử dụng mẫ u chuẩ n lầ n th ứ tƣ với hàm lƣợng 213 IU/ống Do số lƣợng mẫu chuẩn Quốc tế có hạn nên WHO khuyến cáo quốc gia nên có mẫu chuẩn địa phƣơng cho kiểm định từng lô vắc xin vắc xin DTP sản xuất nƣớc nhiề u nƣớc để phu ̣c vu ̣ nhu cầ u [40] Ở Việt Nam , , còn nhập vắc xin DTP phòng bệnh của nhân dân , đó viê ̣c kiể m tra công hiê ̣u thành phầ n ba ̣ch hầ u có tầ n suấ t khá lớn Nhà sản xuất cần vắ c xin mẫu chuẩ n quố c gia đ ể kiểm định công hiệu vắc xin trình sản xuất, còn Viện kiểm định Quốc gia Vắc xin Sinh phẩm y tế cần mẫu chuẩn Quốc gia để kiểm định vắc xin xuấ t xƣởng và đăng ký Hiê ̣n , chƣa có vắ c xin m ẫu chuẩn quốc gia bạch h ầu, thêm vào mẫu chuẩn Quốc tế có đơn vị chuột lang Vì vậy, mẫu chuẩn Quốc gia đƣợc thiết lập nối chuẩn với MCQT theo đơn vị miễn dịch chuột lang Phƣơng pháp có chi phí tốn khả có đƣợc lƣợng chuột lang lớn để làm thƣờng quy không khả thi với nhiều phòng thí nghiệm Do vậy, việc chuyển đổi sang phƣơng pháp dùng chuột nhắt sử dụng đơn vị chuột nhắt cần thiết Việc chuyển đổi đƣợc thực từng Quốc gia Song chƣa có phòng thí nghiệm công bố Tƣ̀ nhƣ̃ng lý đó Viê ̣n kiể m đinh ̣ Quố c gia Vắ c xin và Sinh phẩ m y tế đã phố i hơ ̣p với Viện Vắc xin Sinh phẩm Y tế (IVAC) sản xuất vắc xin ba ̣ch hầ u d ự tuyển mẫu chuẩ n Quố c gia ti ến hành: “Xác định tính khả dụng Vắc xin bạch hầu đông khô RD6 dự tuyểnmẫu chuẩn Quốc gia” với mục tiêu sau: Xây dựng quy trình chuẩn định chất lượng Vắc xin mẫu chuẩn Quốc gia Bạch hầu đông khô để làm thước đo đánh giá, kiểm định vắc xin xuất xưởng phục vụ cho sức khỏe cộng đồng Mục tiêu cụ thể: Đánh giácác tiêu sau xuất xƣởng Xác định giá trị công hiệu bạch hầu chuột lang Vắc xin mẫu chuẩn dự tuyển Dự đoán tuổi thọ vắc xin mẫu chuẩn Đánh giá tính đồng vắc xin mẫu chuẩn dự tuyển thể sử dụng hai kết để đƣa vào tính giá trị trung bình độ ẩm tồn dƣ mẫu chuẩn RD6 Độ ẩm tồn dư % 1.8 1.75 ĐÂTD (%) GM+2*S D GM-2*SD 1.7 1.65 GM Linear (GM) 1.6 Lần làm 1.55 10 15 Hình 3.2: Đồ thị biểu diễn độ chụm kết độ ẩm tồn dƣ mẫu RD6 Nhìn vào đồ thị ta thấy kết nằm khoảng trung bình ±2*SD tức đạt độ chụm Do độ ẩm tồn dƣ mẫu RD6 đƣợc tính = trung bình nhân kết NICVB IVAC = 1,69 (%), CV= 3,1 (%) Độ ẩm tồn dƣ số quan trọng vắc xin mẫu chuẩn ảnh hƣởng tới độ ổn định vắc xin mẫu chuẩn Độ ẩm tồn dƣ thực chất lƣợng nƣớc còn lại sản phẩm đông khô, lƣợng nƣớc khiến phản ứng giáng hóa protein bạch hầu tiếp tục diễn ảnh hƣởng đến hàm lƣợng kháng nguyên bạch hầu ống mẫu Do vậy, độ ẩm tồn dƣ thấp độ ổn định cao ngƣợc lại Ngoài độ ẩm tồn dƣ giúp đánh giá trình đông khô tốt hay chƣa tốt Sau đông khô sản phẩm đƣợc hàn điều kiện khác độ ẩm tồn dƣ khác nhau.Kết độ ẩm 37 tồn dƣ mẫu RD6 1,69 (%), mẫu chuẩn Quốc tế 0,68 % Nhƣ độ ẩm tồn dƣ RD6 cao mẫu chuẩn Quốc tế Tuy nhiên, kết nhỏ 3% (tiêu chuẩn) Điều cho thấy trình đông khô đóng ống mẫu chuẩn phƣơng pháp chân không tốt Mẫu chuẩn RD6 có độ ổn định cao Kết luận: Độ ẩm tồn dƣ mẫu chuẩn RD6 đạt yêu cầu đƣợc xác định 1,69 (%) 3.1.5 Đánh giá nhận dạng Quy trình nhận dạng đƣợc thực NICVB IVAC phƣơng pháp khuếch tán miễn dịch kép, đƣờng kết tủa kháng nguyên bạch hầu kháng thể bạch hầu đƣợc biểu diễn theo kết nhƣ hình dƣới đây: Cung kết tủa kháng nguyên kháng thể bạch hầu Hình 3.3: Kết nhận dạng thành phần bạch hầu mẫu RD6 Nhìn vào hình ta thấy có cung kết tủa màu xanh kháng huyết bạch hầu chuẩn với giải độc tố bạch hầu vắc xin (giữa giếng 1và với giếng 5, khoảng giếng 10 với giếng 6, khoảng giếng 11với giếng 7) Vậy mẫu RD6 đạt nhận dạng Thử nghiệm nhận dạng thử nghiệm nhằm xác định kháng nguyên vắc xin loại kháng nguyên cần phản ứng đặc hiệu kháng nguyên kháng thể Mẫu chuẩn quốc tế mẫu chuẩn RD4 sản xuất trƣớc không đƣợc kiểm tra thử 38 nghiệm nhƣng với mẫu chuẩn bạch hầu thử nghiệm xác định tính đặc hiệu mẫu chuẩn nên nhóm nghiên cứu tiến hành kiểm tra tiêu 3.2 ĐÁNH GIÁ TÍNH ĐỒNG NHẤT 3.2.1 Đánh giá tính đồng trọng lƣợng khô Thực kiểm tra trọng lƣợng khô mẫu RD6 NICVB IVAC phƣơng pháp cân trọng lƣợng mẫu trƣớc sau sấy khô 120°C Kết thu đƣợc nhƣ sau: 50 Khối lượng khô (mg) 46.78 45 40 42.43 39.56 38.12 36.22 45.95 43.68 42.69 42.26 48.75 47.54 46.94 45.76 44.78 41.67 39.99 38.26 39.34 38.56 37.15 35 30 25 20 15 10 5 10 Hình3.4: Biểu đồ biểu thị trọng lƣợng khô mẫu RD6 NICVB IVAC Sử dụng phần mềm SPSS tính toán giá trị P t-test Sig (2 tailed) = 0,064> 0,05: chứng tỏ khác biệt có ý nghĩa thống kê giá trị trung bình kết NICVB IVAC Chứng tỏ kết hai nơi khác biệt 39 Có thể sử dụng hai kết để đƣa vào tính giá trị trung bình trọng lƣợng khô mẫu chuẩn RD6 55 mg 50 Khối lượng khô (mg) TB+ 2*SD 45 TB-2*SD TB 40 35 Lần làm 30 10 15 20 25 Hình3.5: Đồ thị biểu diễn độ chụm kết khối lƣợng khô mẫu RD6 Nhìn vào đồ thị ta thấy kết nằm khoảng Trung bình ±2*SD tức đạt độ chụm Do khối lƣợng khô mẫu RD6 đƣợc tính = trung bình cộng kết NICVB IVAC = 0,04105 (g), CV= 0,08528 (%) Tính đồng khối lƣợng khô số phản ánh đồng vắc xin mẫu chuẩn phân liều đóng ống đông khô.Khối lƣợng khô ống đồng lƣợng kháng nguyên bạch hầu ống mẫu chuẩn gần Điều phản ánh tính đồng mẫu chuẩn cao Độ lệch chuẩn kết 0,00359; CV 0,08528% ( 0,05: chứng tỏ khác biệt có ý nghĩa thống kê giá trị trung bình kết NICVB IVAC Nhƣ vậy, kết hai nơi khác biệt Có thể sử dụng hai kết để đƣa vào tính giá trị trung bình công hiệu mẫu chuẩn RD6 41 1300 IU/ống 1200 1100 1000 Công hiệu (IU/ống) 900 TB+2*SD 800 TB -2*SD 700 TB Linear (TB -2*SD) 600 500 400 10 Lần làm 15 Hình 3.7: Đồ thị biểu diễn độ chụm kết công hiệu mẫu RD6 Nhìn vào đồ thị ta thấy kết công hiệu nằm khoảng Trung bình ±2*SD tức đạt độ chụm.Do công hiệu mẫu RD6 đƣợc tính = trung bình kết NICVB IVAC = 921,05 IU/ống,CV= 0,20 (%).Công hiệu giá trị quan trọng nhất, giá trị cần xác định để sử dụng vắc xin mẫu chuẩn Quốc gia Kết vắc xin bạch hầu dự tuyển mẫu chuẩn Quốc gia RD6 đƣợc xác định 921,05 IU/ ống So sánh với nghiên cứu trƣớc Việt Nam nhƣ công hiệu bạch hầu mẫu chuẩn RD4 GS.Nguyễn Thị Kê cộng nghiên cứu sản xuất 312 IU/ống, hay công hiệu mẫu chuẩn Quốc tế lần thứ 132 IU/ống, lần thứ ba thứ tƣ lần lƣợt 160IU/ống 213 IU/ống mẫu chuẩn RD6 có công hiệu 921,05 IU/ống cao nhiều[4][43] Với giá trị công hiệu mẫu chuẩn RD6 khắc phục đƣợc nhƣợc điểm mẫu chuẩn trƣớc thay phải dùng nhiều (2-4) ống cho lần thử nghiệm mẫu RD6 với công hiệu 921,05 IU/ống cần dùng ống cho lần thử nghiệm Điều đáp ứng tiêu chí quan trọng sản xuất sử dụng mẫu chuẩn nên sử dụng ống cho lần kiểm định Tính đồng công hiệu số phản ánh đồng vắc xin mẫu chuẩn phân liều đóng ống đông khô.Công hiệu ống đồng đều, tính đồng mẫu chuẩn cao Độ lệch chuẩn kết 42 161,75; CV 0,20% thấp, kết nằm khoảng Trung bình ±2SD chứng tỏ tính đồng trọng lƣợng khô RD6 đạt yêu cầu.Nhƣ vậy, công hiệu mẫu chuẩn RD6 đạt yêu cầu đƣợc xác định 921,05 IU/ống 3.3 DỰ ĐOÁN TUỔI THỌ CỦA VẮC XIN MẪU CHUẨN Tiến hành xác định công hiệu mẫu RD6 bảo quản 50°C / độ ẩm 75% khoảng thời gian tháng, tháng, tháng phƣơng pháp thử thách chuột lang Kết mẫu kiểm tra NICVB IVAC thu đƣợc nhƣ sau: Bảng3.5: Kết công hiệu RD6 (trên chuột lang) thời điểm ủ mẫu nhiệt độ 500C/ độ ẩm 75% STT Thời gian Công hiệu * ủ mẫu Trung bình kết NICVB IVAC (tháng) 921,05 856,21 905,05 2 760,48 799,37 779,04 3 755,8 740,56 748,12 651,44 628,56 639,06 *: trung bình nhân công hiệu tính chương trình Weighted Geometric Mean Sử dụng phần mềm SPSS tính toán giá trị P t-test Sig (2 tailed) = 0,789> 0,05: chứng tỏ khác biệt có ý nghĩa thống kê giá trị trung bình kết NICVB IVAC Chứng tỏ kết hai nơi khác biệt Từ kết ta thiết lập đƣợc phƣơng trình hồi quy tuyến tính biểu thị mối tƣơng quan thời gian bảo quản công hiệu nhƣ sau: 43 công hiệu (IU/ống) y = -45.51x + 896.9 R² = 0.958 1000 công hiệu (IU/ống) 500 0 Tháng Hình 3.8: Đồ thị biểu diễn phụ thuộc công hiệu bạch hầu RD6 bảo quản nhiệt độ 50°C theo tháng Phƣơng trình hồi quy thu đƣợc: Y= -45,514*X +896,93 R2= 0,9583: đạt yêu cầu tính hồi quy Dựa vào phƣơng trình hồi quy, ta tính đƣợc thời điểm mà đó, công hiệu còn 50%: X 460,5  896,93  9,369(tháng )  45,514 Tuổi thọ dự đoán điều kiện bảo quản - 20°C: C = k × X = 27× 9,369 = 1199,26 (tháng) tƣơng đƣơng 99,93năm Nhƣ với phƣơng pháp theo dõi điều kiện bảo quản lão hóa cấp tốc, ta xác định đƣợc tuổi thọ dự đoán mẫu nghiên cứu 99,93 năm Tuổi thọ dự đoán theo phƣơng pháp không phán ánh xác số tuổi thọ thực mẫu có chất sinh học nhƣng phản ánh tƣơng đối tuổi thọ mẫu nghiên cứu Kết cho thấy tuổi thọ dự đoán mẫu chuẩn RD6 cao Vắc xin bạch hầu mẫu chuẩn Quốc tế 07/216 đƣợc xác định tuổi thọ phƣơng pháp lão hóa cấp tốc, mẫu chuẩn Quốc tế có tuổi thọ 20 năm[43] Do từ kết kết luận mẫu chuẩn RD6 có tuổi thọ phù hợp yêu cầu đƣa 10 năm Tuy nhiên,sự biến đổi chất có chất sinh học phụ thuộc vào biến đổi nhiệt độ thấp so với chất có chất hóa học nên phƣơng pháp thúc đẩy nhiệt để dự đoán tuổi thọ vắc xin mẫu chuẩn có độ xác không cao Do phải tiếp tục giám sát công hiệu vắc xin mẫu chuẩn RD6 điều kiện bảo quản thƣờng (-200C) theo thời gian Việc chọn thời điểm giám sát dựa vào phân 44 tích xu hƣớng theo mốc thời gian định kỳ cụ thể Nghiên cứu chƣa xác định đƣợc giai đoạn mẫu chuẩn bắt đầu giảm công hiệu liên tục Đây giai đoạn quan trọng bƣớc vào giai đoạn độ ổn định công hiệu mẫu chuẩn thấp, không còn đủ tin cậy để đƣa vào thử nghiệm mẫu chuẩn phải hủy bỏ 45 KẾT LUẬN Các tiêu sau xuất xƣởng mẫu RD6 bao gồm: cảm quan, vô trùng, độ ẩm tồn dƣ, độ chân không, nhận dạng, công hiệu đạt yêu cầu, đó: độ ẩm tồn dƣ 1,69(%), độ chân không đạt 99,54%, công hiệu chuột lang 921,05 IU/ống Về tính đồng RD6: đạt yêu cầu với trọng lƣợng khô 0,04232 (g), CV 0,08528 %, công hiệu 921,05 IU/ống, CV (0,20%), kết nằm khoảng Trung bình ±2*SD Tuổi thọ vắc xin mẫu chuẩn 10 năm Đƣa đƣợc quy trình chuyển đổi đơn vị công hiệu từ chuột lang sang chuột nhắt với công hiệu chuột nhắt 798,29 IU/ống 46 KIẾN NGHỊ Tiếp tục giám sát công hiệu mẫu chuẩn RD6 theo thời gian điều kiện bảo quản thông thƣờng (-200C) Tham gia vào thiết lập mẫu chuẩn vùng (ASEAN) cho vắc xin bạch hầu mẫu chuẩn chƣa có mẫu chuẩn vùng vắc xin Việc thiết lập mẫu chuẩn vùng có ý nghĩa lớn kiểm định cho phép tiết kiệm đƣợc nhiều chi phí so với việc Quốc gia tự xây dựng mẫu chuẩn riêng Bên cạnh đó, việc thiết lập mẫu chuẩn vùng thƣờng cho kết xác có phối hợp nhiều phòng thí nghiệm 47 Tài Liệu Tham Khảo Tiếng Việt Trần Tử An (2005), Kiểm nghiệm dƣợc phẩm, Nhà xuất Y học, Phần 7, tr81-86 Lê Văn Hiệp (2006), Vắc xin học vấn đề bản, Nhà xuất Y học, phần 6, tr.123-128 Nguyễn Thị Kê cộng (1999), Nghiên cứu sản xuất vaccine mẫu chuẩn Quốc gia Bạch hầu- uốn ván - ho gà, tr 44,54,59 Dƣợc điển Việt Nam IV, (2009), Vắc xin bạch hầu hấp phụ, tr 653, 654, 334-336 Lê Văn Phủng cộng (2009), Vi khuẩ n Y ho ̣c , Nhà xuất giáo dục Viê ̣t Nam Phần 4, tr.106-108 Tiếng Anh Aggerbeck H, Heron I (1991), " Improvement of a Vero cell assay to determine diphtheria antitoxin content in sera.", Biologicals,pp 19,71 - 76 Aggerbeck H, Norgaaed –Pedersen, Heron I (1996), "Simultaneous quantitation of diphtheria and tetanus antibodies by single antigen, timeresolve flosurescense immunoassay", Journal of Immunological Methods 190, pp 170-183 Bryan Howard et al(2007), "The COST Manual of Laboratory Animal Care and Use, categories of animal model and their characteristis", pp 45-46 Kreeftenberg JG et al(1986), "A mouse model to estimate the potency of the diphtheria component in combined vaccines", Development of biological standardization 64, pp 21-24 10 Yenny et al (1993), "Standardizing the potency of Diphtheria in-house reference toxoid using serologycal method by neutralization test in Vero cell culture", p 10 11 Euroean Commision (2009), "Alternative testing strategies-progress report 2009, Replacing, reducing and rifining use of animal in research genomics 48 &biotechnology for health Luxenbourg: office for official Publication of the European Communities", EUR 23886 12 Edmunds WJ, Pebody RG, Aggerback H, Baron S, Berbers G, Conynvan 4)Spaendonck MA, Hallander HO, Olander R, Maple PA, Melker HE, Olin P, Fievret-Groyne F, Rota C, Salmaso S, Tischer A, vonHunolstein C and Miller E (2000), "The sero-epidemiology of diphtheria in Western Europe ESEN Project European Sero-Epidemiology Network.", Epidemiology and Infection 125 (1), pp 113 - 125 13 RIVM National Institute of public Health and the environment, (2000), Laboratory animal Husbandry in Vaccin Quality Control, 68-70 14 Galazka, AM (1993), "The Immunological Basis for Immunization Series, Module 2: Diphtheria.", World Health Organization 15 Hardy I, Dittman S and Sutter R (1996), "Current situation and control strategies for resurgence of diphtheria in newly independent states of the former Soviet Union", The Lancet 347, pp 1739 - 1744 16 Immunization, WHO Department of (2006), "Temperature sensitivity of vaccines", Vaccines andBiologicals 17 JF Carpenter , JH Crowe, T Arakawa (1990), "Comparison of solute-induced proteinstabilisation in aqueous solution and in frozen and freeze-dried state", J DairySci 73, pp 3627-36 18 Kreeftenberg JG, van der Gun JW, Marsman FR, Sekhius VM, Bhandari SR and Maheswari SC (1985), "An investigation of a mouse model to estimate the potency of the diphtheria component in combined vaccines", Journal of Biological Standardization 13 (3), pp 229 - 234 19 Manual for quality control of Diphtheria, Tetanus and Pertussis vaccines (2013), pp 147-155 20 Maple PA, Efstratiou A, George RC, Andrews NJ and Sesardic D (1995), "Diphtheria immunity in UK blood donors", The Lancet 345, pp 963 - 965 49 21 Matejtschuk P, Rafiq , Johnes S, Gaines Das R (2005), "A comparison of vialswith ampoules for the storage of biological reference materials", Biologicals 33, pp 63-70 22 Pikal, MJ (1990), " Freeze drying of proteins Part II Formulation selection", Biopharm 3(9), pp 26-30 23 R Winsnes, D Sesardic, A Daas, M-E Behr-Gross (2006), "Collaborative study for thevalidation of serological methods for potency testing of diphtheria toxoid vaccine(part 2)", Pharmeuropa Bio 1, p 73 24 Redhead K, Gaines Das R (1991), "A collaborative assay of the proposed Third British reference preparation for Pertussis vaccine and the relative potencies of the second International Standard and the second British Reference Preparation for Pertussis Vaccine ", Biologicals 19, pp 107 111 25 Sesardic D, Prior C, Daas A and Buchheit KH (2003), "Collaborative study for establishment of the European Pharmacopoeia BRP Batch for Diphtheria Toxin.", Pharmeuropa Bio 1, pp - 21 26 Sesardic D, Winsnes R, Rigsby P and Gaines-Das, R (2001), "Calibration of replacement International Standard and European Pharmacopoeia Biological Reference Preparation for Diphtheria Toxoid, Adsorbed", Biologicals 29, pp 107 - 122 27 Wang, W (2000), "Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals", Int J Pharm 203, pp 1-60 28 WHO (1990), "Annex 2: requirements for Diphtheria, Tetanus, Pertussis and combined vaccines" No.800, p p13 29 WHO (1995), "Manual of laboratory methods for potency testing of vaccines used in the WHO Expanded programme on Immunization", pp 198-206 30 WHO (1998), "Requirements for yellow fever vaccine (Requirments for Biological Substances No 3, revised 1995)", WHO Technical Report 872, pp 30-68 50 31 WHO (2003), "Recommendation for Diphtheria, Tetanus, Pertussis and Combined Vaccines annex 5", p 32 WHO (2006), "Annex 2: Recommendation for the preparation, characterzation and establishment of international and other Biological reference standards Part A" No 932 33 WHO (2013), Manual for quality control of Diphtheria, Tetanus and Pertussis vaccines 12-14 34 WHO (2013), Manual for quality control of Diphtheria, Tetanus and Pertussis vaccines 15 35 WHO (2013), Manual for the establishment of national and other secondary standards for vaccines, Vol Vii,Viii WHO/IBV/11.03 36 Xing D , Gaines Das R, Newland M, Corbel (2001), "Third International Standard for activity of pertussis vaccine:International Confirmation Study of British Standard for pertussis vaccine,coded 66/303", Biologicals 29, pp 133 – 136 51 ... dụng Vắc xin bạch hầu đông khô RD6 dự tuyểnmẫu chuẩn Quốc gia với mục tiêu sau: Xây dựng quy trình chuẩn định chất lượng Vắc xin mẫu chuẩn Quốc gia Bạch hầu đông khô để làm thước đo đánh giá, ...TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - ĐỖ KHÁNH LINH ĐÁNH GIÁ TÍNH KHẢ DỤNG CỦA VẮC XIN BẠCH HẦU ĐÔNG KHÔ RD6 DỰ TUYỂN MẪU CHUẨN QUỐC GIA Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60420107 LUẬN... kiểm định chất lƣợng Còn với mẫu chuẩn Quốc gia chấp nhận việc hợp tác phạm vi Quốc gia. [8] 1.3.4 Vắc xin bạch hầu mẫu chuẩn quốc tế Vắc xin Bạch hầu mẫu chuẩn Quốc tế lần thứ sản xuất năm 1955