Đánh giá tính khả dụng của vắc xin bạch hầu đông khô RD6 dự tuyển mẫu chuẩn Quốc gia (Tài liệu là bản tóm tắt )

Header Page of 126 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - ĐỖ KHÁNH LINH ĐÁNH GIÁ TÍNH KHẢ DỤNG CỦA VẮC XIN BẠCH HẦU ĐÔNG KHÔ RD6 DỰ TUYỂN MẪU CHUẨN QUỐC GIA LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2016 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI Footer Page of 126 Header Page of 126 TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - ĐỖ KHÁNH LINH ĐÁNH GIÁ TÍNH KHẢ DỤNG CỦA VẮC XIN BẠCH HẦU ĐÔNG KHÔ RD6 DỰ TUYỂN MẪU CHUẨN QUỐC GIA Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60420107 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS PHẠM VĂN HÙNG TS TRẦN THỊ THANH HUYỀN Hà Nội – 2016 Footer Page of 126 Header Page of 126 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, nhận giúp đỡ nhiệt tình nhiều người Lời đầu tiên, xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới TS Phạm Văn Hùng, Phó Viện trưởng Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin Sinh phẩm Y tế, TS Trần Thị Thanh Huyền, Bộ môn Vi sinh vật học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên ĐHQG Hà Nội, người thầy tận tình hướng dẫn suốt trình thực đề tài luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo, cán môn Vi sinh vật học khoa Sinh học trường Đại học Khoa học Tự nhiên Đại học Quốc gia Hà Nội có nhiều dẫn giúp đỡ suốt trình học tập Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin Sinh phẩm Y tế tài trợ kinh phí để thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn TS.Trần Văn Bé, Viện trưởng Viện vắc xin Sinh phẩm Y tế tạo điều kiện vềphòng thí nghiệm cung cấp lượng lớn động vật thí nghiệm giúp hoàn thành luận văn Để hoàn thành luận văn, nhận giúp đỡ quý báu bạn đồng nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn TS Trần Lan Phương, CN.Nguyễn Lan Anh, anh chị đồng nghiệp phòng QC,Viện vắc xin Sinh phẩm Y tếvà Ths Lê Thị Hoàng Yến, CN Nguyễn Phương Liên anh chị đồng nghiệp Khoa Vi khuẩn – Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin Sinh phẩm Y tế giúp đỡ suốt trình thực đề tài Cuối cùng, vô biết ơn gia đình, bạn bè giúp đỡ động viên suốt trình học tập thực đề tài Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Học Viên Đỗ Khánh Linh Footer Page of 126 Header Page of 126 MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1.VI KHUẨN BẠCH HẦU VÀ BỆNH BẠCH HẦU 1.1.1 Những nét chung vi khuẩn bạch hầu 1.1.2Độc tố bạch hầu 1.1.3 Bệnh sinh .4 1.1.4 Dịch tễ học 1.2VẮC XIN BẠCH HẦU 1.3MẪU CHUẨN 1.3.1Về thuật ngữ 1.3.2 Về phƣơng pháp điều chế .9 1.3.3Tiêu chuẩn chất lƣợng 11 1.3.4Vắc xin bạch hầu mẫu chuẩn quốc tế 13 1.3.5Vắc xin bạch hầu mẫu chuẩn Quốc gia 14 1.4YÊU CẦU ĐỐI VỚI VIỆC CHUẨN ĐỊNH MẪU CHUẨN QUỐC GIA 16 1.5 ĐỘNG VẬT DÙNG TRONG KIỂM ĐỊNH VẮC XIN BẠCH HẦU 17 1.6PHƢƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ CÔNG HIỆU BẠCH HẦU .19 1.6.1Phƣơng pháp thử thách chuột lang 20 1.6.2 Phƣơng pháp chuẩn độ kháng thể chuột nhắt 21 1.7ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA VẮC XIN MẪU CHUẨN 23 1.7.1Đánh giá độ ổn định dài hạn (Long- term Stability Studies) .23 1.7.2Đánh giá độ ổn định cấp tốc (Accelerated Stability Testing) 23 1.7.2.1 Điều kiện tiến hành phƣơng pháp cấp tốc 23 1.7.3 Dự đoán tuổi thọ sản phẩm theo nguyên lý Vant-Hoff [1, 16] 23 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG,VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU Error! Bookmark not defined 2.2.Vật liệu nghiên cứu – trang thiết bị sinh phẩm vật tƣ tiêu hao Error! Bookmark not defined 2.2.1.Động vật thí nghiệm Error! Bookmark not defined Footer Page of 126 Header Page of 126 2.2.2.Sinh phẩm –hóa chất Error! Bookmark not defined 2.2.3.Vật tƣ trang thiết bị Error! Bookmark not defined 2.3.THIẾT KẾ NGHIÊN CỨU Error! Bookmark not defined 2.4.THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU Error! Bookmark not defined 2.5.CỠ MẪU NGHIÊN CỨU Error! Bookmark not defined 2.6.PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Error! Bookmark not defined 2.6.1 Đánh giá cảm quan Error! Bookmark not defined 2.6.2Đánh giá vô trùng Error! Bookmark not defined 2.6.3Đánh giá đô ̣ ẩ m tồ n dƣ Error! Bookmark not defined 2.6.4Đánh giá đô ̣ chân không Error! Bookmark not defined 2.6.5Đánh giá nhận dạng Error! Bookmark not defined 2.6.6 Đánh giá tính đồng khối lƣợng Error! Bookmark not defined 2.6.7Đánh giá công hiệu tin ́ h đồ ng nhấ t công hiệuError! Bookmark not defined 2.6.8Dƣ̣ đoán ̣n dùng của vắ c xin mẫu chuẩ n Error! Bookmark not defined CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Error! Bookmark not defined 3.1 ĐÁNH GIÁ CÁC CHỈ TIÊU SAU XUẤT XƢỞNGError! Bookmark not defined 3.1.1 Đánh giá cảm quan Error! Bookmark not defined 3.1.2 Đánh giá tiêu vô trùng Error! Bookmark not defined 3.1.3 Đánh giá độ chân không Error! Bookmark not defined 3.1.4 Đánh giá độ ẩm tồn dƣ Error! Bookmark not defined 3.1.5 Đánh giá nhận dạng Error! Bookmark not defined 3.2 ĐÁNH GIÁ TÍNH ĐỒNG NHẤT Error! Bookmark not defined 3.2.1 Đánh giá tính đồng trọng lƣợng khôError! Bookmark not defined 3.2.2 Đánh giá tính đồng công hiệu Error! Bookmark not defined 3.3DỰ ĐOÁN TUỔI THỌ CỦA VẮC XIN MẪU CHUẨNError! Bookmark not defined KẾT LUẬN Error! Bookmark not defined KIẾN NGHỊ Error! Bookmark not defined Footer Page of 126 Header Page of 126 Tài Liệu Tham Khảo .25 Footer Page of 126 Header Page of 126 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang 1.1 Hình ảnh vi khuẩn bạch hầu 1.2 Cấu trúc độc tố bạch hầu 1.3 Màng giả hầu họng độc tố bạch hầu 1.4 Nhãn vắc xin Bạch hầu mẫu chuẩn Quốc tế lần thứ tƣ 11 2.1 Sơ đồ nhỏ mẫu phƣơng pháp nhận dạng bạch hầu 29 3.1 Sự nguyên vẹn ống mẫu RD6 34 3.2 3.3 Đồ thị biểu diễn độ chụm kết độ ẩm tồn dƣ mẫu RD6 Kết nhận dạng thành phần bạch hầu mẫu RD6 37 38 Biểu đồ biểu thị trọng lƣợng khô mẫu RD6 thực NICVB 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 IVAC Đồ thị biểu diễn độ chụm kết trọng lƣợng khô mẫu RD6 Biểu đồ biểu thị kết công hiệu RD6 thực NICVB IVAC Đồ thị biểu diễn độ chụm kết công hiệu mẫu RD6 Đồ thị biểu diễn Sự phụ thuộc công hiệu bạch hầu RD6 bảo quản nhiệt độ 500C theo tháng Footer Page of 126 39 40 41 42 44 Header Page of 126 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên Bảng Trang 2.1 Công thức pha loãng vắc xin 31 2.2 Công thức pha mẫu RD6 pha loãng 34 3.1 Kết kiểm tra cảm quan mẫu chuẩn RD6 NICVB IVAC 35 3.2 Kết kiểm tra vô trùng NICVB IVAC 36 3.3 Kết kiểm tra chân không mẫu chuẩn RD6 36 3.4 Kết độ ẩm tồn dư thực NICVB IVAC 37 3.5 Kết công hiệu RD6 (trên chuột lang) thời điểm ủ mẫu nhiệt độ 500C/ độ ẩm 75% 43 Footer Page of 126 Header Page of 126 DANH MỤC CHƢ̃ VIẾT TẮT STT Chƣ̃ viế t tắ t Chú giải ATCC American Type Culture Collection (Ngân hàng chủng chuẩn Hoa Kỳ) ĐTBH Độc tố bạch hầu DTP Diphtheria- Tetanus- Pertussis (Bạch hầu –Uốn ván – Ho gà ) ED50 Effective dose (Liều bảo vệ 50% động vật thí nghiệm) IU International Unit (Đơn vị quốc tế) KĐTBH Kháng độc tố bạch hầu LD50 Lethal dose 50 (Liều gây chết 50 % động vật thí nghiệm sau 96 giờ) Lf Limes flocculation: Đơn vị lên quốc tế MCQG Mẫu chuẩn quốc gia 10 MCQT Mẫu chuẩn quốc tế 11 NIBSC National Institute for Biological Standards and Control (Viện Quốc gia Sinh phẩm chuẩn chuẩn sinh học) 12 NICVB National Instistute for Control of Vaccines and Biologicals (Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin Sinh phẩm y tế) 13 NMSL Nƣớc muối sinh lý 14 SSI Staten Serum institiute (Viện huyết quốc gia Đan Mạch) 15 IVAC Institute of vaccine and biological (Viện vắc xin chế phẩm sinh học) Footer Page of 126 Header Page 10 of 126 MỞ ĐẦU Bạch hầu bệnh nhiễm khuẩn , nhiễm đô ̣c vi khuẩ n Gram (+) Corynebacterium diphtheriae gây Bê ̣nh ba ̣ch hầ u đã gây nhiề u vu ̣ dich ̣ lớn và nguy hiể m ở nhiề u quố c gia thế giới Và sử dụng vắc xin biện pháp quan tro ̣ng nh ất để phòng bệnh bạch hầu Chấ t lƣơ ̣ng vắ c xin ba ̣ch hầ u đƣ ợc đánh giá qua tiêu chí: an toàn hiệu Thƣ̉ nghiê ̣m kiể m tra công hiê ̣ u là thƣ̉ nghiê ̣m cầ n thiế t đ ể đánh giá hiệu vắc xin Thƣ̉ nghiê m ̣ này cầ n có mẫu chuẩ n công hiê ̣u của vắ c xin mẫu thƣ̉ đƣơ ̣c xác đinh ̣ qua so sánh tƣơng quan với vắ c xin mẫu chuẩ n đã biế t trƣớc giá tri ̣công hiê ̣u Để thống kết kiểm định vắc xin bạch hầu toàn giới, Tổ chƣ́c y tế thế giới (WHO) đã thiết lập mẫu chuẩ n ba ̣ch hầ u quố c tế , NIBSC sản xuất sử dụng mẫ u chuẩ n lầ n th ứ tƣ với hàm lƣợng 213 IU/ống Do số lƣợng mẫu chuẩn Quốc tế có hạn nên WHO khuyến cáo quốc gia nên có mẫu chuẩn địa phƣơng cho kiểm định từng lô vắc xin vắc xin DTP sản xuất nƣớc nhiề u nƣớc để phu ̣c vu ̣ nhu cầ u [40] Ở Việt Nam , , còn nhập vắc xin DTP phòng bệnh của nhân dân , đó viê ̣c kiể m tra công hiê ̣u thành phầ n ba ̣ch hầ u có tầ n suấ t khá lớn Nhà sản xuất cần vắ c xin mẫu chuẩ n quố c gia đ ể kiểm định công hiệu vắc xin trình sản xuất, còn Viện kiểm định Quốc gia Vắc xin Sinh phẩm y tế cần mẫu chuẩn Quốc gia để kiểm định vắc xin xuấ t xƣởng và đăng ký Hiê ̣n , chƣa có vắ c xin m ẫu chuẩn quốc gia bạch h ầu, thêm vào mẫu chuẩn Quốc tế có đơn vị chuột lang Vì vậy, mẫu chuẩn Quốc gia đƣợc thiết lập nối chuẩn với MCQT theo đơn vị miễn dịch chuột lang Phƣơng pháp có chi phí tốn khả có đƣợc lƣợng chuột lang lớn để làm thƣờng quy không khả thi với nhiều phòng thí nghiệm Do vậy, việc chuyển đổi sang phƣơng pháp dùng chuột nhắt sử dụng đơn vị chuột nhắt cần thiết Việc chuyển đổi đƣợc thực từng Quốc gia Song chƣa có phòng thí nghiệm công bố Tƣ̀ nhƣ̃ng lý đó Viê ̣n kiể m đinh ̣ Quố c gia Vắ c Footer Page 10 of 126 Header Page 23 of 126 70 Lf giải độc tố bạch hầu, mg Al+++, 10 mg trehalose ống, đạt công hiệu 160 IU/ống Mẫu chuẩn đƣợc mã hóa 98/560.[8] Vắc xin mẫu chuẩn bạch hầu Quốc tế lần thứ tƣ (4th WHO International Standard for Diphtheria Toxoid, Adsorbed) đƣợc tuyển chọn từ hai vắc xin dự tuyển công ty Sanofi Pasteur (Pháp) công ty Biken (Nhật Bản) sản xuất.Mẫu chuẩn đƣợc kiểm tra tiêu nhƣ: Cảm quan, độ ẩm tồn dƣ, độ vô trùng, chân không, trọng lƣợng khô, công hiệu Riêng với thử nghiệm công hiệu, NIBSC tiến hành hợp tác với 30 phòng thí nghiệm 20 quốc gia giới kiểm tra Kết vắc xin mẫu chuẩn dự tuyển Biken với mã số 07/216, công hiệu đạt 213 IU/ống (theo phƣơng pháp thử thách chuột lang) đƣợc lựa chọn Năm 2014, WHO công bố giá trị công hiệu đƣợc xác định phƣơng pháp thử thách chuột lang mẫu chuẩn Quốc gia nối chuẩn phải sử dụng phƣơng pháp Mẫu chuẩn chƣa có đơn vị Quốc tế phƣơng pháp miễn dịch chuột nhắt[8] Đây khó khăn lớn cho Quốc gia cần chuẩn định mẫu chuẩn Quốc gia phƣơng pháp thử thách chuột lang đòi hỏi lƣợng chuột lang lớn (ít 72 chuột/ lần) Không phải phòng thí nghiệm có đƣợc lƣợng chuột lang nhiều nhƣ thời điểm Hơn chuột lang giá đắt khiến giá thành phƣơng pháp cao 1.3.5 Vắc xin bạch hầu mẫu chuẩn Quốc gia Vắc xin bạch hầu mẫu chuẩn Quốc gia (Việt Nam) loại chuẩn thứ cấp (Secondary reference standards), đƣợc sử dụng làm chất chuẩn thử nghiệm công hiệu bạch hầu NICVB nhà sản xuất nƣớc Năm 1991, viện Vắc xin (IVAC) phối hợp Cencobi tiến hành sản xuất vắc xin bạch hầu mẫu chuẩn Quốc gia Vắc xin mẫu chuẩn đƣợc sản xuất dƣới dạng lỏng, cho công hiệu 300 IU/ml nhƣng bị giảm công hiệu nhanh Chỉ sau ba năm công hiệu giảm gần nhƣ không Năm 1999, GS.Nguyễn Thị Kê cộng sản xuất vắc xin bạch hầu mẫu chuẩn Quốc gia theo công thức: Trong ml vắc xin mẫu chuẩn bạch hầu: 14 Footer Page 23 of 126 Header Page 24 of 126 - 60 Lf giải độc tố bạch hầu - AlPO4 6mg - NaCl: 0.09 g - Merthiolate: 100 µg - Dung dịch Dextran 3% (cho dạng đông khô) Kết quả: Mẫu chuẩn đông khô mã số RD4 đạt công hiệu 172 IU/ống (đơn vị chuột nhắt) 340 IU/ống (đơn vị chuột lang) Mẫu chuẩn dạng nƣớc mã số RD5 đạt công hiệu 173 IU/ml [3] Tuy nhiên, mẫu chuẩn dạng nƣớc giảm công hiệu nhanh sau đó, còn dƣới 30 IU/ml không đƣợc sử dụng Mẫu chuẩn đông khô có công hiệu chƣa cao nên cần dùng tới bốn ống mẫu chuẩn cho lần kiểm định dẫn đến kết chƣa đầy hai năm hết Năm 2006, NICVB phối hợp với IVAC tiếp tục sản xuất vắc xin bạch hầu mẫu chuẩn Quốc gia theo công thức: Trong ml vắc xin mẫu chuẩn bạch hầu: - 50 Lf giải độc tố bạch hầu - AlPO4: mg - NaCl: mg - Merthiolate: 100 µg Mẫu chuẩn đạt công hiệu thấp, 35,3 IU/ống nên không đạt yêu cầu sử dụng làm mẫu chuẩn Đứng trƣớc nhu cầu cần có mẫu chuẩn để phục vụ kiểm định thƣờng quy mẫu vắc xin bạch hầu nƣớc nƣớc NICVB, nhà sản xuất, phối hợp với IVAC tiếp tục sản xuất vắc xin bạch hầu mẫu chuẩn Quốc gia Mục tiêu sản xuất mẫu chuẩn bạch hầu có công hiệu cao (trên 500 IU/ml) để dùng ống mẫu chuẩn cho lần kiểm định Mẫu chuẩn phải có ổn định công hiệu đáp ứng nhu cầu sử dụng thời gian dài (ít năm năm) có đáp ứng chuột nhắt để chuyển đổi sang đơn vị chuột nhắt 15 Footer Page 24 of 126 Header Page 25 of 126 Vắc xin bạch hầu vắc xin giải độc tố nên giá trị công hiệu thu đƣợc phụ thuộcvào hàm lƣợng kháng nguyên tá chất đƣa vào Thành phần ho gà vắc xin DTP phối hợp giúp tăng công hiệu bạch hầu uốn ván.Do đó, vi khuẩn ho gà đƣợc thêm vào mẫu chuẩn RD6 nhƣ tá chất tăng hoạt tính so với nghiên cứu trƣớc Ngoài ra, hàm lƣợng kháng nguyên bạch hầu mẫu RD6 tăng lên 90 Lf/ml Số lƣợng mẫu sản xuất 2370 ống vắc xin bạch hầu đông khô.Nhiệt độ bảo quản: -200C 1.4 YÊU CẦU ĐỐI VỚI VIỆC CHUẨN ĐỊNH MẪU CHUẨN QUỐC GIA Việc kiểm định thực bắt đầu từ nguyên liệu đầu nhƣ: chủng gốc, chủng sản xuất, nƣớc, hóa chất pha môi trƣờng, lọ, nắp nhãn… Trong trình sản xuất việc giám sát kiểm định chất lƣợng phải thực thƣờng xuyên, theo SOP Trong phòng thí nghiệm, việc kiểm định chất lƣợng vắc xin dựa tiêu chí sau đây:  Cảm quan:  Kiểm tra chân không  Tính đồng trọng lƣợng khô  Vô khuẩn  Nhận dạng  Độ ẩm tồn dƣ  Công hiệu bạch hầu Nghiên cứu trƣớc GS Kê cộng việc chuẩn định Mẫu chuẩn bạch hầu Quốc gia RD4 có kiểm tra thử nghiệm trên, nhƣng chƣa có kết phòng thí nghiệm khác nên nghiên cứu sử dụng hai phòng thí nghiệm khoa KĐVX Vi khuẩn (NICVB) phòng QC(IVAC) làm thử nghiệm song song Điều phù hợp với khuyến cáo WHO có sử dụng kết phòng thí nghiệm khác việc chuẩn định Mẫu chuẩn Quốc gia [3] 16 Footer Page 25 of 126 Header Page 26 of 126 1.5 ĐỘNG VẬT DÙNG TRONG KIỂM ĐỊNH VẮC XIN BẠCH HẦU Chuột nhắt chuột lang loài động vật đƣợc dùng phổ biến nghiên cứu y sinh học có sản xuất kiểm định vắc xin Đặc biệt, kiểm định chất lƣợng vắc xin DTP hai loài đƣợc sử dụng thử nghiệm quan trọng an toàn, công hiệu.Trong phép thử xác định công hiệu vắc xin, phƣơng pháp thử thách động vật thí nghiệm thƣờng cho kết xác Phƣơng pháp thử thách động vật gây miễn dịch cho động vật kháng nguyên, sử dụng độc tố gây bệnh vi sinh vật gây bệnh cho động vật miễn dịch Xem đáp ứng động vật theo tỷ lệ sống/ chết mức độ liệt để đánh giá Chuột lang có nguồn gốc từ núi Andes Nam Mỹ, từ Colombia Venezuela xuống Brazil Argentina Lần chuột lang đƣợc sử dụng nhƣ động vật thí nghiệm vào đầu kỷ 19 Chuột lang thuộc Rodentia, tiểu Hystricomorpha, họ Caviidae Chuột lang có ba loại lông ngắn: English, lông xù xì với đốm hình hồng: Abyssian lông dài: Peruvian Chuột lang lông ngắn hầu hết đƣợc dùng nghiên cứu y sinh học chiếm 2-3% tất động vật thí nghiệm sử dụng Trong nghiên cứu này, sử dụng chuột English, IVAC cung cấp Chuột lang loài động vật phổ biến thứ tƣ (sau chuột nhắt, chuột Na Uy thỏ) Mặc dù theo xu hƣớng chung giảm số lƣợng động vật nghiên cứu năm gần nhƣng chuột lang động vật thí nghiệm quan trọng đặc điểm độc đáo không tìm thấy loài gặm nhấm khác Chuột lang loài động vật thí nghiệm gặm nhấm hãn nhất, lịch sử hóa lâu đời Nên nghiên cứu sinh hóa, miễn dịch học, sinh lý học dƣợc học thƣờng đƣợc tiến hành đối tƣợng Chúng đƣợc sử dụng chủ yếu cho sản xuất kiểm soát huyết thanh, kiểm định chất lƣợng vắc xin chế phẩm sinh học Chuột lang dễ gây mẫn cảm, cách tiêm nhắc lại phản ứng mẫn Điều đƣợc thực để nghiên cứu phản ứng mẫn chậm nhƣ đáp ứng miễn dịch tƣơng tự nhƣ đáp ứng miễn dịch ngƣời Ngoài ra, chuột lang vật chủ phù hợp cho số bệnh vi khuẩn gây ra, chúng nhạy cảm với số bệnh lây nhiễm nhƣ lao, bạch hầu…Đặc biệt chuột 17 Footer Page 26 of 126 Header Page 27 of 126 lang nhạy cảm với độc tố bạch hầu Đây đặc tính quan trọng giúp cho chuột lang loài động vật đƣợc nhiều phòng thí nghiệm có uy tín ƣu tiên sử dụng cho thử nghiệm xác định công hiệu bạch hầu phƣơng pháp thử thách chuột lang cho kết xác Tuy nhiên, chuột lang đẻ 2-5 lần sinh năm đẻ khoảng 3,7 lần, lại có trọng lƣợng lớn (chuột trƣởng thành khoảng 800g – 1200g)nên so với chuột nhắt chuột lang có giá thành đắt nhiều cần diện tích lớn việc nuôi dƣỡng nhƣ làm thí nghiệm Đây khó khăn lớn cho nƣớc phát triển làm thử nghiệm công hiêu bạch hầu chuột lang, số lƣợng chuột cho lần làm thử nghiệm 72 chuột Không phải phòng thí nghiệm có khả có nuôi đƣợc số lƣợng lớn chuột cho thử nghiệm Ở Việt Nam có Viện Vắc xin Sinh phẩm Y tế (IVAC) cung cấp đƣợc số lƣợng chuột lang đáp ứng đƣợc nhu cầu [13] Chuột nhắt loài động vật đƣợc sử dụng phổ biến nghiên cứu y sinh Nó thuộc Rodentia, họ Muridae, loài Mus[8] Ít khoảng 1000 chủng chuột nhắt khác đƣợc sử dụng phòng thí nghiệm Chuột nhắt có hai loại chuột chủng (in-bred) : chuột BALBc không chủng (out-bred) Dù sử dụng chuột chủng cho kết đồng hơn, nhiên đa dạng di truyền chúng có giới hạn, chúng lại nhạy cảm với ảnh hƣởng môi trƣờng Bên cạnh đó, phép ngoại suy với ngƣời dễ thử nghiệm sử dụng chuột không chủng Thêm vào đó, chuột chủng có giá thành đắt chuột không chủng nhiều Nên hầu hết chủng chuột sử dụng cho kiểm định vắc xin chuột không chủng [33] Trong chuột Swiss loài đƣợc sử dụng tƣơng đối rộng rãi Chuột Swiss trắng (Lynch 1969) có nguồn gốc từ nhóm chuột nhỏ (02 đực 07 cái)đƣợc đƣa từ Trung tâm Anticancéreux Romand de Lausance (Switzerland) đến Viện Rockerfeller, New York vào năm 1962 Sau Viện nhân đàn cung cấp rộng rãi toàn giới [8, 11] NICVB IVAC trì chuột phục vụ cho làm thí nghiệm Viện Tuy nhiên, chuột nhắt lại không nhạy cảm với độc tố bạch hầu nên thử nghiệm công hiệu bạch hầu phƣơng pháp 18 Footer Page 27 of 126 Header Page 28 of 126 thử thách không áp dụng đƣợc Thay vào đó, năm 1974, Miyamura K cộng tiến hành phƣơng pháp chuẩn độ kháng thể chuột nhắt sau tiêm vắc xin bạch hầu thông qua việc sử dụng tế bào Vero Tế bào Vero dòng tế bào nhạy cảm với độc tố bạch hầu, có khả chiếm đƣợc số lƣợng lớn receptor độc tố So với chuột lang, chuột nhắt có kích thƣớc nhỏ (< 50g/chuột), số lƣợng lần đẻ cao (4-12 chuột/ lứa), số lần đẻ năm cao (khoảng lứa/ năm) nên phƣơng pháp cho giá thành rẻ tính khả thi cao so với phƣơng pháp dùng chuột lang, với nƣớc phát triển nhƣ Việt Nam Nhìn chung, với thử nghiệm động vật,đáp ứng quan sát định lƣợng đƣợc dựa biểu “dƣơng tính’ hay “âm tính”, “sống” hay “chết” Một số đáp ứng sinh lý đặc biệt xác định đƣợc nhƣ thay đổi nhiệt độ, mức độ sản xuất kháng thể, tăng giảm trọng lƣợng Khác với thử nghiệm hóa lý, thƣờng có độ xác cao, thử nghiệm sinh học động vật thí nghiệm xác định hoạt tính sinh học với tính đặc hiệu độ nhạy cao nhƣng lại cho kết với độ xác thấp độ biến thiên lớn tức độ tái lặp thấp Đặc biệt với thử nghiệm công hiệu, độ dao động 95% khoảng tin cậy phụ thuộc vào độ dao động đáp ứng động vật với động vật phạm vi có độ dao động lớn Theo thống kê, Châu Âu có khoảng 37% thử nghiệm công hiệu bạch hầu phải tiến hành lại kết không đáp ứng đƣợc tiêu chuẩn thử nghiệm có giá trị [34] Nhƣ để thấy thử nghiệm động vật thí nghiệm gặp nhiều khó khăn 1.6 PHƢƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ CÔNG HIỆU BẠCH HẦU WHO TRS nhƣ Dƣợc điển châu Âu, Dƣợc điển Việt Nam khuyến cáo công hiệu bạch hầu cần đƣợc kiểm tra tất lô vắc xin sản xuất Công hiệu vắc xin nhà sản xuất đƣợc kiểm định việc so sánh với vắc xin mẫu chuẩn Quốc gia (secondary reference standards) đƣợc tính theo đơn vị IU.Có hai phƣơng pháp kiểm tra công hiệu bạch hầu đƣợc sử dụng phổ biến phƣơng pháp thử thách chuột lang (sau xin gọi 19 Footer Page 28 of 126 Header Page 29 of 126 phương pháp chuột lang đơn vị công hiệu thu từ phương pháp gọi đơn vị chuột lang) phƣơng pháp chuẩn độ kháng thể chuột nhắt tế bào Vero (sau xin gọi phương pháp chuột nhắt đơn vị công hiệu thu từ phương pháp gọi đơn vị chuột nhắt) Theo khuyến cáo WHO, vắc xin bạch hầu mẫu chuẩn quốc tế đƣợc xác định công hiệu phƣơng pháp thử thách chuột lang nên chuẩn định mẫu chuẩn Quốc gia phải sử dụng phƣơng pháp cho thử nghiệm công hiệu[30, 35].Sau phòng thí nghiệm tiến hành chuyển đổi sang đơn vị chuột nhắt để sử dụng thử nghiệm thƣờng quy (nếu phù hợp) 1.6.1 Phƣơng pháp thử thách chuột lang Mối liên hệ phƣơng pháp với đáp ứng nồng độ kháng thể ngƣời đƣợc nghiên cứubởi Greenberg từ năm 1953 Theo đó, lƣợng giải độc tố đƣa vào tỷ lệ thuận với đáp ứng nồng độ kháng thể trẻ nhỏ Do chuột lang có độ nhạy cao với độc tố bạch hầu nên phƣơng pháp đƣợc coi tiêu chuẩn vàng kiểm tra công hiệu bạch hầu [9] Nguyên lý: Đƣa giải độc tố bạch hầu (protein) vào thể chuột lang (kháng nguyên) Cơ quan miễn dịch chuột lang sinh kháng thể, kháng thể có khả trung hoà độc tố bạch hầu đƣa vào sau Mức độ trung hòa tỷ lệ thuận (đến giới hạn định không ngƣỡng tê liệt miễn dịch) với lƣợng giải độc tố đƣa vào Đánh giá mức độ trung hòa đáp ứng chuột theo cấp độ nhiễm độc từ nhẹ đến nặng nhƣ: thăng bằng, liệt, chết Tỷ lệ sống/ chết thƣớc đo công hiệu vắc xin Kỹ thuật: Chuột lang đƣợc tiêm miễn dịch (chứa giải độc tố bạch hầu) với mẫu vắc xin chuẩn (đã biết công hiệu) mẫu vắc xin thử (chƣa biết công hiệu) khoảng nồng độ khác Sau khoảng thời gian tuần thứ 4-6 sau tiêm miễn dịch, toàn chuột đƣợc tiêm thử thách với khoảng 50 liều LD50 độc tố bạch hầu Theo dõi động vật 5-7 ngày ghi lại tỷ lệ sống chết độ pha[28][13] 20 Footer Page 29 of 126 Header Page 30 of 126 Tính kết biện luận:Kết đƣợc tính theo chƣơng trình Probit analysis Đây chƣơng trình tính kết cho phép thử định lƣợng (xác định công hiệu) vắc xin theo phƣơng pháp tiêm thử thách đƣờng tiêm dƣới da Dữ liệu đƣa vào tính kết tỷ lệ sống/chết động vật độ pha loãng mẫu chuẩn mẫu thử Trong phép tính toán này, liều biến đổi theo hàm logarit liều, tỷ lệ đáp ứng quan sát đƣợc biến đổi theo mô hình probit So sánh tƣơng quan mẫu chuẩn mẫu thử để tính kết công hiệu mẫu thử theo mẫu chuẩn[28] Theo để thử nghiệm có giá trị phải đáp ứng tiêu chuẩn sau: ED50 loạt vắ c xin ph ải nằm liều miễn dịch nhỏ lớn nhất.Đáp ứng chuột độ pha loãng phải đạt đƣợc tính tuyến tính theo hàm logarit probit Ƣu điểm phƣơng pháp thử thách chuột lang cho kết có độ xác cao Phƣơng pháp đƣợc sử dụng để xác định công hiệu Mẫu chuẩn bạch hầu Quốc tế lần thứ tƣ[19, 29] Nhƣ đề cập, nhƣợc điểm phƣơng pháp sử dụng nhiều chuột lang, tốn 1.6.2 Phƣơng pháp chuẩn độ kháng thể chuột nhắt Hàm lƣợng kháng độc tố huyết động vật (chuột nhắt chuột lang) đƣợc miễn dịch vắc xin đƣợc chuẩn độ phản ứng Schick (phản ứng trung hòa da) nuôi cấy tế bào Vero, phản ứng ngƣng kết thụ động Nguyên lý phƣơng pháp: Do chuột nhắt không nhạy cảm với độc tố bạch hầu nên sử dụng phƣơng pháp thử thách chuột nhắt với thử nghiệm công hiệu bạch hầu Tế bào Vero dòng tế bào nhạy cảm với độc tố bạch hầu, có khả chiếm đƣợc số lƣợng lớn receptor độc tố Phƣơng pháp chuẩn độ kháng thể chuột nhắt để đánh giá khả trung hòa độc tố kháng thể đƣợc tạo chuột sau tiêm miễn dịch thông qua tế bào Vero Tế bào đƣợc cấy vào phiến 96 giếng với độc tố bạch hầu huyết chuột chứa kháng thể kháng bạch hầu nồng độ khác Kháng thể kháng độc 21 Footer Page 30 of 126 Header Page 31 of 126 tố bạch hầu trung hòa độc tố Nếu lƣợng kháng thể không đủ trung hòa độc tố còn dƣ lại gây độc cho tế bào Vero làm chết tế bào Dựa vào tỷ lệ chết tế bào, so sánh tƣơng quan vắc xin mẫu chuẩn (đã biết công hiệu) vắc xin mẫu thử theo parallel line để tính công hiệu vắc xin theo đơn vị IU [23] Trong thử nghiệm hiệu giá kháng thể đƣợc tính theo điểm kết thúc điểm mà giếng cuối còn tế bào mọc Khi tế bào sống, việc trao đổi chất chúng làm acid hóa môi trƣờng dẫn đến chuyển màu thị đỏ phenol khiến môi trƣờng chuyển màu từ đỏ sang vàng Nhƣ sau 4-6 ngày nuôi cấy, môi trƣờng chuyển màu vàng chứng tỏ tế bào sống, môi trƣờng màu đỏ chứng tỏ tế bào chết Hiện nay, có ba cách đọc điểm kết thúc này: đọc mắt thƣờng (phương pháp Kreeltenberg), đo quang phổ (phương pháp Aggerbeck) thêm dung dịch nhuộm màu xanh thiazolyl (phương pháp Sesardic) [7] Kỹ thuật:Tiêm vắc xin mẫu chuẩn mẫu thử độ pha loãng khác cho chuột nhắt Sau 35 ngày, lấy máu tách huyết riêng rẽ từng chuột.Chuẩn độ kháng thể chuột với tế bào Vero Tỷ lệ chết tế bào Vero độ pha loãng khác kháng thể chuột phản ánh nồng độ kháng thể[29] Tính kết biện luận: Kết công hiệu theo phƣơng pháp đƣợc tính theo chƣơng trình Parallel line Chƣơng trình đƣợc sử dụng để ƣớc lƣợng công hiệu tƣơng quan vắc xin từ liệu đƣa thử nghiệm định lƣợng Trong thuật toán phân tích này, giá trị log2 chuẩn độ từng tuýp huyết riêng lẻ phải đáp ứng hồi quy tuyến tính theo liều bậc 10 Sự khác biệt giá trị trung bình độ pha phải ý nghĩa thống kê Vì khác biệt lớn làm giảm tính giá trị công hiệu ƣớc lƣợng Độ lệch chuẩn bình phƣơng trung bình từ tính chất song song tính tuyến tính phải có ý nghĩa thống kê Một hai tính chất không đáp ứng chứng tỏ thử nghiệm tiến hành giá trị có sai số thiết kế tiến hành thử nghiệm nên kết công hiệu không đủ độ tin cậy [29] So với phƣơng pháp thử thách chuột lang, phƣơng pháp có ƣu điểm dễ thực việc cung cấp chuột nhắt khả thi cho phòng thí nghiệm 22 Footer Page 31 of 126 Header Page 32 of 126 giá thành tƣơng đối rẻ đƣợc sử dụng nhiều nƣớc đƣợc WHO khuyến cáo sử dụng cho thử nghiệm công hiệu bạch hầu [6, 18] 1.7 ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA VẮC XIN MẪU CHUẨN 1.7.1 Đánh giá độ ổn định dài hạn (Long- term Stability Studies) Thử độ ổn định dài hạn phƣơng pháp đánh giá thí nghiệm hóa, lý, sinh học, vi sinh học sản phẩm điều kiện bảo quản Khi nghiên cứu thử độ ổn định dài hạn, tần số thử nghiệm phải đủ để thiết lập hình ảnh độ ổn định sản phẩm Tần số thử nghiệm điều kiện bảo quản dài hạn thông thƣờng tháng lần năm đầu tiên, tháng lần năm thứ hai, năm lần cho năm sau hết tuổi thọ dự kiến [1, 16] 1.7.2 Đánh giá độ ổn định theo phƣơng pháp thúc đẩy nhiệt (Accelerated Stability Testing) Là nghiên cứu đƣợc bố trí để làm tăng tốc độ phân hủy sản phẩm điều kiện khắc nghiệt (nhiệt độ độ ẩm) từ đƣa dự kiến tuổi thọ sản phẩm điều kiện bình thƣờng Nghiên cứu thử độ ổn định điều kiện bảo quản cấp tốc tối thiểu thời điểm, gồm thời điểm đầu, thời điểm kết thúc (có nghĩa 0, 3, tháng) thời gian thử nghiệm tháng Các kết nghiên cứu cấp tốc phản ánh gần với biến đổi đáng kể nguyên liệu điều kiện bảo quản mà nhà nghiên cứu dự định [1, 16] 1.7.2.1 - Điều kiện tiến hành phương pháp cấp tốc Buồng vi khí hậu trì đƣợc nhiệt độ 1,00C độ ẩm tƣơng đối 5,0% - Thời gian bắt đầu thực nghiệm thời gian cho mẫu chuẩn vào thiết bị thử nghiệm - Thời gian kết thúc thực nghiệm thời gian mà công hiệu vắc xin không đạt giới hạn cho phép 1.7.3 Dự đoán tuổi thọ sản phẩm theo nguyên lý Vant-Hoff Theo nguyên lý Vant-Hoff, tốc độ phản ứng hoá học tăng 2-4 lần nhiệt độ tăng 100C Khi đó, tuổi thọ C điều kiện nhiệt độ bảo quản bình thƣờng tbt tƣơng 23 Footer Page 32 of 126 Header Page 33 of 126 quan với tuổi thọ thực nghiệm Ctn nhiệt độ cao ttn đƣợc tính theo phƣơng trình sau: C = K.Ctn Trong đó: (1) ttn ttnbttbt t t 10 10 10 10 K K A A =A A (2) Thay giá trị K vào phƣơng trình (1) ta có: C  Ctn A t 10 (3) ttn: Nhiệt độ tiến hành thử nghiệm cấp tốc (0C) A: Hệ số nhiệt độ tốc độ phản ứng hoá học nhiệt độ tăng lên 100C (A = 2) Khi cần tính nhiệt độ bảo quản thích hợp tx cho phép bảo đảm tuổi thọ mong muốn Cmm (tính ngày) từ tuổi thọ điều kiện bình thƣờng C đƣợc tính theo công thức: t x = t bt + 10 C Lg LgA Cmm (4) Nếu khoảng thời gian C0 kể từ ngày xuất xƣởng đến bắt đầu thực nghiệm lớn 30 ngày mẫu đƣợc bảo quản điều kiện nhiệt độ 300C lúc tuổi thọ thuốc đƣợc tính: C= K.Ctn + C0 (5)[1, 16] 24 Footer Page 33 of 126 Header Page 34 of 126 Tài Liệu Tham Khảo Tiếng Việt Trần Tử An (2005), Kiểm nghiệm dƣợc phẩm, Nhà xuất Y học, Phần 7, tr81-86 Lê Văn Hiệp (2006), Vắc xin học vấn đề bản, Nhà xuất Y học, phần 6, tr.123-128 Nguyễn Thị Kê cộng (1999), Nghiên cứu sản xuất vaccine mẫu chuẩn Quốc gia Bạch hầu- uốn ván - ho gà, tr 44,54,59 Dƣợc điển Việt Nam IV, (2009), Vắc xin bạch hầu hấp phụ, tr 653, 654, 334-336 Lê Văn Phủng cộng (2009), Vi khuẩ n Y ho ̣c , Nhà xuất giáo dục Viê ̣t Nam Phần 4, tr.106-108 Tiếng Anh Aggerbeck H, Heron I (1991), " Improvement of a Vero cell assay to determine diphtheria antitoxin content in sera.", Biologicals,pp 19,71 - 76 Aggerbeck H, Norgaaed –Pedersen, Heron I (1996), "Simultaneous quantitation of diphtheria and tetanus antibodies by single antigen, timeresolve flosurescense immunoassay", Journal of Immunological Methods 190, pp 170-183 Bryan Howard et al(2007), "The COST Manual of Laboratory Animal Care and Use, categories of animal model and their characteristis", pp 45-46 Kreeftenberg JG et al(1986), "A mouse model to estimate the potency of the diphtheria component in combined vaccines", Development of biological standardization 64, pp 21-24 10 Yenny et al (1993), "Standardizing the potency of Diphtheria in-house reference toxoid using serologycal method by neutralization test in Vero cell culture", p 10 11 Euroean Commision (2009), "Alternative testing strategies-progress report 2009, Replacing, reducing and rifining use of animal in research genomics 25 Footer Page 34 of 126 Header Page 35 of 126 &biotechnology for health Luxenbourg: office for official Publication of the European Communities", EUR 23886 12 Edmunds WJ, Pebody RG, Aggerback H, Baron S, Berbers G, Conynvan 4)Spaendonck MA, Hallander HO, Olander R, Maple PA, Melker HE, Olin P, Fievret-Groyne F, Rota C, Salmaso S, Tischer A, vonHunolstein C and Miller E (2000), "The sero-epidemiology of diphtheria in Western Europe ESEN Project European Sero-Epidemiology Network.", Epidemiology and Infection 125 (1), pp 113 - 125 13 RIVM National Institute of public Health and the environment, (2000), Laboratory animal Husbandry in Vaccin Quality Control, 68-70 14 Galazka, AM (1993), "The Immunological Basis for Immunization Series, Module 2: Diphtheria.", World Health Organization 15 Hardy I, Dittman S and Sutter R (1996), "Current situation and control strategies for resurgence of diphtheria in newly independent states of the former Soviet Union", The Lancet 347, pp 1739 - 1744 16 Immunization, WHO Department of (2006), "Temperature sensitivity of vaccines", Vaccines andBiologicals 17 JF Carpenter , JH Crowe, T Arakawa (1990), "Comparison of solute-induced proteinstabilisation in aqueous solution and in frozen and freeze-dried state", J DairySci 73, pp 3627-36 18 Kreeftenberg JG, van der Gun JW, Marsman FR, Sekhius VM, Bhandari SR and Maheswari SC (1985), "An investigation of a mouse model to estimate the potency of the diphtheria component in combined vaccines", Journal of Biological Standardization 13 (3), pp 229 - 234 19 Manual for quality control of Diphtheria, Tetanus and Pertussis vaccines (2013), pp 147-155 20 Maple PA, Efstratiou A, George RC, Andrews NJ and Sesardic D (1995), "Diphtheria immunity in UK blood donors", The Lancet 345, pp 963 - 965 26 Footer Page 35 of 126 Header Page 36 of 126 21 Matejtschuk P, Rafiq , Johnes S, Gaines Das R (2005), "A comparison of vialswith ampoules for the storage of biological reference materials", Biologicals 33, pp 63-70 22 Pikal, MJ (1990), " Freeze drying of proteins Part II Formulation selection", Biopharm 3(9), pp 26-30 23 R Winsnes, D Sesardic, A Daas, M-E Behr-Gross (2006), "Collaborative study for thevalidation of serological methods for potency testing of diphtheria toxoid vaccine(part 2)", Pharmeuropa Bio 1, p 73 24 Redhead K, Gaines Das R (1991), "A collaborative assay of the proposed Third British reference preparation for Pertussis vaccine and the relative potencies of the second International Standard and the second British Reference Preparation for Pertussis Vaccine ", Biologicals 19, pp 107 111 25 Sesardic D, Prior C, Daas A and Buchheit KH (2003), "Collaborative study for establishment of the European Pharmacopoeia BRP Batch for Diphtheria Toxin.", Pharmeuropa Bio 1, pp - 21 26 Sesardic D, Winsnes R, Rigsby P and Gaines-Das, R (2001), "Calibration of replacement International Standard and European Pharmacopoeia Biological Reference Preparation for Diphtheria Toxoid, Adsorbed", Biologicals 29, pp 107 - 122 27 Wang, W (2000), "Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals", Int J Pharm 203, pp 1-60 28 WHO (1990), "Annex 2: requirements for Diphtheria, Tetanus, Pertussis and combined vaccines" No.800, p p13 29 WHO (1995), "Manual of laboratory methods for potency testing of vaccines used in the WHO Expanded programme on Immunization", pp 198-206 30 WHO (1998), "Requirements for yellow fever vaccine (Requirments for Biological Substances No 3, revised 1995)", WHO Technical Report 872, pp 30-68 27 Footer Page 36 of 126 Header Page 37 of 126 31 WHO (2003), "Recommendation for Diphtheria, Tetanus, Pertussis and Combined Vaccines annex 5", p 32 WHO (2006), "Annex 2: Recommendation for the preparation, characterzation and establishment of international and other Biological reference standards Part A" No 932 33 WHO (2013), Manual for quality control of Diphtheria, Tetanus and Pertussis vaccines 12-14 34 WHO (2013), Manual for quality control of Diphtheria, Tetanus and Pertussis vaccines 15 35 WHO (2013), Manual for the establishment of national and other secondary standards for vaccines, Vol Vii,Viii WHO/IBV/11.03 36 Xing D , Gaines Das R, Newland M, Corbel (2001), "Third International Standard for activity of pertussis vaccine:International Study of British Standard for pertussis vaccine,coded 66/303", Biologicals 29, pp 133 – 136 28 Footer Page 37 of 126 Confirmation ... Quố c gia ti ến hành: “Xác định tính khả dụng Vắc xin bạch hầu đông khô RD6 dự tuyểnmẫu chuẩn Quốc gia với mục tiêu sau: Xây dựng quy trình chuẩn định chất lượng Vắc xin mẫu chuẩn Quốc gia Bạch... Xác định giá trị công hiệu bạch hầu chuột lang Vắc xin mẫu chuẩn dự tuyển Dự đoán tuổi thọ vắc xin mẫu chuẩn Đánh giá tính đồng vắc xin mẫu chuẩn dự tuyển Footer Page 11 of 126 Header Page 12 of... TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - ĐỖ KHÁNH LINH ĐÁNH GIÁ TÍNH KHẢ DỤNG CỦA VẮC XIN BẠCH HẦU ĐÔNG KHÔ RD6 DỰ TUYỂN MẪU CHUẨN QUỐC GIA Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60420107 LUẬN